2.

PRINCIPII ŞI METODE DE STERILIZARE

Desfăşurarea lucrărilor practice de microbiologie nu este posibilă fără cunoaşterea

metodelor care să permită îndepărtarea germenilor contaminanţi şi care să asigure posibilitatea
studierii microorganismelor în culturi pure.
Prin asepsie se înţelege manipularea la adăpost de microorganisme; aceasta se realizează
prin respectarea regulilor de manipulare aseptică, ce previn contaminarea persoanelor care
lucrează în laborator şi a mediului.
În prezent, o serie de termeni ce definesc metodele de distrugere şi inhibare a
microorganismelor sunt confundaţi şi utilizaţi necorespunzător, motiv pentru care este necesară
diferenţierea lor corectă:
 Sterilizarea completă: reprezintă un ansamblu de procedee care au ca scop distrugerea
virusurilor şi a microorganismelor vii (atât forma vegetativă, cât şi forma de rezistenţă – sporii)
de pe suprafaţa şi interiorul unor obiecte sau medii;
 Sterilizarea incompletă: ansamblul de procedee care permit distrugerea formelor
vegetative ale microorganismelor;
 Dezinfecţia: este o metodă de sterilizare incompletă care implică folosirea agenţilor
chimici;
 Antisepsia: procedeul prin care este inhibată pentru o perioadă de timp dezvoltarea
microorganismelor.
În practică sunt utilizaţi deseori şi alţi termeni:
 Substanţa microbicidă sau germicidă (bactericidă, fungicidă): are efect dezinfectant, de
distrugere a organismelor în formă vegetativă. Spunem că o substanţă este germicidă dacă
efectul ei se produce cu viteză mare şi se manifestă la concentraţii foarte mici de substanţă. În
această categorie intră substanţele dezinfectante, care se aplică în mod obişnuit pe suprafeţe sau
pe alte obiecte neanimate şi care au toxicitate ridicată, ceea ce face contraindicată aplicarea lor
pe ţesuturile vii.
 Substanţa microbiostatică (bacteriostatică, fungistatică): are efect antimicrobian, de
inhibare a activităţii şi a procesului de multiplicare celulară. Spunem că o substanţă este
microbiostatică dacă efectul ei se produce la concentraţii relativ mari de substanţă, iar viteza de
omorâre a celulelor este mică. Antisepticele sunt substanţe chimice cu acţiune antimicrobiană
care au toxicitate relativ redusă, ceea ce permite aplicarea lor pe ţesuturile vii pentru a împiedica
producerea sau extinderea unei infecţii. Majoritatea antisepticelor folosite sunt soluţii diluate de
substanţe dezinfectante, de coloranţi (albastru de metilen, verde malachit, etc.) sau de
conservanţi alimentari.

2.1. METODE DE STERILIZARE

2.1.1. Clasificarea metodelor de distrugere şi inhibare a microorganismelor

I Metode de distrugere a microorganismelor:
 1. Sterilizarea completă se realizează prin:
 Metode fizice:
- folosirea căldurii umede (autoclavare şi tindalizare);
- folosirea căldurii uscate (incinerare, încălzire la roşu, sterilizare cu aer cald);
- folosirea radiaţiilor (UV, X, β, γ);
- folosirea ultrasunetelor;
 Metode chimice:
- utilizarea substanţelor sterilizante (de exemplu, oxidul de etilenă, β-propiolactona);
 Metode mecanice:
- filtrarea sterilizantă.
2. Sterilizarea incompletă se realizează prin:
 Metode fizice:
- folosirea căldurii umede (fierbere şi pasteurizare);
- folosirea căldurii uscate (flambare);
 Metode chimice (dezinfecţia)
- utilizarea substanţelor dezinfectante;
 Metode mecanice:
- centrifugarea.
II. Metode de inhibare a activităţii microbiene:
 Metode fizice:
- temperatura scăzută (refrigerare, congelare);
- deshidratarea;
- desicarea;
- liofilizarea;
- creşterea presiunii osmotice în celulă prin supraconcentrarea mediului;
 Metode chimice:
- utilizarea agenţilor microbiostatici (dezinfectanţi diluaţi, coloranţi, conservanţi,
antibiotice şi chimioterapice).

2.1.2. Metode de sterilizare completă

Autoclavarea
Sterilizarea prin vapori de apă sub presiune (autoclavarea) este o metodă de sterilizare
completă care se realizează într-un aparat special, numit autoclavă (Fig. 2.1.).
Căldura umedă are un grad de penetraţie mai mare şi astfel un efect sterilizant superior
căldurii uscate. Acest lucru explică faptul că parametrii utilizaţi la autoclavare (temperatura şi
durata de expunere) sunt mai mici comparativ cu cei folosiţi, de exemplu, la metoda de
sterilizare cu aer cald.
Principiul metodei:
 Vaporii de apă sub presiune produşi în autoclavă, la temperaturi de peste 100°C (în mod
obişnuit la 121°C, timp de 15-20 minute) au un puternic efect sterilizant deoarece denaturează
proteinele celulare şi în special enzimele.
Tehnica de lucru:
Autoclava este un cazan cilindric aşezat orizontal sau vertical, prevăzut cu pereţi groşi
(rezistenţi la presiuni ridicate) şi cu un capac greu de etanşeizare. Pe capac sau pe învelişul
extern al autoclavei se află fixate un termometru şi un manometru, care indică temperatura şi
presiunea din interiorul autoclavei (Fig. 2.2).
 autoclava se umple cu apă distilată până la nivelul grătarului şi se aşează coşurile de
sârmă care conţin materialele de sterilizat; Se recomandă ca materialele de autoclavat să fie
acoperite cu hârtie sau folie de aluminiu, pentru ca apa rezultată din condensarea vaporilor să nu
ude dopurile şi astfel să conducă la o contaminare ulterioară;

Fig. 2.1. Autoclavă

 se închide etanş aparatul;

 se porneşte sursa de căldură, având grijă ca supapa pentru eliberarea aerului să fie
deschisă, deoarece, pentru a realiza o bună autoclavare aerul din interiorul autoclavei trebuie să
fie eliminat în prealabil, pentru că amestecul vapori-aer la o presiune dată are o temperatură mai
mică decât cea a vaporilor de apă puri;
 când vaporii ies din autoclavă în jet continuu supapa se închide şi se aşteaptă obţinerea
presiunii dorite;
 când s-a atins presiunea corespunzătoare temperaturii dorite se reglează sursa de căldură
pentru a păstra această presiune constantă (în cazul autoclavelor moderne se deschide în mod
automat o supapă de siguranţă, care asigură păstrarea constantă a presiunii în aparat);
 se asigură menţinerea temperaturii dorite un anumit timp cuprins între 10 şi 60 de minute,
în funcţie de natura obiectelor aflate la sterilizat;
 după scurgerea timpului afectat sterilizării se închide sursa de căldură şi se aşteaptă
scăderea presiunii la zero, după care se deschide supapa care permite eliberarea completă a
vaporilor din aparat. Deschiderea aparatului aflat încă sub presiune poate fi periculoasă şi, în
plus, conduce la decompresie bruscă, fapt care provoacă spargerea sticlăriei, aruncarea dopurilor
şi proiectarea lichidelor din recipiente;
 se scot din aparat materialele supuse sterilizării.
1

7
8

3
5

Fig. 2.2. Secţiune prin autoclavă

1-Capacul aparatului; 2-Cazanul autoclavei; 3-Reglator; 4-Sursa de căldură; 5-Apă distilată; 6-
Coş metalic cu materiale de sterilizat; 7-Supapă; 8-Termo-manometru.

Durata sterilizării depinde de temperatură şi presiune:

 la temperatura de 115°C, adică la o presiune de 0,5 atmosfere, timpul optim de
autoclavare este de 90 minute;
 la temperatura de 121°C (1 atmosferă) timpul de autoclavare recomandat este de 20-30
minute;
 la temperatura de 134°C (2 atmosfere) timpul de autoclavare recomandat este de 10
minute.
Controlul eficienţei sterilizării:
Controlul funcţionării corecte a autoclavei se poate realiza prin mai multe metode:
 fizice: temperatura din interior se controlează cu un termometru special;
 chimice: se folosesc substanţe chimice sub formă de pulbere cu punct de
topire cunoscut, ca de exemplu: benzonaftolul - 110°C, sulful - 115°C, acidul benzoic - 121°C;
 biologice: care utilizează culturi sporulate rezistente la temperaturi ridi-
cate, spre exemplu: culturi sporulate de Bacillus stearothermophilus rezistente la 121°C timp de
5 minute, iar la 130°C timp de 1 minut.
Reuşita autoclavării se verifică prin incubarea la termostat a mediilor şi lichidelor sterilizate,
la temperatura de 28-37°C, timp de 24 de ore.
Aplicaţii :
În autoclavă se sterilizează toate substanţele şi obiectele care nu se degradează la
temperaturi mai mari de 100°C: apă distilată, soluţie fiziologică, ulei de parafină, medii de
cultură, medii contaminate, instrumente metalice, obiectele cu garnituri sau tuburile de cauciuc,
obiecte din plastic rezistent la temperatură (vârfurile de la micropipetă automată, pipetele
Pasteur), membrane filtrante, vată, tifon, etc.
Tindalizarea
Este o metodă de sterilizare fracţionată, imaginată de Tyndall în 1877, care se utilizează
pentru medii şi soluţii ce conţin substanţe termolabile, ai căror constituenţi pot fi denaturaţi sub
acţiunea temperaturilor ridicate.
Principiul metodei:
Tindalizarea constă în trei pasteurizări de câte 60 de minute, efectuate la intervale de 24 de
ore, prin imersia recipientelor cu substanţe termolabile în băi cu apă sau într-o autoclavă specială
la temperatură constantă (60-65°C). Încălzirile repetate ale mediilor şi soluţiilor termolabile
omoară atât formele vegetative existente iniţial, cât şi pe cele germinate din spori în intervalele
dintre încălziri.
Tehnica de lucru:
 prima pasteurizare: distruge toate formele vegetative din mediul de sterilizat;
 incubare: după 24 ore de incubare în condiţii optime, până la a doua pasteurizare, sporii
prezenţi în mediu şi nedistruşi în prima etapă vor germina ajungând în stare vegetativă;
 a doua pasteurizare: distruge sporii care au germinat;
 incubare: este posibil ca uneori, unii spori să nu germineze înainte de a doua pasteurizare,
de aceea mediile se incubează iarăşi în condiţii optime de germinare;
 a treia pasteurizare: asigură distrugerea tuturor sporilor germinaţi şi oferă siguranţa unei
tindalizări reuşite.
Controlul eficienţei sterilizării:
 Eficienţa tindalizării se verifică prin incubarea la termostat a mediilor şi lichidelor cu
substanţe termolabile sterilizate astfel, la temperatura de 28-37°C, timp de 24 de ore.
Aplicaţii:
În practica microbiologică tindalizarea se foloseşte la sterilizarea serului, sângelui, mediilor
de cultură cu lapte sau cu must, soluţiilor de zaharuri, de vitamine, pentru inactivarea unor vac-
cinuri sau sterilizarea antibioticelor.
Incinerarea
Principiul metodei:
Incinerarea presupune arderea într-un crematoriu a materialelor folosite şi nerecuperabile.
Aplicaţii:
Metoda se aplică pentru: cadavre de animale infectate folosite în experienţe, produse
patologice, reziduuri organice, materiale de unică folosinţă din plastic, vată, pansamente, tifon
etc.
Încălzirea la roşu
Principiul metodei
Metoda constă în ţinerea obiectului în flacăra unui bec de gaz, până la înroşirea sa completă.
Deşi prezintă un mare dezavantaj, acela al degradării obiectelor supuse acestui procedeu,
încălzirea la roşu rămâne metoda cea mai rapidă şi frecvent utilizată în microbiologie la
sterilizarea unor obiecte metalice de dimensiuni mici.
Aplicaţii:
Metoda este aplicată la sterilizarea următoarelor obiecte metalice: firul de platină al ansei şi
acului de însămânţare (înainte şi după folosire), spatula şi acul de disociere.
Sterilizarea cu aer cald
Principiul metodei:
Prin această metodă se realizează sterilizarea materialelor cu ajutorul aerului încălzit la 160-
180°C şi menţinut timp de o oră, într-un aparat special numit etuvă, (cuptor Pasteur sau
Poupinel). Căldura uscată produsă de aerul cald are efect distrugător asupra microorganismelor
deoarece determină iniţial coagularea proteinelor şi apoi carbonizarea totală a germenilor.
Tehnica de lucru:
Etuva are forma unei cutii cilindrice, bine izolată cu ajutorul unor pereţi dubli şi cu o placă
de azbest sau vată de sticlă, care reduce iradierea căldurii. În interior, aparatul este prevăzut cu o
sursă de căldură, de obicei o rezistenţă electrică, care încălzeşte aerul la temperatura dorită,
identificată cu ajutorul unui termometru ataşat la aparat. Curenţii de aer cald circulă prin spaţiile
dintre pereţii etuvei şi în interiorul ei printr-un sistem de ventilaţie, iar produşii de combustie
sunt eliminaţi printr-un orificiu, situat în partea inferioară a aparatului. Cu ajutorul unui
dispozitiv de reglare cu termostat se stabileşte temperatura de lucru şi timpul necesar pentru
sterilizare.
Pentru sterilizarea la etuvă trebuie parcurse mai multe etape:
 materialele de sterilizat sunt împachetate cu grijă în hârtie de ambalaj, rezistentă la
temperaturi ridicate;
 obiectele se introduc ordonat în aparat, fără a le lipi complet între ele, lăsând spaţiul
necesar pentru a facilita circulaţia aerului cald şi pentru a asigura o încălzire omogenă. De
asemenea, se va evita contactul cu pereţii interni ai etuvei, pentru ca hârtia de împachetat să nu
se carbonizeze;
 se porneşte sursa de căldură şi se reglează temperatura şi timpul necesar sterilizării;
 la terminarea sterilizării, înainte de deschiderea aparatului se aşteaptă scăderea
temperaturii interioare până la valoarea de 70°C, pentru a evita accidentele, dar şi pentru a
proteja sticlăria, care, la contactul cu aerul rece din exterior, s-ar putea sparge ca urmare a răcirii
bruşte.
Controlul eficienţei sterilizării:
Eficienţa sterilizării cu aer cald la etuvă se verifică în mod indirect, observând culoarea
hârtiei de împachetat. Îngălbenirea hârtiei şi a vatei indică o sterilizare completă, în timp ce
colorarea în maro a acestora arată faptul că s-a depăşit temperatura de 180°C şi că sterilizarea a
fost periclitată.
Aplicaţii:
Această metodă de sterilizare se pretează pentru sticlăria de laborator (eprubete, baloane,
pipete gradate, pipete Pasteur, plăci Petri, anse de etalare din sticlă, fiole de recoltare), obiecte
din porţelan (mojare, capsule), obiecte din metal (pense, bisturie, foarfeci), tampoane de vată
pentru recoltare, etc. Obiectele astfel sterilizate pot fi păstrate timp de maxim două săptămâni în
dulapuri bine închise.
Sterilizarea cu ajutorul radiaţiilor (UV, X, β, γ)
Principiul metodei:
Metoda se bazează pe acţiunea germicidă a radiaţiilor ionizante/neionizante, fiind utilizată
în special la sterilizarea suprafeţelor şi a încăperilor. Cele mai folosite sunt radiaţiile ultraviolete,
care au efect maxim la lungimea de undă de 260 nm.
Aplicaţii:
Lampa germicidă (lampa UV) este de fapt un tub din sticlă specială în care descărcările
electrice într-o atmosferă cu vapori de mercur la presiune joasă generează radiaţii ultraviolete. Se
foloseşte la sterilizarea suprafeţelor şi la reducerea încărcăturii microbiene din spaţiile de lucru.
În prezent majoritatea laboratoarelor de microbiologie sunt dotate cu hotă cu flux laminar, o
incintă în care manipularea materialului biologic se realizează în condiţii de maximă siguranţă şi
sterilitate. În această incintă aerul este recirculat continuu şi sterilizat cu ajutorul unei lămpi UV
şi cu filtre speciale de tip HEPA (High Efficiency Particulate Air Filtres), în timp ce vaporii
nocivi sunt îndepărtaţi cu ajutorul filtrelor din carbon activ sau de tip HEPA (Fig. 2.3.).
Sterilizarea cu ultrasunete
Principiul metodei:
Proprietatea ultrasunetelor de a determina dezintegrarea rapidă a celulelor microbiene este
folosită ca metodă de sterilizare care permite curăţirea eficientă a instrumentelor şi a
suprafeţelor, dar care nu poate fi folosită pentru sterilizarea substanţelor chimice. Ultrasunetele
sunt obţinute în aparate speciale, numite băi de sterilizare prin ultrasonare, prin trecerea unui
curent alternativ de înaltă frecvenţă printr-un cristal de cuarţ.

5
2

Fig. 2.3. Secţiune prin hota cu flux laminar

1-Filtrul HEPA; 2-Prefiltru; 3-Ventilator; 4-Sursa de lumină şi radiaţii; 5-Aer
nesteril; 6-Aer steril

Sterilizarea cu substanţe chimice

Metoda este aplicată la sterilizarea prin fumigaţie sau cu ajutorul unor aparate speciale a
aerului din încăperi, a suprafeţelor şi aparatelor de dimensiuni mari, a unor instrumente, pulberi,
uleiuri, medicamente. Dintre substanţele chimice cu efect sterilizant cele mai folosite sunt:
oxidul de etilenă, -propiolactona, bromura de etil şi formaldehida.
 Sterilizarea cu oxid de etilenă
Principiul metodei:
Oxidul de etilenă este un gaz care poate distruge germenii din produsele termolabile.
Sterilizarea se realizează timp de 4 ore, la 58C şi la o umiditate de 40%, într-o incintă de tip
autoclavă, adaptată special acestui scop, în care se introduc produsele de sterilizat şi oxidul de
etilenă (500 mg/l de recipient). Deoarece oxidul de etilenă este un gaz exploziv, de obicei se
foloseşte în combinaţie cu dioxidul de carbon (90%), sub denumirea comercială Carboxide.
Aplicaţii:
Metoda este utilă în chirurgie şi stomatologie iar în microbiologie se foloseşte la sterilizarea
materialelor din plastic şi a produselor termolabile.
 Sterilizarea cu -propiolactonă (BPL)
Principiul metodei:
Metoda asigură sterilizarea incintelor prin răspândirea în mediu cu ajutorul aparatului de
fumigaţie a vaporilor de -propiolactonă (soluţie apoasă), care au avantajul că la temperatura
camerei formează un mediu umed, de vapori cu putere mare de sterilizare. Substanţa chimică se
aplică prin fumigaţie la concentraţii de 1-5 mg/l, la umiditate de 75-80% şi temperatura de 25°C.
Aplicaţii:
Acest tip de sterilizare se aplică în cazul camerelor de spital, a spaţiilor din industria alimen-
tară, farmaceutică, etc.
Filtrarea sterilizantă
Principiul metodei:
Filtrarea sterilizantă constă în trecerea aerului sau a lichidelor printr-un filtru/membrană
filtrantă cu pori de dimensiuni foarte mici, care reţin toate microorganismele.
Există două mari categorii de filtre sterilizante:
o membrane filtrante care lucrează în profunzime, ce reţin microorganismele în toată
grosimea membranei. Din această categorie fac parte:
 filtrele din sticlă poroasă, notate cu G (G0-G5);
 filtrele Chamberland, confecţionate din porţelan şi notate cu L (din care doar L5-L7 reţin
bacteriile);
 filtrele Berkefeld, fabricate din pământ de infuzori şi notate în funcţie de porozitatea lor
cu V, N şi W;
 filtrele Seitz, care se prezintă sub formă de rondele din azbest amalgamat cu celuloză şi
sunt notate EK şi EKS, ultimele având efect sterilizant;
o membranele filtrante tip “ecran”, care reţin particulele şi germenii doar la suprafaţa lor.
Un astfel de exemplu îl reprezintă membranele filtrante Millipore, care au porozităţi cuprinse
între 0,025 μ şi 1 μ şi sunt alcătuite din acetat de celuloză. Majoritatea bacteriilor pot fi reţinute
cu ajutorul membranelor de 0,22 μ, în timp ce pentru drojdii sunt necesare membranele de 0,45
μ.
Tehnica de lucru:
În microbiologie membranele Millipore se folosesc în mod curent la sterilizarea unor
cantităţi mari de lichid (medii de cultură, soluţii) şi se montează la un sistem de filtrare (Fig.
2.4.).
Un sistem de filtrare se compune dintr-o pâlnie din sticlă gradată sau simplă şi o membrană
filtrantă sterilă care se aşează pe un suport de susţinere a membranei. Suportul membranei se
cuplează la un balon de colectare sau balon Kitasato prin intermediul unui dop de cauciuc sau cu
ajutorul unei cleme de prindere. Pentru ca filtrarea să se realizeze eficient şi rapid, întregul
sistem este cuplat la o trompă de vid.
Asigurarea unei filtrări corecte depinde de respectarea următoarelor norme:
 înainte de începerea filtrării sticlăria folosită şi membranele filtrante se împachetează în
folie de aluminiu sau în hârtie specială şi se sterilizează prin autoclavare la 110°C, timp de 20 de
minute;
 sistemul de filtrare se montează corect, în condiţii aseptice, în apropierea flăcării becului
de gaz;
 se conectează balonul Kitasato la trompa de vid;
 presiunea exercitată la filtrare să nu fie mai mare de 400 mm Hg, pentru a evita
deformarea porilor sau ruperea membranei filtrante;
 timpul de filtrare să nu depăşească 30 de minute, deoarece în timp pot fi antrenate prin
filtru bacteriile mici sau cele foarte mobile;
 se va evita alternanţa de presiune normală şi compresiune, care poate afecta capacitatea
filtrului de a reţine bacteriile;
 lichidul filtrat se recoltează în condiţii aseptice.

2
5 3

Fig. 2.4. Componentele unui sistem de filtrare

1-Pâlnie; 2-Suportul de susţinere a membranei filtrante sterile; 3-Dop de cauciuc; 4-
Balon de colectare; 5- Legătura la trompă de vid.

Pentru sterilizarea unei cantităţi mici de lichid sunt mai utile membranele filtrante montate
într-un suport de polipropilenă (filtre Whatman Polydisc – Fig. 2.5.), care sunt livrate în
ambalaje sterile şi pot fi adaptate la seringi sau la trompa de vid.

Fig. 2.5. Membrane filtrante în suport de polipropilenă tip Whatman Polydisc

 Controlul eficienţei sterilizării:
Lichidul filtrat poate fi controlat prin incubare la termostat la 28-37°C, timp de 24-48 de
ore.
Aplicaţii:
Această metodă este indicată pentru sterilizarea mediilor de cultură lichide sau a soluţiilor
care conţin substanţe termolabile (de exemplu, soluţiile de antibiotice, glucide, vitamine, a
serului, ascitei, a mediilor de cultură ce conţin lapte, mediului cu must, pentru sterilizarea unor
reactivi, separarea exotoxinelor microbiene sau la care pH-ul se poate modifica prin autoclavare.
Pentru decontaminarea bacteriană şi fungică a aerului se utilizează aparate speciale care
combină mai multe metode de sterilizare: iradierea cu raze UV, ozonizarea şi filtrarea aerului
prin filtre HEPA (aparat de sterilizare prin ozonizare şi filtrarea aerului, hota cu flux laminar).

2.1.3. Metode de sterilizare incompletă

Fierberea
Principiul metodei:
Este o metoda de sterilizare incompletă, care nu asigură distrugerea sporilor şi se realizează
în cutii speciale din inox, în care temperatura apei ajunge la 90-100C. Printr-o fierbere timp de
10-15 minute în apă distilată marea majoritate a germenilor patogeni sunt distruşi; totuşi în
practică, pentru siguranţă, fierberea se realizează timp de 30-60 minute.
Aplicaţii:
Metoda este rareori utilizată în microbiologie, dar se folosea în medicină pentru sterilizarea
obiectelor din metal de dimensiuni mici: foarfeci, seringi cu armătură metalică, pense, bisturie
etc.
Pasteurizarea
Pasteurizarea este o metodă incompletă de sterilizare, puţin folosită în microbiologie, dar
utilizată cu mare succes în industria alimentară.
Principiul metodei:
Pasteurizarea presupune încălzirea la o anumită temperatură a produsului de sterilizat şi
păstrarea lui pentru o perioadă de timp la această temperatură, urmată de o răcire bruscă şi
menţinerea lui la rece (4°C). Deoarece sporii pot germina în timpul păstrării unor alimente
pasteurizate, este bine ca acestea să fie închise ermetic şi să se păstreze la temperaturi scăzute .
Aplicaţii:
În industria alimentară există instalaţii speciale pentru sterilizarea parţială a anumitor
lichide (lapte, suc de fructe, bere, vin, conserve). De exemplu, în vinificaţie, pentru conservarea
microbiologică a vinului se pot folosi două tipuri de astfel de metode:
o pasteurizarea obişnuită, care presupune încălzirea vinului timp de câteva zeci de secunde
la 60-70°C ;
o flash-pasteurizarea, adică încălzirea vinului timp de câteva secunde la 95°C .
Flambarea
Principiul metodei:
Flambarea constă în trecerea obiectelor de dimensiuni mici şi cu suprafaţa netedă prin partea
superioară a flăcării becului de gaz. În unele cazuri se utilizează flambarea cu alcool, care constă
în imersia obiectului de sterilizat în alcool, urmată de flambarea lui la flacăra becului de gaz.
Aplicaţii:
Metoda se aplică pentru sterilizarea obiectelor uzuale de laborator: lame microscopice,
suportul metalic al ansei şi acului de însămânţare, suprafaţa externă a pipetelor, gura eprubetelor
şi a flacoanelor de sticlă la deschiderea şi închiderea lor. Flambarea cu alcool este folosită la
sterilizarea anselor de etalare şi a obiectelor de metal (pense, foarfeci).
Dezinfecţia
Principiul metodei:
Dezinfecţia este o metodă de sterilizare incompletă care implică utilizarea substanţelor
dezinfectante.
Dezinfectantele sunt substanţe chimice cu efect germicid, care se aplică în mod obişnuit pe
obiecte neanimate, în scopul distrugerii microorganismelor contaminante.
Prin convenţie internaţională, aprecierea activităţii antimicrobiene a unei substanţe se
realizează comparativ cu cea a fenolului, considerat ca etalon.
Coeficientul fenolic (IF) este un indice care exprimă puterea microbicidă a unei substanţe
faţă de cea a fenolului, care are coeficientul fenolic 1, raportată la două specii de micro-
organisme-test: Salmonella typhi şi Staphylococcus aureus tulpina Oxford. Substanţele cu
coeficienţi fenolici mai mari de valoarea 1 au putere antimicrobiană mai mare decât cea a
fenolului, şi invers.
Aplicaţii:
În laboratorul de microbiologie sunt folosite numeroase substanţe dezinfectante şi produşi
cu rol dublu, dezinfectant şi antiseptic, dintre care cele mai importante sunt enumerate în cele ce
urmează.
o Detergenţii: sunt substanţe care au un bun efect de curăţire mecanică şi o puternică
acţiune germicidă, fiind utilizaţi la spălarea şi curăţarea sticlăriei de laborator.
o Săpunurile: sunt din punct de vedere chimic săruri de sodiu ale acizilor graşi, care
acţionează prin emulsionarea germenilor şi îndepărtarea mecanică a murdăriei şi,
implicit, a germenilor.
o Alcoolul etilic (alcoolul de 70°): este mai eficient comparativ cu alcoolul dublu rafinat
(96° alcoolice), deoarece acţionează mai lent, dar mai profund. Este utilizat la
dezinfecţia mâinilor, a instrumentarului, etc. Nu are efect asupra fungilor şi a sporilor.
o Sublimatul coroziv (biclorura de mercur 1%): substanţă dezinfectantă cu o mare putere
bactericidă (IF = 827), dar toxică. Este o sare cristalină, incoloră, solubilă în apă,
folosită de obicei la dezinfecţia suprafeţelor şi a instrumentelor de laborator. În soluţii
 apoase de 1/1000 omoară bacteriile în 1-10 minute, iar în soluţie 1/500 omoară formele
sporulate în 45-60 de minute.
o Clorul (soluţie apoasă şi gazoasă) şi cloraminele (IF = 200): sunt folosite la dezinfecţia
halatelor, a unor obiecte de îmbrăcăminte, a încăperilor şi suprafeţelor.
o Amestecul sulfocromic: dezinfectant foarte puternic, este prezent în mod constant în
laboratorul de microbiologie, fiind folosit la dezinfecţia pipetelor şi a lamelor
contaminate.
o Formaldehida: are acţiune dublă, dezinfectantă şi sterilizantă, fiind utilizată atât sub
formă lichidă (soluţia de aldehidă formică 40%, numită formol), pentru dezinfecţia
suprafeţelor de ciment, sticlă sau faianţă, cât şi sub formă de aerosoli, la sterilizarea prin
fumigaţie a încăperilor.
Centrifugarea
Principiul metodei:
Centrifugarea reprezintă principala tehnică de separare a microorganismelor din lichidele în
care sunt suspendate sau a unor substanţe cu densităţi diferite.
Tehnica de lucru:
Pentru a accelera procesul de separare a microorganismelor se foloseşte centrifuga (Fig.
3.6.) şi ultracentrifuga. Centrifugele moderne, numite şi “unghiulare”, asigură o poziţie a
tuburilor de centrifugă la un unghi de 45°, care permite o mai bună separare a particulelor, dar şi
o diminuare a încălzirii tuburilor, datorită frecării cu aerul în timpul centrifugării.
Viteza de sedimentare a particulelor la centrifugare depinde de o serie de factori cum ar fi:
 greutatea lor moleculară – cu cât particulele sunt mai mici, cu atât forţa centrifugală
realizată şi durata centrifugării trebuie să fie mai mari;
 vâscozitatea mediului – cu cât vâscozitatea mediului este mai mare, cu atât sedimentarea
este mai dificilă;
 forţa gravitaţională – este un parametru de construcţie caracteristic fiecărei centrifugi,
care se exprimă în unităţi gravitaţionale (g) sau rotaţii per minut (rpm).
 Fig. 2.6. Centrifugă de capacitate mică

Centrifugarea se realizează astfel:

 suspensia de centrifugat este împărţită în mai multe cantităţi egale şi este depusă în
tuburile gradate de centrifugă, care se acoperă cu capace;
 tuburile, care au greutate egală, sunt aşezate diametral opus în rotorul centrifugii;
 se reglează turaţia şi timpul de centrifugare, în conformitate cu valorile dorite;
 la sfârşitul centrifugării capacul se va deschide numai după oprirea completă a rotorului.
Aplicaţii:
Centrifugarea este utilizată la separarea şi izolarea microorganismelor cu greutate
moleculară diferită. Astfel, levurile şi mucegaiurile sedimentează la cel puţin 1000-2000 g,
bacteriile la 2000-4000 g, iar virusurile la 50.000-150.000 g.