ADN CIRCULANT FETAL: METODE, TESTE,

INTERPRETĂRI ȘI PERSPECTIVE
Coordonator ştiinţific: Absolvent:
FOTEA Mădălina-Cristina

Conf. univ. dr. DIMITRIU Daniela Cristina

Facultatea de Medicina
Specializarea: Medicina
Disciplina: Biochimie
 DEFINIȚIE 50-200bp
Fragmente mici

• fragmente de ADN degradate și eliberate în

plasma sanguină.
• circulă predominant ca nucleozomi, 21kb
Fragmente mari
complexe nucleare de histone și ADN.
• ADN-ul fetal liber circulant este definit ca
fiind ADN-ul fetal care circulă liber prin fluxul
sanguin matern.
• principală sursă de origine este procesul de
3-6%
Din AND-ul total fără
apoptoză a celulelor placentare de la nivelul celule aflat în circulația
maternă
sincițiotrofoblastului

Origine
celulele placentare apoptotice
(trofoblaste) derivate din embrion
CONCENTRAȚIE ȘI STRUCTURĂ
Fragmente de
ADN scurte
Spre deosebire de ADN-ul celular,
cffDNA constă mai degrabă în
principal din fragmente de ADN
scurte, decât din cromozomi întregi.
193 de perechi
de baze în lungime
80% au 193 de perechi
de baze în lungime
Săptămâna
IV și VII
Poate fi izolat din sângele
matern începând cu a 4-a
săptămână de gestație deși
abia de la a 7-a săptămână
poate fi considerat fiabil
Timp de înjumătățire
16 minute
CFFDNA este eliminat rapid din
circulația maternă cu un timp de
înjumătățire de 16 minute și este
nedetectabil la 2 ore după naștere
 SCURT ISTORIC
PCR digital microfluidic, PCR tehnici neinvazive de a doua
digital cu picături și generație
• ADN-ul liber secvențierea masivă paralelă
circulant (CFDNA) a
fost descoperit
pentru prima dată
de Mandel și
Metais în anul
1948.

• Ultimele decenii au 1997 2016

asistat la o evoluție
rapidă a acestui
domeniu.

ADN-ul circulant fetal a fost identificat detectarea aneuploidiilor

în plasma și serul gravidelor cromozomiale fetale
utilizând secvențierea masivă
paralelă
INDICAȚII CLINICE

Determinarea Boli Tulburări legate Aneuploidii Risc de

Sexului Monogenice de sarcină (trisomii) preeclampsie
prin detectarea atât autozomal prin detectarea prin detectarea unei Identificarea riscului
secvențelor CFFDNA dominante,cât și prezenței unei copii de concentrații anormale de apariție a
DE pe cromozomul Y, recesiveprin lucru a genei Rhesus, a unui anumit preeclampsiei.
cu importanță detectarea unei alele pentru boalahemolitică a cromozom în
deosebită în cazul moștenite paternal în nou-născutului trisomiile 13 și 21 și
gravidelor purtătoare CFFDNA; un nivel scăzut
de boli X-linkate întrisomia 18

INDICAȚII CLINICE
PROVOCĂRI ȘI LIMITE
Fătul moștenește
Concentrația jumătate din
CFFDNA din sânge genomul său de la
este relativ 1 4
mamă.
scăzută

Cantitatea totală Moleculele CFFDNA

de CFDNA variază sunt depășite
între indivizi; 2 3 numeric 20: 1 de
moleculele de ADN
liber circulant
matern;
METODE DE EVALUARE
Randamentul CFDNA variază în Cea mai comună tehnică utilizată
funcție de diferite proceduri de în prezent pentru detectarea și
manipulare. identificarea secvențelor.

2. Izolare și purificare 4. PCR

1 2 3 4 5

1. Centrifugare 3. Diagnostic fetal 5. NGS

fracția plasmatică este
separată de materia
celulară prin centrifugare.
Diferențele mici între secvențele
de ADN fetal și matern sunt
exploatate pentru a face un
diagnostic fetal specific.
Reacțiile pot fi pregătite prin ancorarea
masivă în paralel a numeroase
molecule amplificate într-o platformă
de secvențiere de generație următoare
(NGS).
 METODE CANTITATIVE
Secvenţierea
masivă paralelă
cantitativă totală
(shotgun) - MPS
• are la bază secvenţierea
de nouă generaţie (NGS),
care analizează toţi totală (shotgun) - MPS
cromozomii.
• este dependentă de
fracția fetală de ADN liber
circulant
Metode cantitative (totale sau
țintite)
Secvenţierea masivă
paralelă cantitativă
Secvenţierea
masivă paralelă
cantitativă ţintită
(targeted)
• generează amplificarea
Secvenţierea masivă
şi secvenţierea selectivă
paralelă cantitativă a regiunilor genomice
ţintită (targeted) • permite axarea analizei
pe cromozomii
importanţi în practica
clinică, în special 13, 18,
21, X şi Y.
 METODA CALITATIVA
Raţia alelelor
• amplifică şi secvenţiază
SNP-uri, într-o manieră ce
numără alele materne şi
fetale
• generează raţia dintre un
cromozom de interes şi
unul de referinţă alelelor
• necesitatea unui
cromozom de referinţă
prezintă o limitare
Polimorfism singular de nucleotide
(SNP)
Analiza genotipică
• utilizează amplificarea
ţintită a SNP-urilor,
urmată de NGS şi o
analiză informatică
Raţia Analiza • metoda este mai mult
analitică decât cantitativă
genotipică • nu necesită un
cromozom de referinţă
• cea mai specifică metodă,
cu rate de 100% de
depistare a aneuploidiilor
• singura metodă capabilă
să detecteze triploidii
 TEHNOLOGIA DE SECVENȚIERE DE ULTIMĂ
GENERAȚIE 3. Generarea
clusterelor
5.Analiză,
demultiplexare și
aliniere

1. Extracția 4. Ciclul de secvențiere

2. Pregătirea
ADN-ului (Sequencing cycle) si
bibliotecii
secvențiere cuplată
terminal (Paired-end
sequencing)
 DISCUȚII ȘI
CONCLUZII
SCOP PRINCIPAL
(trisomia 13), a sindromului Edwards
screening minim
invaziv, clinic corect și
accesibil financiar
pentru aneuploidii
testare prenatală pentru a scădea
cromozomiale fetale în
stadiile incipiente ale
sarcinii.
Screeningul
este un test de screening
extrem de eficient pentru 01 aneuploidiilor
cromozomiale fetale
sindromul Down
depistarea sindromului Patau Aplicații pentru testarea
(trisomia 18) și a aneuploidiilor 02 prenatală a tulburărilor
monogene
cromozomiale sexuale
completare a căii actuale de
Mutațiile de
numărul de teste de diagnostic 03 novo
invaziv
creșterea cazurilor detectate
în comparație cu screeningul Aplicații pentru
prenatal standard. 04 monitorizarea tulburărilor
asociate sarcinii
VĂ MULȚUMESC PENTRU ATENȚIE!

Fotea Mădălina-Cristina
Facultatea de Medicină
BIOCHIMIE