Plantele transgenice: metode i strategii pentru aplicaii practice

GABRIELA ENEA Institutul de Genetic, Departamentul de Transgenez i Epigenetic, Aleea Portocalelor nr.1-3, Bucureti Transformarea genetic a plantelor, proces cunoscut i sub numele de transgenez reprezint la ora actual principalul instrument de cercetare din biologia plantelor dar i un instrument important din punct de vedere practic pentru ameliorarea plantelor de cultur. Prin caracteristicile noi dobndite de plantele transgenice sunt raportate cu o frecven foarte ridicat: rezistena la ierbicide, la insecte, virusuri, obinerea de plante cu sterilitate citoplasmatic masculin precum i obinerea de plante de interes n scop medical. Plantele reprezint principala surs de farmaceutice i substane chimice fine i de aceea, procesele cu privire la transformarea acestora au crescut n ultimii ani, astfel c se poate vorbi de procese care implic modificarea a peste 30 de specii de plante cu importan din punct de vedere economic. Transgeneza este unul din domeniile ingineriei genetice vegetale iar la ora actual cele mai importante strategii i probleme care se pun sunt concentrate asupra nelegerii tiinifice i dezvoltrii tehnice a unor sisteme bine puse la punct pentru transformarea a numeroase specii de plante. Capacitatea de a introduce i exprima diferite gene strine la plante a fost descris pentru prima dat n 1984 la tutun (De Block M., De Sonville A., Debrouwer D., 1995) i apoi a fost extins la peste 120 specii de plante aparinnd a cel puin 35 de familii. Succesul transformrii genetice a plantelor s-a concretizat prin obinerea de plante ornamentale, plante de cultur cu proprieti mbogite, plante medicinale, fructe, etc. Procesele de diversificare i rafinament a tehnicilor de transformare pentru convenien, eficacitate mare, genotipuri variate i caracteristici moleculare superioare vor continua cu efecte de lung durat, astfel c transferul genelor i regenerarea de plante transgenice sunt factori limitativi ai dezvoltrii i aplicrii sistemelor de transformare practic pentru multe specii de plante. Atenia cea mai mare n procesul transformrii este dat de studiul interaciei i expresiei genelor strine-transgenelor- introduse n plante i interacia acestora cu genomul plantei gazd. Ingo Potrykus n 1991 a ncercat s evalueze procesul transformrii genetice a plantelor bazndu-se pe definirea adevrat a transformrii integrative, recurgnd la combinaii genetice, fenotipice i date fizice (Potrykus I., 1991). Din pcate, combinaiile utilizate nu au putut fi dovedite i practic la unele specii de plante. De exemplu, analiza descendenilor unei populaii de copaci este foarte dificil deoarece reproducerea sexuat este nceat, iar propagarea vegetativ la unele specii de plante de cultura, cum ar fi sfecla de zahr, este foarte complicat datorit poliploidizrii sau aneuploidizrii genetice. Similar, o corelare strns ntre datele fenotipice i fizice nu este o caracteristic definitorie a metodelor de transfer a genelor, deoarece muli transformani nu exprim aceste copii de gene introduse.
73

GABRIELA ENEA

Capacitatea de a introduce i exprima (sau inactiva) genele specific n plante furnizeaz o putere nou instrumentului experimental permind testarea direct a ctorva ipoteze din fiziologia plantelor care sunt deosebit de dificil de rezolvat utiliznd alte caracteristici biochimice (Coruzzi G., Puigdomenech P., 1994). Cteva dintre aceste exemple includ: analize de genetic molecular a semnalelor celulare ce controleaz reproducerea sexuat i interacia microorganism-plant; rolul enzimelor specifice n procesele metabolice determinnd poziionarea fotosintezei i nu n ultimul rnd rolul enzimelor specifice i hormonilor specifici procesului de dezvoltare (Newbigen E., Smyth DR., Clarke AE., 1995). Principalele necesiti n procesele de transfer a genelor pentru obinerea de plante transgenice sunt: (a) capacitatea de a inti esuturi ce includ celule competente pentru regenerarea plantelor; (b) o metod de a introduce ADN n aceste celule regenerabile i (c) un procedeu de a selecta i regenera plantele transformate cu o frecven satisfctoare. La ora actual prin utilizarea sistemelor de transformare cu Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, precum i prin bombardamentul cu particule nvelite n ADN, este posibil introducerea de ADN n orice tip de celul de plant. Numai o mic proporie din aceste celule intite nu vor accepta molecula de ADN n timpul acestui tratament i numai o mic proporie din aceste celule vor supravieui tratamentului i integrrii stabile a ADN nou introdus. De asemenea, este general esenial de a detecta eficiena transformrii prin selecia celulelor transformate comparativ cu cele netransformate, care sunt n exces fa de primele i de a stabili aceast eficien a transformrii prin punerea la punct a unor condiii de regenerare de plante dintr-o singur celul transformat. Din punct de vedere practic este necesar utilizarea unor tehnici alternative de evaluare a transformrii i anume: (a) gsirea esutului int; ex: resursele necesare meninerii unui supliment continuu de explante cum ar fi embrioni imaturi la un stadiu corect de dezvoltare pentru transformare. (b) eficien ridicat, economic, reproductibil, pentru a produce muli transformani independeni pentru testare practic. (c) simplitate tehnic, implicnd un minim de manipulri variabile cum ar fi producerea de protoplati i regenerani. (d) cotransformarea frecvent cu gene multiple, cum ar fi o proporie ridicat de linii de plante selectate pentru expresia unor gene marker. (e) selecia sau screeningul eficient de a obine plante transgenice din celule transformate. (f) minimul de timp n realizarea culturilor de esuturi, reducerea costurilor asociate i evitarea indizerabil a variaiei somaclonale. (g) obinerea de transformani uniformi i stabili, pentru speciile cu propagare vegetativ sau linii germinale fertile pentru speciile cu propagare sexual. (h) capacitatea de a introduce secvene de ADN fr secvene de vectori. (i) patternul simplu de integrare i numr mic de copii a genelor introduse, minimizeaz probabilitatea indizerabil de dezagregare a genelor la situsul de inserie, sau multicopii asociate silenierii genelor (Birch R.G.,1997). (j) aplicabilitate opional de transformare a genomurilor organelare. Strategii de realizare a transformrii n prezent cele mai utilizate tehnici de realizare a transformrii la plante sunt: Transformarea protoplatilor; Bombardamentul biolistic sau cu microproiectile; Transformarea mediat de Agrobacterium.
74

Plantele transgenice: metode i strategii pentru aplicaii practice

Dar care dintre aceste metode este cea mai utilizat? Rspunsul la aceast ntrebare depinde de foarte muli factori, de exemplu, de interesele economice, cum ar fi transformarea la porumb, care depinde de accesibilitatea esutului, tipurile de echipamente accesibile. Metodele alese sunt extinse la obinerea de genotipuri de elit, care sunt uneori mai puin accesibile la condiiile de cultura in vitro(Haymes, K.M., Davis T.M., 1998). Este foarte instructiv s considerm c exist specii de plante cum ar fi orezul, care sunt considerat a fi recalcitrante la transformare, dar care acum pot fi transformate datorit utilizrii tehnicilor de bombardament cu particule a embrionilor imaturi, culturilor de celule sau utilizarea transferului direct mediat de Agrobacterium direct asupra calusului embriogenic (Hiei I., Ohta S., Komari T., Kumashiro T., 1994). n fiecare caz, succesul transformrii nseamn: identificarea (sau producerea de culturi de esuturi cu multe celule regenerative) optimizarea parametrilor pentru transfer de gene n celule i punerea la punct a proceselor de selecie i regenerare a plantelor transgenice obinute (fig.1)(Cao J., Duan X., McElroy D., Wu R., 1992).
Identificarea relativ a transformrii Explante disponibile

Dezvoltarea de sisteme de culturi de esuturi

Medii i hormoni

Mod de regenerare Identificarea celulelor regenerabile

Nesatisfctor

Frecvena regenerrii
Satisfctor

Ageni de selecii/startegii

Construci genici

Accesibilitatea regeneranilor

Transfer de gene

Parametrii Agrobacterium

Parametrii
microproiectilelor

Selecia sau screeningul

Expresie tranzient
Nesatisfctor

Regenerare

Distrugere celular
Satisfctor

Caracterizare

Figura 1. Caracteristici generale ale sistemelor de transformare la speciile de plante recalcitrante.

Tranformarea protoplatilor Dintre sistemele de transformare, transformarea utiliznd protoplati este una dintre metodele care necesit mare finee. Protoplatii sunt izolai fiecare printr-un proces mecanic sau enzimatic prin ndeprtarea peretelui celular. Aceste rezultate de producere a unei
75

GABRIELA ENEA

suspensii cu milioane de celule individuale ofer avantajul probabil de intire a unei singure celule. Protoplatii sunt frecvent obinui de la o suspensie de linii celulare stabilite, de la calus obinut din embrioni imaturi, inflorescene imature, mezocotil, frunze imature bazale i antere (Maheshwari N., 1995). Interesant este faptul c multe suspensii celulare pot fi criopreservate i sileniate meninnd capacitatea de a forma calus i regenera plante (DiMaio,J.J., Shillito R.D.,1989). Protoplatii pot fi de asemenea transformai cu Agrobacterium, acest proces fiind facilitat de tratamentul cu polietilenglicol, electroporare sau lipozomi. Aceste sisteme de utilizare a protoplatilor pentru transformare sunt eficiente n cazul monocotiledonatelor (Shillito R., Carswell G., Kramer C.M., 1994). Transformarea biolistic Biolistica este o metod ce utilizeaz microproiectile de tungsten sau de aur care sunt acoperite cu ADN i propulseaz n celulele int prin acceleraie. Aceast acceleraie poate fi produs de o puc cu putere, cu gaze sau cu dioxid de carbon sau heliu, sau prin descrcare electric (Finer J.J., Finer K.R., Ponnapa T., in press). Prin aceast metod se pot introduce secvene de ADN n orice esut, dar succesul depinde de capacitatea esutului int de a prolifera i da natere la o plant fertil. Alternane minore n protocolul standard biolistic produc risipe destul de ridicate. Acest proces include: Precultura adecvat a explantelor materiale; Utilizarea unor microproiectile de dimensiuni mici; Supunerea esutului la un pretratament osmotic prin uscare parial ntr-o capot cu flux laminar sau cultivarea ntr-un mediu ce conine un agent osmotic. Un exemplu elocvent n acest sens l reprezint transformarea porumbului care a fost deosebit de ridicat n aceste condiii (Radolph-Anderson, B., 1995). Analiza molecular a plantelor obinute prin transformare biolistic, n general, relev un patern destul de complex al genelor integrate. La aceasta se adaug faptul c introducerea unor fragmente mari de ADN se realizeaz datorit rupturilor care exist n ADN-ul introdus. Pe de alt parte, destinul ADN-ului introdus nu este foarte clar, ligarea fragmentelor de ADN transgenic naintea integrrii este propus a justifica dac ADN transgenic se introduce n acelai situs n genomul plantei (Pawlowski W.P., Somers D.A., 1998). Acesta poate rezulta prin reducerea expresiei transgenei prin co-supresie. Transformarea mediat de Agrobacterium Capacitatea natural a microorganismelor de a transforma plante este la ora actual cea mai utilizat metod cunoscut i sub numele de metod de transformare mediat de Agrobacterium. Bacteriile de sol din genul A.tumefaciens i A.rhizogenes sunt ageni cauzali ai unor boli la plante si anume producerea de gale n form de coroan, respectiv rdcini firoase (Tepfer D., 1990). n timpul procesului de transformare, un segment specific al vectorului, ADN-T, care poate conine markeri de selecie i/sau gene de interes, este transferat de la bacterie n celula gazd a plantei i inserat n genomul nuclear. Aceste funcii sunt mediate de un set de gene de virulen cu o expresie optim la un pH acid i n prezena inductorilor fenolici, cum ar fi acetosiringona, care se produc prin rnirea celulelor plantei (Hamilton C.M., 1996) (fig.2). Sistemul Agrobacterium este foarte utilizat deoarece este uor de realizat iar costurile de realizare sunt foarte sczute. Mai mult, plantele transgenice obinute prin aceast metod conin frecvent inserii de copii unice. Aceste avantaje au condus la adaptarea acestui sistem
76

Plantele transgenice: metode i strategii pentru aplicaii practice

la multe specii de plante dicotiledonate dar i monocotiledonate. Acum, este posibil de a tranfera fragmente mari de ADN (150kb) n genomul nuclear al plantelor.

Figura 2. Diagrama schematic a procesului de infecie cu Agrobacterium. Cile critice care au loc n bacterie (semnale chimice, genele vir de inducie, Procesarea ADN-T), i n plant (ataarea bacteriei, transferul ADN-T, intirea nucleului, integrarea ADN-T), precum i genele i/sau proteinele cunoscute a media aceste evenimente.

Agrobacterium rhizogenes este utilizat cu succes pentru transferul de gene la multe specii de dicotiledonate, la locul infeciei formndu-se multe rdcini adventive, fenomen cunoscut sub numele de hairy roots. Infecia este urmat de transferul unui fragment din ADN, ADN-T, coninut ntr-o plasmid Ri-ADN, direct n genomul nuclear al plantei. Plasmida Ri const din ADN-T, secvene de grani i suprafaa de virulen. ADN-T conine genele rol (loci rol) A,B,C,D, care confer capacitatea de difereniere de rdcini n celulele transformate. Exist i gene care activeaz sinteza diferitelor clase de opine, cum ar fi cele implicate n procesul de catabolism. Opinele sunt substane naturale unice, pseudoaminoacizi cum ar fi octopine, nopaline, agrocinopine, care servesc ca nutrieni, ca surs de carbon i azot, i ca substane specifice de cretere a patogenitii bacteriei. Suprafaa de virulen conine diferite gene vir care sunt sileniate, deoarece ele nu intr n genomul plantei dar sunt necesare pentru transferul ADN-T. Similar cu transformarea mediat de A.rhizogenes, A.tumefaciens este de asemenea capabil s infecteze plantele. ADN-T de transfer este inserat ntr-o plasmid Ti care induce schimbri metabolice i genetice n celulele plantei rezultnd gale sub form de coroan. Aa cum s-a menionat la A.rhizogenes, plasmida Ti de la A.tumefaciens este i ea purttoare de gene care codific pentru enzime responsabile de sinteza i catabolismul unor aminoacizi cunoscui sub numele de opine. Aceste tipuri de opine, depind de tulpina bacterian utilizat i de asemenea reprezint un caracter de distincie ntre cele doua tulpini de Agrobacterium. Importana i avantajul utilizrii sistemului Agrobacterium este c prin tehnologia ADN-recombinant i ingineria genetic se pot transfera o multitudine de gene ntr-o celul gazd.
77

GABRIELA ENEA

Selecia transformanilor Selecia este o parte importan a proceselor de transformare. n general, genele de interes sunt co-integrate cu markeri selectabili pentru identificarea cu uurin a celulelor recipiente transformate. Markerii de selecie cei mai utilizai confer rezisten la ageni chimici, cum ar fi antibiotice i ierbicide (Wilmink A., Dons J.J. M., 1993). Manozo-6 fosfat izomeraza (MPI) este unul dintre cei mai receni markeri de selecie. Enzima este codificat de gena manA de la E.coli, care convertete monoza-6P n frucozo-6P. Astfel, transformanii ce conin manA pot crete pe manoz ca surs de carbon. Aceast selecie este un mod pozitiv al aciunii de cretere a esuturilor transformante cu o rat care s-i permit acest lucru. Markerul MPI este extrem de eficace pentru selecia transformanilor de sfecl (0,94%), porumb (50%) i gru (25%) (HansenG., Wright M.S., 1999). Markerii de selecie pot fi utilizai ntr-o prim generaie i eliminai mai trziu prin ncruciare convenional. O posibilitate este de a obine dou ADN-T separate; una cu gene de interes i alta cu markeri de selecie, n aceeai sau dou celule diferite de Agrobacterium. Cele dou ADN-T sunt inserate n situsuri nelincate n genomul plantei gazd, permind mai trziu segregarea genetic (Yoder J.I., Goldsbrough, A.P., 1994). Transformarea optim se caracterizeaz printr-o singur copie a transgenei care va segrega mendelian cu o expresie uniform de la o generaie la alta. Transformanii ideali pot fi identificai cu dificultate, depinznd de materialul vegetal care va fi transformat i de cantitatea i complexitatea transgenelor. O gen inserat este esenial randomizat n genom, se observ o variabilitate de la o plant transgenic la alta, fenomen cunoscut sub numele de variaie cu efect de poziie (Gelvin S.B., 1998; Matzke A.J., Matzke M.A., 1998;Vaucheret H., 1998). Perspective Transformarea genetic a plantelor rmne totui o art, deoarece procesul difer de la o plant la alta iar condiiile de mediu sunt caracteristice fiecrei specii n parte. Eficacitatea procesului de transformare const n faptul c cel puin una dintre speciile de plante care nu au fost manipulate anterior n cultur, trebuie s se adapteze la protocolul stabilit i s dea natere la o plant nou, cu caracteristici noi. Exist de asemenea o practic necesar pentru metodele de transformare care vor scade n complexitatea paternului de integrare i expresie a transgenelor. n prezent, sunt comercializate multe plante transgenice ce prezint alteraii ale unei singure gene. Pe de alt parte, nelegerea evenimentelor referitoare la procesele de integrare i expresie a ADN-ului strin n genomul celulei gazd este aparent, multe ntrebri au rmas totui fr rspuns. Exist celule int sau esuturi care sunt mai mult receptibile la transformare? Exist un stadiu fiziologic care permite o transformare mai eficient? Pot fi ele manipulate astfel nct s se obin o eficien ridicat a transformrii? Toate esuturile alese ca int prezint modificri ale nivelului de expresie genic? Dac Agrobacterium este utilizat cu susses n transformare prin faptul c expresia transgenelor este mult mai frecvent, atunci poate fi acest lucru atribuit pe seama integrrii ADN-T n regiunea telomeric ? ( Hoopen R.T., 1996). Tehnologiile de transformare prezint avantaje din punct de vedere al comercializrii multor plante. Introducerea multor transgenice pe pia este o cale multipl a procesului de nregistrare a noi varieti de plante. n cele mai multe ri comercializarea cu plante transgenice este mai nti cercetat i aprobat prin stabilirea unor reguli stricte de autoritile fiecrui guvern naional al rii respective, care trebuie s se asigure c produsele sunt inofensive att pentru mediu ct i pentru consumatori.
78

Plantele transgenice: metode i strategii pentru aplicaii practice

Bibliografie selectiv
1. BIRCH R.G., 1997, Plant transformation: problems and strategies for practical application,, Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant.Mol.Biol.,48, 297-326; 2. CAO J., DUAN X., MCELROY D., WU R., 1992, Regeneration of herbicide resistant transgenic rice plants following microprojectile mediated transformation of suspension culture cells, Plant Cell Rep 11, 586-591; 3. CORUZZI G., PUIGDOMENECH P., 1994, Plant molecular Biology, Molecular genetic analysis of plant development and metabolism, Berlin: Spring Verlag; 4. DE BLOCK M., DE SONVILLE A., DEBROUWER D., 1995, The selection mechanism of phosphinotricin is influenced by the methabolic state of the tissue, Planta 197, 619-626; 5. DIMAIO,J.J., SHILLITO R.D.,1989, Cryopreservation technology of transgenes to R1 progeny, J.Tissue Cult.Methods 12, 163-169; 6. FINER J.J., FINER K.R., PONNAPA T., Particle bombardament-mediated transformation, Current topics in microbiology and imunnology 240, Plant biotechnology: New products and Application) Hammond J., McGarvey P.B., Yusibov V., eds.,) in press; 7. GELVIN S.B., 1998, The introduction and expresion of transgenes in plant, Curr.Opin.Biotecnol., 9, 227-232; 8. HAMILTON C.M., 1996, Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 26, 2135-2142; 9. HANSENG., WRIGHT M.S., 1999, Recent advances in the transformation of plants, Trends in plant science 4, 226-231; 10. HAYMES, K.M., DAVIS T.M., 1998, Agrobacterium mediated transformation of alpine Fragaria vesca and transformation of transgenes to R1 progeny, Plant.Cell.Rep, 17, 279283; 11. HIEI I., OHTA S., KOMARI T., KUMASHIRO T., 1994, Efficinet transformation on rice (Oryza sativaL) mediated by Agribacterium and sequences analysis of the boundaries of the ADN-T, Plant Journal 6, 271-282; 12. HOOPEN R.T., 1996, Localization of T-DNA insertion in Petunia by fluorescence in situ hybridization: physicali evidence for suppresion of recombination, Plant Cell 8, 823-830. 13. MAHESHWARI N., 1995, In vitro culture of wheat and genetic transformation-retrospect and prospect, Crit.Rev.Plant. Sci.14, 149-178; 14. MATZKE A.J., MATZKE M.A., 1998, Position effects and epigenetic silencing of plants transgenes, Curr.Opin.Plant Biol.1, 142-148; 15. NEWBIGEN E., SMYTH DR., CLARKE AE., 1995, Understanding and controling plant development, Trends Biotechnology 13, 338-343; 16. PAWLOWSKI W.P., SOMERS D.A., 1998, Transgenic DNA integrated into the oat genome in freqvently interspersed by host DNA, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 95, 1210612110; 17. POTRYKUS I., 1991, gene transfer to plants: assesement of publisched approaches and results, Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant.Mol.Biol.42,205-225; 18. RADOLPH-ANDERSON, B., 1995, Sub-micron gold particles are superior to larger particles for efficient biolistic transformation of organelles and some cell types, BioRad Bulletin, 2015; 19. SHILLITO R., CARSWELL G., KRAMER C.M., 1994, Maize protoplast culture, The Maize Handbook, (Freedling M., Walbolt V.,) Springer, 695-700; 20. TEPFER D., 1990, Genetic transformation using Agrobacterium rhizogenes, Physiol.Plant., 79, 140-146; 21. VAUCHERET H., 1998, Transgene-induced gene silencing in lant, Plant J. 16, 651-659;
79

GABRIELA ENEA

22. WILMINK A., DONS J.J. M., 1993, Selective agents and marker genes for use in transformation of monocotyledonous plants, Plant Mol.Biol.Rep.11, 165-185; 23. YODER J.I., GOLDSBROUGH, A.P., 1994, Transformation systems for generating marker-free transgenic plants, Biotechnology 12, 142-148;

80