LP 4

Examenul microscopic în diagnosticul bacteriologic. Coloraţii utilizate în bacteriologie

Obiective: La sfârşitul acestei lucrări practice studenţii trebuie:

1. Să identifice părţile unui microscop optic şi să il manipuleze corect în scopul efectuării
unui examen microscopic.
2. Să cunoască etapele efectuării unui preparat microscopic în laboratorul de
microbiologie (preparat umed, frotiu).
3. Sa cunoască tipurile de coloratii utilizate în microbiologie.
4. Să cunoască etapele coloraţiei Gram şi să interpreteze rezultatele controlului de calitate
al acesteia.
5. Să cunoască importanţa medicală a coloraţiei Gram.
6. Să descrie corect caracterele morfo-tinctoriale ale bacteriilor observate la examenul
microscopic al unui frotiu colorat.
7. Sa cunoască avantajele şi dezavantajele examenului microscopic

Microscopul optic este format din:

¾ o parte mecanică (talpa, corpul ansamblului mişcărilor: braţul microscopului, suportul
condensorilor, masa port obiect);
¾ sistemul optic (obiective, oculare);
¾ sistem de iluminare.

Puterea de mărire a unui microscop = produsul dintre puterea de mărire a obiectivului, a

ocularului şi a capului binocular (pentru microscoapele binoculare).

Preparate microscopice

a. Preparate microscopice umede

Metoda este indicată pentru observarea rapidă a:

¾ motilităţii microorganismelor
¾ spirochetelor (microscopia pe fond întunecat)
¾ fungilor
¾ protozoarelor
¾ elementelor celulare şi necelulare (în produse patologice).

Tehnica:
¾ Se pune o picatură din produsul de examinat pe o lamă curată şi degresată
¾ Se acoperă picătura cu o lamelă
¾ Se aşează preparatul pe masa port-obiect a microscopului
¾ Se alege obiectivul adecvat: scrutarea preparatului cu obiectiv de 10X, observarea
detaliilor cu obiectivul de 20X sau 40X (NU se utilizeaza obiective cu imersie)
¾ Se reglează iluminarea cu închiderea diafragmei de apertură până la obţinerea celui
mai bun constrast.
¾ După examinare se depune preparatul într-un recipeint cu soluţie dezinfectantă.
 Interpretare:
¾ Un organism este mobil când îşi modifică poziţia faţă de un reper din vecinătate

b. Preparate microscopice colorate

Principiu:
¾ Fixarea coloranţilor pe structura protoplastului permite observarea detaliilor
morfologice;
Indicaţii:
¾ Evidenţierea caracterelor morfologie ale bacteriilor (mărime, formă, aşezarea, unele
structuri speciale)
¾ Evidenţierea afinităţii tinctoriale (în coloraţiile diferenţiale).

Frotiul

Definiţie:
¾ Frotiul este materialul microbian (produs patologic, cultură microbiană) etalat în strat cât
mai subţire şi uniform pe suprafaţa unei lame de microscop.

Etapele efectuării frotiului.

1. Etalarea.
¾ Cultură bacteriană în mediu lichid – se prelevă aseptic cu ansa o picătură şi se
etalează în centrul lamei, în strat cât mai subţire, prin mişcări circulare,
excentrice, pe o suprafaţa de 1-2 cm2 , fără a atinge marginile lamei
¾ Cultură bacteriană de pe mediu solid – se prelevă cu ansa o secţiune din colonie şi
se pune în centrul lamei lângă o picătură de apă distilată sterilă. Se omogenizează
progresiv cultura depusă în picătura de apă şi se etalează.
2. Uscarea.
¾ Uscare spontană la temperatura camerei
¾ Uscare rapidă a frotiului în aer cald deasupra unui bec de gaz
3. Fixarea
¾ Se trece lama, cu frotiul în sus, câteva secunde prin flacăra unui bec de gaz; dosul
mâinii trebuie să suporte atingerea lamei astfel încălzite.

După realizarea frotiului, acesta se colorează i se examinează la microscop după uscare.

Tipuri de coloraţii:
¾ simple: albastru de metilen- evidenţiază morfologia bacteriilor, aşezarea, prezenţa în PP
a celulelor inflamatorii
¾ diferenţiale: Gram şi Ziehl Neelsen – evidenţiază morfologia bacteriilor şi afinitatea
tinctorială
¾ speciale (flageli, spori, incluzii)
Coloraţia Gram

Principiu: Peretele bacterian nu este colorabil, dar prin structura sa chimică condiţionează
colorabilitatea protoplastului în coloraţiile diferenţiale.
Bacteriile Gram pozitive rezistă la decolorarea cu amestecul alcool-acetonă şi rămân colorate
violet, cele Gram negative se decolorează si, pentru a fi observate, trebuie recolorate în roşu.

Etapele coloraţiei diferenţiale Gram:

Nr. Etapa Descrierea etapei Bacterii Bacterii

crt gram gram
pozitive negative
1 Colorarea violet de metil, un minut, se spală Violet Violet
2 Mordanţarea Lugol, două minute, se varsă . Violet Violet
Nu se spală!
3 Diferenţierea amestec alcool acetonă, 5-10 secunde, spală. Violet Incolor
4 Recolorarea soluţie de fucsină fenicată Ziehl diluată Violet Roşu
1/10, 30 secunde, se spală.

Rezultat:
¾ bacterii gram pozitive = violet
¾ bacterii gram negative = roşii

Controlul de calitate
Frotiu martor - suspensie care conţine un amestec de bacterii gram pozitive şi bacterii
gram negative (ex: coci gram pozitivi şi bacili gram negativi)
Pe frotiurile efectuate din produs patologic, leucocitele sunt întotdeauna roşii.
• Leucocite roşii şi bacterii gram pozitive = coloraţie Gram bine efectuată
• Leucocite roşii şi bacterii gram negative= trebuie să examinăm frotiul martor
Surse de eroare:
subdecolorarea – bacteriile Gram negative apar violet
supradecolorarea – bacteriile Gram pozitive apar roşii

Importanţa medicală a coloraţiei Gram

• Prima etapă în identificarea bacteriilor

• Orientează antibioterapia de primă intenţie
• Permite alegerea celui mai adecvat mediu de cultură pentru însămânţare

Microscopia cu imersie şi descrierea unui frotiu

Examinarea :
Se pune o picătură de ulei de cedru pe regiunea de examinat a frotiului. Se roteşte capul
revolverului şi se aduce în axul microscopului obiectivul cu imersie. Privind din lateral, se
coboară atent tubul microscopului, manipulând macroviza până la contactul lentilei frontale a
obiectivului cu picătura de ulei de cedru, cât mai aproape de lamă. Ulterior, privind prin ocular,
se ridică lent tubul microscopului cu ajutorul macrovizei, până la obţinerea imaginii. Se
focalizează imaginea cu ajutorul microvizei.

Descrierea caracterelor microscopice ale bacteriilor:

-forma – coci
- bacili, etc

-variaţia formei- coci rotunzi ( stafilococi, streptococi), ovali (streptococi), lanceolaţi

(pneumococi), în boabă de cafea (neisserii).
- bacili cu capetele rotunde, cu capetele tăiate drept (Bacillus spp.),
cu capetele măciucate (bacilii difterici)

-aşezarea: în grămezi (stafilococii), în lanţuri (streptococii), în diplo (pneumococii,

neisserii), în litere chinezeşti (bacilii difterici)

-mărime relativă: mic, mare

-afinitatea tinctorială (în coloraţiile diferenţiale): gram pozitiv, gram negativ

-prezenţa capsulei (nu se colorează în coloraţia Gram şi apare ca un halou incolor în jurul
bacteriei): capsula pneumococilor

- prezenţa sporului: forma: oval (Bacillus spp., Clostridium spp.), sferic (C.tetani)
aşezare: central (Bacillus spp), terminal (C. tetani), subterminal
(Clostridium spp)
dimensiune: mai mare decât bacteria care l-a format (deformează
bacteria - Clostridium spp), mai mic decât / egal cu bacteria care l-a format (nu deformează
bacteria - Bacillus spp).
Avantajele examenului microscopic:
¾ Permite o depistare rapida a microorganismelor;
¾ Are un cost redus;
¾ Este uşor de efectuat;
¾ Orientează următoarele etape de diagnostic microbiologic;
¾ Se pot evidenţia bacterii necultivabile sau care cresc lent;
¾ Ofera informaţii semicantitative (1 bacterie/câmp ~ 105 UFC/ ml)
Dezavantajele examenului microscopic:
¾ Sensibilitatea redusă.
¾ Nu permite întotdeauna identificarea până la nivel de specie.

Bibliografie: pag. 32-38