"culturi de celule" totalitatea

tehnicilor prin care un organ, un tesut sau

celule dispersate (natural sau prin tehnici de
laborator) sunt mentinute n viata sau
multiplicate n afara organismului ("in vitro")


Se poate studia comportamentul celulelor n
conditii strict definite:

-se adauga sau se extrag molecule specifice
(de exemplu: factori de crestere)

-se determina efectele asupra
comportamentului celular;

-se obtin populatii omogene de celule pentru
analize biochimice;

-pe culturi mixte, se studiaza interactiunile
ntre tipurile celulare.


Clasificarea culturilor de
celule :

1.Dupa felul substratului, pot fi: pe suport organic nutritiv;
pe suport organic nenutritiv;
pe suport anorganic;
n suspensie n mediu lichid.

2.Culturi de celule 2 categorii (raportat la materialul biologic):

a. Culturi de organe (organocultura) = ntretinerea, n medii
nutritive adecvate a unor fragmente de organ (intestin, trahee, rinichi)

b. Culturi de celule = multiplicarea "in vitro" a celulelor din:
-fragmente de tesut (explante); in jurul explantului
se formeaza o coroana de celule care se multiplica;
-suspensii de celule naturale sau obtinute prin
dispersarea n laborator





Clonarea
separarea unei singure celule si
multiplicare a ei separata
rezultnd o linie celulara
uniforma din punct de vedere
genetic.

Practicata de peste douzeci de ani perfecionarea
vaccinurilor i a medicamentelor. Metoda inserarea n bacterii sau
n drojdii a genei care controleaz sinteza moleculelor de interes
terapeutic, permite obinerea unor produse n cantitate aproape
nelimitat.



Micro-injectarea
nucleului unei celule
intr-un ovocit
Mediile de
cultura


dupa consistenta - sunt medii lichide si semilichide;

dupa compozitie - exista medii naturale,
semisintetice si sintetice;

dupa valoarea nutritiva si scopul urmarit

medii de crestere medii defective
medii de mentinere

echilibrul ionic
pH-ul optim 7.2-7.4
temperatura optima
continutul de 02 si de CO2 favorabil;
elemente nutritive, aminoacizi esentiali,
grasimi, vitamine, hormoni, substante
stimulatoare ale cresterii;
evitarea contaminarii cu germeni patogeni
stimularea multiplicarii si cresterii celulelor
prin adaugarea de extracte embrionare.



Mediile
nutritive
contin:
o solutie salina (solutie tampon si indicator);

elemente proteice (ser /plasma / lichid amniotic,
aminoacizi);

elemente stimulatoare ale cresterii (extracte
tisulare de origine embrionara / adulta);

vitamine;

antibiotice.

Arie de lucru sterila
Sticlarie ,instrumente
fine
Dispozitive de curatat si
sterilizat
Recipiente de stocare
pentru mediu,ser,sticlarie
Incubator si hota cu flux
laminar
Sursa de apa
Microscop,agitator
magnetic,
balanta analitica
Substante chimice

Accesul limitat in zona de culturi celulare
Suprafetele se decontamineaza cu etanol 70%
inainte si dupa utilizare
Nu se pipeteaza cu gura, nu se mananca/fumeaza
in zona de lucru
Hainele de protectie se folosesc numai in cadrul
incintei
Se spala mainile inainte si dupa operatii, iar parul
se leaga
Se controleaza emisiile de aer, se sterilizeaza
incinta cu lampi UV

Aria de lucru
sterila
Emisia de aer
Recoltarea de la
embrioni de 1-3 luni.
cristalizor steril cu o
solutie salina cu
antibiotice
Tegumentul embrionului
- sterilizat cu alcool iodat
fara ca acesta sa patrunda
in cavitatile embrionului.
Fragmentele de tesut
embrionar - cutie Petri
sterila cu solutie alcalina
dupa inlaturarea
cheagurilor de sange cu
pense sterile.

Cutie
Petri
Pensa
Cristalizor
steril
Dupa ultima spalare
fragmentele se aseaza
intr-o eprubeta de
centrifuga sterila, iar
prin intermediul unor
foarfeci sterili se
obtine o masa cu
aspect omogen

Sub actiunea
tripsinei si a agitarii
celulele se separa,
iar actiunea
acestora se
sfarseste in
momentul in care
solutia se raceste.

Cu o pipeta Pasteur
se recolteaza o
cantitate de
suspensie de tesut
embrionar si se
intinde pe un
recipient de cultura
(flask)

Pipeta
Pasteur
Recipiente
de cultura
Recipientul se lasa cu
suprafata cu suspensie
in jos la o temperatura
de 37,timp de 30- 60
de minute.
Se introduce mediul
nutritiv,iar recipientele
sunt astuparte cu dop
de cauciuc si incubate
intr-un termostat la
37
Pe perioada incubarii
aceste recipiente nu
trebuiesc miscate o
perioada minima de 3-
4 zile

Aceste tesuturi provin prin
interventie chirurgicala:
-piele
-mucoase
-tesut uterin
-rinichi
-splina si ganglioni etc.
Fragmentele se introduc in solutie
salina cu antibiotice ,unde se lasa
2-3 ore si apoi se efectueaza
etapele de prelucrare preliminara
identice cu ale embrionului.



Controlul mediului de
cultura se efectueaza la
12-24 de ore pentru:
contaminare (bacterii,
fungi, virusi);
constantele fizico-
chimice (pH, proteine
totale);
aprecierea eficientei
culturii (densitatea
celulara pe suport,
eficienta de formare a
coloniilor)

Controlul morfologic al
celulelor din culturi se
face prin:
microscopie fotonica
pe preparate proaspete
histoautoradiografie;
microscopie
electronica.
fragment de tesut
pus in mediu de
cultura din care
cresc celule si apoi
se indeparteaza, iar
celulele se multiplica
mai departe
poate fi izolat din orice
parte a organsimului
cu continut de
tesuturi vii

rezultate bune cu:
embrionii
ovare
ovule
celule
Explant
cardiac
Componente esentiale:
apa, saruri organice,
sursa de azot,
vitamine, hormoni
Componente
optionale: azot
organic, acizi organici,
extracte de diferite
origini
Etapele preparrii unui mediu de
cultur sunt:
1)Diluia srurilor minerale: macro- i
microelemente, apoi ajustarea
lavolumul final.
2)Msurarea pH-ului, corectarea cu KOH
10N; n general pH-ul este de5,5-5,8.
3)Adiia zaharurilor (sucrozei) urmat de
adiia agarului adaugat in ploaie n
timp ce mediul este amestecat tot
timpul.
4)Sterilizarea mediului de cultur la
120oC ntre 20-30 minute.
5)Adugarea vitaminelor i hormonilor
(sterilizai prin filtrare) n mediu cnd
temperatura ajunge la 40-50oC
6)Repartizarea mediului n vasele de
cultur sterile se face imediat dupa
aditia vitaminelor si hormonilor.

Explant in
tub cu agar
Explantul prelevat -
echilibru biochimic
dependent de:
varsta tesutului de
prelevat
stadiul fiziologic al
acesteia
organul la al carui nivel a
fost efectuata prelevarea
structura si dimensiunile
explantului
Clasificarea explantelor:
Explantele ce contin celule
nediferentiate: celule
meristematice caulinare -
mediul trebuie sa permita
declansarea functionarii
celulelor in asa fel incat
programul lor sa se
desfasoare normal

Explantele din tesuturi
diferentiate cu celule
specializate mediile trebuie
sa induca dediferentierea si
redobandirea capacitatii de
diviziune si constituirea
unei structuri meristematice
Initierea culturilor
In conditii de sterilitate
totala
Sterilizare tesuturilor
prelevate: hipoclorit de
de
Ca sau Na 10-30 min.
precedata de imersarea
materialului in alcool 70%
30 sec-1 min, spalarea
cu AD
Evitarea contaminarii
ulterioare
Manipularea la hote cu
aer filtrat prin pori de
0,22 microni
Incubarea culturilor

In camere de
crestere

Incinte climatizate
cu regim
fotoperiodic reglabil

Regimul termic este
25-27C, iar
umiditatea de 90-
100%
Etapele multiplicarii:
Stabilirea unei culturi
de tesuturi aseptice
marire vizbila, aparitia
adventiva pe explant
Cresterea rapida a
structurilor
(multiplicarea propriu-
zisa)
Pregatirea celulelor
pentru subcultivari

Celule din jurul explantului
in faza de contrast
Cultura in vitro
urmareste
readucerea si
mentinerea.
materialului initial
intr-o stare juvenila.
Multiplicarea este
foarte scurta si poate
fi reprodusa la infinit
Se pot produce
cantitati
impresionante de
celule.

Explant

Retinal
Fragmente de periost
prelevate de pe substratul
osos
Lambou periostal
acoperit cu mediu
de cultura
Aspect explant la 4
zile de la
introducerea in
mediul de cultura
10x
20x