Diagnosticul de laborator in parazitoze

In medicina veterinara, a avea mijloace biologice de diagnostic care sa fie usor de executat, sa fie reproductibile, sensibile, precoce si specifice, constituie o necesitate de prim ordin.

In general, metodele specifice de diagnostic de laborator in parazitoze, se clasifica asfel: metode directe, care constau in identificarea si izolarea parazitului; metode indirecte, care cuprind reactiile serologice si alergice. I. METODE DIRECTE 1. Examene coproparazitologice Metoda Willis Tehnica: 3-5g fecale se mojareaza cu o solutie suprasaturata de NaCl, amestecul se strecoara intr-un pahar Willis astfel incat sa formeze la deschiderea paharului un menisc convex, si se aseaza lama. Se lasa in repaus 20-30 minute apoi se aplica lamela pe lama si se examineaza la microscop cu obiectiv 10, 20. Indicatii: concentrarea sporochisturilor, oochisturilor, chisturilor de sporozoare, oncosferelor, oualor de nematode(1). Metoda Willis modificata Tehnica: In primul timp se efectueaza metoda Willis. In timpul al doilea, se indeparteaza 2/3 din supernatant, iar peste sediment se aduga apa de robinet si se omogenizeaza. Lichidul se trece in tuburi de centrifuga si se centrifugheaza la 1500 rpm timp de 2-3 minute. Se indeparteaza supernatantul si sin sediment se fac preparate intre lama si lamela. Indicatii: Se depisteaza in plus fata de metoda Willis formatiunile parazitare grele oua de trematode, unele oncosfere, oua de acantocefali. Metoda sedimentarii active Tehnica: Se mojareaza 3-5g fecale cu apa de robinet apoi suspensia se strecoara in tuburi de centrifuga. Se centrifugheaza la 1500 rpm timp de 2-3 minute. Se indeparteaza supernatantul si din sediment se fac preparate intre lama si lamela. Se examineaza la microscop cu obiectiv 10. Indicatii: oua de trematode, oncosfere, oua de acantocefali. Metoda McMaster Principiu: Elementele parazitare dispersate intr-o solutie suprasaturata de NaCl, floteaza pe suprafata camerelor de numarat, unde vor fi numarate si exprimate per gram de fecale (OPG). Tehnica: In cilindrul cotat se introduce solutie suprasaturata de NaCl pana la prima cotatie a paharelului McMaster, apoi cu o pensa se adauga fecalele, pana cand nivelul lichidului ajunge la cotatia a doua (~ 2g). Se toarna continutul intr-un mojar, se mojareaza si se strecoara intr-un pahar. Se omogenizeaza bine, apoi cu o pipeta se etaleaza doua camere ale lamei McMaster, astfel incat sa fie umplute complet si sa nu contina bule de aer. Pentru flotarea elementelor parazitare, lamele se aseaza pe o suprafata orizontala, unde se mentin circa 5 minute, dupa care se trece la efectuarea numararii le microscop. Numararea elementelor parazitare se face separat pentru fiecare specie, urmarind liniatura retelei existente pe fiecare camera. Numarul de oua se inmulteste cu 50 si se obtine cifra OPG. Indicatii: Aprecierea intensitatii infestatiilor cu oua usoare de nematode, oochisturi, chisturi de balantidium. Metoda Henrikson Tehnica: Se intinde frotiul din fecale sau amprente din intestin, se usuca la temperatura camerei. Se fixeaza frotiul in alcool metilic 96% timp de 2-5 minute, se coloreaza cu carbol fuxina 20-30 minute, se spala cu apa de robinet, diferentiere cu SO2H4 (concentratie 0,25-10%), timp de 20-60 secunde, spalare cu apa de robinet, recolorare cu verde malachit 5%, spalare, uscare. Se examineaza frotiurile cu obiectiv 100, cu ulei de imersie. Indicatii: Identificarea lui Cryptosporidium spp. Criptosporidiile sunt de 3-6 microni rosii, pe fundalul verde al frotiului. Metoda Blagg Tehnica: Se mojareaza 1g fecale cu 3 ml solutie fixatoare (alcool absolut, formol 38%, glicerina, apa distilata). Se filtreaza intr-un tub de centrifuga peste care se adauga 1 ml eter etilic, se omogenizeaza. Se centrifugheaza 1

minut la 1500 rpm. Din sediment se adauga o picatura pe o lama peste care se adauga o picatura de solutie Lgol. Indicatii: Identificarea flagelatozelor digestive din genul Giardia. 2. Metode larvohelmintoscopice Metoda Baermann Tehnica: Se toarna apa usor incazita in aparatul Baermann (sita, palnie, furtun, clema Morh) peste proba de fecale (5-10g), astfel incat sa acopere complet masa de fecale. Se lasa in repaus 24 ore, interval in care larvele se desprind din masa de fecale si sedimneteaza. Recoltarea se face pe o lama recuperand primele 2-3 picaturi. Examinarea se poate face fara a aplica lamela daca lichidul este clar sau cu lamela daca lichidul contine reziduri. Se examineaza ci obiectiv 10. Indicatii: strongilatoze pulmonare la rumegatoare si carnivore. Metoda Vajda Este o metoda ce se preteaza la examenul coproscopic, la speciile de animale ce elimina crotine: oi, capre, iepuri. Tehnica: Se aseaza intr-o sticla de ceasornic 3-5 crotine, peste care se aduga apa calduta pana ce le acopera. Se lasa in repaus 15-20 minute, apoi cu o pensa se indeparteaza cu grija crotinele. Se examineaza continutul direct din sticla de ceasornic cu obiectiv 10. Indicatii: In diagnosticul nematodozelor pulmonare (dictiocauloza, protostrongilatoza, mulerioza). 3. Examenul parazitologic al sangelui se face cu scopul evidentierii parazitilor extracelulari (in plasma) sau intracelulari (intraeritrocitari). Examenul sangelui in stare proaspata Se poate face in doua moduri: in picatura strivita sau in picatura suspendata. Indicatii: Ambele metode sunt recomandate pentru examinarea parazitilor extracelulari (mobili) si mai exact pentru Trypanosoma la cabaline sau Dirofilaria la canide, cabaline, bovine. Examenul sangelui in frotiuri fixate si colorate May-Grunwald-Giemsa Indicatii: pentru evidentierea parazitilor intracelulari (ex. Babesia, Theilleria) sau a celor extracelulari (ex. Leschmania, Toxoplasma, Microfilaria, Trypanosoma). Coloratia May-Grunwald-Giemsa: colorare cu solutie May-Grunwald, 3 minute, cu numar cunoscut de picaturi; se aduga apa distilata neutra, 1 minut, cu acelasi numar de picaturi, apoi se indeparteaza. Se introduce frotiul in baie Giemsa timp de 20-30 minute. Frotiul se spala sub jet de apa redus, se usuca si se examineaza cu obiectiv de imersie (2). 4. Examenul direct ntre lama i lamela, se practica cu precadere in infectia experimentala, pentru controlul densitatii parazitilor din lichidul ascitic, sau pentru controlul prezentei chisturilor de la nivelul tesutului muscular sau al tesutului nervos. In mod obisnuit, din diverse produse patologice ca sange, sediment din LCR, lichid din camera anterioara a ochiului, saliva, secretii oculare, punctat hepatic, splenic, muscular, ganglionar, sau din substanta cerebrala se pot efectua urmatoarele metode: 5. Frotiu sau/si amprenta de organe (se coloreaza May-Grunwald-Giemsa);

6. Sectiuni histologice (se coloreaza May-Grunwald-Giemsa);

6. Sectiuni histologice (se coloreaza May-Grunwald-Giemsa); 7. Inoculare intraperitoneala la soarece. Metodele directe prezinta aceleasi avantaje ca si cele indirecte, la care se mai adauga dificultatile legate de timpul destul de lung pana la obtinerea unui rezultat (in cazul inocularii la animal), posibilitatile de confuzie cu alti germeni asemanatori, ca si faptul ca se pot obtine rezultate fals negative in cazurile in care parazitii sunt in numar mic in tesutul prelevat pentru examinare sau inoculare. Pentru diagnosticul in viata s-au imaginat metode de imbogatire din preparatele bioptice. Se recurge in mod frecvent la izolarea parazitului la soareci. In acest caz este necesar a se avea in vedere posibilitatea unei infectii spontane inaparente a animalului si de aceea este indicat a se asigura inainte de inoculare ca animalul este indemn, prin efectuarea unei reactii serologice. 8. Reactia de polimerizare in lant (P.C.R. - polymerase chain reaction).

Diagnosticul molecular consta in evidentierea prin tehnica PCR a ADN-ului parazitar, utilizandu-se ca primeri secvente de ADN specifice. Metoda a fost folosita cu succes pe sange periferic, lichid cefalorahidian, lichid amniotic, tesut cerebral, corp vitros, umoare apoasa, lavaj bronhoalveolar si urina (3). Metodele de extragere a ADN-ului se bazeaza mai ales pe o fragilizare fizica sau chimica a peretelui formatiunii parazitare. Tratamentele fizice sunt in general sonicarea, alternanta inghet-dezghet si agitarea cu perle de sticla. Tratamentele chimice constau in incubarea oochisturilor in solutii enzimatice (proteinaza K sau medii conventionale pentru dechistarea sporozoitilor) sau cu compusi care perturba integritatea peretilor (hipoclorit de sodiu, cetiltrimetil amoniu bromid). Aceasta prima etapa, obligatorie, este urmata printr-un timp de extractie si de purificare a ADN-ului prin metode clasice. II. METODE INDIRECTE 1. Imunoflorescenta indirecta (I.F.I.). Reactia de imunoflorescenta indirecta consta in decelarea anticorpilor anti-parazitul cercetat prin vizualizarea complexelor antigen-anticorp, cu ajutorul unei anti-imunoglobuline de specie cuplata cu o substanta fluorescenta (FITC), atunci cand serul de cercetat este pus in contact cu antigenul. Principiul metodei: Varianta indirecta a imunofluorescentei are ca si principiu cuplarea anticorpului marcat fluorescent (antiimunoglobulina de specie) cu anticorpul specific fata de antigen, si vizualizarea efectului fluorescent la microscopul prevazut cu lampa cu ultraviolete. Interpretarea rezultatelor: lamele se citesc la microscopul prevazut cu lampa UV; se considera pozitive probele in care toti tachizoitii sunt fluorescenti pe toata suprafata lor si nu doar in zonele apicale; se considera ca reactii dubioase acele situatii in care polurile apicale ale tachizoitilor prezinta fluorescenta, aceasta lipsind insa in restul invelisului tachizoidal si reactii negative in absenta fluorescentei (Fig 1). Fig. 1 - Imunoflorescenta indirecta - interpretarea rezultatelor 2. Testul de Aglutinare modificat (M.A.T.) Metoda MAT permite identificarea anticorpilor specifici de tipul IgG anti-parazitul de cercetat in serul tuturor speciilor de animale, intrucat nu presupune utilizarea unor anticorpi specifici marcati enzimatic. Interpretarea rezultatelor: citirea se face la o susa de lumina (transluminator) pe camp intunecat. Vor fi considerate pozitive acele probe si dilutii la care antigenul este depus pe fundul godeului sub aspect umbeliform si ocupa cel putin 50% din fundul godeului; probele in care antigenul a sedimentat intr-un singur punct sub forma unui buton sunt considerate negative (Fig. 2). Fig. 2 - Interpretarea rezultatelor M.A.T. 3. Metoda imunoenzimatica ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Aceasta metoda poate fi definita ca o succesiune de reactii antigen-anticorp, ultima dintre acestea fiind relevata printr-o reactie enzimatica cu schimbarea culorii unui cromogen. Metoda furnizeaza combinatia unica de sensibilitate, specificitate si aplicabilitate practica pentru detectia unor antigene sau a anticorpilor. Este utilizata in doua aplicatii majore: pentru detectia/confirmarea unui agent patogen sau pentru detectia/evaluarea statusului imun umoral (prezenta anticorpilor, titrul acestora). Dar aplicabilitatea tehnicii ELISA nu se opreste aici, ea fiind utila in diverse situatii cum ar fii testarea postinfectioasa, postvaccinala sau dupa expunerea la un agent patogen. In functie de complexitatea variantei tehnice (utilizarea de anticorpi monoclonali, anticorpi de captura, antigene recombinate, combinare cu tehnicii legate de acizii nucleici hibridizare cu sonde de competitie, amplificare prin PCR etc), exista teste tip ELISA destinate evaluarii imunitatii mediate celular, dar acestea au o utilizare mai restransa. Majoritatea truselor ELISA disponibile comercial si utilizate in laboratoarele de diagnostic sunt destinate evaluarii imunitatii umorale, iar in cadrul acesteia cel mai frecvent pentru detectia imunoglobulinelor din clasa IgG (anticorpi serici, anticorpi maternali, anticorpi din galbenusul de ou). Metoda ELISA cunoaste mai multe variante tehnice:

ELISA varianta directa Are ca scop identificarea/detectia antigenului sau anticorpului. Antigenul legat la placa recunoaste si fixeaza anticorpul cuplat cu enzima care descompune substratul specific,oxidnd cromogenul care se coloreaza. Intensitatea acesteia se masoara la un spectrofotometru, la o lungime de unda adecvata cromogenului si se exprima in unitati densitate optica (DO). Aceasta varianta se utilizeaza ca test de control pentru antigenul de captusire (daca se foloseste un conjugat standardizat) sau pentru controlul conjugatului (daca se foloseste un antigen de captusire standard). Anticorpul legat la placa recunoaste si fixeaza anticorpul cuplat cu enzima, restul, desfasurndu-se la fel. Aceasta varianta se foloseste pentru controlul conjugatului imunoenzimatic.

ELISA varianta indirecta Este una dintre cele mai utilizate variante tehnice si are ca scop identificarea/detectia anticorpilor. Antigenul legat la placa (antigen de captura) recunoaste si fixeaza anticorpii din proba de cercetat. Acestia, la rndul lor, recunosc si fixeaza anticorpii anti-anticorpi cuplati cu enzima (conjugatul imunoenzimatic) care descompune substratul specific producnd oxidarea unui cromogen ce isi schimba culoarea. Intensitatea acesteia se masoara la un spectrofotometru, la o lungime de unda adecvata cromogenului si se exprima in DO. n acest caz, exista o relatie directa intre cantitatea de anticorpi din proba si valoarea DO

ELISA varianta Sandwich (captura de antigen) Are ca scop identificarea/detectia antigenelor. Anticorpul legat la placa (anticorp de captura) recunoaste si fixeaza antigenul din proba de cercetat. Acesta, la randul lui, recunoaste si fixeaza un al doilea anticorp anti-antigen (preparat pe alta specie) cuplat cu enzima (conjugatul imunoenzimatic) care descompune substratul specific producand oxidarea unui cromogen ce isi va schimba culoarea. La fel ca si in cazul metodelor precedente se citesc densitatile optice, valoarea lor avnd o relatie directa cu cantitatea antigenului din proba.

ELISA varianta Dublu-sandwich (captura de complex antigen-anticorp) Scopul acestei variante este detectia/identificarea antigenelor. Anticorpul legat la placa recunoaste si fixeaza antigenul din proba de cercetat. Acesta recunoaste si fixeaza un al doilea anticorp anti-antigen (preparat pe alta specie) care la rndul lui reactioneaza cu anticorpul anti al doilea anticorp cuplat cu enzima (conjugat imunoenzimatic). Prin descompunerea substratului specific se produce oxidarea unui cromogen ce isi schimba culoarea. Citirea si interpretarea rezultatelor se face identic, mentinandu-se relatia directa intre cantitatea de antigen din proba si valoarea DO.

ELISA de competitie Scopul tehnicii este identificarea/cuantificarea antigenelor/anticorpilor. Antigenul/anticorpul de testat intra in competitie cu un antigen/anticorp de referinta pentru recunoasterea si fixarea la reagentul de captura Se pot distinge trei modele:

Pentru detectia anticorpilor cu antigen de referinta, in care anticorpul de captura si cel din proba de testat intra in competitie pentru legarea unui antigen de referi Pentru detectia anticorpului, in care anticorpul din serul de cercetat intra in competitie cu anticorpi de referinta pentru legarea la antigenul de captura; Pentru detectia antigenului, in care antigenul de testat intra in competitie cu un antigen de referinta pentru legarea la anticorpul de captura; Interpretarea rezultatelor prin ELISA de competitie se realizeaza diferit fata de variantele tehnice enuntate anterior. Intrucat conjugatul recunoaste numai reagentul de referinta, legarea reagentului de testat la cel de captura opreste dezvoltarea reactiei imunoenzimatice propriu-zise. Aceasta inseamna ca valorile DO vor fi mici la probele pozitive si mari la cele negative, deci semnalul inregistrat de spectrofotometru va fi invers proportional cu concentratia antticorpilor/antigenelor din proba de cercetat. Aceasta tehnica se foloseste in diagnosticul bolilor infectioase si parazitare, precum si pentru detectia de micotoxine, vitamine, hormoni, substante dopante (4).