UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINARA BUCURETI

FACULTATEA DE HORTICULTURA

SPECIALIZAREA TEHNOLOGIA PRODUSELOR AGROALIMENTARE"

VALORIFICAREA UNOR SUBPRODUSE I DEEURI AGRICOLE DE NATUR LIGNOCELULOZIC PRIN ZAHARIFICARE I FERMENTARE SIMULTAN

TEZA DE DOCTORAT

Coordonator tiinific, Prof. Univ. Dr. GHEORGHE CMPEANU

Doctorand, ef lucrri FLORENTINA ISRAEL-ROMING

BUCURETI 2005

CUPRINS

CUPRINS

INTRODUCERE PARTEA I. STUDIU DOCUMENTAR CAPITOLUL 1. Componentele biomasei de natur celulozic i strucutra lor 1.1. Celuloza 1.1.1. Structura celulozei 1.1.2. Proprieti fizice 1.1.3. Proprieti chimice 1.2. Hemicelulozele 1.3. Lignina 1.4. Materiile pectice 1.5. Subproduse i deeuri agroalimentare de natur lignocelulozic CAPITOLUL 2. Sistemul polienzimatic celulazic 2.1. Componentele sistemului celulazic 2.2. Specificitatea de substrat a celulazelor 2.3. Adsorbia celulazelor la suprafaa celulozei 2.4. Sinergismul dintre componentele sistemului celulazic 2.5. Aspecte ale mecanismului general de degradare a celulozei CAPITOLUL 3. Pretratamente aplicate materialelor lignocelulozice 3.1. Pretratamente mecanice 3.2. Pretratamente fizice 3.2.1. Pretratamente cu vapori 3.2.2. Pretratamente prin iradiere 3.3. Pretratamente chimice 3.3.1. Pretratamente alcaline 3.3.2. Pretratamente acide 3.3.3. Pretratamente cu ageni oxidani 3.4. Pretratamente biologice 3.5. Pretratamente combinate CAPITOLUL 4. Degradarea microbian a materialelor lignocelulozice 4.1. Microorganisme implicate n degradarea materialelor lignocelulozice... 4.2. Degradarea celulozei cu tulpini de Trichoderma viride 4.2.1. Optimizarea producerii de celulaze 4.2.2. Limitarea represiei catabolice 4.3. Culturi mixte 4.4. Valorificarea unor materiale lignocelulozice prin bioconversie PARTEA a Ii-a. REZULTATE EXPERIMENTALE CAPITOLUL 5. Creterea susceptibilitii materialelor lignocelulozice la hidroliza enzimatic 5.1. Materiale i metode de lucru 5.1.1. Materiale folosite 5.1.2. Metode de lucru

6 8 9 9 9 13 14 16 17 19 20 23 23 24 26 27 29 34 34 36 36 37 37 37 38 40 40 41 43 43 45 45 48 49 50 55 56 56 56 57

CUPRINS

5.2. Influena pretratamentului alcalin asupra degradrii enzimatice a materialelor lignocelulozice 5.3. Influena pretratamentului alcalino-peroxidic asupra degradrii enzimatice a materialelor lignocelulozice 5.4. Optimizarea pretratamentului alcalino-peroxidic 5.4.1. Optimizarea temperaturii pretratamentului alcalino-peroxidic aplicat unor materiale lignocelulozice 5.4.2. Optimizarea timpului pretratmentului alcalino-peroxidic aplicat unor materiale lignocelulozice 5.4.3. Optimizarea dimensiunii materialelor lignocelulozice 5.4.4. Optimizarea raportului material lignocelulozic:soluie alcalino-peroxidic 5.5. Influena pretratamentelor asupra structurii materialelor lignocelulozice 5.5.1. Analiza spectral FTER - transmisie 5.5.2. Analiza spectral FTIR-ATR 5.6. Concluzii CAPITOLUL 6. Selectarea unor tulpini flingice nalt productoare de celulaze 6.1. Materiale i metode de lucru 6.1.1. Materiale folosite 6.1.2. Metode de lucru 6.2. Screening-ul tulpinilor cu potenial celulozolitic 6.3. Concluzii CAPITOLUL 7. Zaharificarea i fermentarea simultan a unor materiale de natur lignocelulozic 7.1. Materiale i metode de lucru 7.1.1. Materiale folosite 7.1.2. Metode de lucru 7.2. Influena culturii mixte asupra sintezei celulazelor 7.3. Influena raportului fung:drojdie asupra sintezei celulazelor 7.4. Alegerea momentului optim de inoculare a drojdiei 7.5. Influena concentraiei sursei de carbon asupra culturii mixte 7.6. Concluzii CAPITOLUL 8. Posibiliti de valorificare a materialelor lignocelulozice prin cultur mixt 8.1. Materiale i metode de lucru 8.1.1. Materiale folosite 8.1.2. Metode de lucru 8.2. Obinerea preparatului enzimatic purificat 8.2.1. Separarea complexului celulazic prin precipitare cu aceton 8.2.2. Separarea prin adsorbie pe hidroxilapatit 8.2.3. Separarea prin cromatografie de schimb ionic 8.3. Caracterizarea preparatului enzimatic purificat 8.3.1. Determinarea parametrilor cinetici 8.3.2. Determinarea pH-ului optim de aciune 8.3.3. Determinarea temperaturii optime de aciune

62 65 75 75 77 78 79 80 80 84 85 87 87 87 89 94 96 97 97 97 99 99 108 110 111 113

114 115 115 116 120 121 121 122 125 125 126 128

CUPRINS

8.3.4. Determinarea compoziiei n aminoacizi prin analiza HPLC 8.4. Valorificarea reziduului 8.5. Concluzii CONCLUZII GENERALE BIBLIOGRAFIE ANEX

129 132 134 136 140 154

INTRODUCERE

INTRODUCERE

Biomasa celulozic, rezultat din procesele de fotosintez, este incontestabil cea mai abundent resurs rennoibil, producia mondial fiind de ordinul miliardelor de tone anual. Folosirea de ctre om a acestei imense resurse conduce la producerea de cantiti mari de deeuri i subproduse ce conin celuloz, ceea ce are ca rezultat implicit deteriorarea mediului. Degradarea acestor deeuri i subproduse, i valorificarea lor sub form de substane organice sau energie este unul din domeniile ce au polarizat atenia cercettorilor n ultimele decenii. Un obiectiv vital al biotehnologiei mileniului II este conversia enzimatic a biomasei celulozice ce se rennoiete permanent. Astfel, procese fermentative noi i din ce n ce mai eficiente au ca obiectiv transformarea acestei "monede" biologice ntr-o serie de produse de consum. Cele mai comune surse de celuloz sunt lemnul i bumbacul. Pentru utilizri industriale, sursa major de celuloz este lemnul, chiar dac puritatea a-celulozei obinute nu este foarte mare. Derivatele de celuloz folosite n industria farmaceutic, n cea a vopselurilor i explozivilor sunt de obicei obinute din bumbac. Totui, trebuie s fie investigate i alte surse alternative de celuloz, fiind vizate n special o serie de deeuri i subproduse cu coninut lignocelulozic, pentru care valorificarea ar putea rezolva i o serie de probleme ecologice. Pentru a putea valorifica mai eficient aceast resurs imens, ce se rennoiete n permanen, trebuie s se cunoasc ct mai bine particularitile legate de structura i proprietile celulozei. n ultimii douzeci de ani, interesul din ce n ce mai mare pentru aceast problematic, ct i dezvoltarea unor tehnici moderne de investigare a condus la elucidarea unor noi aspecte legate de poliglucidele parietale. Poliglucidele structurale din regnul vegetal sunt compui ternari, de urmtoarele tipuri principale: celuloze, hemiceluloze, pectine i gume. Acetia au proprietatea de a forma agregate macromoleculare mono i bidimensionale, constituind catene lineare i ramificate. Rezistena mecanic nu poate fi conferit exclusiv prin participarea lor. De aceea, aceste structuri poliglucidice sunt stabilizate, de fapt rigidizate, prin prezena altor compui tridimensionali, respectiv ligninele. Astfel, se poate afirma c structura parietal de tip vegetal este definit cantitativ de raportul celuloze-hemiceluloze-pectine-lignine. Este evident faptul c variaia a patru

fNTRODUCERE

tipuri de compui (chiar dac trei dintre ei sunt destul de nrudii structural) conduce la realizarea unor structuri parietale specifice. Transformarea polimerului celulozic n ali compui utili, este posibil prin scindarea sa n entiti cu mas molecular mic, ideal uniti monomerice glucidice. Aceast conversie poate fi fcut fie prin metode chimice, fie prin metode enzimatice. Metodele enzimatice sunt din ce n ce mai mult abordate datorit modului selectiv de aciune, eliminnd astfel posibilitatea formrii de produi secundari nedorii. Viteza i gradul de hidroliz enzimatic depind de suprafaa celulozei expus efectiv atacului enzimelor celulozolitice. De aceea, pentru a crete regiunile amorfe i suprafaa ce poate fi atacat enzimatic, este esenial aplicarea prealabil a unui pretratament. Pretratamentele pot fi de natur fizic, cum sunt mcinarea i mrunirea, piroliza, explozia n vapori cu nalt presiune, i de natur chimic, cum ar fi tratarea cu alcalii, acizi sau ageni de oxidare. Astzi, n vederea creterii eficienei acestor pretratamente, ele se practic cuplate dou sau mai multe. Microorganismele ce sunt implicate n degradarea celulozei includ bacterii, actinomicete i flmgi. Dintre acestea, fungii sunt cei mai des utilizai, att pentru realizarea de studii privind degradarea celulozei, ct i ntr-o serie de aplicaii industriale. Totui, trebuie menionat c, dei exist numeroi fungi ce cresc pe celuloz sau produc enzime care degradeaz celuloza amorfa, puini dintre acetia produc extracelular un sistem celulazic complet capabil s degradeze celuloza cristalin. n natur, succesul microorganismelor n degradarea materialelor lignocelulozice este datorat n mare msur aciunii sinergice a acestora, incluznd chiar i speciile care nu au potenial celulozolitic. Aceast lucrare prezint cercetrile derulate n vederea realizrii unui proces de bioconversie a unor deeuri agroalimentare, avnd ca obiectiv final valorificarea integral a mediului de cultur. Pentru experimentele prezentate n acesta lucrare, s-au utilizat ca material lignocelulozic paie de gru i de orz. Ele au o digestibilitate foarte sczut (45 - 50%), sunt prea srace n totalitatea constituenilor intracelulari (minerale, proteine etc.), necesari, mai nti pentru microorganisme, apoi pentru animalul gazd. n urma aplicrii unui pretratament adecvat, care s mbunteasc

susceptibilitatea acestora la atacul enzimatic, deeurile menionate au fost utilizate ntr-un procedeu de bioconversie, ca surs de carbon pentru cultivarea unor microorganisme cu potenial lignocelulozic.