STUDII CLINICE I EXPERIMENTALE

STUDIU PRIVIND EFICACITATEA TERAPIEI FOTODINAMICE CU ACID 5-AMINOLEVULINIC N PSORIAZIS VULGAR

D. BODA*, ADRIANA DIACONEASA**, MONICA NEAGU**, HARILLAQ KALESHI****, L. VLDU****, SANDA POPESCU* Bucureti

Rezumat
Terapia fotodinamic (PDT) presupune interacia dintre un fotosensibilizator (acid 5 aminolevulinic-ALA, sau methilaminolevulinat-MAL), esutul activat de fotosensibilizator i lumin. n diverse aplicaii clinice ale PDT s-au utilizat numeroi fotosensibilizatori, precum i surse de lumin coerent (lasere) i necoerent (LED, lmpi). PDT poate fi o opiune terapeutic la pacieni cu forme de psoriazis localizat, rezistente la terapiile convenionale, ce nu necesit/sau nu vor terapii sistemice. Scopul acestui studiu a fost cuantificarea efectelor n vivo ale terapiei ALA-PDT, la pacieni cu forma localizat de psoriazis vulgar, pe culturi de keratinocite obinute nainte i dup terapia ALA-PDT, monitoriznd proliferarea i apoptoza cheratinocitelor. 10 pacieni cu vrste ntre 20-58 de ani au fost introdui n studiu, dintre care 4 de sex feminin i 6 de sex masculin. Culturile de keratinocite umane au fost obinute la 3 zile anterior terapiei ALA-PDT i la 3 zile dup terapie (10% ALA, la 2 ore de incubare, expunere la lampa OMNILUX 20 J/cm2, 16 min, 4 edine la interval de 7 zile). Proliferarea celular a fost evaluat indirect prin determinarea oxidazei intracelulare CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation kit (Promega) (Technical Bulletin #TB112). Apoptoza a fost evaluat prin testul FITC_anexina i propidium iodide. Evaluarea clinic s-a fcut calculnd scorurile PASI i BSA nainte i dup ultima edin ALA-PDT. Am obinut o reducere cu 52% a scorului PASI i 31% a scorului BSA, fr a obine vreo remisie complet. Reaciile adverse, prurit, eritem, edem au fost observate doar pe suprafeele expuse. Potenialul proliferativ al cheratinocitelor n cultura dup ALA-PDT este redus semnificativ iar apoptoza (celulele An+ i An+PI+) este crescut. Cuvinte cheie: terapie fotodinamica, acid aminolevulinic, psoriazis, apoptoz, proliferare keratinocitar.

Summary
Topical photodynamic therapy (PDT) involves application of a photosensitizer (5-aminolevulinic acid - ALA or methyl aminolevulinate MAL) followed by its activation by visible light. A wide range of photosensitizer and both coherent (lasers) and non-coherent (lamps and LEDs) light sources have been used to perform PDT on the specific application. PDT may offer a treatment alternative for patients with resistant psoriasis, who do not require or want systemic therapies and have localized psoriasis. The aim of the study was to evaluate the in vivo effects of PDT treatment in psoriasis vulgaris, on cultured keratinocytes before and after the treatment, monitoring the keratinocytes proliferation and apoptosis. 10 patients aged between 20-58 years, 4 women and 6 men, were enrolled in the study after signing an informed consent. Human primary keratinocyte cultures were obtained 3 days before and 3 days after ALA-PDT treatment (10% ALA, 2 hours, light exposure ~ 600-700nm - OmniluxTM 20 J/cm2, 16 min, 4 sessions 7 days interval). Cellular proliferation was evaluated indirectly by intracellular oxidase determination - CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation kit (Promega) (Technical Bulletin #TB112). Apoptosis was assessed with double labelling FITC-annexin and propidium iodide. Clinical evaluation was performed by calculating PASI and BSA before the first and after the last treatment. We obtained a 52% improvement of PASI and a 31% BSA reduction, with no total clinical remission. Adverse events were observed only on exposed site. Proliferative potential after ALA-PDT is markly reduced and apoptosis is increased (An+ cells and An+PI+ cells). Key words: photodynamic therapy, aminolevulinic acid, psoriasis, apoptosis, keratinocytes proliferation.

DermatoVenerol. (Buc.), 53: 85-90

* U.M.F. Carol Davila Bucureti. Grigore Alexandrescu Bucureti. *** Institutul Victor Babe Bucureti. **** Spitalul Colentina Bucureti.
** S.C.U.C.

85

DermatoVenerol. (Buc.), 53: 85-90

Introducere
Terapia fotodinamic n dermatologie Terapia fotodinamic (phodynamic therapy PDT) const n combinarea unui agent fotosensibilizant i a luminii vizibile n vederea distrugerii selective a celulelor tumorale sau a esuturilor proliferative. Substanele fotosensibilizante pot fi porfirine, chlorine, ftalocianine sau precursori de tipul acidului 5-aminolevulinic (5-ALA) i derivai ai si. Sub aciunea luminii cu lungime de und adecvat, substana fotosensibilizant decade din starea stabil elibernd astfel compui toxici, n special specii reactive de oxigen, care distrug cu precdere esutul bolnav. Acumularea selectiv a substanei fotoactive n celulele int se explic prin mai multe mecanisme: transport membranar aberant, activitate crescut a enzimelor din ciclul de sintez al hem, biodisponibilitatea fierului, proprieti ale stratului cornos, penetrare i distribuie tisular variabil. n dermatologie, se prefer terapia topic cu substan care penetreaz uor stratul cornos i se acumuleaz preferenial n tegument. Cei mai utilizai compui aprobai pentru PDT n multe ri, sunt acidul 5-aminolevulinic (ALA) i derivatul su metilat (metil-aminolevulinat). 5-ALA a fost introdus din anul 1982 i folosit cu succes n tratarea tumorilor cutanate. ALA induce sinteza de protoporfirin IX (PpIX) n celulele ncrcate cu acest compus (11). Sursele de lumin utilizate pentru activarea compuilor fotosensibilizani pot fi sursele de lumin coerent (lasere) sau de lumin non-coerent (lmpi i LED). Lumina albastr realizeaz o penetrare superficial, pe cnd cea roie una mai profund, permind astfel o diversitate a aplicaiilor terapeutice (5). Fotodistrugerea se realizeaz prin dou tipuri de mecanisme - un mecanism direct care determin deteriorarea celular ireversibil (apoptoz sau necroz) i un mecanism indirect care afecteaz componentele vasculare i ale sistemului imun. n prezent PDT cu 5-ALA este aprobat pe scar larg pentru tratamentul keratozelor actinice, epiteliomului bazocelular superficial i al bolii Bowen. Rezultate promitoare s-au obinut i n tratamentul altor dermatoze: psoriazis vulgar, sarcoidoz, sclerodermie localizat, acnee vulgar, condyloma acuminatum,

veruci vulgare, epidermodysplasia verruciformis, precum i n procedee de rentinerire cutanat (1). PDT n tratamentul psoriazisului vulgar Psoriazisul este o afeciune cutanat cronic, neinfecioas, care prezint o component inflamatorie i proliferativ i este determinat genetic. Rspndirea acestei maladii este larg, cu o inciden la nivelul ntregului glob ntre 1,5 i 4%. Fiziopatologic, caracteristice leziunii sunt hiperproliferarea i diferenierea anormal a keratinocitelor, infiltratul inflamator nsoit de modificri la nivelul vascularizaiei cutanate. Bazele moleculare ale patogeniei psoriazisului nu sunt elucidate n totalitate. Studiile realizate pe familii i gemeni monozigoi au confirmat implicarea componentei genetice n etiopatogenia psoriazisului. Totui, pentru ca boala s se exprime, este nevoie de prezena unor factori trigger (cum ar fi infecii, medicamente, stress, traumatism fizic asupra pielii). Actual, psoriazisul este considerat o boal cu determinism plurifactorial, care pentru a se exprima clinic necesit prezena unor factori genetici i de mediu. Boala are evoluie cronic, cu afectarea important a calitii vieii. Impactul asupra strii de sntate este unul major, din aceast cauz un arsenal de opiuni terapeutice este adoptat pentru majoritatea pacienilor. Opiunile terapeutice cuprind tratamentul topic keratolitic, emolient, reductor, sistemic imunomodulator, fototerapie, pn la noile terapii biologice cu rezultate bune, dar care sunt costisitoare i uneori sunt urmate de recderi la ntreruperea tratamentului. Experiena actual acumulat pe plan mondial recomand PDT ca metod alternativ de tratament n psoriazisul vulgar, rezervat n special cazurilor rezistente la terapie, care nu necesit, nu doresc sau nu pot urma tratament sistemic (7). n ce privete modul de aciune, Bissonnette et al. (2) au demonstrat inducerea apoptozei limfocitelor T n unele plci de psoriazis dup PDT cu ALA administrat oral. Fransson i Ros (6) au remarcat normalizarea markerilor de proliferare i difereniere, inclusiv citokeratin 16 i filagrin, n keratinocitele de la nivelul plcilor de psoriazis dup 2- 5 tratamente PDT cu ALA topic. Populaiile limfocitare

86

DermatoVenerol. (Buc.), 53: 85-90

dermale CD4(+) i CD8(+) au fost de asemenea n scdere substanial. n ce privete modul de aplicare al PDT n psoriazis, ALA topic pare mai sigur dect ALA sistemic, cu efecte adverse limitate la locul de aplicare: eritem, senzaie de arsur i prurit n primele 72 de ore dup aplicare. Este necesar decaparea prealabil a leziunilor cu scuam groas (3). Robinson et al. (14) propunea regimul terapeutic cu edine repetate, de energie mai sczut 2-8 j/cm2. Radakovic-Fijan et al (12) au evaluat comparativ trei protocoale terapeutice cu ALA topic i iradiere cu lumin 600-740 nm cu fluene diferite n trei loturi de studiu (5, 10 i 20 j/cm2). Dup edine repetate (de 3 ori pe sptmn, n total 12 edine sau mai puine n caz de dispariie a leziunilor), PSI (psoriasis severity index) a artat o scdere de 59% n grupul cu 20 j/cm2, fa de 49% respectiv 46% n grupurile cu 10 j/cm2 i 5 j/cm2. Diferena de eficacitate a fost semnificativ statistic mai mare n grupul cu 20 j/cm2.

Obiectivul studiului
Terapia fotodinamic reprezint o opiune promitoare n psoriazis, cu puine reacii adverse (reprezentate n principal de eritem i senzaie de arsur local) i mai puin costisitoare n comparaie cu terapia biologic, dar care necesit n continuare evaluri privind mecanismele de aciune, protocoalele de aplicare i cunatificarea eficacitii. n acest sens am realizat un studiu care a urmrit cuantificarea efectelor clinice ale terapiei fotodinamice asupra pacienilor cu psoriazis vulgar, forma sporadic localizat, precum i a efectelor n model experimental utiliznd culturi primare de keratinocite obinute de la pacienii luai n studiu, evalundu-se potenialul apoptotic i proliferativ nainte i dup instituirea PDT.

Material i metod
S-au selectat pacieni cu psoriazis vulgar forma n plci. Criterii de includere n studiu: aduli cu vrste ntre 18-60 ani, cu psoriazis vulgar, forma n plci; diagnosticul de psoriazis s fie confirmat prin examen histo-patologic; scor PASI < 8, BSA (body surface area) 10-20% (fr a lua n considerare leziunile de la nivelul capului); eec la cel puin alte dou metode terapeutice;

fr alte tratamente n ultimile 3 luni (cu excepia keratoliticelor i emolientelor, a cror utilizare a fost ncurajat); fr patologie asociat care s contraindice PDT. Pe baza criteriilor de includere, dintre pacienii Clinicii Dermatologie II, Spitalul Clinic Colentina, n perioada ianuarie 2007 - noiembrie 2007, s-a selectat un lot de 10 pacieni, cu urmtoarele caracteristici: 6 brbai i 4 femei; vrste cuprinse ntre 20 i 58 de ani. Lotul de pacieni constituit a fost tratat printr-un protocol de terapie ALA-PDT dup cum urmeaz: s-a utilizat ALA 10% topic la nivelul tuturor leziunilor cu excepia feei, timp de incubare de 2 ore, apoi expunere la radiaie luminoas ~ 600-700nm (OmniluxTM) la o fluen de 20 J/cm2, 16 min tratament, 4 edine de tratament la interval de 7 zile. La 6 pacieni s-au recoltat biopsii cutanate, de la nivelul unei leziuni int n prealabil alese, localizat preferabil la nivelul brae sau antebrae, nainte i la 3 zile dup ultima edin de terapie. Keratinocitele umane au fost izolate din biopsii de 3-6mm2 nainte i dup aplicarea terapiei, dup un protocol adaptat utiliznd 5 metodologii (4,8,9,10,13). Pentru testarea viabilitii celulelor separate din biopsii s-a utilizat kitul CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Technical Bulletin #TB163, Promega). De asemenea n paralel s-a utilizat pentru testarea viabilitii testul excluziei cu Tripan blue. Pentru a decela capacitatea proliferativ a keratinocitelor cultivate s-a utilizat un test indirect de cuantificare a oxidazelor intracelulare, prin testul reducerii srii de MTS, CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation kit (Promega) (Technical Bulletin #TB112), test care cuantific activitatea proliferativ prin cuantificarea numrului de celule viabile din cultura celular respectiv. Evaluarea proceselor apoptotice timpurii s-a realizat cu sistemul Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit I (BD Pharmingen). Pentru a diferenia stadiile apoptozei i necrozei, se utilizeaz n acelai sistem de detecie anexina V-FITC (Ann) i iodura de propodiu (PI) care este un colorant vital celular. Astfel celulele vii sunt dublu negative (Ann-/PI-), celulele aflate n apoptoza timpurie sunt Ann+/PI-, iar celulele care sunt n apoptoza trzie sau moarte sunt dublu pozitive (Ann+/PI+).

87

DermatoVenerol. (Buc.), 53: 85-90

Fig. 1. Pacient VP, leziuni coate nainte de PDT

Fig. 2. Pacient VP, leziuni coate la 48 h dup prima edin PDT

Fig. 3. Pacient VP la 5 zile dup a treia edin PDT

Evaluarea clinic a pacienilor s-a fcut iniial i la 1-3 zile dup fiecare edin PDT, prin calcularea PASI i BSA.

Rezultate
Se vor discuta dou categorii de rezultate: rspunsul terapeutic la ALA-PDT, cuantificat clinic prin efectele asupra PASI i BSA; efectele

PDT la nivel celular, reflectate prin modificarea potenialului proliferativ i apoptotic al keratinocitelor cultivate de la nivelul leziunilor de psoriazis, martori ai mecanismelor prin care ALA-PDT i exercit efectul terapeutic. Detaliem pozele nainte i dup terapia ALAPDT la 2 din pacienii cu psoriazis vulgar, forma sporadic localizat. Dup cele 4 edine ALA-PDT, PASI s-a mbuntit n medie cu 52%, iar BSA s-a redus n medie cu 31%. La niciun pacient nu s-a nregistrat remisiune total. Unul dintre pacienii aflai n studiu nu a tolerat tratamentul din cauza senzaiei de arsur intens i a eritemului, efectund numai prima edin de terapie. Un grad de eritem postterapeutic i senzaie de arsur a fost nregistrat la toi pacienii, dar nu s-au nregistrat alte reacii adverse. Capacitatea proliferativ a keratinocitelor primare post ALA-PDT este evident mai sczut fa de keratinocitele din leziunile iniiale (control). Dup 7-8 zile de la izolarea keratinocitelor din biopsiile cutanate supuse tratamentului, keratinocitele primare i pierd capacitatea proliferativ i nu mai pot fi meninute n cultur. Determinrile funcionale au fost realizate n primele 72-96 h de la izolare.

88

DermatoVenerol. (Buc.), 53: 85-90

Fig. 4, 5. Pacient NS cu leziuni pe feele de extensie al membrului superior nainte de PDT i la 5 zile dup prima edin PDT

Capacitatea proliferativ a keratinocitelor izolate din biopsii cutanate supuse terapiei ALA-PDT

Concluzii
Rezultatele clinice i studiile de biologie celular sunt convergente n sensul recomandrii PDT cu ALA topic ca i metoda terapeutic promitoare n psoriazis. Indicaia major o constituie cazurile cu forme limitate, dar rezistente la tratament i cu impact major psihosocial asupra pacienilor. Sunt necesare studii controlate ulterioare pentru evaluarea diverselor protocoale terapeutice n ce privete eficacitatea i limitarea efectelor adverse.
Intrat n redacie: 26 mai 2008

Gradul de apoptoz al culturilor celulare dup terapia cu ALA-PDT este modificat fa de control. Astfel, se constat o cretere marcant a procentului de celule An+ (apoptoza timpurie) i An+PI+ (apoptoza trzie sau necroz). Familia de fotosensibilizatori testat (ALA), nu interfer cu activitatea topoizomerazelor I i II, enzime implicate n replicarea ADN. Este posibil ca efectele nregistrate privind activarea cilor de apoptoz s nu fie legate de efectul direct asupra acizilor nucleici, ci s fie declanate de mecanisme membranare i/sau mitocondriale.

89

DermatoVenerol. (Buc.), 53: 85-90

Bibliografie
1. Babilas P, Karrer S, Sidoroff A, Landthaler M, Szeimies RM. Photodynamic therapy in dermatology-an update. Photodermatol Photoimmunol Photomed 2005;21:142-9. Bissonnette R, Tremblay J, Juzenas P et al. (2002) Systemic Photodynamic Therapy with ALA induces apoptosis in lesional T cell lymphocytes of psoriatic plaques. J Investig Dermatol 119:77-83. Boehnke W, Sterry W, Kaufmann R. (1994) Treatment of psoriasis by topical photodynamic therapy with polychromatic light. Lancet 343:801. Boyce ST, Methods in Molecular Medicine: Tissue Engineering Methods and Protocols, Morgan JR, Yarmush ML (Eds.), vol. 18, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 365-388, 1999. Brancaleon L, Moseley H. Laser and Non-laser Light Sources for Photodynamic Therapy. Laser Med Sci 2002;17:173-186. Fransson J, Ros A. (2005) Clinical and immunohistochemical evaluation of psoriatic plaques treated with topical 5-ALA PDT. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine 21:326-323. Goldman MP, Dover JS, Alam M. Photodynamic Therapy, second edition, 2008 Elsevier Inc. Gragnani A, Morgan JR, Ferreira LM. Experimental model of cultured keratinocytes. Acta Cir Bras, 2003 Vol 18 Special Edition, http://www.scielo.br/acb. Green H, Kehinde O, Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple 10.

2.

11.

3.

4.

12.

5.

13.

6.

14.

7. 8.

15.

16.

9.

epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci 1979;76:5665-9. Green H. Cultured cells for the treatment of disease: The successful growth of human skin cells in culture has made it possible to restore epidermis after severe burns and other forms of damage. Sci Am 1991 265(5); 96-102. Kennedy JC, Marcus SL, Pottier RH. Photodynamic therapy (PDT) and photodiagnosis (PD) using endogenous photosensitization induced by 5-aminolevulinic acid (ALA): mechanisms and clinical results. J Clin Laser Med Surg 1996;14:289304. Radakovic-Fijan S, Blecha-Thalhammer U, Schleyer V et al. (2005) Topical ALA PDT as a treatment option fot psoriasis? Results of a randomized, observer blinded study. Br J Dermatol 152:279-283. Radu E, Simionescu O, Regalia T, Dumitrescu D, Popescu LM. Stem cells (p63+) in keratinocyte cultures from human adult skin, JCMM, 2002, 6(4):593-8. Robinson D, Collins P, Stringer M et al. (1999) Improved response of plaque psoriasis after multiple treatments with topical ALA-PDT. Acta Dermato Venerologica 79:451-455. Technical Bulletin #TB112, CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation kit, Promega Corporation. Technical Bulletin #TB163, CytoTox 96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay kit, Promega Corporation.

90