Curs 11- Genetic RECOMBINAREA GENETIC LA EUCARIOTE Recombinarea genetic este procesul prin care are loc transferul

intra- sau intermolecular a unor secvene de ADN, avnd ca rezultat modificri n nlnuirea genelor sau a unor pri din gene. Se poate produce astfel, reasortarea unor nucleotide la nivelul aceleiai molecule de ADN sau ntre molecule separate, rezultnd, n final, una sau dou molecule recombinate. La eucariote procesul de recombinare genetic este legat de fenomenul sexualitii i se realizeaz n special n cursul meiozei, fiind condiionat de realizarea contactelor ntre cromosomi urmat de disjuncia independent a perechilor de cromosomi (bivaleni). n cazul organismelor eucariote au fost descrise 3 tipuri de recombinare genetic: recombinarea intracromosomal prin crossing-over (schimbul reciproc de segmente cromosomale); recombinarea intercromosomal prin disjuncia independent a cromosomilor omologi; recombinarea genetic nereciproc prin conversie genetic.

Recombinarea intracromosomal (crossing-over) se realizeazatt n meioz ct i n mitoz. Ea poate avea loc intergenic, ct i intragenic. Recombinarea intragenic este un fenomen rar. Acest fenomen manifest interferen negativ care determin creterea probabilitii ca un al 2-lea crossing-over s aib loc n apropierea primului. Formarea bivalenilor n meioz presupune participarea a 2 cromosomi de origine diferit (matern i patern), ntre care se stabilesc contacte intercromatidice (sinapse) ce conduce la formarea unei structuri specializate numit complex sinaptinemal. Importana complexului sinaptinemal n desfurarea recombinrii genetice intracromosomale este dovedit de faptul c la organismele la care nu se produce acest complex, nu are loc procesul de crossingover. Formarea chiasmelor este dependent de sinteze proteice ce au loc la sfritul zigotenului. Procesul de recombinare genetic implic ruperea i reunirea cromatidelor participante, fapt ce conduce la un schimb reciproc de segmente de ADN de dimensiuni egale i la apariia de cromosomi (iar apoi de gamei) recombinai (Fig. 1).

Fenomenul de crossing-over se realizeaz mai mult sau mai puin randomic, de-a lungul perechilor de cromosomi omologi. Astfel, probabilitatea realizrii recombinrii ntre 2 loci crete odat cu distana dintre acetia pe cromosomi. Deoarece procesul de crossing-over afecteaz numai 2 dintre cromatidele bivalenilor, doar 50 % dintre produii meiozei sunt de tip recombinat, restul de 50 % sunt de tip parental. S-a constatat c ntre genele plasate pe cromosomii omologi, n afar de crossing-over simplu, pot aprea i crossing-overe multiple (Fig.2). Dac procesul de recombinare are loc la nivelul unor gene heterozigotze, indiferent de numrul de crossing-overe ce se realizeaz, procentul de recombinare nu depete 50 %.

Procesul recombinrii genetice poate avea loc i n celulele somatice. Schimburile intercromatidice (sister chromatid exchange) au fost evideniate mai ales n celulele mamaliene aflate n cultur in vitro, ele nefiind urmate, de obicei, de modificri fenotipice deoarece cromatidele implicate sunt identice. Fenomenul recombinrii mitotice a fost studiat n special n cazul fungilor (Aspergillus nidulans, S. cerevisiae) la care n ciclul de via predomin haplofaza. Recombinarea mitotic poate avea loc n cursul metafazei i presupune asocierea cromosomilor omologi i realizarea schimbului genetic nainte de diviziunea centromerului. Procesul de crossing-over se poate produce i la nivelul aceleiai gene (crossing-over intragenic). n mecanismul molecular al recombinrii genetice de tip crossing-over, sunt implicate proteine specifice, procesul recombinrii fiind asociat cu cel de reparare genetic. Recombinarea intercromosomal are loc prin disjuncia independent a perechilor de cromosomi care reprezint suportul material pentru disjuncia perechilor de factori ereditari. Segregarea independent are loc la trecerea celulelor sexuale de la metafaza I la anafaza I, cnd are loc aezarea ntmpltoare a cromosomilor de origine matern sau patern deasupra sau dedesubtul planului ecuatorial al plcii metafazice. Acest comportament al cromosomilor de origine maten, care se mperecheaz cu cei de origine patern i apoi separarea perechilor respective, a fost comparat de ctre Muller cu formarea perechilor de dansatori n timpul dansului i separarea lor la sfritul acestuia. Din aceast cauz, Muller a denumit acest comportament dansul cromosomilor . Cu ct numrul cromosomilor i a genelor coninute este mai mare cu att numrul de combinaii posibile de gamei i de organisme este mai mare. Posibilitatea ca un organism s fie asemntor cu altul este de (1/2) 2n, n care n =numr de perechi de cromosomi, iar 2n reprezint numrul total de cromosomi din complementul speciei respective. Conversia genic este o recombinare nereciproc. In cadrul conversiei genice, un segment din molecula de ADN a unei cromatide se desprinde i se ataeaza de alta cromatida. Este posibil, in acest mod, ca un cromozom sa conina o gena in doua exemplare (daca transferul s-a realizat intre cromozomi omologi), iar altul o gena in minus. Are loc cu o frecventa mai mare in cursul diviziunii meiotice dar poate avea loc si in celulele somatice. Ea a fost evideniat prin analiza tetradelor la ciupercile din genurile Saccharomyces, Aspergillus, Neurospora unde apar abateri de la raportul normal de segregare alelic, ca i cum se produce o transformare a alelei A n a (Fig. 3).

Frecvena recombinrii genetice nereciproce poate crete de la un capt la altul al unui locus genic, fenomen numit polarizarea conversiei. Astfel , la fungi, n locul raportului de segregare normal de 4 : 4, se ntlnesv valori diferite ale acestui raport: 6 : 2, 5 : 3, 7: 1 sau chiar 8 :0. fenomenul conversiei genice a fost evideniat i la plante, n cazul unor gene ce intervin n determinismul pigmentaiei, precum i la virusuri (n special bacteriofagi). Unii autori consider c, de fapt, conversia genic este consecina unui proces de recombinare, n urma cruia apar nepotriviri ale unor baze azotate situate pe cromatide omoloage. Aceste zone de nepotrivire sunt reparate prin excizie i prin adugarea nucleotidei corespunztoare. Prin reparaie poate reaprea astfel, tipul normal.

Curs 12- Genetic RECOMBINAREA GENETIC LA PROCARIOTE La procariote au fost descrise mai multe ci de transfer de material genetic: transformare genetic, conjugare, sexducie i transducie, asociate cu mecanisme ce asigur integrarea noii informaii genetice n genomul gazdei. Indiferent de natura sa, transferul de gene reprezint un fenomen n care moeculele informaionale i schimb gazda, avnd de traversat dou bariere celulare: una la ieire din celula donatoare i alta la intrarea n celula receptoare. 1. Transformarea genetic Fenomenul transformrii genetice a fost descoperit n 1928 de ctre Griffith, n urma experimentelor realizate cu pneumococi asupra oarecilor. Ulterior , Avery, Mac Leod i McCarthy, au descoperit, n 1944, c agentul transformant este reprezentat de ADN izolat din celulele bacteriene. Transformarea genetic la bacterii presupune transferul unui fragment de ADN (cromosomal sau plasmidial) de la o bacterie donatoare i ncorporarea acestuia n genomul unei bacterii receptoare. Asemenea fragmente de ADN sunt, n general, de dimensiuni mari (n medie de 20.000 perechi de nucleotide), putnd conine gene utile care, ptrunse n bacteria receptoare, pot nlocui printr-un proces de recombinare o secven de nucleotide omoloag din genomul acesteia. Informaia genetic nou integrat n cromosomul bacteriei receptoare este transmis stabil de-a lungul generaiilor. Fenomenul de transformare genetic a fost evideniat prima dat la pneumococul Diploccocus pneumoniae i ulterior la Bacillus subtilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Staphylococcus sp., etc. Pentru a putea prelua ADN exogen din mediul extracelular, celulele receptoare trebuie s manifeste o anumit stare specific numit stare de competen. Aceasta presupune ca peretele celular i membrana celular ale celulei bacteriene receptoare s fie permeabile pentru ADN exogen, iar celula s se afle ntr-o anumit faz a ciclului de via care s permit acceptarea acestuia. n cursul realizrii competenei are loc activarea unor receptori specifici localizai la nivelul peretelui celular cu rol de legare a ADN exoged la suprafaa celular. Numrul receptorilor activi, variaz de la o specie bacterian la alta, de exemplu: la Streptococcus au fost identificai 80 de receptori, la Bacillus subtilis 50, iar la Haemophilus doar 4 receptori. La unele specii bacteriene, starea de competen este o stare natural, fiziologic, aprnd ntr-o anumit etap a ciclului de via i dureaz un anumit interval de timp. De exemplu, la Azotobacter, 5

Staphylococcus, Pneumococcus competena este maxim pe parcursul fazei logaritmice, n timp ce la alte specii Bacillus, Pseudomonas, Methylobacterium- competena este maxim la trecerea de la faza logaritmic la cea staionar. n cazul altor specii, starea de competen poate fi indus prin tratamente specifice (oc de temperatur, adugarea unor ioni etc.). ntr-o populaie bacterian, proporia celulelor capabile de a prelua ADN exogen poate fi estimat pe baza frecvenei de transformare, urmrind un anumit marker genetic. Pentru a se obine o frecven ridicat de integrare/ transformare, este necesar ca ADN transformant s provin de la o tulpin bacterian nrudit (ADN omolog). n cazul utilizrii unor organisme nenrudite (ADN heterolog), eficiena procesului de transformare este foarte sczut. Multe bacterii se pot liza n mod natural, mai ales n timpul etapelor finale ale ciclului celular. n aceste condiii, ADN este eliberat n mediu extracelular de unde poate fi preluat de alte bacterii aflate n aceeai populaie. La bacterii, procesul natural de transformare genetic (cu fragmente de ADN cromosomal eliberat prin metoda lizei celulelor bacteriene) se realizeaz n mai multe etape: 1. legarea reversibil (adsorbia) a moleculelor de ADN dublu catenar, la nivelul situsurilor receptoare aflate pe suprafaa celular; 2. preluarea ADN exogen de ctre celulele competente; 3. convertirea ADN dublu catenar la forma monocatenar, prin degradarea uneia dintre catenele moleculei iniiale; 4. integrarea segmentului de ADN monocatenar n cromosomul celulei receptoare; 5. segregarea i exprimarea fenotipic a noii informaii genetice integrate n genomul celulei gazd. Procesul de transformare este destul de rspndit n natur, mai ales n cazul tulpinilor bacteriene nrudite, el jucnd un rol important n evoluia bacteriilor. Aceast concluzie este ntrit i de observaia c transferul de gene prin transformare genetic are loc nu numai pe orizontal (ntre bacterii nrudite) ci i ntre grupe de organisme nenrudite (fenomen ce explic, de exemplu, rspndirea rezistenei la antibiotice). 2. Conjugarea bacterian Conjugarea bacterian reprezint un mod de transfer unidirecional de ADN de la o celul donatoare la o celul receptoare prin intermediul unei legturi intercelulare directe (pil de sex) i condionat de prezena n bacteria donatoare a unui element genetoic specializat numit conjugon. 6

Fenomenul conjugrii a fost descoperit n 1946 (de ctre Lederberg i Tatum) n urma experimentelor cu tulpini de Escherichia coli ce conineau sau nu o plasmid specific notat F. Din acest punct de vedere, celulele bacteriene care conin plasmida F ( factorul F) sunt notate F +, iar cele care nu conin aceast plasmid sunt notate F -. n cazul bacteriilor Gram negative, n afar de plasmida F, funciile necesare procesului de conjugare se gsesc la nivelul mai multor plasmide. De exemplu, n cazul plasmidelor de rezisten la antibiotice (plasmida RP4) i plasmidele Col ce conin determinani genetici pentru sinteza colicinelor. Factorul F este alctuit din ADN dublu catenar circular cu o lungime de 94,5 kb i n numr de 1-2 copii/celul. Transferul prin conjugare al acestor plasmide se datoreaz prezenei unei regiuni specifice, regiunea tra, ce reprezint cca 30 % din lungimea plasmidei F. Cu excepia fectorului F, celelalte plasmide conjugative pot include i alte tipuri de gene: pentru rezistena la antibiotice, toleran la metale grele, virulen patogenitate etc. Studiile asupra procesului de conjugare efectuate la E. coli , au permis stabilirea etapelor acestuia: Formarea i stabilirea agregatelor de conjugare; Pregtirea ADN pentru transfer Transferul ADN conjugativ Refacerea structurii circulare i dublu catenare a ADN transferat.

n prima etap are loc sinteza de ctre celula donatoare a pililor de sex structuri specializate, tubulare, localizate la suprafaa celular, alctuite din molecule de pilin (protein a crei sintez este codificat de gene plasmidiale). A 2-a etap a conjugrii presupune intervenia unei proteine, codificat de genele plasmidiale, care are rolul de a realiza o cresttur monocatenar la nivelul genei oriT (originea transferului). La nivelul captului 5 al catenei de ADN crestat, se leag o protein specific, codificat tot de gene plasmidiale de la nivelul regiunii tra. Are loc apoi, transferul catenei crestate, ncepnd cu captul 5 , transferul fiind cuplat cu procesul de replicare al plasmidei, conform modelului cercului rotativ. In acest fel, pe msur ce procesul de replicare avanseaz, una dintre catenele vechi (cea crestat) se deplaseaz prin pilul de sex n celula receptoare (Fig. 1). In acelai timp, n celula donatoare are loc restabilirea structurii factorului F. la nivel populaiei de bacterii, consecina transferului factorului F este masculinizarea acesteia, adic se produce generalizarea caracterului F +al celulelor bacteriene.

Fig. 1. Reprezentarea schematic a procesului de conjugare Un tip special de conjugare este cel realizat ntre celulele bacteriene care conin factorul F integrat n cromosom (celule de tip Hfr) i celulele de tip F (Fig. 2). Integrarea factorului F n cromosomul bacterian nu se realizeaz la ntmplare , ci la nivelul unor situsuri ce prezint omologie ntre cele dou tipuri de molecule. Celulele rezultate n urma unui asemenea proces de integrare , au primit denumirea de celule de tip Hfr (High frequency of recombination).

Modalitatea specific de integrare a plasmidei F n cromosomul bacterian, face ca secvena oriT s fie localizat aproape de una dintre marginile plasmidei linearizate i integrate la captul acesteia, consecina fiind transferul specific al ADN monocatenar n celula receptoare. In a 3-a etap, n cazul transferului dintre bacteriile F + i F -, dup crestarea monocatenar la nivelul secvenei OriT, ncepe transferul AND monocatenar reprezentat de o scurt secven din plasmida F i apoi de o copie a AND cromosomal al gazdei (Fig. 2). Cea mai mare parte a plasmidei F rmne la nivelul celuilalt capt al cromosomului, i doar foarte rar este transferat n celula acceptoare. Cantitatea de informaie genetic transferat, proprie celulei donatoare, este direct proporional cu timpul n care cele dou celule au stat n contact (cu ct contactul este mai lung, cu att segmentul de ADN transferat va fi 8

mai mare). Astfel, pentru transferul complet al ADN cromosomal la E. coli sunt necesare aproximativ 90120 minute de contact ntre celule, n timp ce transferul plasmidei F din bacteria F + ntr-o bacterie F dureaz 2-3 min. Procesul de transfer de segmente cromosomale din bacteria donor Hfr n cea acceptoare F este urmat de cele mai multe ori de transformare genetic (fenomen controlat de o serie de enzime sintetizate de gazd) ceea ce nseamn c poriuni din respectivul segment se integreaz n genomul noii gazde fiind meninut i transmis constant n generaiile urmtoare. Procesul de conjugare dintre celulele Hfr i celulele de tip n uniti de timp (minute). Transferul de gene cromosomale bacteriene mediat de plasmidele de sex este numit sexducie. In urma conjugrii F + x F se obin doar celule de tip F + , care sunt parial diploide , coninnd alturi de genele proprii i gene similare provenite de la bacteria donatoare. 3. Transducia fagic Transducia fagic este procesul prin care un fragment din cromosomul bacterian este transferat de la o bacterie la alta prin intermediul capsidei (nveliului proteic) anumitor bacteriofagi temperai. Fenomenul a fost descris iniial la bacteriofagi specifici unor tulpini de Salmonella typhimurium, iar ulterior el a fost mai bine studiat n cazul fagului specific tulpinilor de E. Coli . In funcie de structura genetic a fagilor transductori i de mecanismul de formare a materialului genetic al particulri fagice, au fost descrise dou tipuri de transducie fagic: transducie specializat i transducie generalizat. Bacteiofagii ce realizeaz transducia generalizat produc particule ce conin, n cea mai mare parte, ADN provenit din bacteria gazd (din orice parte a cromosomului) i doar o foarte mic parte genom fagic. n cazul fagilor ce determin transducia specializat, ei produc particule ce conin att gene fagice (majoritare) ct i gene cromosomale bacteriene provenite dintr-o anumit regiune a cromosomului bacterian. Cel mai cunoscut bacteriofag ce realizeaz transducie specializat este fagul . n forma lui natural, fagul poate prelua, ca fag transductor, doar scurte secvene de ADN din genomul gazdei n care s-a multiplicat (dup ce a parcurs ciclul lizogen), dimensiunea acestora fiind limitat de capsida fagic. Secvenele pe care le poate prelua fagul sunt foarte precise. Tranducia generalizat este mediat de fagi viruleni precum i de anumii fagi temperai ai cror genom nu se integreaz la nivelul unor situsuri specifice din cromosomul gazdei (de exemplu fagul P1). F servete la realizarea hrilor cromosomale la bacterii , distana dintre gene (dispuse n ordine pe segmentul transferat) exprimndu-se