Enzime artificiale

Exista astazi o serie de posibilitati pentru constructia unei enzime artificiale.

Acestea sunt in mod general polimeri sau oligomeri sintetici cu activitati
asemanatoare enzimelor, fiind adesea numite sinzime. In general ele sunt construite astfel
incat pot poseda doua entitati structurale, un situs pentru substrat si un situs cu activitate
catalitica efectiva. Experientele au aratat ca producerea situsului pentru legarea
substratului este relativ simpla in timp ce situsurile catalitice sunt oarecum mult mai dificil
de realizat. Ambele situsuri pot fi proiectate separat totusi se pare ca daca sinzima poate fi
constyruita cu un situs pentru starea de tranzitie a reactiei, acesta poate realiza adeseori
ambele functii.
In general sinzimele asculta de cineticile de saturatie Michaelis-Menten. Pentru o
reactie cu un substrat secventa reactiilor va fi:
sinzima + S  (complex sinzima-S) sinzima + P
Unele sinzime sunt simple proteine derivatizate. (Enzimele imobilizate covalent nu
intra in aceasta categorie.) Un exemplu este derivatizarea mioglobinei, transportorul de
oxigen din muschi, prin atasarea ionului (Ru(NH 3)5)3+ la trei resturi histidinice de pe
suprafata proteinei. Acest proces converteste enzima de la transportor de oxigen la o
oxidaza, care catalizeaza oxidarea acidul ascorbic folosind ca oxidant oxigenul molecular.
Aceasta sinzima este aproape la fel de eficace ca si ascorbat oxidazele naturale.
Este imposibil sa se proiecteze protein-sinzime pornind de la zero, adica direct din
aminoacizi liberi, cu oarece probabilitate de succes, caci in prezent conformatiile lor nu pot
fi prezise doar din structura lor primara. Asemenea proteine vor avea de asemenea si
neajunsurile enzimelor naturale fiind sensibile la denaturare, oxidare si hidroliza.
De exemplu polilizina leaga coloranti anionici ca si albumina serica, dar numai 10%
sunt la fel de puternic legati ca in cazul proteinei naturale, in ciuda faptului ca exista multe
sarcini si lanturi laterale apolare.
Acidul poliglutamic insa arata proprietati sinzimice mult mai apropiate de a unei
enzime naturale. Acesta actioneaza ca o esteraza, in mare masura ca si proteazele acide.
De exemplu pentru hidroliza acetatului 4-nitrofenil, prezinta o frumoasa curba pentru relatia
pH-activitate cu o activitate optima la circa pH = 5,3 si cinetici Michaelis-Menten cu o K m de
2mm si vmax de 10-4 la 10-5 s-1. `

1
 Ciclodextrinele (dextrinele Schardinger) sunt in mod natural molecule toroidale
formate din sase, sapte, opt, noua sau zece unitati de D-glucoza legate -1,4 si unite cap-
coada intr-un cerc [-, β-, -, - si ε- ciclodextrine respectiv: ele pot fi sintetizate din amidon
prin intermediul ciclomaltodextrin glucanotransferaza (EC 2.4.1.19) obtinuta din Bacillus
macerans]. Ciclodextrinele difera in diametre si cavitati (ce au valori in jur de 0,5 – 1 nm)
dar toate au in jur de 0,7 nm adancime. Acestea formeaza buzunare hidrofobice datorita
atomilor de oxigen glicozidici si gruparilor C-H indreptate spre fata interioara. Toate
gruparile C-6 hidroxil se proiecteza spre unul din capete si toate gruparile hidroxil C-2 si C-
3 spre celalalt. Caracteristica lor globala este hidrofilica, fiind solubile in apa, dar prezenta
buzunarului lor hidrofobic le permite sa lege molecule hidrofobice de marimi
corespunzatoare.
Ciclodextrinele sinzimice sunt in mod obisnuit derivatizate in scopul de a se
introduce grupari eficiente din punct de vedere catalitic. Au fost analizati numerosi astfel de
derivati. De exemplu, o grupare hidroxil C-6 a unei β-ciclodextrine a fost covalent
derivatizata printr-o piridoxal coenzima activata. Sinzima rezultata nu numai ca actioneaza
ca o transaminaza (schema de reactie I) dar arata de asemenea si o stereoselectivitate
pentru L-aminoacizi. Nu a fost totusi la fel de active ca si transaminazele naturale.

L-aspartat + 2-oxoglutarat oxaloacetat + L-glutamat

Polietilenimina este formata prin polimerizarea etileniminei pentru a forma o matrice

tridimensionala inalt ramificata. Circa 25% dintre aminele rezultate sunt primare, 50%
secundare si 25% tertiare.

2
 II
etilenimina polietilenimina
Aminele primare pot fi alchilate rezultand o serie de derivati. Daca 40% din aceste
sunt alchilate cu 1-iodododecan pentru a da situsuri legate hidrofobic si restul sunt alchilate
cu 4(5)-clorometilimidazol pentru a da situsuri catalitice, in general acido-bazice, sinzima
rezultata are 27% din activitatea -chimotripsinei fata de esterii 4-nitrofenil. Asa cum s-a
putut astepta din structura sa aparent intamplatoare, ea are o foarte scazuta specificitate
esterazica. Alte sinzime pot fi create in maniere similare.
Anticorpii aflati in starea de tranzitie ceruta de reactia lor specifica, pot actiona ca
sinzime. De exemplu, esterii fosfonati cu formula generala (R-PO 2-OR’)- sunt analogi stabili
ai starii de tranzitie ce apare in hidroliza esterilor carboxilici. Astfel anticorpii monoclonali
dezvoltati pentru imunizarea proteinelor conjugate, atasate covalent la acesti esteri
fosfonati, actioneaza ca esteraze. Specificitatile acestor anticorpi catalitici (de asemenea
numiti abzime) depind de structura lanturilor laterale (de exemplu R si R’ din (R-PO 2-OR’)- )
a antigenilor. Valorile Km sunt in general destul de joase, adesea in regiunea
micromoleculara. Valorile vmax sunt de asemenea mici (mai mici de 1 s-1), fiind totusi de
1000 de ori mai mari comparativ cu vitezele de hidroliza prin ionii hidroxil din mediu.
O strategie similara poate fi utilizata pentru producerea de sinzime prin ‘imprimarea’
moleculara a polimerilor, folosind prezenta unei stari de tranzitie analoaga formei de
polimerizare a rasinilor sau proteina non-enzima inactivate in timpul denaturarii termice.

Sisteme de Regenerare a Coenzimelor

Multe oxidoreductaze si toate ligazele utilizeaza coenzime (de exemplu NAD +,
NADP+, NADH, NADPH, ATP), care trebuie regenerate cu fiecare molecula de produs ce
se formeaza. Desi coenzimele sunt necesare pentru cele mai multe enzime utilizabile,
aplicatia lor este in prezent limitata in mod sever pe de o parte de inaltul cost al
coenzimelor si pe de alta de dificultatile de regenerare a acestora. Aceste doua probleme
ar putea fi insa depasite daca coenzima este imobilizata impreuna cu enzima si regenerate
in situ.

3
 O metoda simpla de imobilizare/regenerare a coenzimelor ar fi de utilizare a
intregului sistem celular fapt ce va conduce binenteles la o mai larga utilitate. Insa, asa
cum se cunoaste, imobilizarea coenzimelor impreuna cu enzimele conduce in general la o
eficienta si flexibilitate mai scazuta decat in cazul doar a sistemelor enzimatice imobilizate.
O solutie convenabila de imobilizare si a coenzimelor impreuna cu enzimele lor ar fi
reactoarele membranare. Acestea insa trebuie sa aibe dimensiunea porilor mai mica decat
diametrul coenzimelor corespunzatoare, fapt ce este extrem de restrictiv.
Pentru o imobilizare si regenerare adecvata coenzimele trebuie derivatizate. Cand
acest proces se poate aplica cu succes, coenzimele se ataseaza de suport fara ca functiile
lor biologice sa fie intr-un fel afectate. Calea sintetica cea mai larg aplicata implica
alchilarea azotului aminic exociclic N6- al adeninei prezenta in coenzimele NAD+, NADP+,
NADH, NADPH, ATP si coenzima A.
In unele aplicatii, asa cum sunt cele ce utilizeaza reactoare membranare, este
necesar doar ca dimensiuna coenzimei sa fie suficient de mare pentru a fi retinuta in
interiorul sistemului.
Derivatii cu greutate moleculara mare si solubili in apa, sunt mult mai utilizabili
deoarece ei depun o mult mai mica rezistenta difuzionala decat matricile insolubile.
Matricile insolubile larg folosite in aceste scopuri sunt dextranii, polietilenimina si
polietilen glicolii. Pentru a se permite o libertate de miscare suficienta si a se evita pe cat
posibil efectele inhibitoare, se considera ca trebuie atasate cantitati mici de coenzime la
acesti suporti pentru.
Proprietatile cinetice ale coenzimelor derivate variaza, depinzand de sistem, dar in
general constantele Michaelis sunt mai mari si vitezele maxime mai mici decat ale
coenzimelor native.
Coenzimele imobilizate pe suporti insolubili au cinetici oarecum mai putin favorabile
chiar si atunci cand sunt co-imobilizate aproape de situsul activ al enzimelor ce le
utilizeaza. Aceasta situatie se asteapta sa se imbunatateasca o data cu cresterea
informnatiei asupra conformatiei partii proteice ce inconjoara situsurile active ale enzimelor
si metodele de imobilizare vor deveni mai sofisticate. Insa costul unor asemenea derivati
ramane totusi ridicat asa incat acestia vor deveni viabili din punct de vedere economic doar
pentru productia unor produsi cu o valoare foarta inalta.

4
 Exista totusi cateva sisteme disponibile pentru regenerarea coenzimelor derivatizate
prin metode chimice, electrochimice sau enzimatice.
Regenerarea enzimatica este avantajoasa datorita inaltei sale specificitati. Totusi
pentru regenerarea dinucleotidelor oxidoreductazelor s-au dovedit competitive si
procedurile electrochimice.
Pentru a fi utilizabile in regenerarea coenzimelor, procesele enzimatice trebuie sa
utilizeze substraturi ieftine si enzime usor disponibile si sa dea produsi usor de separat si
care nu interfera cu procesul de regenerare. Astfel de exemple sunt format dehidrogenaza
si acetat kinaza, desi in prezent aceste preparate enzimatice comerciale au o activitate
scazuta:

III

IV

Tehnologia enzimelor este in prezent intr-o faza de maturare si evolutie.

Maturarea este aratata prin dezvoltarea teoriilor privind functionarea enzimelor si
aceste sunt legate de structura lor primara prin intermediul carora se configureaza
structura lor tertiara.

5
 Evolutia se manifesta prin marirea tot mai mult a domeniului de utilizare.
Exista totusi o serie de domenii de dezvoltare si procesare utila a materialelor,
descoperirilor care sunt inca destul de greu de inteles.
In orice caz este clar ca enzimele vor fi mult mai larg utilizate in viitor si aceasta se
va reflecta prin numarul mai mare de enzime disponibile pe plan industrial dar si pentru
cercetare, varietatea reactiilor catalizate si domeniul conditiilor de mediu in care acestea
vor lucra. Enzimele ce se obtin déjà in mod industrial vor fi utilizate in noi domenii.
De asemenea vor fi obtinute noi enzime, descoperite in nisele lor biologice sau
produse prin ingineria enzimelor, vor fi exploatate pentru catalize in reactii neexploatate
pana acum.
Se considera ca acum suntem tocmai in procesul de inceput a erei tehnologiei
enzimatice.