Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mureş
LP1 MD

Reguli de protecţie a muncii în laboratorul de microbiologie

În laboratorul de microbiologie se lucrează cu material infecţios
Pentru a preveni răspândirea germenilor din materialul infecţios, precum şi pentru a evita
suprainfectarea acestor materiale cu germeni străini, trebuie respectate anumite reguli de ordine
interioară:
 Este strict interzis accesul persoanelor străine în laborator
 Intrarea în laborator şi participarea la lucrările practice se va face numai după audierea şi
însuşirea regulilor de protecţie a muncii (dovedită prin semnătură pe un proces verbal)
 Intrarea în laboratorul de microbiologie necesită purtarea obligatorie a echipamentului de
protecţie (halat cu mâneci lungi). Se recomandă ca echipamentul de protecţie să fie păstrat
separat de hainele utilizate în exterior.
 Toate produsele biologice vor fi considerate ca potenţial infectante
 Consumarea de alimente şi băuturi, ducerea mâinilor la faţă în timpul lucrului, fumatul
în laborator sunt strict interzise.
 Este interzisă introducerea în gură a oricărui obiect din laborator
 Este interzisă aducerea în laborator a obiectelor de uz personal
o hainele, servietele, genţile, vor fi lăsate în vestiarul special amenajat

o este permisă aducerea în laborator a materialelor de scris şi a lucrurilor de valoare,

acestea din urmă fiind aşezate în laborator în locuri special amenajate.

 Este interzisă intrarea în laborator în lipsa unui cadru didactic

 Nu este permisă fuga sau mersul rapid prin laborator

 Lucrul în laboratorul de microbiologie implică contact cu material infecţios! Pentru a

preveni accidentele de lucru, este necesară urmarea strictă a metodelor de lucru şi a
regulilor de dezinfecţie şi antisepsie:

o însămânţările se fac la flacără, flambându-se gâtul recipientelor la deschidere şi la

închidere
o ansa şi acul de platină se sterilizează înainte şi după folosire prin încălzire la roşu,
iar portansa se va flamba
o pipetele şi lamele de sticlă contaminate nu se vor decontamina la flacără, ci se
scufundă după folosire în recipiente cu soluţie dezinfectantă existente la mijlocul
fiecărei mese. Tot în aceste recipiente se vor introduce lamele şi lamelele de sticlă
folosite

o pipetarea cu gura este interzisă. În vederea pipetării se vor folosi dispozitive de

pipetare adecvate
o cutiile Petri, eprubetele, sau alte recipiente şi materialele contaminate se introduc
după lucru în găleata de infecte care va fi autoclavată

1
Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP1 MD

o manipularea aparatelor se va face respectând instrucţiunile de folosire specifice

o atenţie la manipularea substanţelor caustice şi inflamabile
o în cazul răspândirii accidentale a materialului infecţios, va fi anunţat cadrul didactic
care conduce lucrările şi care va indica măsurile de dezinfecţie

 După terminarea lucrului mâinile se antiseptizează prin introducerea lor într-o substanţă
antiseptică (cloramină, bromocet) pentru câteva minute, apoi se spală cu apă caldă şi săpun.

 Fiecare student are obligaţia de a-şi supraveghea spaţiul de lucru, păstrând ordinea şi
curăţenia:
o fiecare student îşi va alege locul de lucru la începutul primei lucrări practice, loc pe
care şi-l va păstra până la încheierea semestrului/anului universitar
o orice alterare a suprafeţei de lucru sau a diferitelor obiecte adiacente spaţiului de
lucru propriu produsă exclusiv din vina studentului, va fi penalizată prin amendă
şi/sau absenţă nemotivată în ziua respectivă
o orice alterare existentă a zonei de lucru va fi consemnată cadrului didactic la
începutul lucrării practice

2
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP1 MD

Controlul creşterii microorganismelor

- în practica medicală
- spitale – secţii medicale şi chirurgicale – infecţii nozocomiale
- cabinete medicale, stomatologice
- în microbiologie
- material infecţios – risc pentru contaminarea mediului, îmbolnăvirea
personalului
- diagnostic corect: prevenirea contaminării probelor din mediul extern

Definiţii:
DECONTAMINARE: reducerea numărului de germeni de pe un obiect sau dintr-o substanţă până
la 0, poate fi efectuată prin mai multe metode:
ANTISEPSIE: decontaminarea tegumentelor şi mucoaselor cu ajutorul unor substanţe chimice
antiseptice bacteriostatice (netoxice pentru tegument): alcool etilic 70, tinctură de iod 5%,
KMnO4 0,1%, detergenţi cationici. Distruge doar formele vegetative
DEZINFECŢIE: distrugerea patogenilor (mai puţin a sporilor) de pe suprafeţe, din aer, cu
ajutorul unor substanţe chimice dezinfectante bactericide (toxice pentru ţesuturi vii): fenoli,
formol, H2CO3. Împiedică răspândirea bolilor infecţioase.
STERILIZARE: distrugerea sau îndepărtarea tuturor formelor vii (inclusiv spori)
ASEPSIE: absenţa patogenilor – menţinerea sterilităţii – presupune aplicarea tehnicilor aseptice
pentru a împiedica pătrunderea microbilor într-un substrat steril.
SANITIZARE – măsuri pentru asigurarea sănătăţii publice
PREZERVARE, CONSERVARE - păstrarea viabilităţii microorganismelor o durată variabilă de
timp
CURAT – lipsit de murdărie organică/anorganică (fără referire la microorganisme)

Factori care influenţează eficacitatea metodelor de control

 mărimea populaţiei bacteriene
o moartea bacteriilor este exponenţială (mai mulţi germeni = mai mult timp)
 timpul de expunere la agentul decontaminant
o creşterea timpului de expunere creşte rata distrugerii
 efectul concentraţiei, a temperaturii şi a pH-ului
o creşterea concentraţiei creşte rata distrugerii
o temperatura, concentraţia, pH-ul la care acţionează agentul
o stabilitatea agentului la pH, temperatură
 structura germenului
o endospori - clostridii
o chist – Protozoa
o peretele celular - Mycobacterium
 interacţiunea cu mediul înconjurător – protecţia germenilor
o prezenţa substanţelor organice protejează microorganismele (curat – murdar)
o dezinfecţie în spitale – selectarea rezistenţei

3
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP1 MD

Metode de decontaminare

Metodele se aleg în funcţie de situaţia practică. (materialele care urmează a fi tratate sunt
termostabile/ termorezistente, etc. ?)
Nu toate metodele de decontaminare sunt şi metode de sterilizare!
Metode fizice
I. Căldura
a. Căldura uscată:
- Încălzirea la roşu – ansa de platină
- Flambare – completarea sterilizării – trecerea obiectului prin flacără
- Incinerarea – arderea cu reducere la cenuşă
 indicaţii: materiale dispozabile din plastic, reziduuri organice solide,
carcasele, cadavrele animalelor
- Sterilizarea prin aer cald – mecanism de acţiune: oxidare
 indicaţii: sticlărie de laborator, vase din porţelan, instrumentar
chirurgical, pulberi termostabile
 contraindicaţii: soluţii apoase, obiecte din cauciuc, plastic, ţesături
şi vată din bumbac sau fibră sintetică, materialele contaminate din
laborator
 se realizează în etuvă (cuptorul Pasteur, Poupinel)
 160C 2h, 180C 1h

b. Căldura umedă:
- Fierberea – mecanism de acţiune: denaturare
 distruge formele vegetative, nu şi sporii
 nu este metodă de sterilizare eficientă
 100C, 30 minute
- Vapori fluenţi – în vasul Koch, Arnold
- Tindalizarea – sterilizarea fracţionată: evită încălzirea la temperaturi de
peste100C
 încălzire în 3 zile consecutive, între încălziri incubare la termostat
pentru germinarea sporilor
 tindalizare la 100C în vasul Koch (Arnold) utilizând vapori fluenţi
 tindalizare la 65C în baie de apă
 sterilizarea unor medii de cultură, alimente
- Sterilizare prin vapori sub presiune – autoclavarea; mecanism de acţiune:
denaturare
 temperatura vaporilor de apă într-un spaţiu închis creşte proporţional
cu presiunea
 0,5 atm – 115C
 1 atm – 121C
 2 atm 134C
 în microbiologie: 121C timp de 15’- 30’
 în blocurile operatorii: 134C timp de 30’
 indicaţii: sterilizarea materialului infecţios din laborator, medii de
cultură termostabile, instrumente chirurgicale, halate, câmpuri
operatorii, etc.
 contraindicaţii: material plastic, piele, blană

4
Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP1 MD

schemă autoclav orizontal

II. Pasteurizarea
 denaturarea proteinelor – expunere la temperaturi de sub 100C
 produse alimentare termolabile
 nu se distrug: micobacteriile, enterovirusurile
- joasă (LTLT – low temperature long time)
- înaltă (HTST – high temperature short time)
- (UHT – ultra high temperature)

III. Filtrarea
 reţinerea microorganismelor din medii lichide sau aer
 trecerea prin membrane cu porozităţi diferite (0,22, 0,45, 0,8)
 membrane: acetat, nitrat celuloză, policarbonat, teflon
 sterilizarea lichidelor termolabile şi sterilizarea aerului pentru crearea unui
mediu aseptic (boxe cu flux de aer laminar – HEPA filter: High-efficiency
Particulate Air)

IV. Centrifugarea – pentru virusuri se folosesc viteze mari (10000 rpm)

V. Radiaţii
 ionizante – distrug ADN-ul
- penetraţie mare
- sterilizarea instrumentelor chirurgicale, stomatologice
- nu este o metodă des folosită
 neionizante – alterarea ADN-ului
- ex. razele UV – lampa germicidă
- nu sunt penetrante
- sterilizarea suprafeţelor de lucru netede, curate, sanitizarea
saloanelor, sălilor de operaţie
VI. Vibraţii ultrasonice

5
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP1 MD

Substanţe chimice
I. Agenţii alkilanţi:
 au acţiune sporo- şi bactericidă (glutaraldehida, oxidul de etilen); formaldehida
are doar efect dezinfectant
 sterilizarea instrumentelor medicale, a echipamentelor endoscopice, a
medicamentelor
 oxidul de etilen: substanţă gazoasă cu penetrabilitate mare
 glutaraldehida: soluţie apoasă 2%

II. Soluţii dezinfectante şi antiseptice

 Halogenii
- Clorul şi derivaţii de clor, hipocloriţii
- Iodoforii
 Derivaţii fenolici
 Detergenţi
 Alcooli – etanol 70-80%

Substanţe chimice utilizate în microbiologie:

- pentru dezinfecţie: cloramină 5%, fenol 3%, etc.
- pentru antisepsia mâinilor: bromocet 1% o, cloramină 1%, etc.

Metode de prezervare

1. Frigul
 refrigerare: 4C: stare de viaţă latentă – efect bactriostatic
 congelare la -21C – sterilizare
 congelare bruscă la -70C: prezervare

2. Desicare
 liofilizarea – congelare bruscă şi desicare: prezervarea pe termen lung a
culturilor bacteriene,
 presiune osmotică – îndepărtarea apei din alimente (fructe, lapte praf)

Controlul sterilizării şi al sterilităţii

Controlul sterilizării: controlul procesului de sterilizare

 metode fizice – controlul temperaturii (termometru), presiunii (manometru), timpului de
expunere
 metode chimice: se folosesc substanţe cu punct de fuziune apropiat de temperatura la
care se face sterilizarea (acidul benzoic are punctul de fuziune la temperatura de 121C)
 metode biologice: fiole Stearotest – suspensie de spori de Bacillus stearotermophilus;
atingerea temperaturii de 121C duce la distrugerea sporilor, indicatorul din fiole
virează.
Controlul sterilităţii: eficienţa sterilizării şi menţinerea sterilităţii; se realizează prin metode
bacteriologice (recoltarea probelor de pe suprafeţe sterile, cultivare)

6
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP1 MD

Recoltarea şi transportul produselor patologice

Obţinerea unui rezultat corect la examenul microbiologic impune respectarea unor reguli privind:
 modul de recoltare al produsului patologic (PP)
 metodele de conservare
 modalităţile de transport

Se pun următoarele întrebări:

 Ce se recoltează? – care este PP în care se pot găsi microorganismele suspectate
-Căutăm microbul:
- la poarta de intrare
- în organe ţintă
- în focare metastatice nespecifice
- căile de răspândire (sânge, ganglioni)
- căile de eliminare (intestin, căi urinare)
- Căutăm antigenele microbiene:
- umori
- exsudate – lcr, spută
- sânge
- urină
 Cum se recoltează? – care este calea de acces indicată pentru prelevarea PP
 Cât se recoltează? – cantitatea produsului prelevat
 Când se recoltează? – care este momentul optim de recoltare
 În ce scop se recoltează? – precizarea examenelor de laborator solicitate

Se ţine cont de următoarele reguli:

 prelevarea se face înaintea instituirii tratamentului antimicrobian
 se folosesc recipiente curate şi sterilizate pentru a preveni contaminarea probelor
 evitarea contactului cu substanţe bacteriostatice sau bactericide a produsului
 în unele cazuri trebuie folosite medii de transport sau lichide conservante
 recipientele de transport se închid ermetic pentru a preveni contaminarea mediului şi a
personalului care manipulează PP
 produsul să fie însoţit de un bilet de trimitere completat corect
 probele să fie etichetate şi transportate la laborator în cel mai scurt timp posibil

7
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP1 MD

Pentru examen virusologic

- se transportă imediat în recipiente închise ermetic, pe gheaţă, însoţite de formular de cerere de
analiză completată corespunzător
- unele virusuri sunt deosebit de labile şi îşi pierd viabilitatea/infectivitatea rapid (ex:
citomegalovirus, varicella-zoster virus, virusul respirator sinciţial), de aceea dacă produsele nu
pot fi prelucrate imediat trebuie congelate rapid la -70C
- produsele nu se congelează la -20C (virusurile îşi pierd viabilitatea)

Produse patologice care pot fi recoltate:

- exsudat faringian
- secreţie nazală
- secreţie nazo-faringiană
- spută
- sânge
- LCR
- urină
- secreţie vaginală
- secreţie uretrală şi prostatică
- materii fecale
- bilă
- puroi
- secreţie conjunctivală
- exsudate din cavităţi închise

8
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Nr. Produsul Examen bacteriologic

Crt. patologic
1. Exudatul  Înainte de tratament bacterian
faringian  Înainte sau la 3-4 ore de la toaleta gurii, alimentaţie
 Pacientul
o Pe scaun ,gâtul în extensie, deschide gura, spune “A”
 Medicul
o Deprimă limba cu apăsătorul steril, şterge ferm cu tamponul:
 Amigdalele
 Peretele posterior al faringelui
 !!! recoltare de pe zonele imflamate, leziuni, depozite purulente
o Introduce tamponul în tubul protector, noteată datele pacientului
o Examinare în maxim 3 ore de la recoltare

2. Secreţia nazală  Pacientul suflă nasul

 Medicul
o umectează tamponul faringian în ser fiziologic
o şterge, pe rând , vestibulul foselor nazale
 Examinare 2-3 ore de la recoltare

3. Secreţia nazo-  pacientul aşezat, capul flectat pe spate

faringiană  medicul
o introduce tamponul nazo-faringian printr-o nară, până la peretele posterior al nazo-faringelui
o lasă câteva secunde, după care roteşte uşor, apoi retrage puţin
o reinseră, roteşte, retrage definitiv
 Examinare 2-3 ore de la recoltare

4. Sputa  La internare
 Instruirea bolnavului: periajul dinţilor, clătirea gurii cu apă (sterilă)
 Tuse sopontană, intensă, supravegheată
9
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

 Cantitate: 1-2 ml probă purulentă

 tuşitori cronici,TBC, fungi
o toată sputa de la expectoraţia matinală sau expectorată în interval de 1 – 2 ore
 tuse slab productivă
o stimularea expectoraţiei
!! nu se examinază probele de spută adunate în 24 de ore

5. Sânge  Recoltare în recipiente speciale pentru hemocultură

 1 set = 1 flacon aerob + 1 flacon anaerob
 Se recomandă recoltarea sângelui din 2 locuri diferite
 Volum recoltat: 10 ml (1-3 ml la copii)
 Recoltarea pentru hemocultură, presupune lipsa tratamentului cu antibiotice, altfel există riscul ca germenii
să nu crească
 Tehnica
o Antiseptizarea tegumentului cu iod, apoi cu alcool
o Se aşteaptă uscarea zonei antiseptizate
o Recoltarea sângelui cu ac şi siringă
o Decontaminarea dopului la flacoanele de hemocultură
o Transferul sângelui din seringă în flacoane
 Nu se refrigerează

6. LCR  Prin puncţie lombară

 Condiţii stricte de asepsie
 nu se refrigerează (Neisseria meningitidis)

7. Urina  Pacientul trebuie educat (explicat pe înţelesul fiecărui bolnav) – pentru pervenirea contaminării probei
 Momentul prelevării
o Prima urină de dimineaţă
o Recoltare după cel puţin 3 ore de la micţiunea anterioară
 Recoltarea
10
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

o se face după toaleta riguroasă a organelor genitale externe cu apă călduţă şi săpun
o din jetul mijlociu
o în recipiente sterile speciale pentru recoltarea urinii
 cantitatea necesară: 10-20 ml
 pentru nou-născuţi se folosesc pungi sterile din material plastic
 se mai poate preleva urina prin puncţie suprapubiană sau prin cateter
 indiferent de prelevare, examenul microbiologic al urinii trebuie efectuat în cel mult 2 ore de la prelevare
o dacă acest interval nu poate fi respectat, probele trebuie păstrate la 4ºC imediat după recoltare

8. Secreţiile  vaginite
genitale – la o din fundul de sac vaginal, cu tampon steril care apoi se introduce în mediu de transport
femei o se efectuează două frotiuri
 cervicite
o cu un tampon steril se îndepărtează mucusul de la nivelul cervixului
o cu un alt tampon se recoltează produsul patologic prin introducerea şi rotirea în canalul cervical
o evitarea comtaninării probei cu flora vaginală
o se efectuează două frotiuri
 la fetiţe
o tamponarea secreţiei de la nivelul vulvei
o cu ajutorul unui cateter se introduc în vagin 2 ml ser fiziologic steril, apoi se colectează lichidul de
spălătură
o se efectuează două frotiuri
 nu se refrigerează (Neisseria gonnorhoeae)

9. Secreţiile  uretrite
genitale – la o se recolteaza secreţie uretrală cu tampon steril, care se introduce în mediu de transport
bărbaţi o se efectuează două frotiuri
o se poate recolta şi urină – primul jet
 prostatite
o se recoltează secreţie prostatică după masaj prostatic

11
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

o ejaculat colectat în recipient steril

10. Materii fecale  scaun emis spontan

o defecare în containere de unică utilizare de carton sau material plastic
 cu tampon / linguriţa coprorecoltorului
 porţiuni lichide, mucoase, sanguinolente
 volum 3 – 5 cm3
 prelevare rectală
o cu sonda Nelaton
 umectarea sondei în ser fiziologic steril
 penetrarea sfincterului anal prin rotare lentă
 introducere intrarectală ≈ 15 cm
 adaptarea unei siringi sterile de 10 ml
 1 – 2 aspiraţii
 Introducerea aspiratului în tub steril cu dop, cu mediu de conservare lichid

 Pentru depistare Clostridium difficile

o Recoltare de scaun diareic (lichid sau moale) în recipient curat, fără mediu de transport
11. Leziuni  Recoltarea puroiului
tegumentare o Ocazie unică, frecvent irepetabilă
o Cu tampon steril (cantitate redusă)
o Prin aspiraţie (cantitate suficientă)
o Biopsie, secreţii (intervenţii chirurgicale) – materialul bioptic se introduce în ser fiziologic steril

12
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Schema diagnosticului bacteriologic

Metode directe

1. Examenul direct al produsului patologic:

a. examen macroscopic
b. examen microscopic
c. evidenţierea antigenelor bacteriene prin metode serologice
d. detectarea ADN-ului microbian (reacţii de hibridizare, amplificare genică
– PCR)
2. Izolarea germenului în cultură pură:
a. însămânţarea şi cultivarea pe medii de cultură
b. inoculare la animale de laborator
3. Identificarea germenului izolat din cultură pură:
a. cercetarea caracterelor de cultură şi morfotinctoriale
b. cercetarea caracterelor biochimice şi de metabolism
c. determinarea structurii antigenice prin:
reacţii de aglutinare
reacţii de precipitare
reacţii de umflare a capsulei
d. determinarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia)
e. tehnici de detectare a ADN microbian (punctul 1/d)
4. Determinarea patogenităţii germenului izolat prin:
a. teste in vitro
b. teste in vivo (boala experimentală)
5. Determinarea sensibilităţii germenului la antibiotice şi chimioterapice
(antibiograma)
Metode indirecte
a. detectarea anticorpilor din serul bolnavilor (anticorpii se urmăresc în
dinamică)
b. reacţii biologice cutanate de diagnostic (IDR)

13