Cromatografia

Definiţie: Cromatografia cuprinde o familie de metode fizico-chimice de separare,

analitică sau preparativă, a amestecurilor complexe de molecule, bazate pe distribuţia
repetată a moleculelor între o fază mobilă şi una staţionară. Se produce o mişcare a fazei
mobile într-o migrare diferenţiată a moleculelor de-a lungul fazei staţionare. Pe parcursul
sistemului cromatografic se stabileşte de mai multe ori echilibrul dintre cele două faze.
Lungimea corespunzătoare stabilirii unui echilibru, referitoare la o componentă a amestecului,
se numeşte lungimea unui taler teoretic. Condiţia unei separări bune este ca lungimea
talerelor teoretice să fie mică pentru toate componentele amestecului şi procesul, în
totalitate, să cuprindă un număr cât mai mare de talere.
Criterii de clasificare:
a) Clasificare după starea fizică a fazelor staţionară şi mobilă care constituie sistemul
cromatografic:
a.1). faza staţionară solidă:
- faza mobilă gaz: cromatografie gaz - solid (CGS)
- faza mobilă lichid: cromatografie lichid - solid (CLS)
a.2). faza staţionară lichidă:
- faza mobilă gaz: cromatografie gaz - lichid (CGL)
- faza mobilă lichid: cromatografie lichid - lichid (CLL)
b) Clasificare după natura interacţiunilor dintre componentele amestecului şi fazele
mobilă şi/sau staţionară.
b.1). Cromatografia de adsorbţie (CA):
 În cromatografia de adsorbţie faza staţionară este un solid (cu grupari polare), iar faza
mobilă este o soluţie apoasă sau neapoasă (cu grupari polare si nepolare).
 Moleculele polare din faza stationara solida stabilesc interacţiuni hidrofobe dipol-
dipol, forţe van der Waals, legături de hidrogen cu moleculele polare din faza mobila
care sunt RETINUTE.
 Moleculele NEpolare din faza mobila NU interactioneaza cu componentele polare ale
fazei stationare.
 Procesul de adsorbţie-desorbţie este repetat de multe ori. Viteza de mişcare a moleculelor
depinde de gradul lor de adsorbţie la suportul solid. Cei mai mulţi dintre adsorbanţi
trebuie activaţi prin încălzire la 110-120 0C înainte de utilizare deoarece capacitatea lor de
adsorbţie scade în prezenţa apei legate. Cromatografia de adsorbţie poate fi realizată în
coloană sau pe strat subţire, folosind o varietate mare de solvenţi organici.

1
 b.2). Cromatografia
de partiţie (CP):
 În cromatografia de
partiţie (de repartiţie) distribuţia moleculelor între fazele lichide, mobilă şi staţionară, se
bazează pe solubilităţile moleculelor în cele două faze.
 O substanţă, solubilă în două faze nemiscibile, se va distribui (va partiţiona) între aceste
două faze în acord cu solubilitatea ei.
 Coeficientul de partiţie (repartiţie) reprezintă raportul concentraţiilor substanţei în cele
două faze (solvenţi) şi este constant, indiferent de concentraţia absolută.

 Faza staţionară lichidă este menţinută pe loc de un solid poros, cum ar fi o hârtie de
filtru (matrice suport inert, fibre de celuloză). În acest caz, hârtia de filtru umedă (un
strat polar de molecule de apă legate la grupările hidroxilice ale celulozei) reprezintă faza
staţionară normală.
 Faza mobila este formata din molecule polare si NEpolare.
 Substanţele care sunt mai solubile în faza mobilă vor trece rapid prin sistem (cele
POLARE), în timp ce cele mai solubile în faza staţionară vor fi încetinite (cele Nepolare).
 Distribuţia moleculelor între cele două faze are loc repetat pe măsură ce materialul se
mişcă în susul sau în josul hârtiei.
 În cazul cromatografiei de partiţie cu fază inversă, faza staţionară este un solvent nepolar
(exemplu o hidrocarbură C18 ca octadecilsilanul) care este legat chimic la o matrice
suport poroasă (exemplu silice) în timp ce faza mobilă poate fi aleasă dintr-un număr
mare de solvenţi, de obicei apă sau o soluţie tampon apoasă, conţinând unul sau mai
mulţi solvenţi organici - exemplu acetonitril (ca în cromatografia de înaltă presiune cu
fază inversă, FI-HPLC).

2
 b.3). Cromatografia de schimb ionic (CSI)
 În cromatografia de schimb ionic moleculele sunt separate pe baza sarcinii lor nete.
 Faza staţionară este o răşină schimbătoare de ioni (un polimer reticulat cu multe grupări
funcţionale încărcate electric).
 Faza mobilă este o soluţie apoasă. Moleculele sunt întârziate în mişcarea lor de-a lungul
coloanei, depinzând de semnul şi mărimea sarcinii lor. Are loc repetat legarea
electrostatică a moleculelor la grupările cu sarcini opuse ale răşinii schimbătoare de
ioni şi ruperea acestor legături. Ideal, proba este aplicată pe coloană la un pH la care
moleculele au sarcina opusă celei a grupărilor răşinii, astfel încât moleculele se leagă la
coloană.
 Schimbătorii de ioni pot fi cationici sau anionici, depinzând de ionul pe care îl schimbă.
Schimbul ionic este definit ca o substituţie a unui ion legat de o matrice inertă cu un alt
ion prin desfacerea unei legături ionice şi formarea unei noi legături ionice, fără alte
modificări structurale semnificative.
 O răşină care are grefate grupări negative şi schimbă ioni pozitivi este un cationit şi
schimbătorul de anioni se mai numeşte anionit.
 Fiecare tip de schimbător este clasificat ca puternic sau slab, în funcţie de tăria ionizării
grupărilor funcţionale. Un schimbător cu o grupare aminică cuaternară este astfel un
schimbător anionic bazic puternic, în timp ce grupări aminice secundare alifatice sau
aromatice duc la un schimbător anionic bazic slab. Un cationit acidic puternic conţine
grupări acidice sulfonice.
 Abilitatea unui schimbător de ioni de a adsorbi contraioni este definită cantitativ de
capacitate.
 Capacitatea totală a unui schimbător de ioni este cantitatea de grupări încărcate sau
potenţial încărcate per unitate de masă de material uscat.
 Capacitatea unui schimbător ionic este funcţie şi de porozitatea răşinii. Matricea este
reticulată prin legături covalente, formând o “sită moleculară”. Porozitatea răşinii depinde
de gradul ei de reticulare. Răşinile pur sintetice (polistirenice sau acrilice) au o reticulare
între 2 şi 16%, cu 8% fiind cele mai bune în acest scop. Schimbătorii de ioni celulozici au
reticulare redusă sau de loc, în timp ce cei bazaţi pe dextran sunt disponibili în două grade
de reticulare.

Schimbare de cationi (E+ cu F+) R-Y-E+ + F+ → R-Y-F+ + E+

R- reprezintă scheletul (suportul) inert al răşinii schimbătoare de ioni, pe care se ataşează

gruparea funcţională sau Y-.

3
 b.4). Cromatografia de gel-filtrare (CGF) (de excludere, sită moleculară).
 Faza staţionară constă din particule sferice de gel cu mărime şi porozitate controlată
(polimeri reticulaţi) şi este în general folosită sub formă de coloană.
 Faza mobilă este lichidul trecut prin coloană. Moleculele sunt fracţionate pe baza mărimii şi
formei lor.
 Moleculele mai mici difuzează mai uşor în porii particulelor de gel decât cele cu dimensiuni
mari, având aceeaşi formă generală. Cu cât penetrarea în pori este mai mare, cu atât mai
întârziată va fi mişcarea moleculelor prin coloană. Mişcarea în interiorul şi în afara
particulelor de gel are loc repetat pe măsură ce materialul se mişcă prin coloană.
 Moleculele mai mari decât porii particulelor de gel sunt excluse din gel şi se mişcă mai
rapid prin spaţiul dintre particulele de gel.
 Principalul factor de separare în gel-filtrare este masa moleculară a particulelor.
Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un gel spre a fi utilizat în cromatografia de
gel-filtrare sunt:
 matricea gelului trebuie să fie inertă chimic;
 gelurile trebuie să fie stabile fizico-chimic;
 trebuie să prezinte un conţinut mic în grupări ionice pentru a evita efectele de schimb ionic;
 să aibă grad de umectare mare;
 să poată fi realizabilă obţinerea unei game largi de tipuri de gel cu aceeaşi constituţie chimică,
dar cu porozitate şi mărime a particulelor diferită pentru a acoperi diferite domenii de
fracţionare;
 mărimea particulelor şi distribuţia pe mărimi a particulelor să fie riguros controlată;
 granulele gelului să fie rigide, stratul cromatografic să nu se compacteze şi să opună rezistenţă
la eluţie (rezistenţă mecanică bună).

4
 b.5). Cromatografia prin
interacţiune hidrofobă (CIH)
 Această tehnică este utilizată pentru a separa proteine şi exploatează care au centre hidrofobe,
cu resturi de aminoacizi hidrofobi (exemplu leucină, izoleucină, valină, fenilalanină)
situate pe suprafaţa lor. Proteinele diferă între ele prin natura şi extinderea acestor regiuni
hidrofobe.
 Grupările utilizate în cazul fazelor staţionare CIH sunt mai puţin hidrofobe şi împachetate mai
puţin dens, astfel rezultând o adsorbţie medie a proteinelor.
 Retenţia şi eluţia pot fi realizate folosind soluţii apoase astfel încât o proteină individuală să
poată fi izolată cu conformaţia ei tridimensională intactă.
 Separările se bazează pe interacţiunile dintre cele trei componente ale sistemului: faza
staţionară hidrofobă, moleculele hidrofobe ale probei şi faza mobilă apoasă.
 Într-un mediu apos, grupările hidrofobe tind să se asocieze şi acest fapt are ca rezultat
legarea unora dintre proteine la faza staţionară, unde tăria legării depinde de gradul de
hidrofobicitate al proteinei. Această tendinţă este promovată de prezenţa unor săruri, cel mai
adesea sulfat de amoniu, care produce efecte de precipitare (“salting out”).
 Eluţia componentelor poate fi realizată prin diferite metode:
 reducerea concentraţiei de sulfat de amoniu în faza mobilă, pentru a scădea efectul de
precipitare;
 schimbarea sării în faza mobilă cu una care nu produce fenomenul de precipitare;
 includerea unor detergenţi neionici (Triton X-100) pentru a reduce interacţiunile hidrofobe;
 includerea unor alcooli alifatici, reducând polaritatea fazei mobile;
 schimbarea pH-ului;
 reducerea temperaturii.

5
 b.6). Cromatografia de afinitate (CA):
Este cel mai selectiv tip de cromatografie şi constă în stabilirea unor legături între
componenta de separat şi un ligand.
 În cromatografia de afinitate, ligandul (o moleculă, un grup, ion sau atom) este ataşat
covalent la matrice (polimerul suport).
 Legătura dintre ligand şi molecula de separat este strict specifică şi se bazează, de obicei, pe
activitatea biologică a moleculelor (antigen-anticorp, enzimă-substrat, hormon-proteină de
transport sau receptor, ADN sau ARN-secvenţă de baze complementare, etc).
 Pe măsură ce un amestec de proteine este trecut prin coloană, numai proteina ţintă se leagă
specific la matrice. Coloana este spălată apoi de câteva ori cu tamponul în care proteinele au
fost dizolvate pentru a elua proteinele care au fost legate nespecific.
 În final, proteina ţintă este eluată prin trecerea prin coloană a unui solvent conţinând o
concentraţie mare de ligand liber, sau o soluţie salină concentrată.
 În CA ligandul trebuie să prezinte o interacţiune specifică dar reversibilă cu molecula de
purificat.
 O matrice suport ideală este agaroza.
 Dacă ligandul este mic şi molecula de purificat este mare, legarea poate fi restricţionată
datorită prezenţei prea apropiate a suprafeţei matricei. Această problemă poate fi rezolvată
prin introducerea unui “braţ distanţier” (exemplu o catenă hidrocarbonată cu 6 atomi de
carbon) între ligand şi matrice. Exemple de adsorbanţi cu specificitate de grup includ:
 Lectinele (un grup de proteine produse de fungi, plante şi animale) leagă specific resturi
glucidice. Sunt foarte utile pentru purificarea macromoleculelor ce conţin glucide precum
glicoproteine, lipoproteine serice, proteine-receptor membranare.
 Proteina A (proteină membranară de suprafaţă din bacteria Staphylococcus aureus) are
afinitate pentru regiunea constantă (Fc) a anticorpilor IgG ai multor specii de mamifere.
 Coloranţii imobilizaţi (exemplu Cibacron Blue) se utilizează pentru purificarea unui număr
mare de enzime şi proteine, cofactori nucleotidici ca NAD+ şi NADP+.
 Poli(Uridinil)-agaroza poate fi utilizată pentru izolarea de ARN m datorită cuplării biospecifice
a poli(Uridinil) cu secvenţa terminală poli(Adenil) caracteristică moleculelor de ARNm.

6
 b.7. Cromatografia covalentă (CC):
 Este o variantă a cromatografiei de afinitate care implică formarea de legături
covalente relativ puternice dar reversibile între suportul afin şi moleculele de
purificat. Un tip de CC este utilizată pentru purificarea proteinelor conţinând
grupări tiol (-SH).
 Dacă proba este aplicată pe o coloană conţinând o matrice cu grupări disulfid 2’-
piridil, proteinele ce conţin grupări tiol înlocuiesc gruparea piridil de pe suport şi
devin imobilizate prin punţi disulfidice.
 Eluarea componentelor legate se poate face incluzând reactivi ce conţin grupare tiol,
precum cisteina, glutationul, 2-mercaptoetanolul sau ditiotreitolul în faza mobilă.
 Altă formă de CC utilizează acid boric imobilizat care leagă grupări carbohidrate
(glicoproteine).

b.8). Cromatografia cu metale chelate (CMC)

 Acest tip exploatează abilitatea unor ioni metalici, în special Cu2+, Zn2+, Hg2+, şi
Cd2+, de a lega proteine prin formarea de complecşi coordinativi cu grupări
imidazol din histidină, grupări indol din triptofan, sau grupări tiol din cisteină.

7
  Ionul metalic poate fi imobilizat prin chelare cu acid iminodiacetic (IDA), legat
covalent la agaroză.
 Proteinele care se leagă la ionii metalici pot fi eluate utilizând liganzi ai metalelor în
forma liberă (de exemplu aminoacizi) în faza mobilă.

c) Clasificare după forma şi construcţia fazei staţionare:

c.1). Cromatografia capilară: varianta gaz-lichid are o putere de rezoluţie foarte mare..
 Faza stationara lichidă, vâscoasă, este depusă pe peretele unui tub capilar,
 Faza mobilă, gazoasă, trece prin lumenul capilarei.

c.2). Cromatografia în strat subţire (CSS)

 Faza staţionară (oxid de aluminiu, silicagel, celuloză, acetat de celuloză, DEAE-
celuloză, CM- şi P-celuloză, răşini schimbătoare de ioni, pulbere de poliamidă sau
policaprolactamă, etc.) este depusă în strat subţire pe o placă de sticlă sau pe o folie
de material plastic.
 Faza mobila: Probele se pregătesc anterior prin procedee diferite de deproteinizare
(dializă, precipitare), extracţie, desalinizare, concentrare, etc.
 Aplicarea probelor pe placa cromatografică se face punctiform cu pipete capilare sau
pipete automate, sau liniar cu ajutorul unor aplicatoare speciale. În paralel se aplică
standarde cu substanţe cunoscute.
 Camerele de CSS sunt confecţionate din sticlă şi permit fixarea şi observarea plăcilor.
 Sunt prevăzute cu capac ce permite închiderea etanşă, realizându-se astfel o saturare
cu vaporii fazei de irigare.
 Faza mobilă înaintează sub acţiunea forţelor capilare, antrenând componentele
amestecului. Componentele separate apar ca nişte pete (ca atare sau în urma colorării
cu un reactant specific) pe placa cromatografică.
c.3). Cromatografia pe hârtie (CH):
 Ca material de suport serveşte celuloza sub forma unei hârtii speciale, tăiată în formă
de benzi dreptunghiulare sau în formă de ic. Acestea conţin faza staţionară, de obicei
apa, sau sunt uneori impregnate cu substanţe hidrofobe (cromatografie în fază
inversă).
 O substanţă dată migrează cu atât mai repede cu cât are un coeficient de partiţie mai
mare în raport cu faza mobilă.
 Proba (amestecul de componente de separat) se depune într-un punct de start, în
cantitate foarte mică (1-10 microlitri).
 Hârtia este uscată, apoi irigată (developată) cu un solvent în sistem mono sau
bidimensional.
 După migrare, hârtia este din nou uscată, apoi substanţele sunt vizualizate (prin reacţii
de culoare, lumină UV) şi apar sub forma unor pete (spoturi) sau benzi, fapt care
permite evidenţierea calitativă a componentelor, evaluarea lor cantitativă şi obţinerea
componentelor în scop preparativ (prin decuparea spoturilor şi apoi eluare, sau prin
scurgerea continuă a componentelor în recipiente separate).

8
 Cu toate acestea cromatografia pe hârtie a cunoscut aplicaţii largi în analiza amestecurilor
de aminoacizi, zaharuri, componente lipidice, acizi organici, porfirine si pigmenţi biliari,
alcaloizi, hormoni şi medicamente într-o serie întreagă de produse biologice în scop de
cercetare sau diagnostic.

Mişcarea substanţelor în cromatografia pe hârtie sau în strat subţire este caracterizată de

valoarea Rf. Aceasta reprezintă raportul dintre distanţa parcursă de probă şi cea parcursă de
solvent, amândouă măsurate de la linia de origine (start):
distanta parcursă de probă
Rf =
distanta parcursă de solvent (2)
Valoarea Rf este proporţională cu solubilitatea probei în faza mobilă.
Alternativ, se poate exprima mişcarea substanţelor raportând-o la un standard cu mobilitate
cunoscută, RX, unde:
distanta parcursă de probă
RX =
distanta parcursă de standard (3)

c.4). Cromatografia pe coloană.

 Faza staţionară sub formă de particule sferice (un adsorbent, o răşină sau un gel) este
conţinută într-un tub de sticlă, plastic sau oţel.
 Eluentul este introdus în coloană cu ajutorul unei pompe debitoare sau se lasă să curgă
prin coloană sub acţiunea gravitaţiei.
 Amestecul de separat este introdus la acel capăt al coloanei unde pătrunde eluentul.
 Efluentul, care se colectează la celălalt capăt al coloanei, se trece printr-un dispozitiv
analizor, care sesizează prezenţa componentelor.

9
c.5). Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC).
 Cantităţi mari de faze staţionare “moi”, care necesită curgeri prin coloană a fazei
mobile la presiune scăzută pentru a evita compresia;
 Matricea (suportul) în HPLC constă din particule sferice care sunt mult mai mici şi
mai uniforme ca dimensiune, şi mult mai strâns împachetate decât particulele din
coloanele cromatografice convenţionale.
 Eluentul este trecut prin coloană cu o presiune mare (până la 400 bari).
 Coloanele HPLC sunt de obicei confecţionate din oţel inoxidabil, şi toate
componentele, valvele, sunt realizate din materiale care rezistă la presiunile înalte
utilizate.
 Separarea unor macromolecule (în special proteine şi acizi nucleici) necesită, de
obicei, sisteme “biocompatibile”, în care componentele din oţel inoxidabil sunt
înlocuite cu titan, sticlă, fluoroplastice;
 Comparativ cu formele clasice ale cromatografiei de lichide (CH, CSS, CC), HPLC
prezintă o serie de avantaje:
 Rezoluţia şi viteza de analiză depăşesc cu mult metodele clasice;
 Coloanele HPLC pot fi reutilizate fără reîmpachetare sau regenerare;
 Reproductibilitatea este mult îmbunătăţită deoarece parametrii care afectează eficienţa
separării pot fi controlaţi îndeaproape;
 Manevrarea aparatului şi analiza datelor pot fi uşor automatizate;
 HPLC este adaptabil la proceduri preparative la scară mare.
 HPLC este utilizată pentru separarea unui număr foarte mare de biomolecule nepolare,
polare şi ionice, incluzând peptide, proteine, oligozaharide, vitamine.

c.6). Cromatografia de gaz (CG):

 CG clasică utilizează coloane de oţel cu diametrul intern de 1-2 milimetri şi cu
lungime de 2-3 metri, umplute cu particule solide, acoperite cu filmul fazei staţionare.

10
 Faza staţionară este în general un polimer siliconic reticulat, depus sub formă de film
pe peretele interior al capilarei; la temperaturile de operare acesta se comportă într-o
manieră similară unui film de lichid, dar este mult mai robust.
 Faza mobilă (“gazul purtător”) este de obicei azot sau heliu. Separarea selectivă se
realizează prin partiţia diferenţiată a componentelor individuale între gazul purtător şi
faza polimerică siliconică.
 Probele sunt injectate în “capul” coloanei printr-un sistem de injecţie conţinând un
septum, sub forma unei soluţii foarte diluate.

11