Aplicatii ale microundelor si

undelor de radiofrecventa in
fenomene de rezonanta

RES (RPE)
RMN
 Rezonanţa Electronică de
Spin (RES)
 Rezonanţa Electronică de Spin (RES)--care
include şi Rezonanţa Electronică
Paramagnetică (REP)-- este fenomenul fizic de
absorbţie rezonantă de microunde de la o sursă de
microunde de către un sistem cu spini electronici
„neîmperecheaţi” (adică, ce nu sunt cu spini anti-
paraleli) dintr-o probă macroscopică în prezenţa
unui câmp magnetic extern care ridică degenerarea
nivelelor (energetice) electronice de spin.
Fenomenul REP a fost descoperit şi raportat la
Universitatea statului Kazan de fizicianul rus Evgenii
Zavoisky în 1944, iar independent fenomenul RES a
fost observat în acelaşi timp de dr. Brebis Bleaney la
Universitatea din Oxford din Marea Britanie.
 Principiul RES (REP)
 Originea semnalului de absorpţie RES
 Orice electron are un moment magnetic şi o valoare a
numărului de spin: s = 1/2 , si cu proiectiile pe directia unui
camp magnetic extern cuantificate de numerele cuantice
magnetice ms = +1/2 şi ms = –1/2
 în prezenţa unui câmp magnetic extern de intensitate B0,
momentul magnetic al electronului se aliniază fie (ms = –1/2
paralel, fie antiparalel (ms = +1/2) cu acest câmp magnetic
aplicat. Aceste două alinieri a spinului electronic corespund la
două nivele de energie electronică de spin diferite (vezi şi
Efectul Zeeman).
 Diferenta de energie dintre cele două stări/nivele de spin
electronic este dată de ecuaţia fundamentală a teoriei RES:
ΔE =E+1/2-E-1/2= [1/2 ge mBB0 –(-1/2gemBB0)] =geμBB0,
Deoarece, in general, energia de interactiune cu un camp
magnetic B0 a unui sistem cu momentul magnetic m este E=
m.B0
 unde ge este numit „factorul giromagnetic” al electronului (vez
şi factorul Landé), iar μ este magnetonul Procopiu-Bohr.
Această ecuaţie spune că separarea sau despicarea
(„splitting”) dintre cele două nivele de energie este strict
proportională cu intensitatea câmpului magnetic aplicat,
aşa cum este ilustrat fenomenul în următoarea figură

E= m.B0
E+1/2=gemBB0

E-1/2=gemBB0
Precesia Larmoor a electronului
Intr-un camp magnetic extern

Precesia Larmoor a
electronului intr-un camp
magnetic extern
 In prezenta unui camp de MU se
poate produce rezonanta

+ =

Sistemul atomic absoarbe de la campul de MU o cuanta

de energie egala cu diferenta dintre energiile celor doua
nivele relevate in camp magnetic static, absorbtia
aparand ca o linie in spectrul RES
 In general, cand substanta studiata prezinta
paramagnetism (ca rezultat al existentei electronilor cu
spin necompensat (diferit de zero) se pot induce
tranzitii intre starile energetice de spin prin aplicarea
unui camp magnetic static care sa le ridice degenerarea
si prin aplicarea ulterioara a unui camp electromagnetic
de energie comparabila cu diferenta dintre cele doua
nivele energetice relevate.

 Tranzitiile de absorbtie apar ca linii in spectrele RES sau

REP (rezonanta electronica paramagnetica)
 Inregistrarea spectrelor RES este deosebit
de utila pentru studierea radicalilor liberi
(intotdeauna = sisteme paramagnetice)
produsi prin scindarea (disocierea) unei
molecule, de exemplu sub actiunea
radiatiilor ionizante (dar nu numai)
 Studierea acestor radicali liberi
paramagnetici poate da informatii despre
locul unde s-au produs (in proba expusa la
radiatii ionizante) si chiar despre
mecanismele de actiune ale acestor
radiatii
 Conditia de rezonanta in fenomenul RES;
exemplu numeric
 Conditia de rezonanta este data de
relatia
 unde n este frecventa microundelor iar
h este constanta lui Planck
 In practica, majoritatea aparatelor hn= DE
lucreaza la o valoare data a frecventei hn = geμBB0
microundelor si cu un camp magnetic
static variabil.
 Daca avem un camp de microunde cu
frecventa de 20 GHz atunci campul
magnetic static necesar pentru
producerea rezonantei va fi de circa
0.71 Tesla, (un magnet de laborator de
mari dimensiuni).
 De asemenea, ceea ce se inregistreaza
este derivata liniilor de absorbtie.
Valorile lui DE pentru diferite nivele
energetice E sunt specifice anumitor
specii de radicali liberi
(paramagnetici)
Spectrul RES al
unei substante
simple va
prezenta linii
specifice in
anumite zone ale
domeniului de
valori ale lui B
Fenomenul RES si inregistrarea lui
 Cele mai comune aparate lucreaza in domeniul
9-10 GHz (X-band).
 In combinatie cu alte tehnici, RES se poate
aplica la detectarea si urmarirea radicalilor liberi
in decursul reactiilor lor in sistemele biologice.
 Tehnica RES de frecventa mare (95 GHz, banda
W) este utila in studierea unor probe foarte mici
deoarece este caracterizata de mare rezolutie si
poate face usor diferenta intre diversele specii
de radicali – care apar “suprapusi” daca sunt
analizati in banda X.
 Radicalii ce au fost studiati in banda W includ si
pe cei ai unor molecule importante din punct de
vedere biologic cum sunt chinonele si flavinele
sau radicalii tirosinei si triptofanului (aminoacizi).
 Direct EPR of a tyrosyl radical
H H
COR'
HC CH2 O.
NHR
H H

 Gunther, M.R., Sturgeon, B.E., and Mason, R.P., Free Radic. Biol. Med. 28:709-719, 2000
 Tipuri de analize RES in vivo
 Spectrometrele RES care lucreaza la
frecvente mici: 1-2 GHz (L-band) si 2-4
GHz (S-band),sunt capabile sa inregistreze
spectre de la organisme vii si organele
perfuzate pentru detectarea oxigenului
solvit in tesuturi, a concentratiei de oxid
de azot NO si studierea reactiilor redox
specifice metabolismului animal.
Analizarea prin RES a lichidului din vezica biliara
presupune:

1. Colectarea lichidului la fiecare 15 min

2. Inghetarea imediata la –70oC
3. Transferarea in cuve plate de cuart
4. Barbotarea de oxigen pentru evidentierea –
prin oxidare- a radicalilor aflati in forma
redusa si apoi cu azot pentru ingustarea
liniilor spectrale
5. Introducerea cuvei in cavitatea rezonanta
6. Acordarea instalatiei pentru obtinerea
rezonantei
Bile samples collected every 20 min
for 2 h in tube containing DP and BC
 Spectrele RES ale unor radicali liberi evidentiati in
lichidul biliar

Knecht, K.T., DeGray, J.A., and Mason, R.P., Mol. Pharmacol. 41: 943-949, 1992.
 Pe baza acestui fenomen s-a dezvoltat Spectroscopia RES
Spectroscopia
care constă în înregistrarea şi analizaRES
detailată a spectrelor
RES.
 Tehnologia RES a condus la dezvoltarea de aparate RES
foarte sensibile pentru înregistrarea şi amplificarea de
spectre RES, fie cu surse de microunde continue, fie
mai recent cu pulsuri de microunde, urmate de
transformări de tip Fourier (FFT sau FFT= FT foarte
rapide).
 In termeni de sensibilitate, spectroscopia RES ocupa un
loc intermediar între spectroscopia de infraroşu apropiat
(NIR, sau IRA) pulsată (FT-NIR), pe de o parte- şi
spectroscopia RMN/NMRI pe de altă parte, (cu un factor
de o sută pînă la o mie de ori mai mare în comparaţie cu
cele din urmă, cel puţin pînă în prezent!).
 Această capacitate de detectare de cantităţi extrem
de mici de spini electronici neîmperecheaţi face ca
tehnica RES să fie extrem de utilă în studiul radicalilor
liberi in chimie, ionilor paramagnetici in chimia
fizică, diferitelor efecte biochimice şi biofizice în
 Schema bloc a unei instalatii RES

• The EPR Spectrometer consists of many different components.

– Microwave Bridge: Electromagnetic Radiation Source
– Microwave Cavity: Amplifies weak signals from the sample
– Magnet: Splits the electronic spin energy levels
– Console: Contains signal processing and control electronics
and a
units for acquiring a spectrum
– Computer: Used to analyze data as well as coordinating all
the units for acquiring a spectrum.
 Markerii de spin
 Un marker de spin este (SL) o molecula organica
ce contine un electron impar de obicei un atom de
azot si, in plus, prezinta si capacitatea de a se lega
cu alte molecule.

 Markerii de spin sunt instrumente utile pentru

sondarea dinamicii locale a proteinelor sau
membranelor biologice pe baza spectroscopiei RES

 Astfel se poate monitoriza o regiune specifica din

interiorul unei proteine.

 Se pot utiliza si aminoacizii cu markeri de spin.

 Approximate Energy Levels for a
14N Nitroxide Spin Label; S =½, I=1

In general, EPR gives

information on the #
and nuclear spin state
of nearby nuclei –
coordination sphere of
metal centers in
in metalloproteins

Interactiunea
nivelelor energetice
electronice de spin
cu energia nucleului
Energy level Diagram for a 15N Nitroxide
S=½; I=½
 Rezonanţa magnetică nucleară
(RMN)
 Dintre toate metodele fizice, rezonanţa magnetică nucleară (RMN)
este aceea care oferă cea mai bogată şi completă informaţie
structurală asupra compuşilor organici.
 Spre deosebire de spectroscopia IR, în RMN practic toate semnalele
sunt interpretabile relativ uşor, iar spre deosebire de spectroscopia
electronică metoda RMN oferă mult mai multe informaţii. În timp ce
spectroscopia IR sau cele de masă sunt prea bogate în informaţii,
deci greu interpretabile, iar cele UV-VIZ prea sărace, spectrele RMN,
atât cele 1H cât şi cele 13C, conţin exact informaţia necesară, care
poate fi pusă în legătură directă cu formula structurară a substanţei.
Dezvoltată prin analogie cu rezonanţa electronică de spin, rezonanţa
magnetică nucleară de înaltă rezoluţie, aplicată iniţial pentru studiul
protonilor şi extinsă ulterior pentru o serie de alţi nuclizi: 13C, 19F,
31P, 17O etc., a devenit în prezent cea mai importantă metodă de
studiu a structurii, configuraţiei compuşilor organici
Principiul RMN – schema despicarii nivelelor in camp magnetic si
conditia de rezonanta

hn= DE
hn = gNμNB0
 Magnetismul nuclear


 Întocmai ca şi electronul, protonul efectuează o mişcare rapidă de rotaţie în
jurul axei sale, mişcare numită “spin nuclear 21”.
 Mişcării de rotaţie a protonului (sarcină electrică) I se asociază moment
magnetic de spin.
Deşi lipsit de sarcină, neutronul prezintă de asemenea un moment magnetic
de spin.
 Acest fapt neaşteptat se poate explica prin existenţa unei structuri interne
comportând sarcini electrice fracţionare (quark).
În cazul unor nuclee compuse din mai mulţi protoni şi neutroni, are loc o
compensare spinilor particulelor elementare, spre exterior manifestându-se
un moment magnetic rezultant.
Magnetismul nuclear este caracterizat prin numărul cuantic de spin nuclear,
I, care, spre deosebire de cel al electronului, poate avea valori diferite
pentru nuclee diferit, în conformitate cu următoarele reguli:
 a) nuclizii conţinând un număr par de protoni şi un număr par de
neutroni au numărul cuantic de spin nuclear egal cu zero (I=0). La aceşti
nuclizi momentele magnetice de spin ale protonilor şi neutronilor se
compensează separat; ne-apărând un moment magnetic de spin nuclear
(μI=0). Există 165 asemenea nuclizi stabili.
b) nuclizii conţinând un număr impar fie de protoni fie de neutroni au
ca valori I numere fracţionare: . Există 110 asemenea nuclizi stabili,
împărţiţi aproape egal în nuclizi par-impari şi impar-pari (după valorile lui Z
şi lui N).
c) nuclizii în care atât protonii cât şi neutronii sunt prezentaţi în număr
impar au valori I întregi: I=1;2;3 (există numai 6 asemenea nuclizi stabili:
2D, 6Li, 10B, 14N, 50V, 180Ta).
Cele de mai sus se mai pot exprima şi în felul următor: nuclizi cu număr de
masă, A= Z+N, impar au totdeauna spinul nuclear … în timp de nuclizii cu
A par au spinul nul când Z este par şi numărul întreg diferit de zero când Z
este impar.
 Se deci că nucleele izotopilor aceluiaşi element pot avea
comportări magnetice foarte diferite. De exemplu,
nuclizii 16O şi 18O nu posedă moment magnetic de spin
(I=0) în timp ce 17O are . (Pentru alte mărimi I, v.
tabelul 5.1).
Unitatea de moment magnetic nuclear este aşa-numitul
magneton nuclear, μn, (analog cu magnetonul Bhor-
Procopiu al electronului) definit prin relaţia

 în care e reprezintă sarcina elementară, h - constanta lui

Planck, mp – masa protonului iar c – viteza luminii.
Între valoarea teoretică a momentului magnetic,
calculată din impulsul de rotaţie şi valoarea reală există o
nepotrivire, datorită unei repartiţii diferite a sarcinii
electrice în raport cu masa. Aceasta face necesară
introducerea aşa-numitului factor giromagnetic nuclear,
gn, reprezentând raportul între valoarea reală şi ce
teoretică a momentului magnetic.
 Orientarea nucleelor în câmp
magnetic exterior
 Momentul magnetic foarte mic al nucleelor se poate pune în
evidenţă prin interacţiune sa cuantificată, cu un câmp
magnetic exterior. Vectorul momentului magnetic al nucleului
se orientează în raport cu direcţia câmpului exterior.
Orientarea se cuantifică, în sensul ca proiecţia momentului
magnetic nuclear pe direcţia câmpului poate avea avea numai
anumite valori. În general momentul magnetic al nucleului
poate adopta (2I+1) orientări. Pentru nucleele cele mai des
întâlnite 1H, 13C, 19F, 31P, spinul nuclear I are valoarea ,
astfel încât rezultă numai 2 orientări posibile (na aproximativ
în sensul câmpului (făcând cu aceasta un unghi de ) numită şi
orientare paralelă şi alta aproximativ opusă sensului câmpului
(făcând un unghi de 126º cu aceasta) numită şi orientare
antiparalela.
 Pentru a se putea menţine la această înclinaţie constantă
vectorul momentului magnetic nuclear execută o mişcare de
precizie de (Larmor) de frecvenţă proporţională cu
intensitatea H a câmpului magnetic exterior ().
 În cele două orientări posibile ale nuclizilor care
au I=1/2 apare o diferenţă de energie ΔE, dată
de relaţia 5.3:

Spre deosebire de nivelele energetice din

spectroscopia optică, în acest caz diferenţa de
energie dintre cele două stări este influenţabilă
din exterior prin valoarea intensităţii H a
câmpului magnetic exterior (fig. 5.1.c)

 În mod asemănător spectroscopiei optice trecerea de
la nivelul energetic inferior (orientarea paralelă pe
cel superior (orientarea antiparalelă) se poate realiza
prin absorbţia unei cuante de radiaţie
electromagnetică de energie egală cu ΔE:
Spectroscopia RMN se bazează tocmai pe acest
fenomen de trecere de la un nivel energetic pe altul
(simultan cu inversarea spinului în raport cu câmpul
magnetic exterior) atunci când nucleul situat în câmp
magnetic este iradiat cu o sursa de radiaţii
electromagnetice de frecvenţă adecvată v. Tranziţia
din orientarea paralelă în cea antiparalelă este
însoţită de absorbţia de energie electromagnetică.
 hn= DE
Ecuaţia este relaţia fundamentală de rezonanţă
(egalitate a energiei radiaţiei absorbite, hv, cu hn = gNμNB0
diferenţa de energie ΔE a stărilor nucleului)
magnetică nucleară; cu ajutorul ei se poate
determina mărimea frecvenţei de rezonanţă pentru
diferiţi
 Factorul de sensibilitate relativă faţă proton, este dat
pentru acelaşi câmp magnetic exterior şi acelaşi număr
de nuclee. În penultima coloană este indicat factorul
care ţine seama doar de caracteristicile magnetice
nucleare (moment magnetic nuclear, raport
giromagnetic), în timp ce ultima coloană s-a luat în
consideraţie abundenţa izotopică naturală.
Factorii de sensibilitate arată că toţi nuclizii din tabel dau
semnale de intensitate relativă mai mică decât protonul;
intensitatea relativă este doar puţin mai mică la 19F, dar
la alţi nuclizi ca de ex. 13C, la abundenţa naturală, ea
este atât de redusă încât pentru 13C-RMN trebuie
folosite tehnici diferite (transformată Fourier, a se vedea
mai departe).
 În această ordine de ideii merită menţionat că
radioizotopul hidrogenului tritiul[1], are factorul de
sensibilitate relativă 1,21, deci mai mare ca al protonului.
De aici decurge importanţa şi sensibilitatea
determinărilor de 3H-RMN, care se aplică în practică pe
scară din ce în ce mai largă (în special în determinările
de distribuţie a 3H în molecule marcate).
 Momentele magnetice nucleare, μI , fiind extrem de mici,
diferenţele de energie dintre cele două nivele (orientări)
sunt şi ele extrem de mici şi corespunzător acestora
frecvenţele absorbite sunt de ordinul zecilor de
megahertzi (la câmpuri uzuale de 10000 – 25000 Oe) în
funcţie de valoarea gn a nuclidului.
 Aceste frecvenţe de absorbţie corespund frecventelor de
precizie Larmor a nuclidului respectiv în câmpul H dat.

Populaţiile celor două nivele, fundamental, N0, şi excitat,
N1, sunt corelate prin ecuaţia lui Boltzmann):
unde T este temperatura în K, ∆E diferenţa de energie a
nivelelor, iar K este constanta Boltzmann.