SFATUL GENETIC

Sfatul genetic reprezinta un ansamblu de masuri care se

iau in vederea inlaturarii sau limitarii raspandirii bolilor
genetice in populatia umana.
Sfatul genetic este solicitat in urmatoarele circumstante:
- Cuplul doreste copii, iar unul dintre parteneri are o ruda
apropiata care sufera de o boala ereditara.
- Unul dintre parinti are deja un copil cu un defect grav din
nastere.
- Femeia a avut deja unul sau mai multe avorturi spontane.
Problemele severe ale cromozomilor fetusului pot duce
uneori la pierderea sarcinii. Pierderile repetate ale sarcinii
pot indica o problema genetica.
- Femeia a nascut deja un copil mort, care prezenta
semnele fizice ale unei boli genetice. Multe boli genetice
grave produc anomalii fizice care dau copilului afectat un
aspect specific.

- daca partenerii cuplului prezinta un anumit grad de

inrudire ( legatura consagvina);
- daca femeia are peste 35 de ani, i se recomanda in
timpul sarcinii sa faca amniocenteza in vederea stabilirii
unui diagnostic prenatal , luand in consideratie ca riscul
bolilor cromosomiale cresc odata cu virsta femeii;
- daca in perioada timpurie a graviditatii mama a primit
medicamente, a trecut chimioterapia sau a fost supusa
radiatiei sau a altor factori chimici nocivi;
Obiectivele principale ale sfatului genetic sunt acelea de a
stabili riscul pe care-l intampina un individ sau cuplu de a
avea descendenti afectati de o boala ereditara.

Exista mai multe metode de diagnosticare a maladiilor:

Clinico-genealogica - colectarea informatiei completa
da la persoana in cauza (date despre parintii, frati,
surori, buneii, rudele apropiate: ce maladii au suportat).
Metoda citogenetica consta in cercetarea garniturii
normale de cromosomi si al anomaliilor de numar si de
structura a cromosomilor. De asemenea aceasta metoda
include determinarea cromatinei sexuale. Pentru aceste
analize, se colecteaza singe, sau celulele maduvei
osoase, a pielii, a lichidului amniotic, tesuturilor
embrionale.

 Metoda molecularo-genetica. Permite determinarea

modificarilor structurale si functionale din acizii nucleici in
patologia ereditara. Se extrage probele de ADN din
singele periferic, din vilozitatile corionale, lichidul
amniotic.
Metoda imunogenetica - se utilizeaza in studiul
pacientilor si rudelor lor in cazurile de imunodificienta
ereditara. Permite determinarea predispozitiei ereditare
cu ajutorul markerilor genetici (sistemul HLA).
Metoda gemenilor se bazeaza pe compararea
frecventei caracterelor la gemenii monozigoti (identici) si
dizigoti (neidentici).

 In afara de examenele care se fac pentru toate

gravidele:
- hemoglobina (depistarea anemiei),
- grup sanguin, glicemie, teste pentru boli infectioase
(exemplu: RW - test pentru sifilis), secretii vaginale,
- ecografie, sumar de urina, greutatea, tensiunea
arteriala, inaltimea fundului uterin precum si prezenta
batailor cordului fetal pentru femeile ce intra in grupul de
risc se mai fac teste suplimentare, numai dupa acordul
femeii, dupa o consultatie medico-genetica.

Metode de diagnostic prenatal

Amniocenteza
Amniocenteza este un test efectuat asupra femeii
insarcinate, de obicei intre saptamanile 16 si 18. Medicul
introduce un ac subtire in abdomenul femeii pentru a
preleva o cantitate mica de lichid amniotic, cca.20 de ml,
ce inconjoara fetusul.
Analiza se face dupa o prealabila scanare ecografica ce
va releva imagini despre uter, placenta, lichid amniotic si
fetus. Celulele din lichidul amniotic descuamate din
tegumentele si mucoasele fetusului sunt cultivate in
conditii speciale si apoi testate pentru prezenta
anomaliilor cromozomiale.

Analiza serveste si la determinarea sexului copilului. Cand exista

posibilitatea unei cezariene sau riscul de nastere prematura, amniocenteza
poate ajuta si la stabilirea gradului de maturitate al plamanilor copilului.
Ca si prelevarea de villus corionic, procedura are un risc scazut de a
provoca un avort spontan.

Amniocenteza este recomandata in urmatoarele situatii:

Varsta materna inaintata. Cu cat inainteaza in varsta
femeile au un risc din ce in ce mai mare de a naste un
copil cu sindrom Down. In unele tari amniocenteza se
practica la toate gravidele peste 35 de ani. Optiunea
pentru a efectua testul prenatal poate sa apartina si
femeilor tinere
Familii in al caror istoric figureaza bolnavi cu sindroame
cromozomiale. In aceasta situatie nu conteaza varsta
mamei si este recomandata amniocenteza pentru
testarea cromozomilor
Familii in al caror istoric figureaza boli genetice, sau daca
parintii sunt purtatori ai unei boli genetice.
Depistarea ecografica a unor anomalii

 Analiza vilozitatilor coriale:

Aceasta analiza permite diagnosticarea bolilor ereditare in primul
trimestru de sarcina (in saptamina 8-10 de sarcina).
Prioritatea acestei metode consta in faptul, ca daca se determina
schimbari in dezvoltarea copilului, graviditatea poate fi intrerupta
prin recomandarea avortului terapeutic.
Prelevarea de villus corionic (Chorionic villus sampling CVS)
consta in recoltarea cu ajutorul unui cateter, care se introduce in
cervixul uterin, de tesut extraembrionar, care din punct de vedere
genetic este identic cu celulele fetale.

Removing a cell for

Searching for Chromosome and Gene Defects

diagnosis from a human
Pre-Implantation Genetic Diagnosis (PGD)

embryo.

The diagnosis: trisomy 21 (Down syndrome).

Testul alfa-fetoproteinei :
Cu ajutorul acestei analize se determina cantitatea de alfafetoproteina, subsatnta elaborata de catre copil si ce trece in singele
mamei. Testul e cert in saptamana 20 de sarcina.
Cantitatea crescuta de aceasta substanta poate semnala o
malformatie deschisa de tub neural (anencefalia, spina bifida - o
maladie caracterizata prin dereglarea formarii coloanei vertebrale si
a maduvei spinarii).
In cazul in care se determina cresterea alfa-fetoproteinei, deseori
este necesar de efectuat si alte investigatii, cum ar fi:
ultrasonografia, amniocenteza.

PRICIPII SI TEHNICI
Dezvoltarea unor tehnici moleculare din ce n ce mai
sofisticate a condus la o explozie de informaii asupra
structurii i funciei genelor precum i asupra
mecanismelor de reglare a activitii lor.
Aplicarea acestor tehnici a culminat cu finalizarea n anul
2001 a celui mai ndrazne i ambiios program de
investigare a biologiei umane, Proiectul Genom Uman.
Impactul geneticii n practica medical, sntate public i
cercetarea medical, a devenit important i unanim
recunoscut. Volumul informaiilor referitoare la aspectele
moleculare ale patologiei umane se afl ntr-un proces
de cretere exponenial.

FISH
Principiul acestei metode de citogenetica moleculara
este hibridizarea prin complementariatea a unei sonde
de AND monocatenat de cca kb cu o anumita regiune a
unui cromozom.
Sonda este marcata fie direct prin incorporarea unui
nucleotid fluorescent fie indirect prin incorporarea unui
nucleotid modificat ce contine o molecula reporter
( precum biotina sau digoxigenina) care e recunoscuta
de un ligand specific (streptavidina pt biotina si Ac
specifici pt digoxigenina) conjugat cu un fluorocrom.

Izolarea ADN
Metoda de izolare ADN se alege n funcie
de materialul din care este izolat ADN:
snge, ser, esut, oase, mduv, lichid
amniotic, etc.
n studiile de genetic molecular sursa
major o reprezint leucocitele sangvine.
Pornind de la civa mililitri de snge,
prelevat pe anticoagulant, se pot obine
cteva sute de micrograme de ADN.

Protocol de lucru
Protocolul este ajustat pentru izolarea ADN din 2 ml snge.
Se preleveaz sngele (2ml) n tuburi Falcon sterile de 50-15 ml si se adaug 7 ml BLB 1x.
Tuburile se in pe ghea 30.
Centrifugare la 2500 rpm, 10.
Se elimin supernatantul si se resuspend n 6 ml BLB.
Centrifugare la 2500 rpm, 10.
Se elimin supernatantul i se amestec cu 200 l BLB.
Centrifugare la 2500 rpm, 10.
Se elimin supernatantul i se resuspend n 100 l BLB.
Se adaug: 800 l WLB, 20 l Proteinaz K, 40 l SDS 20%. Se incubeaz peste noapte la
370C.
Se adaug 240 l de NCl 6M si se agit puternic 15 secunde.
Centrifugare 15 la 3500 rpm, fr frn.
Se recupereaz supernatantul n 40 l NaCl si se agit 15 secunde.
Centrifugare 15 la 3500 rpm.
Se adaug 4 ml etanol 100% pentru precipitare (rcit la 40C).
ADN se recupereaz cu o pipet pasteur n 200 l etanol 70% (rcit la 40C), ntr-un tub
eppendorf de 1,5 ml.
Se centrifugheaz 10 la 2500 rpm.
Se las etanolul s evapore .
Se resuspend ADN n 200 l TE.
Se pune pe baie de ap la 650C, 30 pentru inactivarea nucleazelor.
Se las ADN s resuspende la temperatura camerei.
Se pstreaz la -20C.

Reacia de polimerizare n lan

(PCR)

Reacia de polimerizare n lan (PCR) este definit ca o metod de

sintez i amplificare enzimatic in vitro a unor secvene de ADN
Reacia PCR este contituit din serii de trei pai eseniali, care
definesc un ciclu PCR:
- denaturarea ADN matri dublu catenar
- alinierea perechilor de primeri la matricele de ADN monocatenar
- extensia primerilor sub aciunea ADN polimerazei
ADN ce urmeaz a fi amplificat se afl n cantitate foarte mic i
este utilizat ca matri pe un sector limitat (ADN int), delimitat de
doi primeri, cu orientare opus, unul pe catena matri 5'-3 iar
cellalt pe catena matri 3'-5'. Primerii sunt reprezentai de
oligonucleotide sintetizate ,,in vitro", reprezentnd piese scurte de
ADN monocatenar, de numai 20-50 nucleotide lungime.

Denaturarea (la
temperatura de
94oC)

Etapa de asociere a
primerilor
(la temperatura de
54-60oC)
Etapa de elongare
(la temperatura de
72oC)
2 copii (dup un
singur ciclu)

Aplicaii ale tehnicii PCR

Identificarea si analiza mutatiilor in ADN.
Detectarea mutatiilor punctiforme cunoscute si
necunoscute, prin digestie cu endonucleaze de restrictie
a produsului amplificat.
Detectarea polimorfismelor ADN pentru depistarea
indirecta a mutatiilor producatoare de boli.
Pe baza metodei PCR au fost elaborate programe de
screening al familiilor in care exista predispozitie la
diabet zaharat, boli coronariene, hipertensiune arteriala,
precum si unele forme de cancer.
Rol important in diagnosticul prenatal si presimptomatic
al bolilor monogenice (boli cauzare de o sigura mutatie
genica)

Electroforeza

Este o metod care permite moleculelor ncrcate electric s

migreze n cmp electrostatic, spre polul de semn contrar

Metod standard de analiz a acizilor nucleici

Mobilitatea electroforetic este determinat de urmatorii factori:

concentraia de agaroz, conformaia moleculei de ADN, prezena
bromurii de etidiu n gel, tamponul de electroforez si voltajul
aplicat.

Pentru electroforez se folosesc geluri de:

agaroz
poliacrilamid

Protocol de lucru

Pentru prepararea a 200 ml de gel de agaroz 2% n soluie tampon TBE 0,5x, se

cntresc 4 grame de agaroz ntr-un vas gradat i se completeaz pn la volumul de
200 ml cu soluie tampon TBE. Se amestec bine.
Se nclzete soluia de agaroz pe o plit electric sau baie de ap
Dup formarea gelului, se las s rceasc pn la aproximativ 500C sau pn se
poate atinge vasul cu mna.
Se adaug bromura de etidiu, 10 l de soluie 10 mg/ml. Se amestec bine.

Se monteaz pieptenele

6. Se toarn gelul uor,

evitndu-se formarea de bule.

7. Dup ntrirea gelului acesta

se fixeaz n aparat, cu godeurile
poziionate la polul negativ.

8. La 10 l produs de PCR se
adaug 1 l de tampon de
ncrcare i se amestec.
9. Dac se observ plutirea
probelor nseamn c tamponul
de ncrcare nu are densitatea
necesar. Se poate folosi acelai
tampon dar ntr-o cantitate mai
mare.
10.Electroforeza se realizeaz la
100 V, 2-3 h, pn cnd albastrul
de bromfenol a parcurs 2/3 din
lungimea gelului.
11.Dup migrarea probelor, se
ndeprteaz gelul din aparat, i
se pune acesta pe geamul
transiluminatorului pentru
vizualizare.

Cel mai utilizat sistem de

electroforez n gel de
agaroz este cel pe
orizontal.

Cel mai utilizat sistem de

electroforez n gel de
agaroz este cel pe
orizontal.

 Metoda cea mai utilizat pentru vizualizarea ADN n gelurile de

agaroz i acrilamid este colorarea cu colorantul fluorescent
bromur de etidiu, care are proprietatea de a se intercala ntre
bazele stivuite din ADN

Secvenierea ADN

Secvenierea ADN const n stabilirea cu exactitate a succesiunii

nucleotidelor dintr-o anumit regiune genomic. n 1977 au fost
publicate dou metode diferite prin care se putea realiza
secvenierea ADN: metoda degradrii chimice Maxam-Gilbert i
metoda enzimatic Sanger.

Principiu:
- se sintetizeaz o caten de ADN complementar fragmentului, cu
secven necunoscut, utiliznd ADN polimeraza i o amors
rediomarcat.
- reacia poate fi inhibat n dreptul unui anumit nucleotid, prin folosirea
unor analogi nucleotidici de tipul didezoxinucleotidelor care au pierdut
gruparea 3OH.
- ADN polimeraza poate aduga un astfel de nucleotid, dar dup ce
acesta a fost ncorporat, reacia se oprete datorit absenei gruprii
3OH din didezoxinucleotid, necesar polimerizrii.
- se realizeaz fragmente cu o lungime egala distanei dintre amors i
locul unde s-a ncorporat un anumit didezoxinucleotid.

Molecula
de
ADN
ce
trebuie
secveniat este separat n cele dou
catene
Fiecare caten este clonat ntr-un
vector monocatenar, fiind inserat ntrun anumit situs, dup o secven
primer cunoscut i marcat radioactiv
sau fluorescent
Monocatenele de ADN servesc ca
matri pentru sinteza unei catene noi,
complementare,
folosind
ADN
polimeraza i nucleotidele necesare
sintezei.
Reacia se desfoara concomitent n
4 eprubete; n fiecare se va stabili
localizarea unui anumit nucleotid,
folosind ca analog inhibitor un anumit
didezoxinucleotid.
Ansamblul celor patru reactii poate fi
citit
pe
o
scara
(pozitionala
directionata), de la fragmentele mici la
cele mari.