UNIVERSITATEA TEHNIC CLUJ-NAPOCA

CENTRUL UNIVERSITAR NORD

BAIA MARE



METODE CROMATOGRAFICE DE
SEPARARE










Metode de analiza





2013

DETERMINAREA LIPOFILICITII UNOR
ANTIOXIDANI I NDULCITORI PRIN
METODE
CROMATOGRAFICE I METODE
COMPUTAIONALE






- Autor

RODICA DOMNICA BRICIU
Cluj-Napoca, 2010













Cuvinte Cheie:
Lipofilicitate
Vitamine lipofile
Flavonoide
ndulcitori
Cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC)
Cromatografie pe strat subire de nalt performan (TLC)
Faze stationare cromatografice impregnate
Analiza componentelor principale (PCA)




Introducere

Lipofilicitatea este definit de IUPAC ca fiind afinitatea unei
molecule sau a unui amestec de compui pentru un mediu lipofil,
determinarea valoric a acesteia fiind o consecin a comportamentului
de distribuie ntr-un sistem bifazic, fie lichid-lichid, fie lichid-solid.
Importana acestui parametru se regsete n contextul monitorizrii
comportamentului n mediu biologic al unui compus dat, ntruct se
consider c valoarea lipofilicitii descrie indirect procesul de adsorbie,
distribuie, metabolizare i eliminare (ADME). Exist mai multe
posibiliti de determinare a lipofilicitii, ns tehnicile cromatografice
sunt cu desvrire cele mai reprezentative. Posibilitatea abordrii mai
multor tehnici cromatografice n vederea estimrii
lipofilicitii prezint un avantaj semnificativ datorit faptului c
rezultatele obinute prin mai multe metode pot s se valideze reciproc.



Scopul lucrrii

Scopul aceste lucrri este s ofere o caracterizare pertinent a unora
dintre cele mai
importante grupuri de compui cu o importan relevant n domeniul
alimentar i farmaceutic. De asemenea, cromatografia de lichide i
cromatografia pe strat subire vor fi analizate n contextual investigrii
lipofilicitii, determinndu-se particularitile specifice. Un numr larg
de indici de lipofilicitate teoretici i experimentali vor fi investigai,
caracterizai i comparai ntre ei.
Prin intermediul cromatrografiei pe strat subire, folosindu-se
posibilitile de impregnare a plcilor normale de silicagel cu diverse
uleiuri i grsimi naturale, incluznd aici i grsimea uman, se dorete
elucidarea mai corect a modului de aciune biologic a acestor compui.
De asemenea, folosindu-se Analiza Componentelor Principale (PCA), se
va efectua o analiz pertinent n vederea stabilirii nivelului caracterului
lipofil al grsimilor i a uleiurilor, pentru a arta care dintre grsimile i
uleiurile studiate sunt mai apropiate de grsimea uman.
Determinrile cromatografice a lipofilicitii au creat un fundament n
experimentele QSAR, pornindu-se de la supoziia c fazele staionare
inverse pot fi asociate cu membranele biologice reale. Totui,
complexitatea real regsit la nivel celular nu poate fi reprodus, fapt
ce duce la necesitatea abordrii unor noi alternative. Aceast posibilitate
poate veni dintr-un domeniu cromatografic neexplorat n acest domeniu
i anume cromatografia pe strat subire, folosindu-se plci impregnate.
Posibilitatea de impregnare cu diverse uleiuri i grsimi a plcilor de
silicagel vine s susin i s ofere noi alternative. Rezultatele obinute
pe grsimea uman vor susine relevana experimentelor realizate.
Aceste rezultate, alturi de cele obinute prin HPLC vor crea pentru
prima dat o ierarhie real, att a compuilor implicai n acest studiu,
ct i a fazelor staionare, inclusiv a uleiurilor, respectiv a grsimilor
folosite la impregnare. Literatura de specialitate nu prezint determinri
similare sau nrudite, astfel c trebuie apreciat faptul c att clasele de
compui investigate, folosirea de plci impregnate cu diverse materiale
lipofile, ct i o parte din metodologiile de investigare a rezultatelor
obinute au fost aplicate aici pentru prima dat.



Materiale i aparatur

Toate materialele folosite au respectat condiiile de calitate analitice.
Cromatografia de lichide a vitaminelor i a flavonoidelor s-a realizat
folosindu-se un sistem cromatografic Agilent 1100 Series cuplat cu
spectrometru de mas MSD 1100, n timp ce ndulcitorii au fost analizai
pe un cromatograf de lichide Agilent 1200 Series cuplat la un
spectrometru de mas n tandem 4000 Q TRAP LC-MS/MS.


Cromatografie

1.Vitaminele lipofile
Vitaminele lipofile au fost analizate prin HPLC i TLC folosindu-se
mai multe tipuri de faze staionare chimic legate, iar n cazul TLC s-au
introdus o serie de faze staionare obinute n urma impregnrii cu
uleiuri sintetice (parafin i trioxtilamina) i uleiuri vegetale (msline,
floarea soarelui i porumb). Condiiile de eluie sunt prezentate n
Tabelul 1.




Tabel 1. Sistemele de faz mobil corespunztoare diferitelor faze staionare
investigate.

Nr
Faz staionar Faz mobil

MeOH (%)
HPLC
1 Lichrosphere RP-18e 86-90: variabilitate de 1%
2 Eclipse XDB-CS 86-90: variabilitate de 1%
TLC
1 RP-18 95-99: variabilitate de 1%
2 RP-18W 89-97: variabilitate de 2%
3 CN 71-83: variabilitate de 3%
4 Parafin 90-94: variabilitate de 1%
5 TOA 92-98: variabilitate de 2%
6 Msline 90-98: variabilitate de 2%
7 Floarea Soarelui 90-98: variabilitate de 2%
8 Porumb 90-98: variabilitate de 2%


2. Flavonoidele
Flavonoidele au fost analizate prin HPLC i TLC folosindu-se un
numar mare de faze staionare, unele obinute n urma impregnrii cu
uleiuri sintetice (parafina i trioctilamina), uleiuri vegetale i produse
derivate (msline, floarea soarelui, porumb i margarina) i grsimi
animale (ulei de cod, unt, grsime de oaie, grsime de gin, grsime de
porc i grsime uman). Sistemele de faze mobile folosite pentru eluia
fazelor staionare luate in considerare sunt prezentate n Tabelul 2.
Tabel 2. Sistemele de faz mobile corespunztoare diferitelor faze staionare
investigate.
Nr Faz staionar Faz mobil MeOH (%)
HPLC
1 LiChrosphere RP-lSe 70-80: variabilitate de 2.5%
2 Eclipse XDB-CS 70-80: variabilitate de 2.5%
3 Lichrosphere 100CN 66-70: variabilitate de 1%
TLC
1 RP-18 65-85: variabilitate de 5%
2 RP-18 W 55-75: variabilitate de 5%
3 CN 50-70: variabilitate de 5%
4 NH2 20-40: variabilitate de 5%
5 Parafin 50-70: variabilitate de 5%
6 TOA 50-70: variabilitate de 5%
7 Msline 50-70: variabilitate de 5%
8 Floarea Soarelui 50-70: variabilitate de 5%
9 Porumb 50-70: variabilitate de 5%
10 Margarina 50-70: variabilitate de 5%
11 Unt 50-70: variabilitate de 5%
12 Cod 50-70: variabilitate de 5%
13 Porc 55-75: variabilitate de 5%
14 Gin 55-75: variabilitate de 5%
15 Oaie 55-75: variabilitate de 5%
16 Om 50-70: variabilitate de 5%



3. ndulcitorii
ndulcitorii au fost analizai n vederea investigrii lipofilicitii prin
TLC pe faze staionare chimic legate (RP-18, RP-18W, RP-8, CN i
NH2) i faze staionare impregnate (parafin, msline, floarea soarelui,
porumb, ricin, margarin, unt, cod, porc, gin, oaie, om). Faza mobil a
fost amestecuri de acetonitril (ACN): apa, n care fracia de ACN a
variat ntre 85 i 95%, schimbate cu 15 incremente de 2.5%, cu excepia
plcilor de NH2, unde intervalul ales a fost ntre 65 i 85% schimbat cu
incremente de 5% pentru fiecare pas. Pentru fazele staionare impregnate
procentul de ACN a fost ntre 70 i 90%, schimbate cu incremente de
5%.
Analiza HPLC a ndulcitorilor a avut ca scop modelarea reteniei
cromatografice a zaharidelor. Pentru aceasta zaharidele au fost analizate
pe o coloan cromatografic Supelcosil NH2. Eluiile s-au realizat n
mod izocratic cu cinci faze mobile constnd din amestecuri ACN: ap,
unde procentul de ACN a variat ntre 80-90%.










Studiul i caracterizarea cromatografic a vitaminelor, a
flavonoidelor i a ndulcitorilor


1.Vitamine lipofile

A B

C D

Figurile 1-4.Reprezentarea grafic a variabilitii valorilor log k i

n funcie
de concentraia modificatorului organic. A: HPLC RP-18, B: RP-18W, C: TOA,
D: Msline.
Se observ clar faptul c -carotenul i licopenul au de departe cele
mai ridicate valori ale lipofilicitii. Structura simetric a acestor dou
molecule i faptul c prezint o mas molecular mare i fr gruprii
funcionale polare le susine ca fiind cele mai lipofile.
Chiar dac mrimea moleculelor este asemntoare carotenilor,
prezena oxigenului n molecul cauzeaz un efect polar puternic, care
rezid n valorile indicilor de lipofilicitate.
Dintre compuii studiai n acest experiment, retinoidele prezint cel
mai sczut caracter lipofil. Aceasta este o consecin a mrimii
moleculei i a prezenei gruprilor funcionale hidroxil, carboxil i
carbonil din molecule.
Tendina compuilor de a interaciona sau nu cu faza staionar i
implicit variaia parametrilor cromatografici odat cu schimbarea
procentului de modificator organic din faza mobil se poate observa din
extrasul din figurile de mai sus.
Analiznd n detaliu graficele expuse se observ c nu exist anomalii
n comportamentul cromatografic, acesta fiind unul liniar, respectndu-
se o cretere proporional a valorilor logk i

n funcie de fracia de
modificator organic din faza mobil.




2. Flavonoide
Flavonoidele studiate au fost compui metil, metoxi i hidroxi derivai.
Indici de lipofilicitate obinui indic faptul c derivai metil sunt cei
mai lipofili, urmai de cei metoxiderivai i de compui hidroxi derivai.
Compui poli-hidroxi derivai sunt mult mai hidrofili.

A B

C D
Figurile 5-8. Reprezentarea grafic a variabilitii valorilor log k i RM n
funcie de concentraia modificatorului organic: A: HPLC RP-18, B: RP-18,
C: Porumb, D: Om.
Comportamentul cromatografic al flavonoidelor odat cu schimbarea
raportului de faz mobil s-a artat a fi unul echilibrat, mecanismul de
retenie fiind unul unitar pe tot intervalul de 25 faz mobil ales,
indiferent dac fazele staionare au fost foarte diferite, remarcndu-se
similariti ntre fazele staionare chimic legate i cele obinute prin
impregnare.





Figura 9-12. Profilele de corelaie a valorilor RM0 obinuti prin TLC.
Se remarc similitudini ridicate intre diversele faze staionare, nsa
cele mai asementoare sunt uleiurile i grsimile, inluznd aici i
grsimea uman. Diagramele obinute permit remarcarea unui
comportament diferit al compuilor pe plcile impregnate cu TOA,
care a facilitat interaciuni puternice cu flavonoidele ce prezint grupri
funcionale metoxil i metil, i interaciuni mult mai slabe cu derivai
hidroxil. Acest comportament observat susine nc odat aprecierile
prezentate pentru vitamine.


Concluzii


Vitaminele lipofile

Indicii de lipofilicitate obinui pentru vitaminele lipofile au avut
valori foarte mari, distingndu-se dintre acetia carotenii ca fiind
cei mai lipofili (-caroten > licopen), urmai de tocoferoli (-
tocoferol > -tocoferol > -tocoferol), xantofile (lutein
zeaxantin > astaxantin) i retinoide (all-trans retinal 9-cis
retinal > acid retinoic > retinol).
Lipofilicitatea vitaminelor depinde n foarte mare msur de
prezena gruprilor funcionale polare (hidroxil) n molecul, de
numrul i respectiv poziia acestora.
Cei mai reprezentativi indici de lipofilicitate obinui au fost
mediile parametrilor de retenie i scorurile dup primele
componente principale obinute n urma analizei componenetelor
principale.
Hrile de lipofilicitate folosite pentru gruparea i estimarea
caracterului lipofil al vitaminelor lipofile au condus la grupuri i
clusteri liniari care sunt n mare concordan cu particularitile
structurale ale compuilor.

Flavonoidele


Flavonoidele au fost investigate din punct de vedere al
lipofilicitii prin cromatografie de lichide de nalt eficien (RP-
18, RP-8 i CN) i prin cromatografie pe strat subire, folosindu-se
plci chimic legate (RP-18, RP-18W, CN i NH2) i plci
impregnate cu uleiuri sintetice (ulei de parafin i TOA), uleiuri
vegetale i produse derivate (ulei de msline, ulei de floarea
soarelui, ulei de porumb i margarin) i grsimi animale (unt, ulei
de cod, grsime de om, grsime de porc, grsime de oaie, grsime
de gin).
Comportamentul cromatografic al flavonoidelor pe toate fazele
staionare a fost unul uniform de cretere odat cu creterea
concentraiei modificatorului organic din fazele staionare,
excepie fcnd comportamentul observat pe plcile NH2 unde
derivaii hidrozil au artat un comportament cresctor, n timp ce
derivai metoxilai i cei metilai au condus la valori mai mici ale
parametrilor de retenie.
Flavonoidele studiate au condus la indici de lipofilicitate grupai n
funcie de tehnica folosit (HPLC sau TLC) i n funcie de natura
fazelor staionare (chimic legate sau impregnate).
Plcile impregnate cu TOA folosite la investigarea vitaminelor
lipofile i a flavonoidelor au condus la un comportament puin
diferit fa de restul plcilor investigate. S-a remarcat faptul c
interaciunea compuilor cu faza staionar variaz foarte mult
odat cu creterea numrului de grupri hidroxil din molecule.






Bibliografie selective

http://goldbook.iupac.org/LT06965.html
2. J. Sangster, Octanol-water partition coefficients of simple organic compounds J.
Phys. Chem. Ref. Data 1998, 18, 1111-1229.
3. D. Casoni, A. Kot-Wasik, J. Namiesnik, C. Srbu, Lipophilicity data for some
preservatives estimated by reversed-phase liquid chromatography and different
computation methods, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 2456-2465.
4. R.D. Briciu, A. Kot-Wasik, J. Namiesnik, C. Srbu, A comparative study of the
molecular lipophilcity indices of citamins A and E and of some precursors of
vitamin A, estimated by HPLC and by different computation methods, Acta
Chromatogr. 2009, 21, 237-250.
5. L.R. Snyder, J.J. Kirkland, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd
Ed. John Wiley and Sons, New York, USA, 1979.
6. R.D. Briciu, D. Casoni, Lipophilicity estimation of some flavonoids by reverse
phase thin-layer chromatography, Acta Universitatis Cibiniensis, Serie F Chemia,
2008, 11, 71-81.
7. D. Casoni, R.D. Briciu,Lipophilicity of parabens estimated by reverse-phase
high performance thin-layer chromatography and different computation methods,
Acta Universitatis Cibiniensis, Serie F Chemia, 2008, 11, 71-81.
8. R. Kalizsan, Structure and Retention in Chromatography: A Chemometric
Approach,
Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1997.
9. P. Haber, T. Bauczek, R. Kaliszan, L.R. Snyder, J.W. Dolan, C.T. Wehr,
Computer simulation for the simultaneous optimization of any two variables and
any chromatographic procedure, J. Chromatogr. Sci. 2000, 38, 386-392.
10. K. Valko, R.L. Snyder, J.L. Glajch, Retention in reversed-phase liquid
chromatography as a function of mobile-phase composition, J. Chromatogr. A,
1993, 656, 501-520.
11. T. Kowalska, K Kaczmarski, W. Prus, Theory and mechanism in thin-layer
chromatography, In J. Sherma, B. Fried (Eds.), Handbook of Thin Layer
Chromatography, Marcel Dekker, New York, USA, 2003, pp. 47-80.
12. E.C. Bate-Smith, R.G. Westall, Chromatographic behavior and chemical
structure I. Some naturally occuring phenolic substances, Biochem. Biophys. Acta
1950, 4, 427-440.
13. E. Soczewinski, C.A. Wachtmeister, The retention between the composition of
certain ternary two-phase solvent systems and RM values, J. Chromatogr.A. 1962,
7, 311-320.
14. K. Valk, P. Segel, New chromatographic hydrophobicity indices (0) based
on the slope and the intercept of log k versus organic phase concentration plot, J.
Chromatogr. A 1993,
631, 49-61.
15. C.M. Du, K. Valk, C. Bevan, D. Reynolds, Rapid gradient RP-HPLC method
for lipophilicity determination: A solvation equation based comparison with
isocratic methods, Anal. Chem. 1997, 70, 4228-4234.
16. I.V. Tetko, Prediction of phisicochemical properties, In S. Ekins (Eds.), Risk
Assessment for Pharmaceutical and Environmental Chemistry, John Wiley and
Sons, New Yersy, USA, 2007, pp. 241-275.
17. R. Mannhold, G.I. Poda, C. Ostermann, I.V. Tetko, Calculation of molecular
lipophilicity: State of the art nd comparison LogP methods on more than 96000
compounds, J. Pharm. Sci. 2009, 98, 861-893.
18. G.L. Biagi, A.M. Barbaro, M.C. Guerra, G. Gantelli-Forti, M.E. Fracasso,
Relation between and RM values of sulfonamides, J. Med. Chem. 1974, 17, 28-
33.
19. H. F. Pop, C. Srbu, A new fuzzy regression algorithm, Anal. Chem. 1996, 68,
771-778.
20. A. G. Gonzles, M. A. Herrador, A. G. Asuero, Intra-laboratory testing of
methos accuracy from recovery assays, Talanta, 1999, 48, 729-736.