2/15/2010

1
Bacteriofagul. Caractere
morfobiologice. Utilizarea
practic a bacteriofagilor
((fag vegetativ fag vegetativ))
Proprietatile biologice ale bacteriofagului
Bacteriofagi sunt numite virusurile ce
infecteaz bacteriile. Un virus este un
organism (o unitate genetic) care nu are
structur celular, nu posed metabolism
propriu i este capabil s se reproduc doar n
celula-gazd.
Bacteriofagii sunt parazii intracelulari
obligatorii ale celulelor bacteriene. Toate
bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi.
In majoritatea cazurilor, un fag anume
infecteaz doar celulele unui singur gen, unei
anumite specii sau a unei tulpini -
specificitatea fagului. Aceast specificitate de
infecie este determinat de prezena
receptorilor pentru acest fag la suprafaa
bacteriei-gazd.
Structura bacteriofagului
Structura fagilor corespunde regulilor
generale ce se refer la structura virusurilor.
1. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent
dublucatenar, linear sau circular).
2. Inveli proteic numit capsid, cu rol de
protecie a materialului genetic. Prin
receptorii de la suprafa contribuie la
infecia gazdei.
3. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim,
endolizina).
Capsida este constituit din subuniti
proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-o
ordine distinct, conferind forma fagului.
Exist 3 forme morfologice principale de fagi:
Fag icosaedric: are form sferic constituit din
20 fee triungiulare, 30 muchii i 12 vrfuri
(simetrie cubic a capsidei).
Fag cilindric: reprezint bastonae proteice
formate din capsomere, asamblate ntr-o
structur tubular (simetrie helicoidal a
capsidei).
2/15/2010
2
Fag complex: este constituit din cap icosaedric ataat la
o coad helicoidal. Coada este format din doua tuburi
concentrice, un tub intern rigid - canalul axial, care este
inconjurat de teaca cozii, un manon contractil. Gulerul
cozii (colul) se afl la jonciunea capului cu coada. La
partea distal a cozii se afl o plac hexagonal, placa
bazal, la fiecare apex fiind ancorate cte un croet i o
fibr. Ele reprezent sistemul de fixare a fagului pe
bacteria receptoare i contribuie la injecia materialului
genetic n celul.
Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad
lunga i non-contractila, alii - coada scurt, sau far
coad. Exist i fagi filamentoi.
Interaciunea dintre bacteriofag
i celula-gazd
Bacteriofagii exist n stare de virioni extracelulari,
iar la infectarea unei bacterii ei pot duce la doua
tipuri de infecii:
Infecie litic: determinat de fagii viruleni. La
finele ciclului de multiplicare bacteria infectat este
lizat elibernd fagii nou-formati.
Infectie nelitica sau lizogen: determinat de
fagii temperai (moderai). Ei infecteaz bacteriile
fr a le distruge.
INFECTIA LITIC (ciclul biologic al fagului virulent)
Adsorbia. Dupa o ciocnire intmpltoare, fagul se
fixeaz prin intermediul plcii bazale (la inceput
prin fibrele sale, apoi prin croete) de un receptor
specific la nivelul peretelui celular bacterian
(uneori flageli sau pili).
2/15/2010
3
Penetrarea. Dup fixarea ireversibil a fagului pe
peretele bacterian, n urma aciunii unei enzime
(ex. lizozim) care perforeaz peretele, are loc
contracia manonului care apropie capul de
placa bazal, canalul axial penetreaz membrana
citoplasmic a bacteriei i ADN fagic este injectat
in bacterie.
Expresia genomului viral (biosinteza
componentelor fagice, maturizarea). Dup
penetrarea ADN viral n bacterie (fag
vegetativ), timp de aproximativ 12 minute,
virionul nu este depistat n bacteria infectat.
Aceasta este faza de eclips. Ea coincide cu
sinteza enzimelor virale care vor asigura
ulterior:
replicarea ADN fagic;
sinteza proteinelor fagice;
asamblarea acestor elemente.
Asamblarea fagilor. Odat ce compuii capsidei i
acizii nucleici se sintetizeaz n cantiti suficiente,
are loc asamblarea spontan a particulelor noi de
fagi, prin incorporarea acidului nucleic n capsid.
Eliberarea. Majoritatea fagilor, dup maturizare,
sunt eliberai n urma lizei peretelui bacterian cu
enzime ale bacteriofagului (endolizina)
Timpul dintre infectie i eliberare (ciclul de
reproducere) este de 20-60 minute la 37C, fagii sunt
eliberai n valuri de 50-1000 fagi per celul.
2/15/2010
4
INFECTIA NON LITIC SAU LIZOGEN :
FAGII TEMPERAI
Fagii temperai (moderai) atunci cand infecteaz o bacterie
pot:
- sau induce un ciclu complet de multiplicare, ce duce la liza
bacteriei,
- sau, mai frecvent, dup injectarea ADN-ului, s integreze
acest ADN n cromozomul bacterian prin recombinare
specific, formnd un profag (lizogenizare)
- sau sa ramn n citoplasm sub form de plasmid.
In ultimele dou cazuri bacteria nu moare i, multiplicndu-se,
replic genomul viral concomitent cu propriul su genom:
bacteria (cultura) este numit lizogen. Ea posed i
transmite descendenilor capacitatea de a produce fagi n
absena infeciei.
2/15/2010
5
Proprietile culturilor lizogene
1. Inducia ciclului litic. Profagul pstreaz
virulena potenial. Meninerea strii de
lizogenie implic sinteza unui represor proteic,
codificat de fag. Dispariia lui duce la inducia
ciclului litic. Inducia se poate declana
spontan la un numar limitat de celule sau
poate fi provocat la majoritatea celulelor, de
ex., la aciunea unor mutageni, ca razele
ultraviolete sau mitomicina C.
Ca urmare, cnd sistemul SOS este activat,
proteina RecA scindeaza represorul proteic al
fagului, permind expresia ciclului litic. Pentru
aceasta profagul trebuie sa fie excizat - operaie
invers integrrii. Excizia este efectuat de
ctre proteina xis, codificat de fag. Urmeaz
replicarea genomului, sinteza componentelor
fagului i fagii asamblai sunt eliberai prin liza
celulei (profagul - gen potenial letal!).
n timpul replicrii fagului moderat fragmente de ADN
bacterian pot fi ntroduse din eroare n particulele
virale. Aceti fagi pot n continuare ntroduce n
cromosomul altor bacterii ADN bacterian capturat
proces de transfer genetic numit transducie.
Natura genelor bacteriene transferate poate fi diferit:
gene din apropierea locului de inserie a fagului
(transducie specific) sau fragmente de ADN
bacterian ntroduse din ntmplare n capsida fagului
(transducie generalizat)
2/15/2010
6
2. Imunitate contra suprainfectiei. Bacteriile lizogene
sunt imune la fagul virulent omolog profagului gzduit.
Acest fag se adsoarbe, injecteaza ADNul, dar fr a se
replica sau provoca liza.
3. Conversie fagic (modificarea fenotipului celulei
cauzat de genele profagului).
Bacteriile infectate cu un fag pot prezenta unele
caractere absente la celulele neinfectate. Aceast
conversie fagic poate fi cauzat de expresia unor gene
ale fagului de ctre celule, sau de inactivarea unor
gene cromozomale la integrarea profagului. De ex.,
tulpinile de Corynebacterium diphtheriae care
provoac difteria sunt lizogenizate de un anumit tip de
fagi care codeaza i exprim o toxin puternic; toxina
eritrogen a Streptococcus pyogenes , etc
Cultura i titrarea bacteriofagilor. Efectul fagilor viruleni asupra
culturilor bacteriene
Bacteriofagii sunt cultivai n laborator n mediu de cultur
lichid sau solid n prezena bacteriilor omologe.
Cultivarea n mediu lichid: Bacteriile sensibile i fagii se
ntroduc ntr-un bulion nutritiv (numrul de fagi este mult
mai mic dect al bacteriilor). Amestecul este incubat pentru
a permite bacteriilor s se multiplice i de a fi infectate de
ctre fagi. In consecin, numrul fagilor crete mai rapid
dect cel al bacteriilor pn la un punct critic cnd numrul
fagilor prezeni este suficient pentru a infecta toate bacteriile
culturii. Toate celulele bacteriene sunt lizate n acelai timp,
ce duce la dispariia complet a turbiditii culturii
(clarificarea mediului).
Cultivarea fagilor n mediu solid: Amestecul
bacterii-fagi poate fi adugat la geloza topit i
rcit la 45 C i apoi turnat n cutia Petri.
Bacteriile cresc, se multiplic, formnd o
pelicul fin, iar fagii continu s infecteze
provocnd liza confluent a culturii bacteriene.
Aceste colonii de fagi se manifest sub forma
unor pete sterile (plaje). Numrul plajelor indic
numrul fagilor infecioi n prelevat (fiecare
colonie se formeaz pe contul multiplicrii unui
virion fagic).
Bacteriofagii pot fi intlnii n diferite prelevate
umane sau din mediul extern. Fagii indic
prezena bacteriilor sensibile.
IZOLAREA BACTERIOFAGILOR
Prelevate: ap, sol, materii fecale, puroi, etc
I. Izolarea direct filtrarea prelevatelor prin filtre
bacteriene, ultracentrifugare.
II. Izolare prin metoda de mbogire fr
nsmnare materialul de examinat se
inoculeaz ntr-un mediu nutritiv lichid (pentru
multiplicarea bacteriile omologe fagului cutat).
Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este
supus filtrrii. In filtrat s-au acumulat fagii care
s-au inmulit pe contul bacteriilor omologe din
prelevat.
2/15/2010
7
III. Izolare prin metoda de mbogire cu
nsmnare inocularea prelevatului ntr-o
suspensie bacterian omolog fagului cutat.
Cultura bacterian asigur mbogirea fagilor.
Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul
este supus filtrrii.
INDICAREA BACTERIOFAGILOR
1. Metoda OTTO. Pe placa de geloz din cutia
Petri se nsmneaz n gazon suspensia de
bacterii omologe fagului. n continuare se
aplic o pictur de filtrat care conine fag
(cutia poate fi nclinat ca pictura s se
preling). Cutia se incubeaz la 37 C timp de
24 ore.
Aprecierea: dac n filtrat se aflau fagi omologi
culturii bacteriene, n locul aplicrii filtratului
se observ o zon de liz (colonie negativ de
fag).
2. Metoda FURT
Filtratul ce conine fagi se amestec cu geloz
topit i se toarn n cutia Petri. Suprafaa
cutiei se mparte n 4 sectoare. n fiecare
sector se nsmneaz n striuri culturi
cunoscute de diferite bacterii. Incubare la
37 C 24 ore.
Aprecierea: lipsa creterii bacteriilor ntr-un
sector indic prezena fagului omolog.
3. Metoda FISHER
Similar cu metoda Furt, doar c suprafaa cutiei
se mparte n 10 cadrane, astfel pot fi
nsmnate 10 culturi bacteriene i pot fi
indicai concomitent mai muli fagi.
TITRAREA BACTERIOFAGILOR
Este utilizat pentru determinarea numrului de
fagi viruleni n prelevat sau cultur.
Metodele de titrare a bacteriofagului
I. Titrarea bacteriofagului n mediu lichid
(metoda Appelman)
II. Titrarea bacteriofagului n mediu solid
(metoda Gratia)
APPELMAN la diluii logaritmice a culturii de
fag (10
-1
.....10
-10
) n bulion peptonat se adaug
suspensie bacterian omolog fagului
examinat. Dup 24 ore de incubare la 37 C se
apreciaz titrul fagului: diluia maxim a
fagului care nc mai provoac liza bacteriilor
(mediu clar).
2/15/2010
8
GRATIA. Dup diluia logaritmic a fagului i
adugarea culturii bacteriene, coninutul
fiecrui tub se amestec cu geloz topit i
amestecul se toarn n cutii Petri. Dup 24 ore
de incubare la 37 C se numr plajele formate
(coloniile negative de fagi). Numrul plajelor
corespunde cu nr de fagi viruleni din
materialul de examinat.
APLICAREA PRACTIC A FAGILOR
n domeniul terapeutic
- Tratamentul i profilaxia maladiilor infecioase
n domeniul diagnostic
- Fago-identificarea identificarea tulpinilor
bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor
omologi (metoda Otto, Furt, etc)
- Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor
tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea speciei n
lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru
tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a.
Lizotipul reprezint un marker epidemiologic.
Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni,
fagii temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei
pot asigura transferul de material genetic prin
transducie).
Genetica bacterian.
Variabilitatea genetic la bacterii
Materialul genetic al celulei bacteriene:
1. Cromosomul
2. Plasmidele
Modificarea patrimoniului genetic al bacteriilor
are importan major n bacteriologia
medical, deoarece ea poate cauza
modificri n potenialul patogen al
bacteriilor sau sensibilitatea lor la
antibiotice.
2/15/2010
9
Mecanismele variabilitii genetice la bacterii:
I. MUTAII
1. Substituia unei nucleotide cu alta n timpul
replicrii ADN
2. Deleia, inseria sau inversarea unor nucleotide
ntr-o gen
Frecvena mutaiilor 10
-6
10
-10
pentru un caracter
anumit.
Modificrile determinate de mutaii (ex.: rezistena la
AB) se transmit la descendeni (transmitere
vertical). Unele mutaii pot fi reversibile
II. RECOMBINAREA
1. Recombinarea generalizat (schimb de ADN ntre 2 secvene
corespunztoare)
2. Recombinarea specific (integrarea sau excizia unei secvene
de ADN, ex: plasmid, bacteriofag)
3. Transpoziia
Elementele transpozabile reprezint secvene de ADN cu lungime
variabil, flancate de secvene repetate inversate.
mperecherea acestor secvene permite excizia lor i
renserarea n alt loc al cromosomului sau plasmidei. Unele
elemente, numite transpozoni, conin gene suplimentare
(frecvent gene de rezisten la AB)
Transpoziia duce la rearanjamente genomice. Unii transpozoni,
numii conjugativi, au capacitatea de a trece de la o bacterie
la alta.
Importana practic: numeroase gene de rezisten la AB sunt
situate pe transpozoni, ce perimite rspndirea lor.
Transpozonii pot trece de la cromosom la plasmid i ulterior
la alte bacterii prin conjugare. Transpozonii conjugativi pot
trece direct la alt bacterie
III. TRANSFERUL DE MATERIAL GENETIC
Materialul genetic poate fi transferat de la o bacterie la
alta (transmitere orizontal). Trei mecanisme de
transfer sunt posibile:
A. Transformarea
Fragmente de ADN (eliberate n urma lizei bacteriene)
pot penetra n alte bacterii i se pot integra prin
recombinare n ADN-ul lor. Este necesar ca bacteria
care accept materialul genetic s se afle ntr-o
stare particular, de competen. Transformarea
se poate realiza doar n cadrul bacteriilor de
aceeai specie sau din specii nrudite
2/15/2010
10
B. Transducia
Transferul de material genetic se realizeaz prin
intermediul bacteriofagilor moderai. n momentul
exciziei profagului din cromosomul bacterian el
devine virulent, multiplicndu-se i liznd bacteria
gazd. n cursul acestui proces fragmente de ADN
bacterian pot fi ntroduse din eroare n particulele
virale, care la rndul lor se pot integra prin
recombinare n cromosomul altei bacterii acest
proces reprezint transducia.
Transducia poate fi specializat i generalizat
C. Conjugarea
Mecanismul cel mai frecvent n natur. Este un transfer
de ADN (plasmide conjugative) de la o bacterie donor
ctre o bacterie receptor. Bacteria donor exprim pe
suprafaa sa structuri ce permit contactul dintre celule
(pili F). n timpul conjugrii plasmida se replic i o
copie trece prin intermediului pilului F n bacteria
receptor. Transferul se efectueaz ntre bacteriile de
aceeai specie, dar i ntre specii diferite. Multiple gene
de rezisten la AB sunt localizate n plasmide i prin
conjugare se asigur caracterul epidemic al rezistenei
la AB.
Plasmida conjugativ poate asigura transferul unei
plasmide neconjugative sau al unor gene cromosomale
(prin integrarea plasmidei n cromosom)