GENETICA MOLECULARA

 Analiza structurii genetice a unui individ / populatii presupune

 Principiile izolarii ADN din materiale biologice umane

 Electroforeza in gel de agaroza

 Reactia de amplificare enzimatica = reactia de polimerizare in lant =

PCR

 Markeri ADN
 Markeri generati de enzime de restrictie (RFLP)
 Markeri microsateliti (viatia lungii secventei ADN)
 Markeri repetitivi
 REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT (PCR)
Reactia PCR se bazeaza pe selectarea
unui fragment de acid nucleic ajutorul primerilor
conceputi astfel incat secventa lor safie
complementara cu fiecare capat al secventei si
amplificarea acestui fragment prin cicluri
repetate de sintezade DNA.

Primerii, dNTP-urile si celelalte

componente ale rectiei, inclusiv matrita DNA,
sunt amestecate si tuburile de reactie sunt
plasate intr-un thermal cycler, care trece reactia
printr-o succesiune de etape ce se desfasoara
la temperaturi diferite si perioade de timp
diferite.

Fiecare ciclu de reactie cuprinde trei

pasi: topirea, la 950C, hibridizarea, la o
temperatura variabila funtie de primer si
sinteza noii catene ADN, la 720C.

Fiecare ciclu PCR dubleaza teoretic

cantitatea de secvente ale matritei in reactie.
Electroforeza in gel a agaroza 2% a produsilor de amplificare PCR ale markerului STR TH01 folosind ADN-
ulElectroforeza in gelChelex
extras cu metoda a agaroza
100.2% a produsilor
Liniile 1-9 probe de amplificare
ADN, Linia 10 –PCR alenegativ
control markerului STR TH01
al amplificarii, Mkfolosind
– markerADN-
de
ul extras cu metoda Chelex 100. Liniile 1-9 probe ADN, Linia 10 – control negativ al amplificarii,
greutate 100pb. Liniile 1, 4, 5 – indivizi sigur heterozigori, cu alele care au o diferenta ≤ 6pb intre ele Mk – marker de
greutate 100pb. Liniile 1, 4, 5 – indivizi sigur heterozigori, cu alele care au o diferenta ≤ 6pb intre ele
 Componenetele reactiei PCR
Componenetele reactiei PCR
Primerii
 dimensiunea primerilor sa fie cuprinsa intre 15-30 bp ;
 primerii sa aibe un procent molar de guanina + citozina cuprins intre 40-60% ;
 primerii sa nu fie complementari intre ei la capatul 3’ astfel incat sa nu se formeze dimeri ;
 valoarea Tm a primerilor sa permita atasarea la temperatura de 55˚C-60˚
 sa existe o distributie echilibrata a domeniilor bogate in A/T si G/C
 primerii sa nu prezinte structuri secundare interne
Enzimele

Caracteristici
Naturala
Termostabili
(nat.) Activitate Activitate Rata de
ADNpolimeraza Sursa tate
/Recombinata exonucleazi exonucleazi extensie
‘half-life’la
(rec.) ca 5’3’ ca 3’5’ (nt. sec-1)
950C (min)
Taq nat. Thermus aquaticus 40 Da Nu 75
Pyrococcus
Pfu nat. >120 Da Da 60
furiosus
VentTM rec. T. litoralis 1380 Nu Da -
DeepVentTM rec. Pyrococcus GB-D 400 Nu Da >80
Thermus
Tth rec. 20 Da Nu 33
thermophilis
 Matrita ADN
 Reactia PCR este direct influentata de calitatea matritei ADN introduse.

 Integritatea AND matrita este si ea importanta pentru succesul unei reactii

PCR. Anterior polimerizarii, se recomanda verificarea electroforetica a dimensiunii si
integritatii AND matrita.

MgCl2
 Ionii Mg2+ formeaza complexe solubile cu deoxinucleotidtrifosfatii,
formand astfel substratul recunoscut de ADN polimeraza.

 Concentratia optima de MgCl2 variaza intre 1mM -5mM. Excesul ionilor

de Mg2+ in reactia PCR poate determina atasari nespecifice ale primerilor.

Deoxinucleotidtrifosfati (dNTP)- dCTP, dGTP, dATP, dTTP

 In reactie trebuiesc introduse cantitati echimolare din toate cele patru

tipuri de molecule pentru a micsora riscul unei polimerizari eronate.

 Concentratia finala recomandata este de 50-500mM pentru fiecare

dNTP.Concentratia dNTP trebuie corelata cu concentratia ionilor Mg 2+.
 MARKERI
MARKERI ADN
ADN
(A) Polimorfise de secventa --------AGACTAGACATT-------
(A) Polimorfise de secventa --------AGATTAGGCATT-------

– RFLP: Restriction fragment-length polymorphism (polimorfismul lungimii

fragmentelor de restrictie)

–– SNP: Single nucleotide polymorphism (polimorfismul unei nuclotide)

---------(AATG)(AATG)(AATG)----------
(B)
(B)Polimorfisme
Polimorfismede
delungime
lungime ---------(AATG)(AATG)----------

–– Minisateliti = VNTR: Variable number of tandem repeats (numar variabil de

repetitii in tandem)

–– Microsateliti = STR: Short tandem repeats (repetitii scurte in tandem)

 POLIMORFISMUL
POLIMORFISMULFRAGMENTELOR
FRAGMENTELORDE
DERESTRICTIE
RESTRICTIE
(RFLP)
(RFLP)
RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism

•RF vine de la Restriction Fragments (fragmente de restrictie). Acestea sunt

fragmentele rezultate in urma taierii moleculei ADN cu enzime de restrictie
•L vine de la Length (lungime) si se refera la lungimea fragmentelor de restrictie
•P vine de la Polymorphisms (polimorfism), un termen grecesc petru “multe
forme”. Lungimea unora dintre fragmentele de restrictie variaza foarte mult intre
indivizi.
Acesta este, istoric vorbind, primul tip de polimorfism ADN identificat
si utilizat in cartarea genica
Enzimele de restrictie sunt produse se bacterii ca mecanism de aparare impotriva
virusurilor
Aceste enzime taie ADN la niveul unor secvente specifice, denumite situsuri de recunostere

Rezultatul – fragmente mai mici de ADN denumite RFLP-uri

In acest tip de polimorfism o schimbare in secventa ADN poate determina aparitia sau
abolirea unui situs recunoscut de o enzima de restrictie

In marea majoritate a cazurilor sunt markeri bialelici si deci au o utilitate limitata in

cartarea generala
 - boala genetica – la pacientii ambele alele ale genei pentru lantul
Screening pentru anemia falciforma β al hemoglobinei (betaS) au in pozitia 6 aminoacidul Val (valina)
- indivizii normali au in aceasta poziti Acidul Glutamic
-singura diferenta este o substituti de la T la A in codonul 6

- converteste codonul GAG (pt Glu) in GTG (pt. Val)

- disparitua situsului CTGAGG – recunoscut de o enzima de restrictie

Polimorfism RFLP la 5 indivizi:

- liniile 2 si 5 = forma
salbatica a situsului RFLP;
-liniile 1 si 3 = au un situs de restrictie
in plus;
- linia 4 = individ cu 2
situsuri de restrictie in plus fata de
forma salbatica
 VARIATIA
VARIATIANUMARULUI
NUMARULUIDEDEREPETITII
REPETITIIIN
INTANDEM
TANDEM==
MINISATELITII
MINISATELITII
(VNTR)
(VNTR)
O secventa scurta de ADN (20 – 50 nucleotide) repetata de un numar variabil de ori

Multialelici si, deci, cu grad mare de informativitate pentru analiaza variabilitatii genetice in
populatiile umane

VNTR – urile apar in general prin crossing over inegal

Nu sunt uniform distribuiti in genom: mai ales la nivelul telomerelor si regiunilor
hipervariabile

Doua tipuri:
- unici in genom = VNTR single locus
- cu locatii multiple in genom = VNTR multilocus
 Dezavantajele minisatelitilor
VNTR
VNTRmultilocus
multilocus
1. necesita oameni specializati pentru a obtine
Caracteristicile VNTR multilocus un pattern corect;

 Primii minisateliti descrisi - Jeffreys

(1985) - probe de ADN desemnate:
 33.6, cu motivul reprezentat de
secventa (AGGGCTGGAGG) - repetata
de pana la 18 ori
 33.15 - secenta de bazade 16pb
(AGAGGTGGGCAGGTGG) repetata de
pana la 29 de ori
 Locii detectati prin aceste probe erau
dispersati in genom, de unde si numele de
2. cantitatea relativ mare de ADN necesara
pentru Southern Blotting (analiza unui VNTR
multilocus necesita o cantitate de ADN de 25 de
ori mai mare decat cere o analiza a unui VNTR
single-locus);
3. dificultatile pe care le prezinta interpretarea
unui numar mare de fragmente de ADN.
Variatiile individuale ale gelurilor de agaroza pot
altera mobilitatea electroforetica a ADN-ului,
generand asa-numitele benzi "shifts".

"VNTR-uri mutilocus".

 Prin analiza acestor markeri sunt

generate patternuri de benzi specifice
pentru ficare individ, in functie de
numarul de repetitii al secventei de baza.
 VNTR
VNTRsinglelocus
singlelocus
Caracteristicile VNTR singlelocus

 Larg raspanditi in genom – ex. in

asociere cu locusul -globinei pe
cromozomul 16, denumit  HVR (HVR =
hipervariable locus)

 Fragmentele polimorfice sunt de

obicei mai lungi decat in cazul
minisatelitilor multilocus, deoarece
numarul de repetitii in tandem al
secventei de baza este mai mare.

 Patternurile sunt reprezentate doar

de doua benzi maxim, care indica cele
doua alele existente la acel locus.
Patternul bialeleic al acestor markeri
este mai usor de interpretat, cu toate ca
gradul de informativitate nu este la fel de
mare ca pentru VNTR-urile multilocus
 REPETITII SCURTE IN TANDEM MINISATELITII
(STR)
TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAA - numarul unitatilor repetitive
GACAGGTG ATA/GATA/GATA/GATA/GATA/ GATA/GATA/
GATA/GATA/GATA/GATA/ GATA TCATTGAAA GACAAA
variaza de la alela la alela, in
ACAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC timp ce regiunile flancatoare
(unde se fixeaza primerii pentru
= 12 repetii in tandem - este denumita “alela PCR) sunt identice la toti
12”
indivizii si toate alele
D = markerul apartiene AND
17 = cromozomul 17
D17S128
S = single locus (exista intr-o singura copie in genom)
128 = locusul 128 descris pe cz. 17

Tipurile de repetitii ► Dinucleotide (CA)(CA)(CA)(CA)

STR: ► Trinucleotide (GCC)(GCC)(GCC)
► Tetranucleotide (AATG)(AATG)(AATG)
► Pentanucleotide (AGAAA)(AGAAA)
► Hexanucleotide (AGTACA)(AGTACA)
Caracteristicile STR- urilor
Avantajele microsatelitilor
 Sunt similare cu VNTR-urile si
metodele prin care sunt analizate sunt
aceleasi, dar difera de VNTR-uri pentru ca  permit analiza unor probe
degradate (deoarece sunt analizate
au o unitate repetitiva de baza mai mica (2-
7pb) si o dimensiune totala de asemenea fragamente scurte de ADN)
mai mica (pana la 500pb).

 Repetitiile tetranucleotidice sunt cele  prin reactia PCR pot fi analizate

cantitati foarte mici de material genetic
mai utilizare sisteme in analizele de
linkage, in cartarea genetica, in genetica
populatiilor si in medicina forensica
datorita fidelitatii mari cu care se
 numarul de loci care pot sa fie
analizati este foarte mare; acesta este
realizeaza amplificarea secventelor tinta important in anaizele de identificare
prin PCR. individulala cand sunt luate in studiu si
rude
 grad mare de heterozigotie in
populatie
 procesul de analiza este rapid;
poate fi terminat in una doua zile;
 numar regulat de repetitii
 alele usor de identificat
 Localizarea SNP -urilor
SNP-urile din regiunile necodificatoare pot sa ....
 aibe nici un efect
 afecteze semnalele reglatorii
 interfereze cu situsurile de splicing
 sa introduca un codon STOP anticipat

SNP-urile din regiunile codificatoare pot (cSNP) sa...

 determine modificari sinonime ale codonului
 determine modificari nesinonime ale codonuluio – modificarea aminoacidului
codificat
ARMS
ARMS- - PCR
PCR( (Amplification
AmplificationRefractory
RefractoryMutation
MutationSistem)
Sistem)

 Aceasta metoda de detectare a mutatiilor punctiforme a fost pentru

prima data descrisa de Newton et al. 1989 si a devenit curand o tehnica
standard pentru evidentierea SNP-urilor, deoarece e rapida, de incredere
si nu scumpa.

 Metoda presupune crearea a trei primeri, unul consens si doi alela –

specifici.

 Astfel, primerul “normal”, care contine nucleotida wild-type este

refractar la amplificarea secventei tinta “mutate” si, invers, primerul
“mutat” nu va amplifica secventa tinta cu forma salbatica a
polimorfismului. In general, primerii alela – specifici au ultima ba de la
capatul 3’ modificata.

 Tehnica se bazeaza si pe “propietatea” Taq polimerazei de a nu avea

activitate de proof reading 3’-exonucleazica
Deoarece polimorfismele Apa I si Taq I sunt localizate foarte aproape
unele de altele le-am analizat printr-un ARMS – PCR dublu, in patru
reactii hibrid.