Eritrocite artificiale

microEA EA submicrometrice cu membran lipidic nanoEA cu membran biodegradabil

Biotehnologii industriale, an III

Eritrocite artificiale

Eritrocite artificiale. Sus: compoziia eritrocitelor i a EA. Dreapta jos: eritrocite artificiale

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

celule cu acelai coninut ca al eritrocitelor, dar cu membran

artificial coninutul este reprezentat de hemolizat eritrocitar ncapsulat n membrane artificiale Hemoglobina microEA cu membran de butilbenzoat conin o combinaie de oxiHb i metHb. OxiHb pstreaz abilitatea de a se combina reversibil cu oxigenul dac n celule se nglobeaz CAT, are loc o reducere puternic a formrii de metHb comportament similar au EA cu membran de cauciuc silastic (cauciuc+plastic), polistiren, etilceluloz, dextran stearat n microEA cu membran de nylon se formeaz o cantitate mai mare de metHb

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

A B

Curba de disociere a oxigenului n eritrocitele normale (A) i microEA (B)

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

Structura hemoglobinei

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

Anhidraza carbonic Prezent n concentraie mare n eritrocite, este implicat n transportul CO2 n microEA, i pstreaz activitatea

Catalaza Catalizeaz reacia de descompunere a apei oxigenate la ap i oxigen Dac este nglobat n microEA, i pstreaz activitatea i poate fi folosit n terapia enzimatic a animalelor cu lips congenital a catalazei Imunologia EA EA nu posed antigene de grup sangvin, deci celulele nu aglutineaz, chiar dac EA conin hemolizat de la eritrocite umane incompatibile

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

A B

Implicarea anhidrazei carbonice n meninerea echilibrului acidobazic la nivel (A) pulmonar i (B) renal

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

Injectarea intravenoas a microEA EA cu membran polimeric cu dimensiuni 1 m

Comportamentul EA n circulaia sangvin a fost studiat prin

injectarea intravenoas a celulelor la pisic timp de 1,5 min, urmat de recoltarea probelor pe o perioad de 30 min. Cele mai multe EA realizeaz dou circuite, dup care sunt eliminate rapid din fluxul sangvin de ctre plmni, ficat i splin n timpul infuziei, scade presiunea arterial i crete cea venoas i apar semnele embolismului pulmonar, deoarece EA nu se pot deforma ca s traverseze capilarele mici Chiar dac au dimensiuni submicrometrice, EA sunt eliminate rapid din circulaie. De aceea, pentru prelungirea timpului de circulaie, trebuie modificate proprietile membranei celulare, n special ncrcarea electric determinat de prezena acidului Nacetilneuraminic

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

Injectarea intravenoas a microEA

Timpul de circulaie al EA dup infuzie

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

Injectarea intravenoas a microEA Acidul neuraminic i timpul de circulaie al eritrocitelor

Eritrocitele autoloage marcate cu 51Cr reinjectate,

supravieuiesc n circulaie 3-4 luni

Eritrocitele autoloage tratate cu neuraminidaz, pentru

distrugerea acidului N-acetilneuraminic, sunt eliminate rapid din circulaie, nivelul lor scznd exponenial, iar timpul de njumtire este de 2 ore supravieuirea eritrocitelor n circulaie depinde de prezena la suprafaa celulelor a acidului N-acetilneuraminic

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

Injectarea intravenoas a microEA

Timpul de circulaie al eritrocitelor autoloage reinfuzate, marcate cu 51Cr. Datele provin de la patru cini: fiecare punct reprezint radioactivitatea unei probe de snge provenite dintr-o ven a unui membru. n fiecare caz, primul i al treilea test s-a realizat cu eritrocite provenite de la acelai cine. n al doilea test s-au utilizat eritrocite tratate cu neuraminidaz, provenite de la acelai cine.

1. microEA cu membran polimeric ultrasubire

Injectarea intravenoas a microEA Efectele ncrcrii particulelor polimerice asupra timpului de circulaie al eritrocitelor att particulele din polistiren, ct i cele din polistiren sulfonat dispar rapid din circulaie (30 sec.) particulele de polistiren sulfonat sunt preluate de ctre sistemul reticuloendotelial, pe cnd cele nesulfonate de ctre plmni EA cu membran de nylon sulfonat se prepar prin adugare de diamine sulfonate supravieuiesc n circulaie mai mult dect cele nesulfonate, datorit faptului c nu sunt preluate eficient de ctre plmni i sistemul reticuloendotelial

1. EA micrometrice cu membran polimeric ultrasubire

Injectarea intravenoas a microEA EA cu membran de nylon sulfonat
Timpul de circulaie al EA (diametru mediu 5 m), intravenoas la pisic. Sus: de nylon sulfonat. Jos: EA nylon marcate cu 51Cr dup infuzarea EA cu membran cu membran de

ncorporarea polizaharidelor suprafaa eritrocitelor i a endoteliului vascular este acoperit de mucopolizaharide de aceea, s-au realizat EA cu membran de nylon cu heparin ncorporat celulele cu heparin au fost eliminate din circulaie rapid, ns totui mai lent dect cele fr heparin

1. EA micrometrice cu membran polimeric ultrasubire

Concluzii Se pot prepara EA in vitro Problema major este perioada extrem de scurt de supravieuire a acestora n circulaie Chiar i EA cu diametru mai mic de 1 m sunt preluate de ctre sistemul reticuloendotelial Rspunztor pentru meninerea n circulaie a eritrocitelor este acidul sialic nglobarea acidului N-acetilneuraminic n membrana EA prelungete perioada de supravieuire a acestora n circulaie, dar nu suficient de mult pentru a fi utilizate n diverse aplicaii practice

2. EA submicrometrice cu membran lipidic

EA cu dimensiuni mai mici de 1 m i membran lipidic sau lipoproteic

au un timp de njumtire n circulaie semnificativ mai mare dect al EA cu membran polimeric ultrasubire Cele mai eficiente EA submicrometrice sunt cele care au nglobat PEG (polietilenglicol) n membran. Timpul de njumtire n circulaie mai lung de 30 ore Injectarea intravenoas a EA micrometrice
EA cu membran lipidic. Stnga: Bistrat lipidic care formeaz membrana hemoglobinei ncapsulate. Dreapta: ncorporarea polietilenglicolului (PEG) n membrana lipidic determin mbuntirea marcant a timpului de circulaie a veziculelor cu Hb.

2. EA submicrometrice cu membran lipidic Compoziia membranei Colesterol i fosfolipide Creterea eficienei ncapsulrii Hb utilizarea unor cantiti minime de lipide Timpul de circulaie crete semnificativ prin includerea n membran a lipidelor anionice, dar acestea interacioneaz in vivo cu complementul Utilizarea acidului 1,5-dipalmitoil-L-glutamat-N-succinic sintetic mpiedic activarea complementului

Sistemul complement

un sistem seric de 25 de proteine enzime care se activeaz n cascad biochimic ce ajut sau completeaz abilitatea alctuit din mai multe proteine sangvine circulante, cele mai multe circul sub form de precursori inactivi (pro-proteine). Cnd sunt
stimulate de agenii infecioi, proteazele din sistem cliveaz dintre ele fiind sintetizate n ficat anticorpilor de a cura organismul de ageni patogeni cascad sub aciunea unui trigger

procesul prin care se iniiaz i propag aceast cascad de rezultatul activrii cascadei enzimatice este amplificarea masiv a
rspunsului i activarea complexului de atac al membranei reacii se numete activarea complementului

aceste pro-proteine i iniiaz cascada enzimatic

Sistemul complement

Calea alternativ Compui de suprafa ai agentului infecios

Calea clasic Complex antigenanticorp (IgG sau IgM)

Activarea complementului C convertaza C3 = C3b + C3a Complexul de atac al membranei

Declanarea inflamaiei

Opsonizarea agenilor infecioi

Lizarea agenilor infecioi

2. EA submicrometrice cu membran lipidic

Prepararea membranelor Se pasteurizeaz Hb pentru inactivarea virusurilor Hb este convertit la carbonilHb, ceea ce crete stabilitatea Hb n timpul pasteurizrii n timpul pasteurizrii, are loc denaturarea i precipitarea tuturor celorlalte proteine (inclusiv a methemoglobin-reductazei i catalazei), ceea de duce la obinerea Hb pure Se co-ncapsuleaz apoi catalaza, glutationul i efectorii alosterici cu Hb pur Dup pasteurizare, Hb pur se trece printr-o serie de filtre pentru a ndeprta orice tip de virui, apoi se concentreaz prin ultrafiltrare Dup ajustarea concentraiei de electrolii, Hb se ncapsuleaz n membran lipidic care conine PEG CarbonilHb este convertit napoi la oxiHb prin iluminarea veziculelor cu lumin vizibil, n prezena O2 Hb nu exercit presiune coloid osmotic. De aceea, se adaug soluiei dextran sau amidon EA astfel preparate se pot pstra la 4-23C timp de 2 ani

2. EA submicrometrice cu membran lipidic

Methemoglobina Agenii reductori i glucoza nu pot strbate membrana EA pentru a inhiba formarea metHb. n plus, enzimele eritrocitare se distrug n timpul pasteurizrii. Chiar dac se adaug metHb-reductaz EA, aceasta are nevoie de glucoz ca i cofactor Hb din EA este convertit lent la metHb dup infuzie la temperatura corpului Pentru ncetinirea formrii de metHb, se pot aduga antioxidani de tipul glutationului sau homocisteinei sau EA pot fi deoxigenate prin perfuzare cu azot lichid i depozitate la 4C

2. EA submicrometrice cu membran lipidic

Timpul de circulaie dup infuzie EA cu diametru mai mare de 200 nm sunt eliminate rapid din circulaie Cele cu diametru mai mic de 200 nm sunt eliminate destul de repede de ctre sistemul reticuloendotelial EA cu diametru de ~ 60 nm sunt captate destul de rapid de ctre ficat, prin endoteliul hepatic fenestrat Scderea diametrului EA scade eficiena de ncapsulare a Hb. Dac EA se nchid cu membrane lipidice cu PEG i fosfatidiletanolamine, atunci veziculele cu diametru de 210275 nm au un timp de circulaie destul de ndelungat (30 ore). Veziculele cu diametru mai mic, indiferent de compoziia membranei, sunt eliminate rapid din circulaie

2. EA submicrometrice cu membran lipidic

Sigurana EA submicrometrice cu membran lipidic Studiile clinice au artat c: Indicatorii funciei hepatice (ALAT, ASAT, LDH) se menin n limite normale Bilirubina i fierul se menin la niveluri sczute Concentraia lipidelor crete dup infuzie, dar revine la nivelul normal dup 2 sptmni Infuzarea de EA cu diametru de 250 nm nu produce efecte vasopresoare Concluzii Singurul obstacol major n realizarea practic a EA este timpul de circulaie Utilizarea de EA cu membran lipidic i PEG crete timpul de circulaie suficient de mult pentru ca EA s poat fi folosite n scop clinic

3. EA nanometrice cu membran polimeric biodegradabil

Dei EA submicrometrice rezolv problema timpului de circulaie, rmn cel puin alte dou probleme: 1. Cu ct este mai mic dimensiunea particulei, cu att este mai mare suprafaa sa n acelai volum de suspensie. Astfel, suprafaa total a 1 ml suspensie de EA cu diametrul de 200 nm este de 10 ori mai mare dect a 1 ml suspensie de eritrocite. De asemenea, cantitatea de lipide coninut de membranele EA este de 10 ori mai mare comparativ cu membranele eritrocitelor, iar cantitatea mare de lipide determin reducerea funciei fagocitice a sistemului reticuloendotelial 2. O alt problem nerezolvat este formarea metHb. In vivo, agenii reductori prezeni n plasm, traverseaz membrana eritrocitelor i acioneaz n interiorul celulelor. ns agenii reductori nu pot traversa membrana lipidic a EA. De asemenea, glucoza necesar activrii methemoglobin-reductazei nu poate traversa membrana EA.

3. EA nanometrice cu membran polimeric biodegradabil

Proprietile membranelor biodegradabile 1. Nu conin lipide n membran sau le conin n cantitate mic 2. Persist n circulaie un timp suficient de lung 3. Sunt stabile 4. Rmn stabile dup infuzie pe toat durata aciunii ca substituent al sngelui, dar sunt degradate imediat dup ce i ndeplinesc funcia 5. Materialul membranar i produii si de degradare nu sunt toxici 6. Pe lng Hb, conin enzime specifice eritrocitelor precum SOD, CAT, anhidraza carbonic sau methemoglobin-reductaza 7. Membrana este permeabil pentru agenii reductori i/sau glucoz La ora actual, membrana EA nanometrice se confecioneaz din acid polilactic (PLA), PLA-PEG sau alte materiale biodegradabile, iar diametrul nanocapsulelor este mai mic de 0,2 m

3. EA nanometrice cu membran polimeric biodegradabil

Motivele utilizrii poliesterilor pentru membranele biodegradabile Poliesterii acidului polilactic, poliglicolic i copolimerii lor sunt degradai la acid lactic i acid glicolic care sunt metabolii normali n organismul uman Rata degradrii acestor compui poate fi ajustat prin variaii ale masei moleculare, mrimii particulelor i raportului copolimerilor Poteniala toxicitate a EA nanometrice poate proveni de la monomerii reziduali sau substanele chimice utilizate pentru polimerizare (acid butiric, poli-O-esteri, polianhidride). Toxicitatea poate fi totui diminuat/eliminat prin folosirea metodei evaporrii n solvent Acidul polilactic, poliglicolic i polilactoglicolizii sunt folosii n chirurgie la suturi sau implanturi nc din 1982 i nu provoac reacii adverse sau toxice

3. EA nanometrice cu membran polimeric biodegradabil

Electronomicroscopie a unei EA cu membran de acid polilactic

3. EA nanometrice cu membran polimeric biodegradabil

Sinteza i soarta EA nanometrice Pentru sinteza EA nanometrice este necesar mai puin material dect pentru submicroEA. Acidul polilactic este degradat n organism la acid lactic, apoi la CO2.

3. EA nanometrice cu membran polimeric biodegradabil

Sigurana i eficacitatea EA nanometrice Eficiena Hb nanoncapsulate variaz ntre 13-29% din Hb iniial, n funcie de polimerii utilizai Enzimele i sistemele enzimatice Un mare numar de enzime prezente n mod normal n eritrocite au fost nanoncapsulate i s-a observat ca i pstreaz activitatea (de ex., methemoglobinreductaza catalizeaz transformarea metHb la Hb) Activitatea methemoglobinreductazei poate fi optimizat n prezena glucozei i a NADH Membranele EA nanometrice sunt permeabile pentru glucoz i ageni reductori, dar impermeabile pentru NADH. De aceea, NADH necesar methemoglobinreductazei trebuie ncorporat n EA odat cu Hb

3. EA nanometrice cu membran polimeric biodegradabil

Sigurana i eficacitatea EA nanometrice Enzimele i sistemele enzimatice
Nanoncapsularea determin creterea nivelului de metHb. Incubarea EA la 37C determin creterea n continuare a metHb. Adugarea unui agent reductor, acidul ascorbic, previne creterea nivelului de metHb. Adiia de glucoz i NADH determin scderea i mai accentuat a metHb.