LUCRAREA PRACTICA NR.

Selectarea mediului optim de extractie a proteinelor/enzimelor

Factorii care influenteaza extractia:

- Natura mediului
- Raportul mediu de extractie
- Timpul de extractie
- Temperatura
- pH-ul
Compozitia chimica a mediului de extractie influenteaza:
- izolarea proteinelor
- mentinerea functiei biologice a enzimei
- stabilitatea in timp a preparatului enzimatic
Medii de extractie
1) Apa distilata – mediu hipotonic
2) Solutii saline izotonice – realizarea conditiilor similare celor existente in vivo
- NaCl 0,9%
- KCl 0,15 M
- Zaharoza 0,25 M
Proteinele sunt solubile la concentratii mici de saruri neutre = salting-in si precipita
la concentratii mari din aceleasi saruri = salting-out.
3) Solutii tampon – optime pentru proteinele cu activitate catalitica
- Fosfat de potasiu 0,05 M pH=7,4-7,8
- Citrat de sodiu 0,02 M pH=5,5
4) Detergenti naturali sau sintetici, cationici, anionici sau neionici
- Prezinta capacitatea de a forma micele stabile
- Formeaza legaturi de tip electrostatic si forte de tip Van der Waals cu proteinele
5) Uree si guanidine – sunt folosite in special pentru extractia nucleoproteinelor
Principiul metodei
Se tatoneaza mediul optim de extractie a proteinelor totale din diferite tesuturi.
Extractia se controleaza prin determinarea continutului in proteina prin metoda
Lowry.
Mod de lucru
Se efectueaza pentru fiecare tesut 4 omogenate prin mojararea a cate 1g de tesut si
lasat apoi la extras in 10 ml mediu de extractie: AD, NaCl 0,9%, tampon fosfat de
potasiu 0,05 M pH=7,4, zaharoza 0,25 M.
Extractia are loc timp de 1h la temperatura camerei. Dupa aceea se centrifugheaza
la 6000 r.p.m. timp de 15 minute. Supernatantele reprezinta extractele proteice
totale care vor fi supuse dozarii prin metoda Lowry.
Metoda Lowry
Concentratia proteinelor se determina spectrofotometric. Astfel, intr-o eprubeta se
pipeteaza 1 ml EPT (diluat corespunzator) si 1 ml reactiv alcalin de cupru. Se agita si se
lasa la temperature camerei 10 minute pentru a se forma proteinatul de cupru. Apoi se
adauga 3 ml reactiv Folin-Ciocalteu (diluat 1:10). Se agita si se termostateaza 10 minute la
500C sau se lasa la temperatura camerei timp de 45 minute. Eprubeta se raceste, dupa care
se colorimetreaza la 660 nm fata de apa distilata.
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11

ml Sol.
BSA10mg 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
%

ml AD 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
ml reactiv
alcalin de 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
cupru
Incubare 10 min la temperatura camerei

ml reactiv
FC 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Incubare 10 min la 500C

Racire
DO 660nm 0,045 0,07 0,11 0,153 0,17 0,22 0,26 0,283 0,32 0,34 0,388
6 5 8 7 9 9 2
Calbumina
(µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

DO λ660 nm= 0,0472+0,0034 x concentrația

In final, se vor compara rezultatele, concentratii in proteina exprimate in mg/ml si
se va stabili pentru fiecare tesut, mediul optim de extractie.

Sursa Mediul de extracție Dilutie DO λ= 660 Cp (mg/mL)

nm
NaCl 0,9% 0,19
Ficat bovin Zaharoză 0,25 M 1/50 0,21
AD 0,15
TF 0,05 M 0,28
NaCl 0,9% 0,18
Hrean Zaharoză 0,25 M 1/50 0,2
AD 0,12
TF 0,05 M 0,25
NaCl 0,9% 0,2
Drojdie Zaharoză 0,25 M 1/20 0,27
AD 0,13
TF 0,05 M 0,19
NaCl 0,9% 0,09
Fasole Zaharoză 0,25 M 1/100 0,15
(făină) AD 0,065
TF 0,05 M 0,13