Proiect stiintific de cercetare

EFECTELE DOXICICLINEI ASUPRA

CONDROGENEZEI CELULELOR MEZENCHIMALE ȘI
REPARĂRII CARTILAJELOR

IUGA VERONICA
FACULTATEA DE FARMACIE
ANUL IV
 EXPUNEREA PROBLEMEI

Care este scopul doxiciclinei in medicina si de

ce este necesar sa o studiem?

Doxiclina face parte din categoria moleculelor mici

si este un derivat tetraciclinic sintetic cu activitate
antimicrobiană similară.
Este utilizat în unele zone pentru tratamentul
malariei falciparum cu rezistență la clorochină.
 Prezentarea generala a proiectului

Strategiile de îmbunătățire a calității țesuturilor de

reparație a cartilajului după procedurile bazate pe
celulele măduvei osoase pot reduce dezvoltarea
ulterioară a osteoartritei.
Doxiciclina este ieftină, bine tolerată și s-a demonstrat
că reduce progresia matricei-metaloproteinazelor (MMP)
și osteoartrită. Acest studiu testează ipotezele că
doxiciclina reduce MMP, sporește chondrogenesisul
celulelor stem mezenchimale derivate din măduva osoasă
umană (hMSC) și îmbunătățește reparația in vivo a
cartilajelor.
 CERCETARE

Nouăzeci de pelete de hMSC au fost cultivate în

mediu condrogen cu doxiciclină 0, 1 sau 2 pg / ml.
Peletele au fost evaluate stereomicroscopic, test
proteoglican, qRT-PCR și histologic.
Defectele osteochondrale (OCD) au fost create în
canalurile trochleare ale șobolanilor tratați cu / fără
doxiciclină orală.
Șobolanii au fost sacrificați la 12 săptămâni și
țesuturile de reparație au fost examinate gros și
histologic.
 CERCETARE

Acest studiu arata ca doxiciclina imbunatateste

condrogenoza hMSC si scade MMP-13 in culturile de
pelete si in OCD-urile de sobolan.
Doxiciclina nu a exercitat niciun efect negativ asupra
măsurilor multiple de condrogenizare și reparare a
cartilajelor.
Aceste date susțin utilizarea potențială a doxiciclinei
pentru a îmbunătăți repararea cartilajului pentru a
întârzia apariția osteoartritei.
 INTRODUCERE

Osteoartrita este o cauza principala a durerii.

Incidentele cartilagiilor focale sunt cunoscute pentru accelerarea degenerării
cartilajului înconjurător și pentru accelerarea apariției osteoartritei. Celulele
articulare au o capacitate limitată de a se repara după anumite leziuni.
Microfractura (stimularea măduvei osoase) este frecvent utilizată pentru a
trata leziunile cartilagiilor focale.
Această tehnică implică recrutarea celulelor stem mezenchimale derivate din
măduva osoasă (MSC) în zona defectului pentru a participa la repararea
cartilajelor.
Cu toate acestea, repararea rezultată nu restabilește cartilajul articular hialin,
ci duce la formarea unui țesut cicatricial fibrocartilaginos inferior mecanic1.
Prin urmare, sunt necesare strategii clinice pentru îmbunătățirea tipului și
calității țesutului de reparare după procedurile de stimulare a măduvei pentru a
întârzia sau prevenirea apariției osteoartritei.
 ANALIZE STATISTICE

Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând Pachetul Statistic

pentru Studii Sociale (SPSS).
Ipotezele datelor parametrice au fost testate pentru toate datele:
normalitatea distribuției datelor cu Shapiro-Wilk și omogenitatea
varianței cu testele Levene.
Studiile in vivo au fost efectuate si,ca urmare, datele au fost observate
utilizând animale independente.
Pentru compararea între trei grupuri și date multiple pentru datele in
vitro, a fost utilizată analiza independentă a varianței în două sensuri cu
concentrația de doxiciclină și punctele de timp ca variabile principale
independente.
Pentru comparații între două grupuri pentru datele in vivo, s-a utilizat
t-testul Student pentru datele parametrice și au fost utilizate teste Mann-
Whitney U pentru date non-parametrice.
VARIABILE
VARIABILE
VARIABILE
 REZULTATE

Zonele de pelete chondrogenice hMSC au crescut cu creșterea

concentrațiilor de doxiciclină (p = 0,002) și cu creșterea timpului
în cultura condrogenică (p = 0,002).
Testul Tukey post-hoc a arătat că zonele peleților la punctele de
timp de 14 și 21 de zile au fost semnificativ mai mari pentru cele
cultivate în doze de 1 μg / ml (p = 0,014) și doxiciclină de 2 μg /
ml (p = 0,002) comparativ cu cele cultivate fără adăugare de
doxiciclină.
Nu a existat o diferență semnificativă în zonele de pelete între
cele cultivate în doxiciclină 1 și 2 μg / ml. Efectul interacțiunii
dintre cele două variabile principale, concentrația de doxiciclină și
timpul de cultură, a fost, de asemenea, nesemnificativ (p = 0,377).
Analizele biochimice ale peletelor condrogenice hMSC
 S-au măsurat și calculat conținutul total de GAG și ADN pe probe de
peletă și raportul acestora pe pelete condrogenice vechi de 3, 7, 14 și 21
zile pentru a analiza efectul doxiciclinei asupra condrogenzei și
proliferării /viabilității hMSC.
Pentru toate cele trei măsuri de rezultat, a existat un efect principal
semnificativ al timpului în cultura chondrogenică (p <0,001).
Cu toate acestea, efectul principal al concentrației de doxiciclină și
efectele de interacțiune nu au fost semnificative.
Testele Tukey post-hoc pentru conținutul GAG total și raportul GAG /
ADN au evidențiat diferențe semnificative ale acestor variabile de
rezultat între toate punctele de timp diferite (p <0,001). Pe de altă parte,
testul Tukey post-hoc pentru conținutul total de ADN a prezentat
diferențe semnificative între ziua 3 și ziua 7 (p <0,001), -14 (p <0,001) și
-21 (p = 0,009).
 CERCETARE.ANALIZA.EXAMINARE

Acest studiu a arătat că doxiciclina a îmbunătățit formarea

țesutului cartilagian și a diminuat MMP-13 atât în culturi de
pelete MSC umane cât și în defecte osteocondrale de șobolan.
Folosind mai multe măsuri de condrogenesis și reparații
cartilaginoase, doxiciclina, de asemenea, nu pare să exercite
nici un efect negativ asupra condrogenzei MSC umane in vitro
sau asupra reparației defectului osteochondral la șobolan in
vivo.
Aceste date sprijină în continuare activitatea în utilizarea
potențială a doxiciclinei pentru a îmbunătăți repararea
cartilajului sau ca adjuvant la alte strategii de tratament pentru
întârzierea sau prevenirea apariției osteoartritei.
 Adăugarea doxiciclinei în apa de băut este o metodă
simplă și eficientă de administrare a medicamentului.
Cu toate acestea, există variabilitate inerentă cu această
metodă deoarece admisia de apă liberă de către animale
individuale nu este bine controlată.
De asemenea, este dificil să monitorizați consumul total
de apă pentru a determina aportul real de doxiciclină.
Dificultatea controlării aportului de doxiciclină prin
includerea medicamentelor în apa de băut poate
reprezenta observațiile variabile privind efectele
doxiciclinei observate în acest studiu și în alte studii.
 Studiile in vitro în care doza poate fi controlată a arătat că doxiciclina nu are un
efect toxic / inhibitor asupra mai multor măsuri de condrogeză MSC.
Datele in vitro au arătat, de asemenea, că doxiciclina a prezentat o reducere
dependentă de doză a expresiei genei MMP-13, precum și expresii proteice în ziua 21
a culturii de pelete.
Acest lucru este în concordanță cu activitatea de suprimare a doxiciclinei MMP-13
găsită în alte tipuri de țesuturi diferențiate, cum ar fi condrocitele și sinoviocitele.
Cu toate acestea, inhibarea mediată de doxiciclină a exprimării mmp-13 a apărut
mai devreme după 24 de ore de expunere la doxiciclină în alte studii pe chondrocite.
Acest efect a fost observat la 21 de zile în culturile noastre de pelete
chondrogenice hMSC.
Efectul inhibitor al doxiciclinei asupra exprimării genei mmp-13 poate fi potențial
specific pentru tipurile de celule diferențiate și nu în MSC-urile de stare multi-linie
 Datele in vivo sugerează în plus că administrarea orală de doxiciclină
nu are efect dăunător, dar poate îmbunătăți repararea cartilajului.
În timp ce am efectuat studii in vitro utilizând MSC uman pentru a
îmbunătăți relevanța translațională, am efectuat studii in vivo la
șobolani pentru a investiga efectele doxiciclinei asupra celulelor de
reparație a măduvei osoase gazdă accesate prin crearea defectelor
osteocondrale.
Acest lucru a fost realizat pentru a spori relevanța clinică prin imitarea
mai precisă a proceselor de reparații celulare așteptate care apar în
procedurile de stimulare a măduvei osoase, cum ar fi microfractură,
decât ceea ce se poate obține prin implantarea hMSC în defectele
osteochondrale create la rozătoarele atimice.
 CONCLUZIE

Drept urmare, atât în studiile in vitro, cât și în studiile in vivo că doxiciclina

nu a avut un efect toxic sau inhibitor asupra condrogezei MSC și a reparației
cartilajului.
Mai mult, doxiciclina a inhibat MMP-13 și o îmbunătățire potențială in vitro a
condrogenesisului și reparației cartilajului in vivo.
Aceste constatări sugerează că doxiciclina poate fi utilizată pentru controlul
extern al exprimării transgene în studiile de reparație a cartilajelor care
încorporează strategii de terapie genică mediate de AAV fără a interfera cu
procesul de reparare. Inhibarea doxiciclinelor de MMP-13 poate servi, de
asemenea, pentru îmbunătățirea potențială a reparației in vivo a cartilajului
atunci când este utilizată singură.
Ca atare, evaluarea continuă a efectelor doxiciclinei asupra cartilajului
articular și a proceselor de reparare a țesuturilor bazate pe MSC poate conduce
la noi strategii de tratament ușor de implementat pentru a întârzia dezvoltarea
osteoartritei prin îmbunătățirea proceselor de reparare a cartilajelor.
 BIBLIOGRAFIE

1. Buckwalter JA, Brown TD. Joint injury, repair, and remodeling: roles in post-
traumatic osteoarthritis. Clin Orthop Relat Res. 2004;(423):7–16. [PubMed]

2. Nakajima H, Goto T, Horikawa O, Kikuchi T, Shinmei M. Characterization of the

cells in the repair tissue of full-thickness articular cartilage defects. Histochem Cell
Biol. 1998;109(4):331–8. [PubMed]

3. Payne KA, Lee HH, Haleem AM, Martins C, Yuan Z, Qiao C, et al. Osteoarthritis
and cartilage / OARS. 8. Vol. 19. Osteoarthritis Research Society; 2011. Single intra-
articular injection of adeno-associated virus results in stable and controllable in vivo
transgene expression in normal rat knees. pp. 1058–1065. [PMC free article]
[PubMed]

4. Stieger K, Belbellaa B, Le Guiner C, Moullier P, Rolling F. In vivo gene regulation

using tetracycline-regulatable systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 2009;61(7–
8):527–541. [PubMed]
 BIBLIOGRAFIE

5. Beekman B, Verzijl N, de Roos JADM, Koopman JL, Tekoppele JM. Doxycycline

Inhibits Collagen Synthesis by Bovine Chondrocytes Cultured in Alginate. Biochemical
and Biophysical Research Communications. 1997;237(1):107–110. [PubMed]

6. Brandt KD, Mazzuca SA, Katz BP, Lane KA, Buckwalter KA, Yocum DE, et al. Effects
of doxycycline on progression of osteoarthritis: Results of a randomized, placebo-
controlled, double-blind trial. Arthritis & Rheumatism. 2005;52(7):2015–2025. [PubMed]

7. Fortier LA, Motta T, Greenwald RA, Divers TJ, Mayr KG. Synoviocytes are more
sensitive than cartilage to the effects of minocycline and doxycycline on IL-1α and MMP-
13-induced catabolic gene responses. Journal of Orthopaedic Research. 2010;28(4):522–
528. [PubMed]

8. Golub LM, Ramamurthy NS, McNamara TF, Greenwald RA, Rifkin BR. Tetracyclines
Inhibit Connective Tissue Breakdown: New Therapeutic Implications for an Old Family of
Drugs. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 1991;2(3):297–321. [PubMed]