Monica Cristina Cara et al

Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug Vol. 5 (1) 2011

Determinarea reziduurilor de streptomicin din mierea de albine Determination of streptomycin residues in honey
1

Drd. Ing. Chim. Monica Cristina Cara, Drd.Med. Vet. Simion Gheorghia, Drd. Ing. Chim. Mirabela Panfiloiu
2

Sanitary-Veterinary and Food Safety Directorate of Timis, S.C. Antarctica S.R.L., Timisoara, Romania Rezumat

Mierea de albine a fost prima substan dulce folosit n hrana omului fiind precursoarea zaharului din trestie sau din sfecl. Producerea mierii de ctre albine este un proces complex de transformare, ncepnd cu recoltarea i terminandu-se cu cpcirea celulelor din faguri. Imediat dup extragere, mierea este ntotdeauna clar i lichid. Acest lucru se datoreaz, coninutului ridicat de fructoz, care i face ca unele sortimente, cum ar fi salcmul s rmn permanent n stare lichid. Dac coninutul de glucoz este mai mare dect cel de fructoz, mierea va cristaliza, la temperaturi sub 18C. Mierea este uor sensibil la cldur, de aceea ar trebui s fie depozitat la temperatura camerei. Albinele, ca i orice organisme vii, se pot mbolnvi de diferite boli. Acestea, prin mortalitea pe care o produc n rndul indivizilor coloniei, reduc numrul albinelor i prin aceasta familiile de albine se depopuleaz, devenind neproductive. n multe cazuri, se ajunge la pierderi mari ducnd la pagube nsemnate pentru apicultori. Prevenirea, depistarea i tratarea bolilor cu ajutorul antibioticelor reprezint un factor extrem de important n asigurarea sntii familiilor de albine. Cuvinte cheie: streptomicin, miere Abstract Honey was the first sweet substance used in human food as a precursor sugar cane or beet. Honey production by bees is a complex process of transformation, from harvesting and ending with a striking honeycomb cells. Immediately after extraction,honey is always clear and liquid. This is due to the high content of fructose, which makes some items, such as locust always remain liquid. If the glucose is higher than that of fructose, honey will crystallize at temperatures below 18 C.Honey is easily susceptible to heat, so they should be stored at room temperature. Bees, like all living organisms, can become ill with various diseases. These, by mortality that occur among individuals of the colony, thereby reducing the number of bees and bee families are emptied and become unproductive. In many cases, it appears significant damage resulting in large losses for beekeepers. Prevention, detection and treatment of diseases with antibiotics is an extremely important factor in ensuring the health of bee. Key words: streptomycin, honey

Introducere Mierea rezultat din prelucrarea de ctre albinele melifere a nectarului florilor sau a sucurilor dulci recoltate de pe alte prti ale plantelor (mana). Dup transport i prelucrare, nectarul este depozitat n celulele fagurilor sub form de miere, servind ca rezerv de hran albinelor. Prin prelucrarea nectarului de ctre albine, zaharoza este invertit n fructoz i glucoz, iar coninutul n ap scade pan la 18-20%. Mierea de albine natural s-a ncadrat n 3 clase de calitate: calitatea superioar, calitatea I i calitatea a II-a. Mierea de calitate superioar poate fi doar mierea de salcam i cea de pdure (man). Clasificarea tipurilor de miere se face n funcie de origine i n funcie de modul de producere i/sau prezentare. n funcie de origine exist miere din inflorescen - mierea obinut din nectarul plantelor i mierea din secreie zaharoasmierea obinut n special din excreiile

insectelor care se hrnesc prin suciune din plante pe seciunile vii ale plantelor sau din secreiile seciunilor vii ale plantelor n funcie de modul de producere i/sau prezentare exist: - miere n figure - mierea depozitat de albine n celulele fagurilor fr larve (puiet) sau pe pereii subiri ai structurii fagurelui, obtinut numai din ceara de albine i vndut n faguri ntregi cpcii sau n seciuni de astfel de faguri, - miere cu buci de fagure - mierea care conine una sau mai multe buci de fagure, mierea scurs-mierea obinut prin drenarea fagurilor fr larve deschii, mierea extras este mierea obinut prin centrifugarea fagurilor fr larve (puiet) deschii, mierea presat - mierea oinut prin presarea fagurilor fr larve (puiet) cu sau fr nclzire moderat la o temperatur de maximum 45C, - mierea filtrat- mierea obinut prin ndeprtarea materiilor strine organice

89

Monica Cristina Cara et al

Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug Vol. 5 (1) 2011

i anorganice, ceea ce duce la ndeprtarea, n mod semnificativ a polenului. n momentul n care se constat formarea de coroane de miere cpcit n treimea superioar a fagurelui se apreciaz c mierea este suficient de matur i ramele cu miere se pot scoate din stup. La culesurile de intensitate medie i sczut extracia mierii se realizeaz nainte de terminarea culesului, pe cnd la culesurile principale, de lung durat, se fac extracii repetate pe parcursul ntregii perioade de cules. Dup ridicarea din stupi, fagurii se perie de albine i se duc n ncperi n care temperatura este de pn la 35C, pentru a facilita extracia. Dup ce fagurii s-au ncalzit se recurge la descpcirea lor i la extracia mierii, cu ajutorul extractorului care scoate miere din faguri prin centrifugare.

Se evapor complet (la sec) eluatul la o temperatur de 450C. Se dizolv reziduul n 10 ml PBS -buffer. n analiz se utilizeaz 50 l prob. Standardele i reactivii se pregtesc conform prospectului a kitului ELISA Enzime Linked Immunosorbent Assay.

Procedura
a) se inser un numr suficient de godeuri n rama microplcii, pentru testarea standardelor i a probelor n duplicat, cu nregistrarea poziiilor acestora; b) se adaug 50 l conjugat enzimatic i 50 l prob sau standard n godeuri separate, n duplicat; c) se adaug 50 l anticorp n fiecare godeu i se incubeaz 120 min. la temperatura camerei; d) se vars lichidul din godeuri i se bate energic, cu faa n jos, pe hrtie absorbant, pentru a ndeprta complet lichidul din godeuri; e) se umplu godeurile cu 250l ap distilat, se vars lichidul i se repet operaia de nc 2 ori; f) se adaug 50 l substrat i 50 l cromogen n fiecare godeu, se agit energic i se incubeaz 30 min. la temperatura camerei, la ntuneric; g) se adaug 100 l soluie de stopare n fiecare godeu, se agit bine i se msoar absorbana la 450 nm fa de un martor (blanc aer); se citete n decurs de 60 min.

Obiectiv
Scopul lucrrii l constituie determinarea reziduurilor de streptomicin din miere precum i calculul reproductibilitii rezultatelor msurrii.

absorbanta std . ( proba ) 100 = % absorbtie absorbanta std . zero

Materiale i metode
Pentru efectuarea investigaiilor s-au utilizat 6 mostre de miere de albine provenite din aceeai zon geografic. Din fiecare mostr s-au prelevat cte 3 probe la care s-au adugat 20, 30, respectiv 40 ppb streptomicin (STP) ca fortifiant. n continuare s-a efectuat pregtirea probelor. Extracia: Se cntrete 1 g miere la care se adaug 10 ml tampon pH = 2. Se agit 10 min. pn la dizolvarea complet a mierii, apoi soluia obinut se centrifugheaz 10 min. la 3000 rot./min. Purificarea: se folosesc coloane C18 Baker. Se spal coloana cu 2 ml metanol (100%) i 2 ml ap distilat. n continuare se aplic 5 ml prob n flux de 15 picturi/minut. Se spal coloana cu 3 ml ap distilat. Se usuc coloana timp de 2 min., n curent de aer sau azot. Eluia: Se elueaz proba cu 1ml metanol n flux de 15 picturi/minut.

Rezultate i discuii
Valorile calculate pentru standard sunt aezate ntr-un sistem de coordonate semilogaritmice, fa de concentraia echivalent a Streptomicinei n g/kg. Curba de calibrare trebuie s fie virtual liniar n domeniul 2-32 g/kg (ppb). Prin extrapolarea curbei etalon, se determin echivalenii de streptomicin n g /kg. n scopul obinerii concentraiei efective de Streptomicin n g/kg dintr-o prob, concentraia citit de pe curba etalon trebuie multiplicat cu factorul de diluie corespunztor, pentru miere: 20. n cazul probelor fortificate cu STP (figurile 1, 2 i 3) se constat c la ziua 0 i la ziua 7 cantitile de antibiotic sunt aproximativ egale i se observ prezena unei cantiti medii suplimentare de 1,933 ppb antibiotic. De remarcat unele modificri n coninutul de antibiotic doar dup 16 zile de pstrare.

90

Monica Cristina Cara et al

Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug Vol. 5 (1) 2011

23,000 Prob miere fortificat la 20 ppb STP

3,000 Catitate real STP, ppb 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000
1 2 3 Proba 4 5 6

22,000 21,000 20,000 19,000 18,000 17,000 Ziua 0 Ziua 7 Ziua 16

Prob miere fortificat la 20 ppb STP Prob miere fortificat la 30 ppb STP Prob miere fortificat la 40 ppb STP

Ziua 7

Figura 1. Variaia concentraiei probelor fortifiate la 20 ppb STP comparativ pentru trei zile

Figura 5. Variaia real de STP n ziua 7 comparativ pentru probele fortifiate cu 20, 30, 40 ppb
3,500 Cantitate real STP, ppb 3,000 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 1 2 3 4 5 6 Ziua 16 Prob miere fortificat la 20 ppb STP Prob miere fortificat la 30 ppb STP Prob miere fortificat la 40 ppb STP

Figura 2. Variaia concentraiei probelor fortifiate la 30 ppb STP comparativ pentru trei zile
42,500 Prob miere fortificat la 40 ppb STP 42,000 41,500 41,000 40,500 40,000 39,500 39,000 38,500 38,000 1 2 3 Proba 4 5 6 Ziua 0 Ziua 7 Ziua 16

Figura 6. Variaia real de STP n ziua 16 comparativ pentru probele fortifiate cu 20, 30, 40 ppb

Figura 3. Variaia concentraiei probelor fortifiate la 40 ppb STP comparativ pentru trei zile

n figurile 4, 5 i 6 sunt reprezentate pe zile cantitile reale de STP prezente n probele analizate. Se evideniaz prezena antibioticului n probe fortificate cu 20-30 ppb.
3,500 Catitate real STP, ppb 3,000 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 1 2 3 4 5 6 Ziua 0 Prob miere fortificat la 20 ppb STP Prob miere fortificat la 30 ppb STP Prob miere fortificat la 40 ppb STP

n examinarea canitilor de antibiotic (n cazul nostru streptomicina) n cele 6 probe de miere am recurs la calcularea coeficientului de variaie (CV %) pentru cazul probelor fortificate cu 20 ppb, 30 ppb i 40 ppb. S-a obinut un model bun, cu un indicator de precizie de 0,99. Deviaia standard este o valoare a unui set de date i exprim ct de departe se gsesc datele de media lor. Deviaia standard, SD s-a calculat cu formula:
SD =
unde:

n x 2 ( x ) n(n 1)

n numrul de determinri; x valoarea determinrii curente.

Coeficientul de variaie, CV:

CV = n SD
k

100

[%]

x
i =1

unde:

k = mn; m numr de zile, m = 3 (0, 7,16).

Figura 4. Variaia real de STP n ziua 0 comparativ pentru probele fortifiate cu 20, 30, 40 ppb

Reproductibilitatea rezultatelor msurrii reprezint acordul strns ntre rezultatele obinute; msurri efectuate prin variaia condiiilor de msurare. Pentru analiza i verificarea cantitii de antibiotic din probele de miere, determinat

91

Monica Cristina Cara et al

Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug Vol. 5 (1) 2011

experimental pentru cele trei concentraii de fortifiant, n figura 7 este prezentat urmtoarea caracteristic:
Variaia coeficienilor de variaie cu concentraia reproductibilitate
Valoare coeficient de variaie, %

4,5 3,5

y = -0,7585x + 3,9537 2 R = 0,9999

3,2

2,5 1,5 3
1,683

2,427

2 Concentraie: 3-40ppb; 2-30ppb; 1-20ppb

3. Coeficienii mici de variaie asigur o bun reproductibilitate a testului. 4. Avnd n vedere c limita de detecie a kitului este de 20 ppb pentru miere, am preferat ca determinrile s se realizeze cu cantiti mai mari de fortifiant. 5. Doza optim din punct de vedere calitativ i cantitativ de fortifiant este de aproximativ 30 ppb STP. 6. Din analiza probelor de miere recoltate de apicultori n zona respectiv se constat o ncrcrcare mic cu antibiotic-STP.

Figura 7. Evoluia coeficientului de variaie cu concentraia fortifiantului

Bibliografie
1. Balan, Ovidiu Materii prime i materiale pentru industria alimentar, Tipografia Universitii Tehnice ,,Gh. Asachi Iai, 1999 2. Ghimicescu, George Chimia i analiza alimentelor, buturior i condimentelor, Editura Junimea, Iai, 1977 3. Bratu, Iuliana Studiu asupra factorilor ce influeneaz culoarea diferitelor sortimente de miere din Romnia, Buletin tiinific, Sibiu, vol.IV, p.27-30. 4. Vasile Stanescu, Medicina Legala Veterinara, Editia I, Editura ALL, 1994 5. Protocolul de lucru Determinarea streptomicinei prin metoda Elisa R-Biopharm 6. M. Bura, S. Patruica, V.A. Bura, Tehnologia apicola, Editura Ferma, 2008 7. Marian Nita, Laurentiu Dinu, Adriana Camelia Mitea, Apiterapia, Editura Aius, 2010

Corelaia coeficientului de variaie cu cantitatea de fortifiant adugat, prin caracterul liniar prezentat n figura 7 confirm faptul c reproductibilitatea msurtorilor sunt n concordan cu ateptrile. Concluzii Din investigaiile efectuate se desprind urmtoarele concluzii: 1. Precizia dintr-o serie a fost determinat din rezultatele a trei teste diferite. 2. Coeficienii de variaie (% CV) obinui pentru valorile absorbiei standardelor se traseaz n funcie de concentraiile corespunztoare de Streptomicin.

92