MARKERI ADN

(A) Polimorfise de secventa --------AGACTAGACATT-------

--------AGATTAGGCATT-------

– RFLP: Restriction fragment-length polymorphism (polimorfismul lungimii

fragmentelor de restrictie)

–– SNP: Single nucleotide polymorphism (polimorfismul unei nuclotide)

---------(AATG)(AATG)(AATG)----------
(B) Polimorfisme de lungime ---------(AATG)(AATG)----------

–– Minisateliti = VNTR: Variable number of tandem repeats (numar variabil de

repetitii in tandem)

–– Microsateliti = STR: Short tandem repeats (repetitii scurte in tandem)

 POLIMORFISMUL FRAGMENTELOR DE RESTRICTIE
(RFLP)
RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism

•RF vine de la Restriction Fragments (fragmente de restrictie). Acestea sunt

fragmentele rezultate in urma taierii moleculei ADN cu enzime de restrictie
•L vine de la Length (lungime) si se refera la lungimea fragmentelor de restrictie
•P vine de la Polymorphisms (polimorfism), un termen grecesc petru “multe forme”.
Lungimea unora dintre fragmentele de restrictie variaza foarte mult intre indivizi.

Acesta este, istoric vorbind, primul tip de polimorfism ADN identificat si

utilizat in cartarea genica
Enzimele de restrictie sunt produse se bacterii ca mecanism de aparare impotriva
virusurilor
Aceste enzime taie ADN la niveul unor secvente specifice, denumite situsuri de recunostere

Rezultatul – fragmente mai mici de ADN denumite RFLP-uri

In acest tip de polimorfism o schimbare in secventa ADN poate determina aparitia sau
abolirea unui situs recunoscut de o enzima de restrictie

In marea majoritate a cazurilor sunt markeri bialelici si deci au o utilitate limitata in

cartarea generala
 - boala genetica – la pacientii ambele alele ale genei pentru lantul
Screening pentru anemia falciforma β al hemoglobinei (betaS) au in pozitia 6 aminoacidul Val (valina)
- indivizii normali au in aceasta poziti Acidul Glutamic
-singura diferenta este o substituti de la T la A in codonul 6

- converteste codonul GAG (pt Glu) in GTG (pt. Val)

- disparitua situsului CTGAGG – recunoscut de o enzima de restrictie

Polimorfism RFLP la 5 indivizi:

- liniile 2 si 5 = forma salbatica
a situsului RFLP; -liniile 1 si 3 = au
un situs de restrictie in plus;
- linia 4 = individ cu 2 situsuri
de restrictie in plus fata de forma
salbatica
 VARIATIA NUMARULUI DE REPETITII IN TANDEM =
MINISATELITII
(VNTR)
O secventa scurta de ADN (20 – 50 nucleotide) repetata de un numar variabil de ori

Multialelici si, deci, cu grad mare de informativitate pentru analiaza variabilitatii genetice in populatiile
umane

VNTR – urile apar in general prin crossing over inegal

Nu sunt uniform distribuiti in genom: mai ales la nivelul telomerelor si regiunilor hipervariabile

Doua tipuri:
- unici in genom = VNTR single locus
- cu locatii multiple in genom = VNTR multilocus
 VNTR multilocus Dezavantajele minisatelitilor

1. necesita oameni specializati pentru a obtine un

Caracteristicile VNTR multilocus pattern corect;

 Primii minisateliti descrisi - Jeffreys (1985) -

probe de ADN desemnate:
 33.6, cu motivul reprezentat de
secventa (AGGGCTGGAGG) - repetata de pana
la 18 ori
 33.15 - secenta de bazade 16pb
(AGAGGTGGGCAGGTGG) repetata de pana la 29
de ori
 Locii detectati prin aceste probe erau
dispersati in genom, de unde si numele de
"VNTR-uri mutilocus".
2. cantitatea relativ mare de ADN necesara pentru
Southern Blotting (analiza unui VNTR multilocus
necesita o cantitate de ADN de 25 de ori mai mare
decat cere o analiza a unui VNTR single-locus);
3. dificultatile pe care le prezinta interpretarea unui
numar mare de fragmente de ADN. Variatiile
individuale ale gelurilor de agaroza pot altera
mobilitatea electroforetica a ADN-ului, generand asa-
numitele benzi "shifts".

 Prin analiza acestor markeri sunt generate

patternuri de benzi specifice pentru ficare
individ, in functie de numarul de repetitii al
secventei de baza.
 VNTR singlelocus

Caracteristicile VNTR singlelocus

 Larg raspanditi in genom – ex. in asociere

cu locusul -globinei pe cromozomul 16,
denumit  HVR (HVR = hipervariable locus)

 Fragmentele polimorfice sunt de obicei

mai lungi decat in cazul minisatelitilor
multilocus, deoarece numarul de repetitii in
tandem al secventei de baza este mai mare.

 Patternurile sunt reprezentate doar de

doua benzi maxim, care indica cele doua alele
existente la acel locus. Patternul bialeleic al
acestor markeri este mai usor de interpretat,
cu toate ca gradul de informativitate nu este la
fel de mare ca pentru VNTR-urile multilocus
 REPETITII SCURTE IN TANDEM MINISATELITII (STR)

TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACAGGTG - numarul unitatilor repetitive

ATA/GATA/GATA/GATA/GATA/ GATA/GATA/
GATA/GATA/GATA/GATA/ GATA TCATTGAAA GACAAA
variaza de la alela la alela, in
ACAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC timp ce regiunile flancatoare
= 12 repetii in tandem - este denumita “alela 12” (unde se fixeaza primerii pentru
PCR) sunt identice la toti
indivizii si toate alele
D = markerul apartiene AND
17 = cromozomul 17
D17S128
S = single locus (exista intr-o singura copie in genom)
128 = locusul 128 descris pe cz. 17

Tipurile de repetitii • Dinucleotide (CA)(CA)(CA)(CA)

STR: • Trinucleotide (GCC)(GCC)(GCC)
• Tetranucleotide (AATG)(AATG)(AATG)
• Pentanucleotide (AGAAA)(AGAAA)
• Hexanucleotide (AGTACA)(AGTACA)
 Avantajele microsatelitilor
Caracteristicile STR- urilor

 Sunt similare cu VNTR-urile si metodele prin

care sunt analizate sunt aceleasi, dar difera de
VNTR-uri pentru ca au o unitate repetitiva de
baza mai mica (2-7pb) si o dimensiune totala de
asemenea mai mica (pana la 500pb).
 permit analiza unor probe degradate
(deoarece sunt analizate fragamente scurte
de ADN)
 prin reactia PCR pot fi analizate cantitati
foarte mici de material genetic

 Repetitiile tetranucleotidice sunt cele mai

utilizare sisteme in analizele de linkage, in
 numarul de loci care pot sa fie analizati
este foarte mare; acesta este important in
cartarea genetica, in genetica populatiilor si in anaizele de identificare individulala cand sunt
medicina forensica datorita fidelitatii mari cu luate in studiu si rude
care se realizeaza amplificarea secventelor tinta
prin PCR.
 procesul de analiza este rapid; poate fi
terminat in una doua zile;
 grad mare de heterozigotie in populatie
 numar regulat de repetitii
 alele usor de identificat
 Benzile "fantoma" (amplificare nespecifica)
Benzile nespecifice, sau benzile "shadow" au fost raportate prima data pentru
polimorfismele repetitiilor dinucleotidice de catre Hauge si Litt. Acest fenomen are ca
rezultat apaitia unor pickuri minore care apar cu o unitate repetitiva mai scurta decat
pickurile majoritatii alelelor (Figura 1.5). Mecanismul principal de aparitei a acestor
amplificari nespecifice este alunecarea polimerazei in timplul amplificarii PCR.
Sistemul STR VWA prezinta in mod obisnuit aceste amplificari nespecifice. In cazul
utilizarii Taq polimerazei in reactia de PCR amplificarile nespecifice reprezinta mai
putin de de 10% din totalul benzilor.
 Electroforeza in gel de poliacrilamida
PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis

Principiul metodei

Vizualizarea variantelor alelice ale

markerilor de tip STR se realizeaza
in geluri de poliacrilamida denaturate
cu uree.

Gelurile de poliacrilamida au o
dimensiune mult mai mica a porilor
decat gelurile de agaroza..

Denaturarea initiala a probelor

asigura formarea de ADNmc ceea ce
permite separea cu rezolutie inalta
(cu diferente de pana la 2pb) a
fragmentelor amplificare
300

251---------
247---------
243---------

200
ANALIZA DE LINKAGE PENTRU GENA CD2-AP

ANALIZA
ANALIZA SLINK MULTIPOINT

penetranta penetranta penetranta

completa incompleta (0.7) completa
D6S452 2.26 1,82 -2,91
D6S1651 2,25 1,92 -2,13
D6S1566 2,12 1,95 -2,13
D6S269 2,29 1,82 -2,35
ANALIZA DE LINKAGE PENTRU GENA ITGA3
ANALIZA DE LINKAGE PENTRU GENA ITGA3
Analiza populationala bazata pe SNP
Examplu :

Individ 1:

HVS1 Polimorpism + RFLP

16126C, 16294T, 16296T, 16304C (+13366 BamH1)

Haplotipe Haplogroup: T 2

Individ 2:

HVS1 Polimorphism + RFLP H

162 G - 7025 Alu I
 Doua fenomene care afecteaza frecventa alelelor/genelor :

Founder effect Bottleneck effect

Un numar mic de indivizi se stabilesc Dimensiunea populatiei scade dat unor

intr-o regiune noua, apoi dimensiunea factori de mediu, de ex. Foamete sau
populatiei creste epidemie.

 Variabilitatea genetica scade

 ADN
ADN Mitocondrial
Mitocondrial (mtDNA)
(mtDNA)
La
La formarea
formarea zigotului
zigotului spermatozoidul
spermatozoidul
cromozomul
contribuie
cromozomul doar
doar cu YYmaterialul
materialul genetic
genetic nuclear,
Diversitate genetică
contribuie
nu şişi cu
cu cel
nuInformaţia
Informaţiacel al
cu
al organitelor.
genetică
genetică de
organitelor. De
de aceea,
Depe
pe
nuclear,
tot
cromozomul
aceea, tot
cromozomul YY
mtDNA
este
mtDNA provine
provine de
este transmisă
transmisă la
la mamă,
de exclusiv
mamă,pe
exclusiv fiind
pe transmis
linie
fiind paternă.
transmis
linie paternă.
exclusiv
exclusiv pe
pe linie
linie maternă.
maternă.
Dezechilibru
Dezechilibru de linkage de linkage
Asocierea
Asocierea nene randomică
randomică aa alelelor
alelelor mai
mai
Dovezi multor loci (sau secvenţe de ADN),
multor loci (sau
Microsateliţii
• ADN Mitocondrial
Microsateliţii secvenţe de ADN),
asociere
asociere care
care nu
Microsateliţii
Microsateliţii respectă
nusunt
respectă
sunt loci legile
legile de
loci formaţi
formaţi de
prin
prin
asociere
asociere independentă.
independentă.
repetarea
repetarea în
în tandem
tandem aa unei
unei secvenţe
secvenţe
• ADN-ul cromozomului
scurte Y
scurte de
de ADN.
ADN.
• Dezechilivru de linkage
• Microsateliţii
 Eva Mitocondriala
Cann et al; Nature 1987
 147 indivizi din regiunile
geografice importante (Europa,
Asia, Africa, Australia si Noua
Guinee) au fost analizati

Indivizii din regiunea africana sub-

Sahariana au prezentat cea mai mare
variabilitate a ADNmt-ului

Diferitele linii (haplogrupuri) ale

ADNmt s-au format, prin divergenta,
din acelasi haplogrup ancestral, al
unei femei din Africa
Mitochondrial haplogroups
 mtDNA de Neandertal
Mod. Human AATTCCCCGACTGCAATTCACGCAC-CATCCTC

Chimpanzee ......T.ATT.....ACTGAAA....G....

Neander.#1 GG.CTTTTATTC.T.CCCTGTAAGTATGCT.CT

Neander.#2  .C.....ATT.ATCCCCTGTAA.TATGCTTC

Neander.#3 GG......ATTC.TCCCCTGTAAGTATGCT.C

Neander.#4 GG......ATTC.TCCCCTGTAA.TATGCT.C
 Neandertalienii – Diversitate
genetică limitată
mtDNA differences
Nr. Indivizi
Populaţie analizaţi Mean Min. Max.

Neandertal 3 3.73 - -

Umană modernă 5,530 3.43 0.00 10.16

Cimpanzeii 359 14.81 0.00 29.06

Gorile 28 18.57 0.40 28.79

Harta cromozomului Y
Factorul de determinare testicular (TDF)
Gena pentru butonarea telecomenzii (SRF)
Gena pentru dependenţa de filme violente (T-2)

Gena pt. nevoia de a avea mereu dreptate(LD-U)

Gena pentru scuipat (P2E)

Gena incapacitaţii de aşi exprima emoţiile (ME-2)

Gena pentru capacitatea de a gasi ceva amuzant în râgâituri
(BLCH)
Gena pt. Incapacitatea de a lasa capacul de la WC (BIDET)

Gena pentru pierderea selectivă a auzului (MUM)

Gena pt. Incapacitatea de a cere indicaţii in trafic (LST)

 Y haplogroup distribution

A B C D E F* G H I J K* L M N O P* Q R

Jobling & Tyler-Smith (2003) Nature Rev. Genet. 4, 598-612

 More recent reshaping of diversity

• ‘Star cluster’ Y haplotype originated in/near Mongolia ~1,000 (700-1,300) years ago
• Now carried by ~8% of men in Central/East Asia, ~0.5% of men worldwide
• Suggested association with Genghis Khan (social prestige as a selective force)

Zerjal et al. (2003) Am. J. Hum. Genet. 72, 717-721

 Male vs. Female Divergence

Age of Y mtDNA
Coalescence (Male) (Female)

Minimum 37,000 120,000

Maximum 49,000 474,000

Whitfield, L.S., J.E. Suston, and P.N. Goodfellow. 1995. Sequence variation of the
human Y chromosome. Nature 378: 379-380.
Mixing or replacement?
Diversitatea genetică umană e redusă
 Diversitatea Cromozomului 21
Haplotip
Haplotip
OO combinaţie
combinaţie de de alele
alele (forme
(forme alternative
alternative
ale
ale aceluiaş
aceluiaş locus)
locus) ale
ale unor
unor loci
loci strâns
strâns
linkaţi
linkaţi situaţi
situaţi pe
pe un
un singur
singur cromozom
cromozom
care
care sunt
sunt moşteniţi
moşteniţi împreună.
împreună.

• Există dor trei haplotipuri care sunt comune

pentru 80% din populaţiile umane.
• Mult mai puţine haplotipuri decât era de
aşteptat
Omul modern este distinct dpdv
genetic de Neandertal

Krings et al. (1997) Cell 90, 19-30

Utilizarea markerilor STR pentru analiza
diferenţierii genetice

Based on 120 protein-coding genes in 1,915 populations

Cavalli-Sforza & Feldman (2003) Nature Genet. 33, 266-275