UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA UNIVERSITATEA LIEGE Facultatea de Zootehnie i Biotehnologii Gembloux Agro BioTech

Ing. MARIANA NICULINA MDA

CERCETRI PRIVIND INDICII DE CALITATE I AUTENTICITATE AI MIERII DE SALCM (ROBINIA PSEUDOACACIA)

CONDUCTORI TIINIFICI:
Prof.dr.ing. Liviu Al. Mrghita Prof.dr. Eric Haubruge

Cluj-Napoca 2013

CUPRINS INTRODUCERE I. II II.1. II.2. II.3. III III.1. III.2. MIEREA ORIGINE I AUTENTICITATE..... SCOP, OBIECTIVE I DESIGN EXPERIMENTAL......................................... Motivarea studiilor tiinifice Scopul tezei .. Obiective specifice ale tezei.................................................................................. MATERIAL I METODE.. PROBE DE MIERE............................................................................................ TEHNICI ANALITICE UTILIZATE PENTRU DETERMINAREA AUTENTICITII MIERII. IV IV.1. IV.1.1. IV.1.2. IV.1. 3 IV.1.4. IV.1.5. IV.1.6. IV.1.7. IV.1.8. IV.1.9. IV. 2. IV.2.1. IV.2.2. REZULTATE I DISCUII.......... CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMIC A MIERII DE SALCM Determinarea coninutului de ap................................................................ Determinarea activitii apei (aw).................................................................. Determinarea culorii mierii................................................................................... Determinarea conductivitii electrice.. Determinarea coninutului de cenu.................................................................... Determinarea aciditii mierii........................................................................ Determinarea proteinelor totale. Analiza calorimetric difereniat.......................................................................... Determinarea vscozitaii.............................................................................. DETERMINRI CROMATOGRAFICE........................................................ Determinarea glucidelor prin HPLC-IR.......................................................... Identificarea amprentei gaz-cromatografic GC-MS specific a probelor de miere........................................................................................................... IV.3. IV.3.1. IV.3.2. IV.3.3. IV.3.4. V DETERMINRI SPECTROSCOPICE.......................................................... Spectroscopia n infrarou apropiat (NIR): Analiza calitativ....................... Analiza chemometric a bazei de date spectrale........................................... Spectroscopia n infrarou mediu (MIR): Analiza calitativ......................... Spectroscopia cu raze X ............................................................................... CONCLUZII GENERALE.. BIBLIOGRAFIE............................................................................................ 21 21 23 29 31 32 33 8 9 9 9 10 10 12 12 13 13 14 16 17 17 18 3 4 5 5 6 6 7 7

INTRODUCERE

Evaluarea calitii i a autenticitii mierii este o important arie de cercetare aplicat cu impact relevant n industrie i n protecia consumatorului. Autenticitatea mierii este definit de ctre Codex Alimentarius, EU Honey Directive i cteva legislaii naionale. Termenul de autenticitate are dou aspecte: autenticitatea n ceea ce privete producia (are ca scop prevenirea falsificrilor) i autenticitatea n privina originii geografice sau botanice (are ca scop prevenirea etichetrii greite, tiindu-se c mierea poliflor are preul de vnzare mai sczut dect mierea de salcm). Proiectul de cercetare urmrete caracterizarea mierii de salcm prin evaluarea unor metode analitice fiabile care s permit realizarea unui profil fizico-chimic specific acesteia. Teza este structurat n dou pri principale, prima parte incluznd studiul de literatur, iar cea de a doua parte cercetri proprii, rezultate, discuii, concluzii i perspective. Partea I a lucrrii "Studiul de literatur" cuprinde un capitol, n care se prezint considerente teoretice privind calitatea i autenticitatea mierii. Deasemenea n cadrul acestui capitol sunt prezentate cadrul legislativ i modaliti de etichetare a mierii care s ateste calitatea i autenticitatea mierii. n final, se prezint o expunere a literaturii de specialitate despre parametrii de calitate i metodele analitice actuale utilizate n controlul calitii mierii. n partea a II-a Contibuii Originale cuprinde trei capitole. n capitolul II Scop, obiective i design experimental se prezint etapele, obiectivele i metodele cu ajutorul crora s-a realizat cercetarea. Capitolul III "Material i metode" se prezint metodele de analiz utilizate, metodele fizico-chimice, cromatografice i

spectroscopice. Principalele obiective ale tezei sunt : Investigarea i caracterizarea fizico-chimic a parametrilor care s defineasc optim calitatea i autenticitatea mierii de salcm produs n Romnia

Determinarea amprentei gaz-cromatografice a mierii de salcm produs n Romnia, prin folosirea metodei de extracie SPME urmat de analiza HS / GC-MS Discriminarea mierii pe baza spectrelor, folosind metode de analiz statistic a datelor Evaluarea metodelor spectroscopice i de analiza statistic multivariat pentru creearea de modele matematice utilizate n prezicerea indicilor de calitate ai mierii n vederea determinrii

Optimizarea metodei spectroscopice cu raze X indicelui de cristalizare a mierii

Capitolul al IV-lea cuprinde subcapitole referitoare la evaluarea compoziiei fizico-chimice, la profilului volatil identificat, la analiza calitativ i cantitativ a mierii folosind metodele spectrometrice i analiza statistic multivariat. n cadrul acestor subcapitole sunt prezentate rezultatele obinute n urma identificrii i cuantificrii celor mai importani parametrii ai mierii precum apa, glucidele, coninutul de cenu, de proteine i compui volatili. Deasemenea se prezint indicatori ai prospeimii ( aw , vscozitatea, gradul de cristalizare). Capitolul I . MIEREA ORIGINE I AUTENTICITATE Mierea este un produs natural, consumat ca aliment nc din vremuri antice (Ransome, 2004). Statutul special al mierii pentru consumatori se datoreaz imaginii ei de produs natural i a beneficiilor legate de sntate (Mrghita, 2008, Bura i col., 2005). Dup unele scandaluri privind mierea, calitatea acesteia n funcie de origine a devenit asociat cu ateptrile consumatorilor. Spre exemplu, n cadrul Comunitii Europene, s-a descoperit miere de provenien chinez falsificat cu sirop de porumb cu un coninut ridicat de fructoz, alte incidente constnd n descoperirea unui coninut excesiv de reziduu de antibiotice n miere provenind din ri din lumea a treia (Ochi, 2005). Prin urmare, standardele de calitate pun accent pe importana calitii mierii n funcie de origine, iar acest lucru este utilizat n promovarea vnzrilor prin etichetare specific. Etichete precum monoflor sau poliflor, organic, cu denumire
4

de origine protejat, satisfac cerinele consumatorului, ct i pe cele ale industriei mierii i ale organele de control. n plus, cercettorilor li se cere s pun la dispoziie metode i markeri care stabilesc legtura dintre miere i reglementrile existente. Specificaiile mierii cu indicaie geografic sunt bazate n general pe parametrii fizio-chimici. Aceti indicatori s-au dovedit ca avnd un potenial limitat n determinarea originii a mierii. n consecin, descoperirea unor markeri chimici care s ajute la determinarea calitii mierii n funcie de origine, a fost subiectul multor studii din ultima perioad. Aici se nscriu i studiile care se ocup de compuii volatili (Cuevas-Glory i col., 2007), compuii fenolici (Pyrzynska i col., 2009) i coninutul mineral (Pohl, 2009) din mierea de diferite origini florale i geografice. Cel mai recent i cuprinztor studiu de acest gen este cel scris de Kaskoniene i col., 2010, studiu care ofer rezultate excelente ncercnd s defineasc compui tipici care sunt asociai cel mai bine cu originea mierii. n cadrul proiectului Trace, s-au determinat markerii naturali ai mierii, precum mineralele (Vanhanen i col., 2011), raportul dintre (bio) izotopi i markeri genetici, pentru a determina originea geografic, botanic i originea de producie. n final, analizele specifice de calitate par a fi mai potrivite pentru a relaiona mierea de originea ei, dar acestea sunt n general mai complex de realizat i implic tehnici noi precum spectroscopia de absorbie atomic (AAS), cromatografia de gaze cu spectrometrie de mas (GC-MS) (Aliferis i col., 2010), spectrometria de mas electro-spray (ES-MS) (Beretta i col., 2007) spectrometria emisiei optice de plasm cuplat inductiv (ICP-OES) (Terrab i col., 2004), rezonana magnetic nuclear (RMN) (Tuberoso i col., 2010), transformarea Fourier Raman (FT-Raman) (Fernndez Pierna i col., 2011), transformarea infrarou apropiat (NIR) (Woodcock i col., 2007) i spectroscopia de fluorescen (Karoui i col., 2007).

Capitolul II. SCOP, OBIECTIVE I DESIGN EXPERIMENTAL II.1 Motivarea studiilor tiinifice Mierea de salcm reprezint un aliment cu o arom deosebit, cu mare valoare biologic datorit coninutului de compui biologici activi.
5

Deasemenea , mierea de salcm produs n Romnia este recunoscut ca fiind de o calitate superioar. n anul 2009 mierea de salcm romneasc a fost medaliat la concursul internaional Apimondia, Montpellier. Aceast calitate superioar se ncadreaz perfect n pachetul legislativ de calitate a Uniunii Europene, care prevede etichetarea i protejarea produselor regionale de calitate. Astfel reprezentanii industriei mierii romneti i-au exprimat interesul pentru etichetarea de tip IG (Indicaie Geografic) a mierii din Romnia. Pentru obinerea acestor denumiri de origine protejat este necesar determinarea indicilor de calitate i autenticitate a mierii de salcm n vederea redactrii caietului de sarcini. Acest studiu a aprut ca o necesitate de a gsi rspunsuri la ideile enunate mai sus, tiut fiind faptul c ara noastr este un productor important de miere monoflor de salcm. Posibilitatea efecturii unui stagiu la Universitatea din Liege, Facultatea Gembloux Agro-Bio Tech i la Centrul de cercetare a Regiunii Walone(CRA-W) din Gembloux , Belgia a fcut posibil ca acest studiu al parametrilor de calitate i a biomarkerilor s fie aprofundat, verificat i validat cu ajutorul unor metode moderne, nedistructive i mai puin costisitoare.

II.2 Scopul tezei Scopul cercetrilor efectuate n cadrul prezentei teze de doctorat l reprezint determinarea parametrilor de calitate i ai biomarkerilor de autenticitate ai mierii de salcm produs n Romnia. II.3 Obiective specifice ale tezei Un prim obiectiv n vederea elaborrii unei metodologii relevante pentru analiza calitii i autenticitii mierii a fost prelevarea probelor de miere de salcm autentice din trei regiuni bioapicole pe parcursul anilor 2009, 2010, 2011. Evaluarea metodelor fizico-chimice uzuale n vederea determinrii indicilor de calitate ai probelor de miere de salcm (coninut de ap, activitatea apei, aciditate, conductivitatea electric, cenua, culoarea, coninutul de proteine totale)
6

 Evaluarea metodei de analiz calorimetric diferenial, DSC, pentru studiul parametrilor termici i procesele fizice specifice mierii (Tg , Tf, H, tranziii de faz ) Caracterizarea reologic a probelor de miere Determinarea spectrului glucidic din probele de miere de salcm prin cromatografie lichid de nalt performan (HPLC) Identificarea profilului compuilor de arom specifici mierii de salcm romneti prin analiza gaz - cromatografic cuplat cu spectrometrie de mas (GC-MS) Analiza spectrometric calitativ i cantitativ n infrarou (NIR i MIR) a parametrilor de calitate a mierii de salcm n vederea construirii unui model PLS Predicia parametrilor de calitate cu ajutorul modelului matematic existent la Centrul de cercetare CRA-W Evaluarea metodei spectroscopice cu raze X pentru determinarea indicelui de cristalizare a probelor de miere Capitolul III. MATERIALE I METODE III.1. PROBE DE MIERE Literatura de specialitate care studieaz calitatea mierii demonstreaz necesitatea stabilirii unor strategii de colectare a probelor pentru mbuntirea analizei markerilor mierii. Strategia aplicat n acest studiu a fost colectarea probelor din diferite zone de producie n ani diferii, cu scopul de a studia tipicitatea mierii de salcm din Romania. Dup cum se va prezenta ulterior, au fost recoltate cincizeci de probe de miere de salcm n anii 2009, 2010 i 2011 direct de la apicultori (origine declarat de productori). Selectarea probelor a fost realizat n trei zone geografice diferite din punct de vedere pedologic i climatic. Zona 1 a reprezentat o mare parte din Transilvania, cuprinznd judeele Alba, Cluj, Covasna, Harghita, Mure, Satu
7

Mare, Slaj i Timioara. Zona 2 a cuprins probe din sud-vestul i sudul rii: Clrai, Dolj, Giurgiu, Teleorman i Vlcea. Zona 3 a reprezentat-o partea de est a Romniei: judeele Bacu, Botoani, Buzu, Galai, Suceava, Tulcea i Vaslui.

Romnia

Zona 1
2009 2010 2011 2009

Zona 2
2010 2011 2009

Zona 3
2010 2011

S1 S2 S3 S8 S9 S10 S12 S13 S24 S16 S17 S18 S20 S22

S23 S15 S28

S48 S51 S53 S58

S4 S6 S14 S19

S25 S27 S35 S36 S37 S38

S50 S57

S5 S7 S11 S21

S29 S30 S31 S32 S33 S34

S39 S40 S41 S42 S52 S55 S56

Figura 1. Clasificarea probelor n funcie de an i zona de colectare (original) III.2. TEHNICI ANALITICE UTILIZATE PENTRU DETERMINAREA AUTENTICITII MIERII Toate tipurile de miere au fost analizate pentru a determina urmtoarele caracteristici fizio-chimice influenate de origine: umiditatea (prin metoda refractometric), activitatea apei (poteniometric), culoarea (metoda colorimetric), conductivitatea electric (metoda poteniometric), coninutul de cenu (prin calcinare i analiz gravimetric), coninutul de proteine (analiza azotului total), vscozitatea, zaharurile (prin cromatografie de lichide de nalt performan cu detecie a indicelui de refracie HPLC-IR). Pentru a gsi markeri specifici ai mierii n funcie de origine a fost realizat analiza compuilor volatili prin gaz cromatografie cu detecie de mas (GC-MS). Analiza spectroscopic n infrarou (FT-IR, FT-NIR) a fost la rndul su utilizat pentru a determina amprenta spectral specific i pentru a construi un model capabil s anticipeze parametrii fizio-chimici n funcie de spectrele

obinute. n final a fost utilizat analiza spectroscopic cu raze X pentru a determina gradul de cristalizare a mierii.

Capitolul IV. REZULTATE I DISCUII IV.1. CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMIC A MIERII DE SALCM IV.1. 1. Determinarea coninutului de ap Mierea de salcm n general are un coninut sczut de ap ( Mrghita i col., 2009; Lazarevic i col., 2012), ceea ce se poate observa i din analizele efectuate. Valorile obinute se ncadreaz n limitele mierilor din climatul temperat, n special din Europa. Dup eliminarea probelor S15 i S25, considerate ca i outlieri (valori extreme), mediana valorilor este 16.80 (95% interval de ncredere pentru mediana de 16.48 i 17.02) i deviaia standard este de 1.14. Utiliznd nivelul de semnificaie 0.05, testul Darling-Anderson indic faptul c datele au o distribuie normal (valoarea p=0.069 > 0.05).

Figura 2. Analiza descriptiv a coninutului de ap pentru mierea de salcm romneasc

IV.1. 2. Determinarea activitii apei (aw) Activitatea apei este un parametru important pentru desfurarea reaciilor biochimice i pentru dezvoltarea microbian n miere. n cazul mierii de salcm s-au determinat valori cuprinse ntre 0.53 i 0.65. Utiliznd nivelul de semnificaie 0.05, testul Darling-Anderson indic faptul c datele au o distribuie normal (valoarea p=0.520 > 0.05).

Figura 3. Analiza descriptiv a parametrului aw pentru mierea de salcm romneasc IV.1. 3. Determinarea culorii mierii Parametrii determinai pentru culoarea mierii sunt L*, a* i b*. Valoarea L* indic gradul de luminozitate, valori pozitive ale parametrului a* indic zona rou, valori negative ale lui a*, componenta verde, valori pozitive ale lui b* indica zona galben, iar valorile negative ale lui b* indic componenta albastr. n figura 4 este rezumat analiza statistic descriptiv pentru parametrul L*, astfel au fost msurate valori cuprinse n intervalul 54.110 i 62.700. Aa cum s-a menionat anterior, axa a* reprezint nuane de la rou (+a*) la verde (-a*), iar intervalul valorilor mierilor de salcm pentru aceast ax este de la -1.28 la 5.8. Axa b* reprezint nuanele de la galben (+b*) la albastru (-b*) i pentru probele de miere s-au obinut valori cuprinse ntre 6.23 i 30.41.
10

Figura 4. Analiza descriptiv a parametrului L* pentru mierea de salcm romneasc

Figura 5. Analiza descriptiv a parametrului a* pentru mierea de salcm romneasc

11

Figura 6. Analiza descriptiv a parametrului b* pentru mierea de salcm romneasc IV.1.4. Determinarea conductivitii electrice n urma analizei, toate probele de miere s-au ncadrat n limitele admisibile ale conductivitii electrice pentru mierea de salcm . Valoarea medie n lotul de studiu a fost 0.11 mS/cm, iar valorile minime de 0.07 mS/cm i maxime de 0.17 mS/cm.

Figura 7 . Analiza descriptiv a conductivitii electrice pentru mierea de salcm romneasc IV.1.5. Determinarea coninutului de cenu n urma analizei descriptive a coninutului n cenu a mierii de salcm produs n Romnia, concluzia este c, datele prezint o distribuie normal (p=0.249) i n cazul majoritii probelor valorile coninutului de cenu se ncadreaz ntre 0.003 i 0.057 (Figura 8), eliminnd valoarea obinut pentru proba S18, considerat extrem.
12

Figura 8. Analiza descriptiv a coninutului de cenu pentru mierea de salcm romneasc IV.1.6. Determinarea aciditii mierii Aciditatea mierii este un parametru de calitate care ajut la aprecierea gradului de prospeime a mierii. n cazul mierii de salcm, dup eliminarea valorii extreme (S18), mediana valorilor este de 12.86.

Figura 9. Analiza descriptiv a aciditatea liber pentru mierea de salcm romneasc IV.1.7. Determinarea proteinelor totale Valorile obinute se ncadreaz ntre 0.43 i 5.36%. Neexistnd valori extreme (outlieri), valoarea medie obinut pentru acest parametru a fost de 2.321.2.
13

Figura 10 . Analiza descriptiv a coninutului de proteine pentru mierea de salcm romneasc IV.1.8 Analiza calorimetric difereniat Analiza calorimetric difereniat se bazeaz pe transferul fluxului de cldur care susine proba n timpul tratamentului termic. Rezultatele sunt obinute prin msurarea continu a diferenei de temperatur ntre celula unde este plasata proba i o celul de referin. S-au realizat practic pentru analiza calorimetric difereniat trei metode n laborator: Metoda 1: vizualizarea temperaturii la care cristalele dispar din prob Metoda 2: demonstrarea inexistenei cristalelor la scderea temperaturii i n timpul necesar pentru efectuarea unor analize, ca de exemplu msurarea vscozitii. Metoda 3: vizualizarea unei eventuale tranziii vitroase, fuziunea cristalelor i degradarea produsului (debutul reaciei Maillard). Termogramele obinute n urma analizei calorimetrice difereniale sunt specifice mierii. In figura 11 se poate observa tranziia sticloas (Tg) (ntre -44.94oC i -38.22oC), care este asociat prii amorfe din miere, apoi picul endotermic corespunztor temperaturii de topire (fuziune) (Tf) (32.92oC i 55oC) cu entalpia (H) de 8.74 J/g .

14

Figura 11. Termogram specific mierii n care sunt prezentate grafic temperatura de tranziie sticloas (Tg) i temperatura de topire (fuziune) (Tf) Rezultatele obinute pentru probele de miere luate n studiu sunt prezentate n tabelul 1.

Tabel 1. Valorile determinate pentru temperatura de tranziie sticloas Tg i fuziune (topire) Tf

Temperatura de tranziie vitroas (Tg) i tempratura de fuziune (Tf ) Nr 1 14 15 23 25 33 44 49 50 Proba S1 S14 S15 S23 S25 S34 S51 S57 S58 Tg (C) -44.61 -42.71 -42.20 -40.9 None None -36.17 -39.83 -37.03 Tf (C) 46.69 52.72 40.35 42.90 50.43 51.15 60.97 61.54 64.12 H (J/g) 18.64 21.20 0.39 8.75 18.02 13.99 0.73 4.53 0.78

15

IV.1.9 Determinarea vscozitii Primul experiment efectuat a constat n testarea comportamentului reologic al mierii de albine analizate. n urma experimentului, s-a observat c toate mierile analizate au un comportament Newtonian la temperatura de 20C. Al doilea experiment a constat n testarea influenei temperaturii asupra vscozitii mierii de salcm romneti (figura 12).

Figura 12. Efectul temperaturii asupra curbelor vscozitii ale diferitelor probe de miere Dup ce mierile au fost tratate termic timp de o or i treizeci de minute la 55 C, s-a trecut la msurarea vscozitii (la temperaura de 20C). Valorile vscozitii specifice mierii au fost cuprinse ntre 4.72 i 62.96 Pas.
o

Figura 13. Analiza descriptiv a vscozitii

16

IV.2. DETERMINRI CROMATOGRAFICE IV.2.1. Determinarea glucidelor prin HPLC-IR Profilul glucidic general i valorile obinute la probele de miere di n Romnia analizate, au fost identice sau apropiate cu cele obinute la nivel European pentru acest tip de miere. n privina coninutului de glucoz, valorile nregistrate la cele 50 de probe analizate, au fost cuprinse ntre 22.32% i 43.71%. Coninutul de fructoz este un parametru foarte important n analiza mierii de salcm. Starea fluid a acestui tip de miere se datoreaz coninutului mare de fructoz, n cazul probelor analizate a fost ntre 33.80% i 48.16%. Zaharoza este un indicator important al autenticitii mierii, standardele fixnd un maxim de 5% n mierea autentic. Probele analizate de noi au avut valori mult mai sczute, neexistnd suspiciuni de falsificare a acestora. Valorile nregistrate sau ncadrat n intervalul 0.0 i 5.51%, cu o medie de 1.0%. O singur prob a avut concentraie mai mare de 5% (proba S58, zona 1, anul 2011). Valorile obinute pentru maltoz la analiza probelor de miere n prezentul studiu a variat ntre 0.68 i 4.16%. Analiza de varian, ANOVA arat c valoarea lui p este mai mic dect 0.05 (p=0.012177), dar F este mai mare dect Fcrit (F=4.848788 i Fcrit=3.195056), deci ipoteza se respinge, existnd diferene semnificative ntre probe. Concentraia isomaltozei pentru mierea de salcm a variat ntre 0.14 i 0.79%. Dup ce s-a efectuat analiza varianei, ANOVA, s-au constat diferene semnificative pentru acest glucid. Astfel, pentru zona geografic 1 media valorilor determinat este de 0.489, iar la celelalte dou zone, aceast medie este mai sczut (0.33 zona 2 i respectiv 0.31 zona 3). n probele de miere de salcm analizate n acest studiu, s-a cuantificat turanoza n limitele a 0.38 i 2.77%, cu o medie de 2.08%.

17

50

40

Concentra ie %

30

20

10

0 Fructoz Glucoz Sucroz Turanoz Maltoz Isomaltoz Erloz

Figura 14. Variaia concetraiei diferitelor glucide identificate n miere Erloza este un triglucid prezent n miere n cantiti diferite, n funcie de originea botanic. Valorile obinute pentru probele de miere analizate s-au ncadrat ntre 0.09 i 3.19%, media determinrilor pentru cele 50 de probe fiind 1.79%. Spectrul glucidic analizat prin cromatografie de lichide de nalt performan cu detecie n infrarou, a evideniat prezena a apte glucide caracteristice pentru mierea de salcm. Coninutul mare de fructoz, raportul supraunitar fructoz/glucoz, cantiti reduse de zaharoz i deasemenea cantiti supraunitare de maltoz, fac ca probele s fie ncadrate n limitele prevzute pentru acest tip de miere (Golob i Plestenjak, 1999; Sanz i col., 2004; Sabatini i col., 2007). IV.2.2. Identificarea amprentei gaz-cromatografic GC-MS specific a probelor de miere. Metoda de analiz GC/MS este o combinare a dou tehnici analitice reprezentative: GC pe coloana capilar care separ componenii unui amestec, i spectrometria de mas (MS) care furnizeaz informaiile necesare pentru determinarea structural a fiecrui constituent. Rezultatele obinute n urma analizei SPME GC/MS se prezint sub forma unor cromatograme (Figura 15).

18

S 1
2500000

2000000

Intensitate / Intensity

1500000

1000000

500000

10

20

30

40

50

60

Timp de retentie / Retention time, min

Figura 15 . Cromatograma GC a compuilor volatili din proba S1 (Zona 1, anul 2009) Aceast parte a studiului analitic are n vedere analiza aromei mierii de salcm, care este produs n cele trei regiuni ale Romniei: Transilvania (Zona 1), Oltenia (Zona 2) i Moldova (Zona 3). Scopul acestui studiu este, pe de-o parte, de a contribui la studiul calitativ i semi-cantitativ al compuilor volatili prezeni n mierea de salcm, utiliznd gaz-cromatografia combinat cu spectrometria de mas (GC/MS), iar pe de alt parte, de a evidenia principalii markeri volatili i proprietile acestora. n urma analizei SPME GC-MS, au fost identificai 79 constitueni volatili. Principalii compui volatili ai mierii de salcm identificai ntr-un procent de 100% sunt : 3-methyl-3-buten-1-ol pentru zona 1, etanolul, acidul acetic, 5-ethenyldihydro5-methyl-2(3H)-Furanone pentru Zona 2, acetona, 3-methyl-3-buten-1-ol, translinalool oxidul, benzemetanol . Printre compui secundari identificai ntr-un procent de 80-90 % sunt : Dimetil sulfid, acetona, 3-hidroxi-2-butanona, linalool oxidul, acidul acetic, 2furancarboxaldehida, benzaldehida, linalool L, hotrienol, 4-ketoisophorona, epoxylinalool, benzenmetanol pentru zona 1 Dimetil sulfid, 3-hidroxi-2-butanona, 2-metil-2-buten-1-ol, nonanal, linalool oxidul, 2-furancarboxaldehida, 5-metil-2-furancarboxaldehida, acidul butanoic, epoxy-linalool, acidul 3-metilpentanoic, benzenmetanolul pentru zona 2

19

Dimetil sulfid, etanol, isoamil alcool, 2-metil-2-buten-1-ol, cis 3-hexen-1-ol, linalool oxid, acidul acetic, 2-furancarboxaldehida, benzaldehida, acidul propanoic, hotrienol, butirolactona, benzenacetaldehida, fenol pentru zona 3. Compuii majoritari corespunztori probelor din fiecare regiune sunt reprezentai grafic n figura 16.
2-furancarboxaldehida

Benzaldehida

30 25 20 15 10 5 0 Zona 1 Zona 2 Zona 3

Figura 16. Comparaie ntre valoriile medii obinute pentru compui volatili majori din mierea colectat din cele trei zone Urmtoarea etap a constat n clasificarea compuilor identificai n clase chimice (Figura 17). S-a remarcat astfel o diferen semnificativ ntre diferitele zone studiate, aa nct acizii carboxilici sunt prezeni n procent mare n probele din Transilvania, 32.22% i Oltenia 30.36% . Procentajul de aldehide n Zona 1, Zona 2 i Zona 3 este destul de important, respectiv 27.63%, 22.34% i 13.43%. Alcoolii constituie o parte important a probelor de miere romneti, atingnd valori de 28.35 % pentru mierea din Zona 3, 23.87% pentru Zona 2, 19.13% pentru Zona1.

20

Benzenetanol

Linalool oxid

Acid acetic

Aceton

Etanol

Eteri 100
80

Aromatici
Acid carboxilic Azotai Alcooli Aldehide Alifatici Esteri

60
40

20
0 Z1 Z2 Z3

Cetone Sulfuri

Figura 17. Variaia concentraiei claselor de compui volatili n funcie de zona de producie Cetonele prezint proporii oscilante, ntre 23.05 i 7.43% n probele de miere din cele trei zone bioapicole. Procentul de compui cu sulf este relativ sczut n probele de miere, cu valori variind ntre 2.17% i 1.57. Se mai poate observa deasemenea prezena deloc neglijabil a esterilor, n probele din zona 3, 2.72%. n cele din urm, s-au luat n considerare hidrocarburile alifatice prezente n toate zonele aflate n studiu, cu un coninut care nu depete 0.93%. IV.3. DETERMINRI SPECTROSCOPICE IV.3.1. Spectroscopia n infrarou apropiat (NIR): Analiza calitativ Spectrometria infrarou apropiat este o metod rapid utilizat pentru caracterizarea cantitativ i calitativ a mierii. Analiza calitativ a mierii presupune determinarea legturilor chimice specifice compuilor chimici caracteristici mierii. Mierea este constituit n principal din ap i glucide. Din acest motiv, interpretarea amprentei spectrometrice a mierii este dominat de absorbia legturilor din grupul funcional XHn. n primul rnd s-a msurat spectrul apei i a standardelor de glucide (fructoz, glucoz, zaharoz). Apoi au fost msurate spectrele probelor de miere. Spectrele obinute n urma analizei spectrometrice NIR se ncadrez ntre 400 i 2500 nm. n figura 18 sunt prezentate spectrelor brute pe domeniul 1100-2500, care conine

21

cele mai multe informaii spectrale i s-au identificat lungimile de und unde sunt diferene de absorie ntre probe.

Figura 18. Amprenta spectrometric NIR al probelor de miere pe domeniul spectral 1100-2500nm, cu evidenierea celor 6 maxime importante Deasemenea pentru a indentifica eventualele diferene date de ctre originea botanic sau geografic s-au suprapus spectrele probelor de miere prin combinaiile prezentate n figura 19 .

Figura 19 . Spectrele comparative ale diferitelor tipuri de mieri

22

IV.3.2. Analiza chemometric a bazei de date spectrale Pe baza spectrelor colectate n urma analizei NIR s-a aplicat analiza PCA pentru a evalua variabilitatea probelor de miere de salcm. Pentru a caracteriza originea geografic s-au introdus i spectre de miere salcm produs n alte ri. Figura 20 evideniaz componenta principal 1 pe axa X care reprezint 68.39% din variabilitate, componenta principal 2 pe axa Y reprezint 27.39% din variabilitate i componenta 3 pe axa Z 0.09%. Astfel se observ c probele din Romnia (Ro) se difereniaz de probele produse n Frana(F) sau Slovacia(Sk).
Scores on PC 2 (27.39%) BH C CZ F I RO RW SK UKR

Samples/Scores Plot of CLASES

3 2 1 0 -1 -2

Scores on PC 8 (0.09%)

20

-20

-40

-20

20

40

Scores on PC 2 (27.39%)

Scores on PC 1 (68.39%)

Figura 20. Analiza PCA a probelor de miere n funcie de originea geografic Deasemenea s-a aplicat analiza PCA n sistem neintit pentru a evalua variabilitatea acestora n funcie de originea botanic. n urma acestei analize se observ c probele de miere, iarb neagr i poliflor, prezint cele mai semnificative deosebiri ale compoziiei chimice (Figura 21). n ceea ce privete probele de salcm i tei au fost grupate mpreun.

23

Figura 21. Reprezentarea variabilitii compoziionale a probelor de miere n funcie de originea botannic Regresia Partial leas squares (PLS) Eficacitatea spectroscopiei infrarou n conjuncie cu regresia Partial least squares a fost testat n determinarea cantitativ a produselor alimentare, agricole, farmaceutice (Yang i Irudayaraj, 2002; Cozzolino i Moron, 2004; Cen i He, 2007; Dale i col., 2009). Analiza chemometric cantitativ s-a desfurat n trei etape: Calibrare, Validare i Predicie.

CALIBRARE Selectarea a n probe

VALIDARE Selectarea a n probe

PREDICIE Probe necunoscute

Valori NIR

Valori de referin

Valori NIR

Valori de referin

Valori NIR

Creeare model matematic

Ecuaie de calibrare

Ecuaia de calibrare

Ecuaie de calibrare

Comparare parametrii sta

Valori prezise

Figura 22 . Reprezentarea grafic a analizei chemometrice cantitative

24

Analiza chemometric cantitativ a datelor spectrale s-a desfurat n dou etape: construirea de modele matematice PLS bazate pe datele spectrale NIR ale probelor de miere romneti

- predicia compoziiei chimice pe baza ecuaiei aparinnd centrului de

cerecetare CRA-W Caracteristicile modelului dezvoltat pe baza probelor de miere romneti n tabelul sunt prezentate valorile de referin obinute n urma analizelor fizico-chimice care vor fi utilizate n crearea modelului de predicie PLS Tabel 2. Valorile de referin a probelor de miere
Parametru / Parameter Conductivitatea electric / Electrical conductivity Coninut de ap / Water content Aciditatea liber / Free Acidity Aciditatea lactonelor / Lactonic acidity Vscozitate / Viscosity Fructoz / Fructose Glucoz / Glucose Zaharoz / Sucrose Turanoz / Turanose Maltoz / Maltose Izomaltoz / Isomaltose Erloz / Erlose Uniti Units mS/cm % meq/Kg meq/Kg Pas % % % % % % % Media / Mean Gam / Range Deviaia standard Standard deviation 0.02 1.38 7.16 1.35 14.51 2.68 3.98 1.05 0.53 0.69 0.18 0.65

0.12 17.01 13.76 1.07 27.47 43.43 30.46 1.00 2.08 3.01 0.39 1.79

0.07-0.18 14.80-21-30 6.63-53.00 0.15-9.80 4.73-62.96 33.80-48.16 22.32-43.71 0.00-5.51 0.38-2.77 0.68-4.16 0.11-0.90 0.00-3.19

Construirea modelului de calibrare PLS (Modelul ptratelor pariale mai mici) este realizat de ctre programul Unscrambler (CAMO ASA, Oslo, Norvegia). Prima dat am introdus n program clasele de spectre, n funcie de zonele de producie. Spectrele introduse n program au fost n format .jdx. Algoritmul PLS consider datele matrici, astfel pentru datele spectrale s-a creeat matricea X i pentru valorile de referin matricea Y.
25

Tabel 3. Modelul de calibrare global pentru principalii indici de caliatate ai mierii: Date statistice referitoare la calibrare i validare
Regiuni spectrale Spectral range (nm) Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Calibrare Calibration RMSEC
S37; S7 S21 S18 S31; S7; S20; S21 S21; S25; S34 S31; S7; S20 S15 S7; S31 S12; S13 S7; S31 S21; S7 2 11 11 11 4 4 12 13 2 4 13 2 0.826 0.015 2.759 0.355 5.561 1.024 1.656 0.461 0.408 0.388 0.051 0.451

Parametru Parameter
Coninut de ap / Water content Conductivitate electric Electrical Conductivity Aciditate liber / Free Acidity Aciditatea lactonelor Lactonic acidity

Zona Zone
Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele

Valori extreme Outliers

PLS factor

Validare ncruciat Cross validation RMSECV

0.868 0.018 3.605 0.443 6.352 1.090 1.943 0.681 0.441 0.399 0.128 0.491

R2
0.635 0.656 0.604 0.483 0.840 0.839 0.804 0.844 0.964 0.71 0.912 0.946

R2
0.579 0.501 0.334 0.221 0.796 0.800 0.769 0.776 0.958 0.823 0.970 0.936

Vscozitate / Viscosity Fructoz / Fructose Glucoz/ Glucose Zaharoz / Sucrose Turanoz / Turanose Maltoz / Maltose Izomaltoz / Isomaltose Erloz / Erlose

RMSEC Root Mean Square Error of Calibration RMSECV - Root Mean Square Error of Cross - Validation

Astfel se constat c cele mai bune rezultate s-au obinut pentru turanoz (RMSECV=0.441 ; RMSEC=0.408 ; R2=0.96) i erloz (RMSECV=0.491 ; RMSEC=0.451 ; R2=0.94). Cele mai sczute valori pentru parametrii statistici specifici modelului creat s-au obinut pentru aciditatea lactonelor (RMSECV=0.355; RMSEC=0.335 ; R2=0.22). Rezultatele fiind asemntoare cu cele prezentate n literatura de specialitate. n ceea ce privete parametrii fizici rezultatele obinute demonstreaz c spectroscopia NIR nu este util n predicia parametrilor fizici. Caracteristicile modelului CRA-W Acest model a fost dezvoltat pornind de la o baz de date format din probe de miere de diferite origini aparinnd centrului de cercetare CRA-W. Gama de etalonare, rezultatele etalonrii i validarea sunt descrise n tabelul. Tabel 4. Modelul de calibrare pentru principalii indici de caliatate ai mierii CRA-W
Parametru / Parameter
Coninutul de ap / Water content Conductivitate electric / Electrical conductivity pH / pH Aciditatea liber / Free acidity Fructoz / Fructose Glucoz / Glucose Maltoz / Maltose Fructoz/Glucoz / Fructose/Glucose Zaharoz / Sucrose Raffinos / Raffinose Erloz / Erlose Melebioz / Melibiose Palatinoz /Palatinose Panoz / Panose Turanoz / Turanose

Media / Mean
17.25 0.36 4.33 10.84 37.78 32.27 3.83 1.17 0.95 0.40 0.52 0.68 0.11 0.15 1.32

Deviaia standard Standard deviation

0.99 0.17 0.32 4.70 2.25 3.71 0.97 0.13 1.41 0.23 0.41 0.33 0.06 0.09 0.34

SEC
0.159 0.060 0.189 2.538 1.461 1.307 0.582 0.046 0.371 0.181 0.19 0.106 0.034 0.062 0.284

R2
0.974 0.871 0.642 0.698 0.577 0.876 0.641 0.880 0.931 0.359 0.781 0.899 0.661 0.502 0.305

SECV
0.167 0.072 0.218 3.387 1.582 1.478 0.628 0.056 0.571 0.190 0.218 0.132 0.037 0.070 0.291

R2
0.972 0.820 0.525 0.480 0.504 0.841 0.582 0.824 0.837 0.292 0.716 0.845 0.590 0.373 0.277

Rezultatele obinute pentru spectrul glucidic sunt prezentate n figura 23 i figura 24.

50

40

Concentraia %

30

20

10

0 Fructoz Glucoz Maltoz

Figura 23. Graficul Boxplot a variaiei concentraiei glucidelor majoritare

3,0

2,5

Concentraia %

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 Zaharoz Raffinos Erloz Melibios Palatinos Panos Turanoz

Figura 24. Graficul Boxplot a variaiei concentraiei glucidelor minoritare

28

IV.3.3. Spectroscopia n infrarou mediu (MIR): Analiza calitativ Spectrele au fost msurate n domeniul spectral 3996 cm-1 i 599 cm-1 . Semnale intense s-au identificat n zona 3400- 3200 cm-1 i 1500-800. n regiunea 3600-2600 se ntlnesc semnale specifice gruprilor OH din apa i glucide. Domeniile spectrale utilizate cel mai des n analiza mierii sunt cele cuprinse n domeniul regiunii fingerprint, 900-1500 cm-1.

Figura 25. Amprentele spectrometrice IR ale probelor de miere S1, S4 i S5 Analiza chemometric efectuat pe spectrele probelor de miere, n duplicat, ne arat c probele sunt distribuite de-a lungul gradienilor de concentraie n funcie de compoziia lor de carbohidrai. Astfel se observ tendina mierilor de a se grupa pe axa ce reprezint fructoza i glucoza, dar se observ c sunt probe care au coninut ridicat de zaharoz.

Figura 26. Analiza PCA a probelor luate n studiu

29

Tabel 5. Caracteristici ale modelului PLS pentru diferii parametri ai mierii de salcm realizat pe domeniul spectral 3599-600 cm-1
Parametru Parameter Coninut de ap / Water content Conductivitate electric/Electrical Conductivity Aciditate liber / Free Acidity Fructoz / Fructose Glucoz/ Glucose Zaharoz / Sucrose Turanoz / Turanose Maltoz / Maltose Izomaltoz / Isomaltose Erloz / Erlose Zona Zone Regiuni spectrale Spectral range (nm) Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul Tot spectrul 15;10;04;13;22 15 15; 58 13;22 Valori extreme Outliers PLS factor Calibrare Calibration RMSEC 25;34;21 4 12 15 12 11 5 7 6 6 6 0.614 0.007 1.878 0.637 1.223 0.434 0.181 0.324 0.061 0.264 R2 0.549 0.904 0.930 0.940 0.904 0.831 0.879 0.779 0.880 0.816 Validare ncruciat Cross validation RMSECV 0.684 0.020 4.017 1.529 1.886 0.485 0.556 0.378 0.733 0.307 R2 0.454 0.630 0.687 0.880 0.797 0.725 0.814 0.706 0.823 0.762

Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele Toate zonele

Pentru domeniul spectral 3599-600 cm-1 valorile obinute pentru RMSEC sunt cuprinse ntre 0.007 i 1.878, valorile pentru RMSECV se integreaz n intervalul 0.549 i 0.940, iar valorile coeficientului R2 sunt cuprinse ntre 0.549 0.940 (calibrare) i 0.454 0.823 (validare). Performana modelelor de calibrare pentru coninutul de ap i glucidele majoritare au prezentatat valori bune, ns inferioare modelelor de calibrare construite pe baza datelor NIR.

IV.3.4. Spectroscopia cu raze X n timpul procesului de cristalizare, se tie c glucoza cristalizeaz prima, deoarece toate gruprile hidroxil interacioneaz cu moleculele de ap. Fructoza are o solubilitate mai mare, din care cauz rmne n soluie o perioad mai lung. Dup cristalizarea mierii, glucoza se regsete ca i glucoz monohidrat i fiecare molecul de glucoz fixeaz doar o molecul de ap (Gleiter i col., 2006). n figura 25 se poate observa c toate semnalele nregistrate la proba de miere se suprapun exact peste semnalele glucozei monohidrat, putnd concluziona c sub aceast form se regsete glucoza dup ce procesul de cristalizare are loc.

Figura 25. Difractogram obinut la proba de miere S24 (rou) i standardului de glucoz monohidrat (negru)

Gradul de cristalizare al probelor din prezentul studiu a fost determinat cu difractometrul cu raze X tip D8 Advance Bruker cu anod de cupru. n figura 26 este prezentat difractograma probei de miere S37 (proba lichid) (rosu) i difractograma probei de miere S9 (prob cristalizat)(roz).

Figura 26. Difractogram miere cristalizat (1) i miere lichid (2) n urma analizei se poate observa c doar 6 probe nu au prezentat deloc cristale n structura lor: S37-S39, S41 i S58. Celelalte probe au avut valori ale gradului de cristalizare cuprinse ntre 1.474 i 81.105%. CONCLUZII GENERALE n concordan cu motivaia i obiectivele propuse , n prezenta tez s-au stabilit indicii de calitate i biomarkerii specifici mierii de salcm. Mierea de salcm pur reprezint ns doar un procent sczut din totalul produciei de miere, deoarece majoritatea mierilor au o compoziie variat de nectar sau man, fiind astfel considerate mieri poliflore. n urma studiului bibliografic s-au identificat metodele de referin, cromatografice i spectrometrice ca fiind utile n determinarea parametrilor de calitate ai mierii. Valorile obinute pentru indicii de calitate s-au ncadrat n limitele legale admisibile i n cele specifice mierii de salcm prezentate n literatur. Mai nti au fost evaluate metodele cromatografice n determinarea spectrului glucidic prin cromatografie lichid de nalt performan (HPLC) i identificarea profilului volatil prin gaz-cromatografie cuplat cu spectrometria de mas (GC-MS).

32

Referine bibliografice: 1. Aliferis K. A., Tarantilis P. A., Harizanis P. C., Alissandrakis E., 2010. Botanical discrimination and classification of honey samples applying gas chromatography/mass spectrometry fingerprinting of headspace volatile compounds. Food Chemistry, 121(3), 856-862. 2. Beretta G., Caneva E., Facino R. M., 2007. Kynurenic acid in honey from arboreal plants: MS and NMR evidence. Planta Medica, 73(15), 1592-1595. 3. Bura M., Ptruic D., Bura V.A., 2005. Tehnologie apicol, Editura Solness. 4. Cuevas-Glory L. F., Pino J. A., Santiago L. S., Sauri-Duch E., 2007. A review of volatile analytical methods for determining the botanical origin of honey. Food Chemistry, 103(3), 1032-1043. 5. Fernndez Pierna J. A., Abbas O., Dardenne P., Baeten V., 2011. Discrimination of Corsican honey by FT-Raman spectroscopy and chemometrics. Biotechnological Agronomic Society, 15(1), 75-84. 6. Golob, T., Plestenjak, A., 1999. Quality of Slovene honey, Food Technology and Biotechnology, 37(3), 195-201. 7. Karoui R., Dufour E., Bosset J. O., De Baerdemaeker J., 2007. The use of front face fluorescence spectroscopy to classify the botanical origin of honey samples produced in Switzerland. Food Chemistry, 101(1), 314-323. 8. Kaskoniene V., Venskutonis P. R., 2010. Floral Markers in Honey of Various Botanical and Geographic Origins: A Review. Comprehensive Review of Food Science and Food Safety, 9(6), 620-634. 9. Lazarevic, K.B., Andric, F., Trifkovic J., Tesik, Z., Milojkovic-Opsenica, D., 2012. Characterization of Serbian unifloral honeys according to their physicochemical parameters, Food Chemistry, 132, 2060-2064. 10. Mrghita L., 2008. Albinele i produsele lor, Editura Ceres, Bucureti. 11. Mrghitas L.A., Dezmirean, D., Moise, A., Bobis, O., Laslo, L., Bogdanov, S., 2009. Physicochemical and bioactive properties of different floral origin honeys from Romania, Food Chemistry, 112, 863-867. 12. Ochi T., 2005. Former Japanese beekeeper speaks out about antibiotics in Chinese honey [2]. American Bee Journal, 145(12), 937-938. 13. Pohl P., 2009. Determination of metal content in honey by atomic absorption and emission spectrometries. Trac-Trends in Analitical Chemistry, 28(1), 117128. 14. Pyrzynska I., Biesaga M., 2009. Analysis of phenolic acids and flavonoids in honey. Trac-Trends in Analitical Chemistry, 28(7), 893-902. 15. Ransome, 2004. The sacred bee in ancient times and folklore. London: Courier Dover Publications, Dover Books on Antropology and Folklore.
33

16. Sabatini, A.G., Bartolotti, L., Marcazzan, G.L., 2007. Conoscere il miele, Edizioni Avenue media, Bologna-Milano, Italia. 17. Sanz, M.L., Gonzalez, M., de Lorenzo, C., Sanz, L., Martinez-Castro, I., 2004. Carbohydrate composition and physic chemical properties of artisanal honeys from Madrid (Spain):occurrence of Echium sp honey, Journal of the Science of Food and Agriculture, 84, 1577-1584. 18. Terrab, A., Pontes, A., Heredia, F.J., Diez, M.J., 2004. Palynological and geographical characterization of avocado honeys in Spain, Grana, 43, 116-121. 19. Tuberoso C. I. G., Bifulco E., Caboni P., Cottiglia F., Cabras P., Floris I., 2010. Floral Markers of Strawberry Tree (Arbutus unedo L.) Honey. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(1), 384-389. 20. Vanhanen L. P., Emmertz A., Savage G. P., 2011. Mineral analysis of monofloral New Zealand honey. Food Chemistry, 128(1), 236-240. 21. Woodcock T., Downey G., Kelly J. D., O'Donnell C., 2007. Geographical classification of honey samples by near-infrared spectroscopy: A feasibility study. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 55(22), 9128-9134.

34