i liz a te

ole c lară ut
u
o m i e m
e t a x on or
c i d jdi il
Te h n i ific a r e a d ro
id e nt
în
Tehnici de taxonomie conventionala – analiza starilor vegetative sexuate si a
raspunsului fiziologic la un numar cat mai mare de teste de fermentatie si
asimilatie. Astfel de studii morfo-fiziologice, permit cel mai adesea identificarea
microorganismelor până la nivel de specie. Aceste caracteristici pot fi influenţate
însă de condiţiile de cultivare şi pot conduce la rezultate eronate

Aplicarea tehnicilor moleculare in sistematica drojdiilor a dus la

identificarea mai acurata a diferitelor specii si la reevaluarea arborilor
filogenetici

• Tehnicile electroforetice speciale de electrocariotipare

• Aplicatiile reactiei PCR

• Determinarea procentului molar G+C

• Analiza polimorfismului de lungime a fragmentelor de restrictie

• Secventierea unor regiuni ADNr din genomul microorganismelor

 Tehnici electroforetice speciale

În absenţa interacţiilor externe, macromoleculele de ADN există într-o formă

relaxată, mişcarea lor fiind de tip Brownian.

Sub influenta unui camp electric extern, moleculele de ADN se aliniaza la

directia campului electric si migreaza spre anod printr-o miscare dirijata, numita
REPTATIE

Electroforeza clasica permite separarea macromoleculelor de ADN de maxim

20 kpb.

Electroforeza in camp electric pulsator PFGE (Pulsed Field Gradient

Gel Electrophoresis) permite separarea moleculelor de ADN cu dimensiuni
cuprinse intre 50 kb – 10000 kb (10Mb)
Cromozomii drojdiilor au dimensiuni mici ceea ce-i face dificil de observat.
Apariţia şi dezvoltarea tehnicilor electroforetice speciale care permit
separarea în stare intactă a moleculelor de ADN cromozomal, au facut
posibilă caracterizarea seturilor de cromozomi aparţinând unor eucariote
inferioare printre care şi drojdiile.

Primele experimente de electrocariotipare pe drojdii au fost realizate pe tulpini

de Saccharomyces cerevisiae – pentru cei16 cromozomi (genom haploid) ce
au dimensiuni cuprinse între 200 Kb – 3 Mb, au fost descrise 13 benzi
electroforetice datorită comigrării unor cromozomi cu dimensiuni apropiate
( XIII si XVI, VII si XV, V si VIII)

Fig.1 Cariotipul speciei S. cerevisiae

 Posibilitatea separării intacte a cromozomilor a relevat faptul că
majoritatea speciilor sunt caracterizate de un polimorfism de lungime al
cromozomilor (CLP – Chromosome Length Polymorphism)

Termenul de PFGE a fost utilizat iniţial de Schwartz şi Cantor pentru

a descrie orice sistem de electroforeză ce foloseşte multiple câmpuri electrice
alternative (Schwartz, 1984).
Ulterior abrevierea PFGE a fost aplicată unor diferite sisteme de
electroforeză în câmp electric pulsat care prezintă variaţii ale geometriei
originale a electrozilor, omogenităţii şi modului de reorientare a câmpului
electric
 Tehnici electroforetice speciale

B B

C C

Orthogonal Field Alternation Gel Transverse Alternating Field Electrophoresis Simultaneous Tangential/ Rectangular
Electrophoresis Inversion Decussate Electrophoresis

-V

Ge l

+V

Rotating Gel

Contour-clamped Homogenous Electric Field Field Inversion Gel Electrophoresis

Cele mai multe dintre aceste denumiri sunt utilizate pentru a descrie
un anumit design al aparatului (ex : geometria electrozilor, circuitul
electric).

Diferenţele majore între aceste sisteme sunt reprezentate de :

√ capacitatea de obţinere de benzi electroforetice clare ;
√ viteza de separare ;
√ dimensiunea suprafeţei de gel ce permite o separare optimă
Tehnica OFAGE ( Orthogonal Field Alternation Gel Electrophoresis - utilizează
două perechi de electrozi ( notaţi A si B ) astfel încât să producă câmpuri plasate
diagonal pe gel sub un unghi mai mare de 90C unele faţă de altele

Când electrozii A sunt activaţi, moleculele de ADN încărcate negativ migrează

înainte şi spre dreapta iar când sunt activaţi electrozii B moleculele migrează
înainte şi spre stânga.

Această alternanţă regulată a câmpurilor electrice A şi B continuă pe toată

suprafaţa gelului şi determină moleculele de ADN să urmeze un traseu în zig-
zag, cu o migrare netă în direcţia înainte.
Intervalul la care direcţia câmpului este schimbată se numeşte timpul de puls
şi creste progresiv cu dimensiunea fragmentelor de ADN.

Tehnica CHEF (Contour - clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis

Principiul de bază al acestei tehnici este constituit de folosirea a 24 de

electrozi aşezaţi în perechi de-a lungul unui contur închis, hexagonal, unghiul de
reorientare fiind de 120º.
 Tehnica FIGE (Field Inversion Gel Electrophoresis)

Reprezintă realizarea experimentală cea mai simplă a unui experiment de

electroforeză în câmp electric pulsat.
Foloseşte o singură pereche de electrozi ce produc un câmp a cărui polaritate
este schimbată cu 180 per ciclu, cu un timp mai mare pentru direcţia înainte

- metoda standard (FIGE), care foloseşte intensităţi egale ale câmpului electric dar
timpul de migrare înainte este mai mare decât cel de migrare înapoi ;
- metoda asimetriei de potenţial (AV FIGE ) în care duratele de migrare sunt
identice dar câmpul electric pe direcţia înainte are valoare mai mare decât cel
revers ;
- Zero Integrated Field Electrophoresis (ZIFE ) în care există atât o asimetrie de
potential cât şi o diferenţă între duratele de migrare corespunzătoare.
Fig.3 Cariotipul speciei Candida albicans Fig.4 Cariotipul speciei Candida parapsilosis
obtinut prin tehnica CHEF obtinut prin tehnica CHEF
Determinarea compoziţiei în baze azotate a ADN

Analiza % mol GC a moleculelor de ADN de diferite origini a arătat că, deşi

orice ADN conţine aceleaşi baze azotate (A, T, G, C), cantitaţile relative ale
acestora variază în funcţie de sursa de la care provine molecula respectivă.

►metoda care permite aprecierea conţinutului in G+C prin determinarea

temperaturii de topire – Tm a ADN este cel mai frecvent utilizată în studiile
de taxonomie.

Tm – melting midpoint – reprezintă temperatura în grade Celsius la care, dintr-o

masă de molecule ADN, jumătate din ele se găsesc în stare dublu catenară şi
jumătate în stare monocatenară (sunt denaturate).
Dinamica procesului de denaturare termică este urmărită prin efectul
hipercromic – creşterea capacităţii de absorbţie a radiaţiilor UV, la lungimea de
undă de 260 nm, fenomen ce are loc in timpul denaturării.

Valorile absorbanţei la 260 nm se înscriu în grafic, rezultând curba de shift

hipercromic

Punctul de mijloc al curbei este considerat a fi Tm şi este corelat cu procentul

molar de guanină+citozină

%mol GC = 2.08 xTm – 106.4 (Owen R.)

 Aplicatiile reactiei PCR in identificarea microorganismelor
►Tehnica RAPD (Random amplified polymorphic DNA)
- amplificare PCR cu primeri (9-10 b) ce se ataseaza randomic la situsuri din
ADN genomic la o temperatură scăzută de 36°C.

► Dacă două astfel de situsuri sunt suficient de apropiate (la mai puţin de câteva
kilobaze), atunci secvenţa cuprinsă între ele este amplificată şi poate fi vizualizată
prin electroforeză în gel de agaroză

Fig.5 Profile de amplificare RAPD (primer RDS12)

obtinute in cazul unor tulpini de Candida albicans
►Tehnica MLST (Multilocus sequence typing)

-Utilizarea acestei tehnici moleculare implică alegerea şi întocmirea unei

scheme de amplificare a unui număr cât mai mare de gene diferite.
-Prezenţa sau absenţa ampliconilor obţinuţi cu ajutorul tehnicii MLST,
precum şi polimorfismul secvenţelor obţinute au sugerat introducerea a două
noi specii Candida metapsilosis şi Candida orthopsilosis în locul grupurilor II
şi III din cadrul speciei Candida parapsilosis (I)

Candida parapsilosis grup I Candida parapsilosis

Candida parapsilosis grup II Candida metapsilosis
Candida parapsilosis grup III Candida orthopsilosis
►Tehnica UP-PCR ( Universally Primed Polymerase Chain Reaction)

-Este o varianta a tehnicii RAPD ce se bazeza pe amplificare ADN genomic cu

primeri unici scurti.

-Principala diferenţă constă în construirea secvenţei primerului şi în stabilirea

condiţiilor de reacţie. Utilizând un astfel de primer universal pot fi obţinute pentru
fiecare dintre speciile studiate profiluri specifice de amplificare

Profilele UP-PCR ale unor diferite

specii ale genului Williopsis
 Studii de omologie pe ADN mitocondrial
► RFLP (Restriction Fragments Lenght Polimorphism)

Distribuţia situsurilor de restricţie corespunzătoare unei anumite enzime este

specifică pentru fiecare tulpina.
Când se supune acţiunii unei enzime de restricţie (digestiei enzimatice) materialul
genetic al unei tulpini microbiene se obţin fragmente de anumite lungimi, respectiv
de anumite mase moleculare, care, odată supuse electroforezei în gel de agaroză,
vor da un model caracteristic de migrare - un profil de restricţie (pattern) anume

Tulpinile similare prezinta pattern-uri de restrictie similare, iar compararea cu

pattern-uri ale unor tulpini de referinta permite incadrarea taxonomica a
izolatelor naturale studiate.

Restrictia se realizeaza cu una sau mai multe enzime, urmarindu-se obtinerea

unei combinatii de fragmente cu maxima specificitate.
endonucleazele de restricţie recunosc secvenţe
tetranucleotidice (Hae III, AluI, RsaI, Sau 3A, Mbo I, etc)
pentanucleotidice (Dde I, Mae III) sau
hexanucleotidice (EcoR I, PstI, BamH I, Kpn I)

Analize de restrictie a ADN mitocondrial

1,4 – BC; 2,5 – LC;
3,6 – C. parapsilosis CBS 604
► Telomere mitocondriale – Markeri moleculari utilizati in
identificarea drojdiilor

ADN mitocondrial dublu-catenar linear - Pichia, Williopsis si Candida

În cazul speciei Candida parapsilosis ADN mitocondrial linear este

caracterizat de prezenţa la capetele moleculei a telomerelor
mitocondriale

Identificarea tulpinilor de Candida

parapsilosis prin reactie PCR cu
primeri specifici pentru telomere
mitocondriale
 nad 6-nad 1 nad 4-nad 5
nad3-nad2 nad 4
atp9 atp8 atp 6

cytb cox2 LSU rRNA cox1 SSU rRNA cox 3

TELOMERE TELOMERE

Organizarea genetica a ADN mitocondrial la Candida parapsilosis

cyt b - gena ce codifică apocitocromul b;

cox1, cox2, cox3 - gene ce codifică pentru subunităţi ale citocrom-oxidazei;
atp 6, atp8, atp9 - gene ce codifica pentru subunităţi ale ATP-azei
mitocondriale;
nad1, nad2, nad3, nad4, nad5, nad6 – gene ce codifică pentru complexele
respiratorii NADH;
LSU rRNA - gena ce codifica pentru subunitatea mare a ARNr;
SSU rRNA - gena ce codifica pentru subunitatea mică a ARNr
Studii de omologie a ARNr si a genelor corespunzatoare

Reprezentarea schematica a genei ARNr

(ITS, internal transcribed spacer ; IGS, intergenic spacer ; D1/D2, domeniile 1 si 2)
►ARNr 18S
 

Studii de secvenţiere

Dimensiunea acestei molecule este suficient de mare pentru a oferi

o rezoluţie optimă studiului.

Datorită faptului că unele regiuni ale acestei molecule prezintă un

grad diferit de conservare analiza ei poate duce la elucidarea
relaţiilor filogenetice între diferite specii de drojdii
►ITS (Internal Transcribed Spacer )

Lungimea regiunilor ITS este relativ constantă între tulpinile

conspecifice de drojdii, dar secvenţa acestora poate varia. În sistematica
drojdiilor studiul acestor regiuni se realizează mai ales prin analize de amplificare
şi restricţie

Profilul de restrictie a ampliconilor ADNr

obtinuti cu ajutorul primerilor ITS1 si ITS4,
in cazul a diferite specii patogene de Candida
Analiza regiunii D1/D2 ADNr 26S

Prin secvenţierea regiunii D1/D2 ADNr26S şi analiza similarităţii dintre aceste

secvenţe, se poate aprecia dacă diferite tulpini de drojdii sunt conspecifice

Două tulpini ce diferă prin mai mult de trei nucleotide pot fi recunoscute ca fiind
specii diferite în timp ce acelea ce prezintă o diferenţă de până la trei nucleotide
sunt conspecifice
Secvente acumulate in bazele de date (%)

Secvente acumulate in baze de date