ENZIMELE

ENZIM de la grec.Eu ZYMOS- n drojdie

Enzime catalizatori biologici de natur proteic, ce mresc viteza reaciilor chimice E- acioneaz strict ntr-o anumit consecutivitate i cu o anumit specificitate

Enzimologietiina, ce se ocup cu studierea enzimelor

Enzimodiagnostica - este determinarea

activittii enzimelor, care se pot modifica n diferite patologii cu scop de diagnoz.

Enzimoterapia
- este utilizarea enzimelor,
extrase i purificate sau sintetizate n laborator, n tratamentul diferitor patologii.

Natura chimic a E

1.

2.
3. 4. 5. 6.

E- sunt proteine i posed toate proprietile fizico-chimice specifice acestor molecule (solubilitate, proprieti osmotice, sarcin electric net, denaturare termic) Dovezile experimentale: Sunt alctuite din AA Prezint macromolecule n ap formeaz sol. coloidale cu propriet. sale specifice Prezint electrolii amfolii Se supun denaturrii Au fost sintetizate n condiii de laborator din AA (ribonucleaza, lizozima)

Asemnrile E cu catalizatorii neorganici

1.

2. 3. 4.

catalizeaz numai reaciile posibile din punct de vedere termodinamic; nu modific echilibrul reaciilor reversibile; nu modific direcia reaciei; nu se consum n procesul reaciilor.

Deosebirile E de catalizatorii neorganici

1.

2. 3.

4. 5.

6.

Viteza catalizei enzimatice este cu mult mai mare dect a celei nebiologice (1 mg de Fe n componena catalazei poate nlocui o ton de Fe metalic). Enzima posed specificitate nalt. Enzimele catalizeaz reaciile chimice n condiii blnde (presiunea obinuit, temperatura 37C, pH aproape neutru). E catalizeaz reaciile fr formarea produselor intermediare randamentul este de 100% Reaciile enzimatice se regleaz. Viteza reaciilor este direct proporional cu cantitatea enzimei.

Structura enzimelor

Masa molecular a E e de mii de ori mai mare dect masa molecular a substratului (S) S - substana asupra creia acioneaz E E acioneaz nu cu toat molecula dar cu un anumit sector denumit centrul activ (CA) CA - locul care asigur interaciunea E cu S i transformarea ulterioar a acestuia.

Particularitile CA
1. 2. 3.

4. 5.

Este o combinare unical n spaiu i n timp a anumitor resturi de AA E o structur tridimensional (AA aflai n locuri diferite) Are form de adncitur sau cavitate, cptuit cu AA hidrofobi, unde nu-i acces de ap (ex. cnd apa este un reagent al reaciei) Ocup o parte relativ mic din volumul E i majoritatea resturilor de AA n molecula E nu contacteaz cu S S relativ slab se leag cu E

Centrul alosteric

Unele E posed i un alt centru (sau alte centre) dect cel activ centru alosteric (allo stereos alt loc) C alos. - are o poziie spaial pentru fixarea metabolitului reglator, numit efector sau modulator Modulatorii se fixeaz necovalent i pot fi: activatori sau inhibitori.La fixareamodulatoeilor, E i modific conformaia. E cu centrul alos. se numesc E alosterice sau reglatoare E alosterice au o structur cuaternar.

Cofactorii enzimelor
Deosebim: 1. E simple alctuite numai din AA 2. E conjugate - snt formate din: a. partea proteic - apoenzim b. partea neproteic - cofactor. Cofactori molecule (sau ioni) mici, mai stabili la aciune dect apoenzimele Cofactorul strns legat n structura E grupare prostetic Cofactorul slab legat, uor disociabil coenzim (Co) n calitate de cofactori apar frecvent cationii unor metale

Rolul Co
Stabilizeaz conformaia activ a moleculei 2. Prezint veriga de legtur ntre S i CA prin leg. coordinative 3. Co pot ndeplini actul de cataliz Ex. transportul electronilor
1.

Tiamina (Vit B1)

Tiaminpirophosfat (TPP),
particip n decaeboxilarea alfacetoacizilor

Riboflavina (Vit B2)

Coenzimele flavinice particip n

reacii de oxido-reducere
Flavinmononucleotid (FMN)

Flavin adenin dinucleotid (FAD)

Participarea FAD-ului in procesele de oxido-reducere

Vitamina PP
Nicotinamid
Nicotinamid adenin dinucleotid NAD (NADP)

NAD particip n reacii de oxido-reducere

Vitamina B6 particip n reacii de

Piridoxin, Piridoxal, Piridoxamin (Vit. B6)

transfer a diferitelor grupe

Piridoxaminphosphat

Ionii de metale cofactori ai E

1. 2. 3. 4.

E care n calitate de cofactori conin metale metaloenzime Metalele sunt fixate de apoenzim prin legturi electrostatice la care particip resturile de AA acizi (Asp, Glu) sau bazici (Arg, Lyz, His) Exemple: citocromii, catalaza (Fe) Citocromoxidaza (Cu) Amilaza salivar (Cl) Alcooldehidrogenaza (Zn)

Mecanismul de aciune al enzimelor.

1.

2.

3.

Procesul catalizei enzimatice poate fi divizat convenional n trei stadii: Difuzia S spre E i legarea cu CA al E - formarea complexului ES. Transformarea complexului primar ES n forma activ, indicat prin ES* Desprirea produselor reaciei de CA al E i difuzia lor n mediul ambiant (complexul EP disociaz n E i P).

Ipoteza lact-cheie (Fischer) i coincidena forat (Koshland)

Modelul clasic (Emil Fischer) consider c potrivirea substratului cu centrul activ al enzimei este analog cu potrivirea lact-cheie. Acest model presupune o rigiditate a structurii enzimei n zona centrului activ. modelul Koshland, numit centrul activ indus, presupune o flexibilitate a CA. n enzima liber CA este preformat ntr-o configuraie spaial uor diferit de cea necesar fixrii S. S induce o modificare conformaional a CA, care favorizeaz fixarea lui

Conceptul clasic "lact- cheie"

- elaborat n 1890 de ctre Emil Fischer - consider c potrivirea substratului cu centrul activ al enzimei este analog cu potrivirea lact-cheie. Acest model presupune o rigiditate a CA. la prima etap a formrii acestui complex n rezultat se modif structura S cptnd starea de tranziie dup care se transform n P E+S-- ES- E+P

Conceptul coencidenei inductive

coincidena forat (Kochland)

Mecanismul de aciune al E

Pentru decurgerea unei reacii este necesar ca molecula de S i E s contacteze ntre ele, pentru aceasta e necesar de contientizarea unei noiuni ca: Energia de activare este energia necesar tuturor moleculelor unui mol de substan, care la o anumit t pot s ating starea de tranziie corespunztoare apixului barierii energetice (KJ/mol; kcal/mol) E - micoreaz energia de activare ale reaciilor chimice. Cu ct mai mult scade energie de activare, cu att mai eficient acioneaz catalizatorul, i cu att mai mult se accelereaz reacia.

Enzymes Lower a Reactions Activation Energy

Clasificarea actual a enzimelor.

Toate enzimele se mpart n ase clase, clasele n subclase, subclasele n subsubclase, iar aici E i are numrul su de ordin. Clasele, subclasele, sub-subclasele i enzimele individuale se noteaz prin cifre desprite de puncte. Ex: LDH - 1.1.1.27 Clasa reprezint tipul de reacie, catalizat de enzime Subclasa precizeaz aciunea E, deoarece indic natura gruprii chimice a S, atacat de E Subsubclasa precizeaz natura legturii S atacat sau natura acceptorului care particip la reacii Denumirea E denumirea S +tipul reaciei catalizate +aza

Clasificarea actual a enzimelor

1.

2.
3.

4.
5.

6.

Oxidoreductaze, catalizeaz reaciii de oxido-reducere; Transferaze, catalizeaz transferuri grupelor funcionale de la un S la altul (metil, amino, acil,); Hidrolaze catalizeaz scindri de legturi covalente cu adiionarea apei ; Liaze, catalizeaz ruperea leg. C-C, C-S i C-N; fr adiionarea apei, adiia la legturi duble i reaciile inverse. Izomeraze, catalizeaz toate tipurile de transformri n cadrul uneia i aceleai molecul ; Ligaze (sintetaze), catalizeaz formarea de legturi ntre carbon i O, S, N, cuplate cu hidroliza legturilor macroergice (utilizarea ATP).

Clasificarea enzimelor.
- catalizeaz reaciii de oxidoreducere; -catalizeaz transferuri grupelor funcionale de la un S la altul (metil, amino, acil,); -catalizeaz scindri de legturi covalente cu adiionarea apei ;
-catalizeaz ruperea leg. C-C, C-S i C-N; fr adiionarea apei, adiia la legturi duble i reaciile inverse.

-catalizeaz toate tipurile de transformri n cadrul uneia i aceleai molecul ;

- catalizeaz formarea de legturi ntre carbon i O, S, N, cuplate cu hidroliza legturilor macroergice (utilizarea ATP).

Proprietile generale ale enzimelor

Factorii care influieniaz activitatea E

Temperatura PH Concentraia S Concentraia E electroliii

Termolabilitatea (t)

E sunt termolabile t optim a majoritii E se afl n limitele 20 - 40 C odat cu creterea t cu 10C (dac lum punctul de plecare 0 ) - V reaciei enzimatice sporete de 1,5 ori, atingnd max la t 40C. Majorarea de mai departe duce la micorarea activitii enzimatice ceea ce mrturisete despre denaturarea proteinei. La t joase E se inactiveaz

Aciunea pH asupra activitii enzimatice

1. 2. 3. 4.

Fiecare E are un pH optim propriu la care i manifest activitatea maximal. Majoritatea E celulare au pHul optim- 7,4 La E digestive pH-lui optim este cel al sediului lor de aciune: Pepsina pH 1,5 2, Amilaza pancreatic - pH 6,4-7,2, Tripsina - pH 7,8-8,0 Arginaza- pH 9,5-10 etc.

[E]

n condiii standard 2 mol de E ntr-o anumit perioad de timp vor transforma de 2 ori mai multe molecule de S dect 1 mol de E (relaie direct proporional).

[S]

Grafic se reprezint sub form de o curb de tip hiperbolic. n perioada iniial a reaciei V crete pe msur ce crete [S]. La un moment dat cnd CA al E se ocup de S V nu mai crete. Ea rmne constant i corespunde V max a reaciei.

Specificitatea

este capacitatea unei E de a selecta dintr-un numr de compui S particular. este o proprietate a E, care instituie eficien i ordine n metabolism, prevenind desfurarea lui haotic. este condiionata de complimentaritatea conformaional i electrostatic ntre CA al E i S.

Specificitatea
- este capacitatea unei enzime de a selecta dintr-un

numr mare de S unul particular, -

-este condiionat de complimentaritatea conformaional i electrostatic ntre CA al E i S.

E S4 S2

Deci fiecare E catalizeaz un anumit tip de reactii sau transformarea unui anumit S.

 Specificitate

de substrat: stereochimic, absolut i relativ : Specificitate stereochimic - E

catalizeaz transformarea numai a unuia din stereoizomerii posibili. Ex: Amilaza scindeaz legturile 1-4 glucozidice din amidon sau glicogen i nu influenteaz asupra legturilor din celuloza.

specificitate de S absolut -

E catalizeaz transformarea doar a unui S (anhidraza carbonica, ureaza).

specificitate absolut de grup E catalizeaz un

anumit grup de substrate (alcooldehidrogenaza)

Specificitatea relativ de grup E catalizeaz

Specificitatea relativ de substrat -

descompunerea anumitor legturi n diferite substrate (pepsina) E catalizeaz transformarea substanelor care aparin diferitor grupe de compui organici (cit. P450 catalizeaz transformarea S hidrofobi)

Mecanismele de activare a E
Sunt : 1. nespecifice: temperatura , iradierea 2. specifice Se activeaz la: 1. majorarea concentraiei S cnd este insuficient 2. majorarea cantitii E 3. introducerea coenzimelor cnd sunt insuficiente 4. Introducerea ionilor metalelor Fe, Cu Se cunosc urmtoarele tipuri de reglare a activitii enzimatice: 1. proteoliza limitata 2. Reglare covalent fosforilare/ defosforilare 3. Autostructurarea cuaternar 4. Alosteric 5. Reactivare

Proteoliz limitat
Unele enzime (proteine) se sintetizeaz n forma neactiv de precursor proenzime (zimogeni) Exemplu: enzimele digestiei: pepsinogenul, tripsinogenul - scindeaza descompunerea proteinelor

Mecanismele de activare a proenzimelor este proteoliza limitata. Proteoliza limitata - este scindarea (nlturarea) unui sector al catenei n rezultat se formeaz CA. H+ Pepsinogen ------pepsin -42AA

Importanla biologic a prezenei formelor neactive .

1. Protejaz de proteoliz proteinele celulelor productoare de E. 2. Este o forma de rezerv a E, care rapid pot fi activate i intervin n reacie.

Reglarea covalent (fosforilare-defosforilare)

Activitatea unor E se modific prin fosforilare. Reaciile de fosforilare sunt catalizate de kinaze specifice. E-OH + ATP -------- E-O-P +ADP Defosforilarea are loc sub aciunea fosfotazei specifice E-OP +H2O------- E-OH +H3PO4

unele enzime snt active n forma fosforilat, iar altele n forma defosforilat. Ex.: glicogen fosforilaza activ n forma fosforilat; glicogen sintaza este activ n forma defosforilat

Autostructurarea cuaternar

Este caracteristic E ce posed structur cuaternar Fiecare protomer n parte nu posed activitate enzimatic La asamblarea lor se modific conformaia fiecrui protomer i corespunztor se modific i conformaia CA, devenind astfel favorabil pentru fixarea i transformarea S

CA

Inhibiia activitii enzimelor

1.

2.

1. 2. 3. 4.

Deosebim: inhibiie nespecific (T, pH, agenii denaturrii ) inhibiie specific Inhibiia poate fi reversibil i ireversibil. La inhibiiia ireversibil inhibitorul covalent se fixeaz de enzim sau se leag att de puternic nct disociaia are loc foarte incet. Exemple: cianurile se fixeaz cu Fe 3+ din citocromoxidaz ---se ntrerupe LR; La o inhibiiie reversibil - inhibitori se fixeaza slab, necovalent de E Deosebim: Inhibiie competitiv Inhibiie necompetitiv Inhibiie prin exces de S Inhibiie alosteric

se aseamn dup structur cu S i se fixeaz n CA al E, mpedicnd fixarea i transformarea S. Nu e posibil fixarea simultan a S i a I. E va fixa pe acel competitor care se afla intr-o concentraie mai mare. inhibiia enzimei (SDH)cu malonat. SDH oxideaza succinatul in fumarat) Malonatul inhiba aceasta E datorita asemanarii cu S. Particularitatea principal a acestui tip de inhibiie este c poate fi nlturat cu adugarea n exes a S(succinat).

Inhibitorul

Inhibiia necompetitiv

inhibitorul nu se aseamn ca structura cu S I i S se leag simultan cu E dar locusurile sint diferite E+S+I--------- ESI Activitatea I const n micorarea numrului turnover al E, dar nu i numrul de molecule de S. I poate fi nlturat de substane care l leag numite reactivatori

I i S se leag simultan cu E n locusuri diferite

Mrirea concentraiei de S nu micoreaza inhibiia.

Cei

mai de vaz inhibitori de acest tip n celulele vii sint produsele intermediare ale metabolismului, care reversibil se fixeaz la unele E reglatoare i modific activitatea lor.

complexul ES, inhib activitatea E E+S----ES +I-----ESI

Inhibiia noncompetetiv I se leag la inhibiia prin modificarea covalent a

moleculei enzimei - prin fosforilare pe baza ATP-ului. Unele enzime fosforilate pierd activitatea de exemplu enzima glicogensintetaza Inhibiia prin exces de S n CA se fixeaz simultan surplus de S ce nu poate fi transformat. Este o inhibiie reversibil nlturarea S. Retroinhibiie -

Inhibiie

alosteric - inhibitorul (efectorul) se leag n centrul alosteric al enzimei, modificnd conformaia moleculei (structura teriar) ce are ca consecin deformarea centrului activ.

CA CA

Retroinhibiie

Sistemele polienzimatice Tipurile de organizare a sistemelor polienzimatice

Fiecare celul a organismului conine setul su specific de E. Unele se gsesc n toate celulele, altele sunt prezente doar n anumite celule sau anumite compartimente celulare. Funcia fiecrei E, nu este izolat, ci strins legat de funcia altor enzime. Astiel din E aparte se formeaza sisteme polienzimatice sau conveiere. Funcia sistemelor polienzimatice depinde de particularitile de organizare a lor in celule. Se cunosc urmatoarele tipuri de organizare a sistemelor polienzimatice: 1. - funcional, 2. - structural-funcional 3. - mixt.

Unitile de activitate ale enzimelor

Unitatea Internaional (U.I.) cantitatea de E care catalizeaz transformarea 1mol de S ntr-un minut n condiii standard Katal (kat) cantitatea de E care asigur transformarea unui mol de S ntr-o secund n condiii standard (1U.I.=16,67 nkat)

Enzimele indicatorii sunt localizate intracelular: n citoplasm (lactatdehidrogenaza, aldolaza), n mitocondrii glutamatdehidrogenaza), n lizosomi (-glucoronidaza, fosfataza alcalin). Acestea enzime n norm n plasm se gsesc n concentraii foarte mici. La afeciunile celulare activitatea acestor enzime n plasm este brusc mrit.

Terapia cu enzime

Enzimele sunt ageni terapeutici unici ce produc efecte importante i specifice. Motivele care au limitat folosirea larg a enzimelor ca medicaie sunt legate de natura proteic: - distribuie redus n organism dependena de dimensiuni, sarcina i de fenomenele de glicozilare (prin glicozilare proteinele sunt recunoscute de receptori i fixate n anumite locuri - posibilitate mic de dirijare extrahepatic, ficatul avnd tendin de a cptta i reine proteinele strine; - inactivarea lor sub aciunea proteazelor digestive n cazul administrarii orale, iar proteazele tisulare le scurteaza de asemeni actiunea; - potentialul lor antigenic, anticorpii formati pot genera reacii de hipersensibilizare adesea grave i pot inactiva enzima.

Tehnici propuse pentru optimizarea proprietilor terapeutice ale enzimelor.

- prin N-acilare a fost crescut semiviata asparaginazei, folosit n leucemie - S-au incercat de asemeni metode de obinere a enzimelor imobilizate. De ex. prin reticularea enzimei, ce conduce la agregate insolubile, prin adsorbie pe polimeri sintetici ori prin ataare covalent, sau prin incorporare ntr-un gel in cursul polimerizarii. Aceste preparate catiga rezistena la enzimele proteolitice i sunt mai putin imunoactive dar pot fi alterate proprietatile farmacocinetice. Asemenea avantaje au dovedit conjugatii cu polietilenglicol (PEG) ai arginazei, ai glutaminasparaginazei sau ribonucleaza supusa reticularii, enzime cu efect antitumoral. Un succes n terapia defectelor genetice a fost imobilizarea enzimelor din ciclul ureogenetic pe un suport de fibrina. S-au propus noi forme farmaceutice prin incapsularea enzimelor in lipozomi microsfere cu membrana bistratificata lipido proteica, in hematii umane, in fantome eritrocitare sau in alti transportori celulari. Noile forme obinute prezint un potenial de ntire tisular. De ex. in cazul unor boli genetice cauzate de deficitul unor enzime lizozomale se impune o terape de substitutie, enzima trebuind tintita direct in lizozomi.