UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I

MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA

COALA DOCTORL
FACULTATEA DE MEDICIN VETERINAR

CARMEN RODICA LAZAR (POP)

OPTIMIZAREA PRODUCIEI POLIZAHARIDULUI KEFIRAN

I CARACTERIZAREA ACESTUIA N VEDEREA UTILIZRII
INDUSTRIALE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCTORI TIINIFICI:
Prof. SORIN APOSTU
Prof. MARIANNE SINDIC

Cluj-Napoca
2013

Cuprins
INTRODUCERE............................................................................................................. IV
CAPITOLUL I .................................................................................................................. V
STUDIU DE LITERATUR ........................................................................................... V
I.1. GRANULELE DE CHEFIR .................................................................................. V
I.2. EXOPOLIZAHARIDE MICROBIANE............................................................... V
I.3. BIOFILME EXPOLIZAHARIDICE .................................................................. VI
CAPITOLUL II ..............................................................................................................VII
SCOP I OBIECTIVE ..................................................................................................VII
II.1. SCOPUL TEZEI.................................................................................................VII
II.2. OBIECTIVELE TEZEI .....................................................................................VII
REZULTATE EXPERIMENTALE ............................................................................. IX
CAPITOLUL III ............................................................................................................. IX
INFLUENA DIFERITELOR CONDIII DE MULTIPLICARE ASUPRA
CRETERII BIOMASEI GRANULELOR DE CHEFIR .......................................... IX
III.1. MATERIALE I METODE ............................................................................. IX
III.1.1 Granulele de chefir ....................................................................................... IX
III.1.2. Optimizarea metodei de multiplicare ........................................................ IX
III.2. REZULTATE I DISCUII ............................................................................... X
III.2.1. Influena timpului de incubare .................................................................... X
III.2.2. Impactul tipului i vitezei de agitare.......................................................... XI
III.2.3. Influena temperaturii ................................................................................ XI
III.2.3. Influena mediul de cultur .......................................................................XII
III.2.4. Influena diverilor nutrieni .....................................................................XII
III.3. CONCLUZII ................................................................................................... XIII
CAPITOLUL IV .......................................................................................................... XIV
I

PRODUCIA I PURIFICAREA POLIZAHARIDULUI KEFIRAN .................. XIV

IV.1. MATERIALE I METODE .......................................................................... XIV
IV.1.1. Producia de kefiran din granule de chefir ............................................ XIV
IV.1.2. Masurtori reologice ................................................................................ XIV
IV.2. REZULTATE I DISCUII .......................................................................... XIV
IV.2.1. Proprietile reologice ale kefiranului .................................................... XIV
IV.3. CONCLUZII...................................................................................................... XV
CAPITOLUL V ........................................................................................................... XVII
CARACTERIZAREA KEFIRANULUI OBINUT DIN GRANULELE DE
CHEFIR ....................................................................................................................... XVII
V.1. MATERIALE I METODE ........................................................................... XVII
V.1.1. Determinarea coninutului n protein ................................................... XVII
V.1.2. Spectroscopia FTIR a soluiei de kefiran ................................................ XVII
V.1.3. Hidroliza chimic a polizaharidului kefiran .......................................... XVII
V.1.4. Analiza soluie de kefiran prin cromatografie de nalt performan pe
strat subire ........................................................................................................... XVII
V.1.5. Cuantificarea prin analiza HPLC a monozaharidelor din kefiran
eliberate chimic..................................................................................................... XVII
V.1.6. Determinarea masei moleculare a polozaharidului prin cromatografie de
excludere de nalt performan ....................................................................... XVIII
V.2. REZULTATE I DISCUII ........................................................................ XVIII
V.2.1. Coninutul proteic al soluiei de kefiran ............................................... XVIII
V.2.2. Amprenta FTIR a kefiranului................................................................... XIX
V.2.3. Identificarea i cuantificarea monozaharidelor prin HPTLC ................. XX
V.2.4. Cuantificarea monozaharidelor kefiranului prin HPLC ....................... XXI
V.2.5. Distribuia masei moleculare n soluia de kefiran prin cromatografie de
excludere de nalt performan ......................................................................... XXII
V.3. CONCLUZII .................................................................................................. XXIII
II

CAPITOLUL VI ....................................................................................................... XXIV

DEZVOLTAREA I CARACTERIZAREA BIOFILMULUI OBINUT DIN
KEFIRAN .................................................................................................................. XXIV
VI.1. MATERIALE I METODE ....................................................................... XXIV
VI.1.1. Optimizarea metodei de obinere a biofilmului .................................. XXIV
VI.1.2. Coninutul n ap ................................................................................... XXIV
VI.1.3. Solubilitatea n ap ................................................................................ XXIV
VI.1.4. Gradul de gonflare................................................................................. XXIV
VI.1.5. Grosimea filmului .................................................................................. XXIV
VI.1.6. Permeabilitatea la vaporii de ap........................................................... XXV
VI.1.7. Spectroscopia FTIR a biofilmelor obinute din kefiran ....................... XXV
VI.1.8. Microscopie electronic de baleiaj ......................................................... XXV
VI.2. REZULTATE I DISCUII ......................................................................... XXV
VI.2.1. Determinarea proprietilor fizice a filmelor ....................................... XXV
VI.2.2. Caracterizarea structurala prin spectroscopie n infrarou cu
transformat fourier ....................................................................................... XXVIII
VI.2.3. Caracterizarea structurii prin SEM .................................................... XXIX
VI.3. CONCLUZII................................................................................................... XXX
CONCLUZII GENERALE ...................................................................................... XXXI
PERSPECTIVE...................................................................................................... XXXIV
ELEMENTE DE ORIGINALITATE .................................................................. XXXIV
BIBLIOGRAFIE SELECTIV.............................................................................. XXXV

III

INTRODUCERE

Pn nu demult, granulele de chefir nu au prezentat interes, ntruct se tia c

reprezint cultura starter pentru obinerea chefirului (o bautur din lapte fermentat), cu
proprieti anticarcinogene, antimutagene, antivirale i antifungice.
Granulele de chefir sunt grupuri de microorganisme, care includ specii de drojdii,
bacterii lactice (BL) i bacterii acetice (BA), cuprinse mpreun de ctre o matrice de
proteine i polizaharide.
Ca urmare a capacitii de multiplicare a granulelor de chefir n lapte, s-a studiat
posibilitatea obinerii unui produs secundar n industria produselor lactate, care ar putea
aduce o valoare adugat; acest produs secundar denumit kefiran este un glucogalactan
solubil n ap i cu proprieti de mbuntire a strii de sntate.
Cercetrile recente au artat c industria alimentar este mereu n cautare de
ingrediente alimentare noi cu scopul de a mbunti textura i gustul produselor
alimentare; cu toate acestea, este de asemenea necesar s mbunteasc i starea de
sntate a consumatorilor.
n aceste cazuri, polizaharidele joac un rol esenial datorit proprietilor lor
fizice i funcionale. De asemenea, ele pot fi folosite i n domeniul tehnologic, ca aditiv
alimentar natural.
S-a observat un interes tot mai crescut n vederea obinerii un nou polizaharid, cu
costuri reduse i potenial de aplicare n produsele alimentare, n industria farmaceutic i
chimic. Prin urmare, prezenta cercetare urmrete ncercarea dezvoltrii unui nou
polizaharid cu multiple proprieti i aplicaii.

IV

CAPITOLUL I
STUDIU DE LITERATUR

I.1. GRANULELE DE CHEFIR

Granulele de chefir au fost monitorizate utiliznd metoda de scanare prin

microscopie electronic de baleiaj (SEM), care indic colonizarea drojdiilor la suprafa
i n interiorul granulelor de chefir i prezena bacteriilor intr-o concentraie mai ridicat
n interiorul granulelor (Gzel-Seydim i col., 2005).
Bacteriile lactice ce se gsesc n matricea granulelor de chefir au atras considerabil
atenia datorit abilitii lor de a inhiba dezvoltarea sporilor i a microorganismelor
patogene, fie prin producerea de acid lacic sau prin dezvoltarea de ageni antimicrobieni
(Rea and Cogan, 1994 citat de Kourkoutas i col., 2007).
Matricea granulelor de chefir conine un polizaharid specific, ce nu poate fi izolat
din alte substraturi i din acest motiv este denumit kefiran.

I.2. EXOPOLIZAHARIDE MICROBIANE

Polimerii cu mas molecular mare, cu lan lung, care se dizolv sau disperseaz
n ap pentru a da proprieti de ngroare sau gelifiere sunt formule indispensabile n
unele produse alimentare. Astfel de polimeri alimentari sunt de asemenea utilizai pentru
efectele lor secundare, care includ emulsifierea, stabilizarea particulelor, controlul
cristalizrii, inhibarea sinerezei (eliberarea apei din alimetele procesate), ncapsularea i
formarea filmelor. O clas alternativ a agenilor bio de ngroare o reprezint
expolizaharidele microbiene (EPS). (Vuyst i Degeest, 1999).
Kefiranul este un polizaharid solubil n ap, este produs din granulele de chefir
care conin o populaie complex de bacterii lactice i drojdii. (Tamime i Robinson,
1988).
Kefiranul este utilizat ca i agent de ngroare, stabilizare, emulsifiere, nlocuitor
al grsimii sau agent de gelifiere i prezint de asemenea activitate anti-tumoral
(Cheirsilp i Radchabut, 2011).
V

Pentru utilizarea acestuia n multe arii industiale cum ar fi industria alimentar,

cosmetic i farmaceutic, o cantitate nsemnat de polizaharid poate fi izolat doar din
granulele de chefir (Zajek i col., 2011).

I.3. BIOFILME EXPOLIZAHARIDICE

Cercetarea biofilmelor dezvolt munca interdisciplinar, n care cercettorii din

diverse domenii cum ar fi micobiologia, chimia, fizica, ingineria i modelarea bazat pe
calculatoare sunt implicate. Investigaiile biofilmelor sunt n general focusate pe aspecte
de structur, funcionalitate precum i de asemenea pe aspectul ecologic (Denkhaus i
col., 2007).
Datele de literatur i studiile preliminare din laborator au artat c kefiranul poate
produce biofilme cu aspect bun i proprieti mecanice satisfactoare, aadar prezint un
potenial excelent ca agent formator de biofilm. Totui, pn azi sunt puine informaii
despre caracteristicile acestui biofilm (Ghasemlou i col., 2010).

VI

CAPITOLUL II
SCOP I OBIECTIVE

II.1. SCOPUL TEZEI

Optimizarea produciei de kefiran din granulele de chefir, un valoros polizaharid,
cu diverse aplicaii n industria alimentar i biomedical.

II.2. OBIECTIVELE TEZEI

Aprofundarea cunotinele necesare obinerii polizaharidului sintetizat din

granulele de chefir, caracterizarea i evidenierea proprietilor filmogene este evideniat
prin urmtoarele obiective:
Influena diferitelor condiii de multiplicare asupra creterii biomasei
granulelor de chefir;
Obinerea i purificarea polizaharidului kefiran;
Caracterizarea si cuantificarea polizaharidului kefiran obinut din granulele
de chefir prin investigaii fizico-chimice i structurale;
Dezvoltarea i caracterizarea de biofilme pe baz de kefiran.

Structura tezei. Teza este structurat n dou pri principale, prima conine
studiul de literatur, iar cea de-a doua este concentrat pe contribuiile originale.
Prima parte cuprinde stadiul actual al cercetrilor n domeniu cu privire la
compoziia chimic i nutriional a chefirului; compoziia matricei granulelor de chefir,
structura chimic, aplicaiile i funcionalitatea kefiranului; structura i caracterizarea
biofilmelor obinute din polizaharide.
A doua parte cuprinde cinci capitole (II-VI):
Capitolul II prezint scopul, obiectivele i design-ul experimental, care stau la
baza realizrii prezentei cercetri.
Capitolul III relev condiiile optime de multiplicare a granulelor de chefir;
creterea lor este influenat de mai muli factori, printre care temperatura de incubare,
omogenitatea mediului sau adaosul de suplimente nutritive.
VII

Capitolul IV prezint modelele experimentale de optimizare a produciei de

kefiran, purificarea polizaharidului, determinarea temperaturii optime de solubilizare a
acestuia i limitarea deteriorrii prin tratament termic.
Capitolul V urmrete caracterizarea i cuantificarea polizaharidului kefiran prin
metode fizico-chimice i structurale.
n capitolul VI este studiat capacitatea soluiei de kefiran de a forma filme.
Calitatea acestor biofilme a fost evaluat prin determinarea proprietilor de barier i a
compoziiei structurale.
O parte din rezultatele experimentale au fost obinute ca urmare a acordului de
colaborare ntre Departamentul de tiina i Tehnologia Alimentelor a Universitii de
tiine Agricole i Medicin Veterinar, Cluj-Napoca, Romnia cu Gembloux Agro-Bio
Tech a Universitii din Liege.
Programul de doctorat a fost finanat de ctre Fondul Social European-Programul
Doctoral POSDRU/88/1.5/S/49598.

VIII

REZULTATE EXPERIMENTALE

CAPITOLUL III
INFLUENA DIFERITELOR CONDIII DE MULTIPLICARE ASUPRA
CRETERII BIOMASEI GRANULELOR DE CHEFIR

III.1. MATERIALE I METODE

III.1.1 Granulele de chefir

Granulele de chefir (GC) provin din colecia Centrului de Cercetri Agricole
Valon (CRA-W, Gembloux, Belgia). Pentru acest studiu, au fost folosite granule de
chefir proaspete.
III.1.2. Optimizarea metodei de multiplicare
Granulele proaspete de chefir-active, splate cu ap steril, au fost inoculate (15g)
n 300 ml mediu de cultur (lapte sau zer) la temperatura de 20 - 25C pentru o perioad
scurt de timp (24-48h), iar mediul a fost schimbat zilnic sau la sfritul incubrii, pentru
ca noua cultur s-i menin viabilitatea.
Probele cu mediu - amestecul de granule de chefir - au fost apoi incubate la
diferite temperaturi (20; 25; 28; 32C) i viteze de rotaie (0-200 rpm), utilizandu-se un
agitator tip 3005, Gesellschaft fr Labortechnik, Germania.
Dup incubare, granulele de chefir au fost separate din produsul fermentat prin
filtrare folosindu-se o sit de plastic. n funcie de destinaie, granulele de chefir au fost
splate cu ap distilat la temperatura camerei pentru izolarea kefiranului sau au fost
splate cu mediu, la 22 - 25C, pentru efectuarea unui nou pasaj (Zajsek i Gorek, 2011).
Masa granulelor de chefir a fost determinat prin cntrirea acestora pe o balan
analitic SHIMADZU (AX 120) (Shimadzu Corporation).
Rata de multiplicare a biomasei a fost calculat conform formulei de mai jos, care
a fost utilizat pentru a evalua efectul condiiilor de multiplicare asupra creterii
biomasei. Toate determinrile au fost efectuate de 3 ori pentru a calcula valoarea medie.
%G =

X n +1 X n
100
Xn
IX

(2.1)

Unde:
G = rata de multiplicare;
Xn = masa biomasei dup n zile (g);
Xn+1 = masa biomasei dup n+1 zile (g).
Metodologia de analiz presupune evaluarea unor condiii diferite de multiplicare:
tipul de mediu (zer deproteinizat, lapte degresat), cantitatea de inocul 5%, adaosul de
diferii nutrieni (substrat de zaharuri, surse de azot, vitamine i minerale), agitare rotativ
la vitez de 0-200 rpm, temperatur (20 - 32C) i timp (2-24h, 48h). Pentru acest
experiment fiecare dintre factori au fost schimbai atunci cnd celelalte variabile au
rmas neschimbate, granulele de chefir multiplicandu-se prin variaia condiiilor de
cretere pentru evaluarea efectelor fiecrui parametru testat.

III.2. REZULTATE I DISCUII

III.2.1. Influena timpului de incubare

n vederea monitorizrii multiplicrii granulelor n laptele degresat standardizat, se
poate observa faptul c masa crete repede in primele 24 de ore, dup care se arat o
scdere semnificativ la 48, respectiv 72 de ore (Figura III.1). Ulterior, se observ c rata
de multiplicare a granulelor ncetinete ca urmare a epuizrii nutrienilor i datorit
creterii aciditii mediului de cultur, care devine impropriu pentru activitatea biologic
a granulelor de chefir. Astfel, dup 24 de ore de testare mediul pare a fi "epuizat",
rennoirea acestuia fiind absolut necesar.

Figura III.1. Dependena de timp a masei granulelor de chefir

III.2.2. Impactul tipului i vitezei de agitare

Efectul tipului de agitare a fost investigat n laptele degresat, folosind trei tipuri:
static, agitare rotativ la vitez de 100 rpm i agitare magnetic (Figura III.2a). Acest
test arat c agitarea cu agitator rotativ a determinat o rat mai mare de multiplicare,
asigurnd o omogenitate mai bun a mediului de testare i, prin urmare, o disponibilitate
mai mare a substratului nutritiv i a aerului necesar speciilor microbiene existente n
granule. Utilizarea barei magnetice pentru agitare a determinat pierderea integritii
granulelor, provocnd astfel ruperea acestora.

Figura III.2. Efectul tipului (a) i a vitezei de agitare (b) asupra biomasei
granulelor de chefir
Cea mai mare cantitate de biomas a fost produs folosind agitatorul rotativ; prin
urmare, am investigat viteza de agitare la 100, 150 i 200 rpm (Figura III.2b). Conform
rezultatelor, viteza de agitare de 125 rpm a determinat cea mai mare rat de multiplicare,
obinndu-se un plus de granule de 38.1 g, dup o incubare la 24 h, temperatur de 25C,
folosindu-se ca mas iniial de granule mKG, 0 = 50 g/L.
III.2.3. Influena temperaturii
Temperatura este un factor care pare a fi esenial pentru aceste teste, avnd n
vedere prezena bacteriilor i drojdiilor n granulele de chefir. S-a evideniat faptul c n
intervalul de temperatur de 25 - 28C, producia de kefiran este cea mai mare, n
principal datorit faptului c microorganismele se protejeaz ele nsele mpotriva
influenelor mediului prin producerea de polizaharid (Figura III.3).

XI

Figura III.3. Efectul temperaturii asupra biomasei granulelor de chefir

III.2.3. Influena mediul de cultur

Pe parcursul testelor preliminare s-a constatat faptul c este foarte important
calitatea mediului (Figura III.4). Rata de multiplicare a granulelor de chefir este direct
afectat de sursa acestuia.

Figura III.4. Dependena biomasei granulelor de chefir de mediul de cultur

Not: Mediu: trei tipuri de lapte naional: lapte degresat de tip 1, 2, 3 = SMT1, SMT2, SMT3, unde
SMT2 a fost lapte bio, dou tipuri de lapte provenind din Belgia: SME, SMC;

Rata de multiplicare a granulelor de chefir n proba SMT2 a fost mai mare dect n
restul probelor, SMT2 fiind un lapte bio, ce reprezint un substrat complet pentru
multiplicarea granulelor
Acest experiment demonstreaz importana seleciei mediului n producia
granulelor de chefir.

III.2.4. Influena diverilor nutrieni

Procesul de optimizare a constat de asemenea i n cercetarea diferiilor factori care
limiteaz producia de polizaharid prezent n granulele de chefir.
XII

Figura III.5. Efectul diverilor nutrieni asupra biomasei granulelor de chefir

*Martor = lapte bio

Cu toate acestea, un mediu de cultur bio asigur o rat de multiplicare mai mare
dect un mediu de cultur convenional cu adaos de nutrienti, precum i un cost mai
redus de producie.
Toi factorii testai (timp, temperatur, mediul de cretere, tipul i viteza de
agitare) determin efecte foarte semnificative asupra creterii biomasei granulelor de
chefir.

III.3. CONCLUZII

Multiplicarea granulelor de chefir este influenat de procesul de obinere i

de calitatea iniial a granulelor;
Factorii de producie care influeneaz creterea biomasei sunt: vrsta
granulelor de chefir, mediul de cultur, adaosul de nutrieni, timpul de inclubare,
tipul i viteza de agitare
Optimizarea mediului de cultur este foarte important n vederea realizarea
unei producii maxime de biomas cu un cost sczut;
Cea mai mare cretere de biomas a fost observat la granulele multiplicate
n lapte bio timp de 24 ore la 25C cu o vitez de agitare de 125 rpm;
Un adaos de extract de drojdie (10 g/L) i minerale (0.25 g/L) determin o
cretere important a produciei granulelor de chefir.

XIII

CAPITOLUL IV
PRODUCIA I PURIFICAREA POLIZAHARIDULUI KEFIRAN

IV.1. MATERIALE I METODE

IV.1.1. Producia de kefiran din granule de chefir

Biomasa de granule de kefir (10% m/v) a fost supus la temperaturi diferite (70,
80, 90; 100 C) n soluie tampon la un pH de 7,5, sub agitare continu, iar intervalul de
timp a fost optimizat prin colectarea de soluie (extras); a fost colectat 100 ml pentru
fiecare prob.
Polizaharidul a fost extras din granulele de chefir, congelate nainte de utilizare
timp de cel puin 24 de ore.
IV.1.2. Masurtori reologice
Msurarea vscozitii probelor de kefiran la 25C a fost realizat cu reometrul
Bohlin CV 120 High Resolution (Bohlin Instruments, Worcestershire, UK). Geometria de
msurare utilizat a fost sistemul de C25, format din Cilindru (diametru 27.5 mm i
adncime 50 mm) i Sond (diametru 25 mm i lungime 37.5 mm).

IV.2. REZULTATE I DISCUII

IV.2.1. Proprietile reologice ale kefiranului

Scopul acestor teste a fost determinarea temperaturii favorabile pentru
solubilizarea kefiranului i limitarea deteriorrii acestuia prin tratament termic.
Probele de kefiran au avut caracteristicile unui fluid pseudo-plastic, cu o
schimbare a viscozitii dependent de concentraie, aa cum se vede n Tabelul IV.1.
Tabel IV.1
Vscozitatea n funcie de concentraia soluiei de kefiran
a
Codificarea probei [mPa]
3.44
Ap distilat
3.58
S - 0.5%
3.92
S - 1%
4.06
S 1.5%

[Pa]
0.1915
0.1657
0.2171
0.2240
XIV

k0
[Pa.sn]
2.6E-04
6E-04
1.33E-04
0.6E-04

R2

1.4162
1.2857
1.5540
1.5880

0.9983
0.9970
0.9987
0.9987

4.43
0.2486 0E-04
S - 2%
4.71
0.2396 2.26E-03
S 3.5%
4.81
0.1965 4.2E-03
S - 5%
11.08 0.1683 2.76E-02
S - 10%
16.48 0.0872 7.19E-02
S - 15%
22.88 0.1293 2.31E-01
S - 20%
S - ntre 0.5% i 20% - soluia de kefiran cu o
(m/v)

1.8151 0.999
1.5313 0.9981
1.9712 0.9981
0.8311 0.9994
0.742 0.9995
0.5921 0.9994
concentraie ntre 0.5% i 20%

Impactul temperaturii asupra cineticii extraciei kefiranului este prezentat n Figura

IV.1.
Msurtorile reologice au artat faptul c polizaharidul kefiran obinut din
granulele de chefir are un comportament newtonian n soluiile foarte diluate, la
temperaturi nalte i perioad lung de extracie i comportament pseudo-plastic sau reofluidifiant n soluiile foarte concentrate. Viteza de forfecare este neliniar i reprezentat
printr-o curb.

Figura IV.1. Comparaie ntre diferite temperaturi de extracie

Temperatura de 80C cu un timp de extracie de 30 minute sunt considerai
parametrii optimi ai extraciei i prezint un efect semnificativ asupra valorii viscozitii
i, astfel, asupra calitii extractului, aa cum se vede n Figura IV.1.

IV.3. CONCLUZII
Parametrii optimi de extracie au fost stabilii ca urmare a testelor de
cinetic a extractelor;
Cunoaterea proprietilor reologice ale soluiei de kefiran este important,
ntruct acestea stabilesc condiiile de prelucrare i sunt n principal responsabile
XV

pentru prezena diferitelor defecte n matricea biofilmului obinut din acest

polizaharid;
Aplicaiile polizaharidelor n diverse domenii depind de capacitatea lor de a
menine caracteristicile stabile reologice cum sunt hidroliza i nivelul de nclzire.

XVI

CAPITOLUL V
CARACTERIZAREA KEFIRANULUI OBINUT DIN GRANULELE DE
CHEFIR

V.1. MATERIALE I METODE

V.1.1. Determinarea coninutului n protein

Pentru determinarea coninutului de proteine al probelor s-a folosit protocolul
rapid StartTM Bradford Protein Assay de la Bio-Rad. Standardele proteice utilizate au
fost BSA (albumina seric bovin) i BGG (beta gamma-globulina), conform
protocolului descris de Bio-Rad.
V.1.2. Spectroscopia FTIR a soluiei de kefiran
Analiza spectrelor pentru probelor de kefiran a fost nregistrat pe o unitate cu o
singur reflexie total atenuat (ATR) la temperatura camerei folosind spectrometrul
FTIR (Shimadzu). Fiecare spectru fost nregistrat pe fracvena 4000 i 500 cm-1 i a
constat din media a 64 de scanri distincte.
V.1.3. Hidroliza chimic a polizaharidului kefiran
Hidroliza acid a fost efectuat cu acid trifluoracetic 0.2 M (TFA), la 80C ntr-un
bloc de nclzire timp de 5 zile; probele au fost prelevate la fiecare 24 de ore.
V.1.4. Analiza soluie de kefiran prin cromatografie de nalt performan pe
strat subire
Determinarea calitativ i cantitativ a monozaharidelor a fost analizat prin
metoda HPTLC, protocolul descris n Camag Application Note.
V.1.5. Cuantificarea prin analiza HPLC a monozaharidelor din kefiran
eliberate chimic
Profilul monozaharidelor a fost determinat folosit HPLC pe un sistem Shimadzu
echipat cu o pomp LC - 10AD, degazor DGU - 14A, autosampler SIL - 10AV VP,
detector (RI) cu indice de refracie RID - 10A. Separarea cromatografic a fost efectuat
la un flux de 1.3 mL/min, folosind ca faz mobil acetonitril: ap 80:20, (v/v).

XVII

V.1.6. Determinarea masei moleculare a polozaharidului prin cromatografie

de excludere de nalt performan
Masa molecular a kefiranului fost determinata folosind sistemul HPLC Alliance
Waters echipat cu detector cu indice de refracie Waters 2410 la 40C (RI).
Separarea a fost efectuat pe o coloan de oel inoxidabil TSK-Gel GMPWxl
(TOSOH) (300 x 7.5 mm, 13 um). Coloana a fost eluat izocratic cu 4.24 g NaNO3 + 500
mg NaN3/L, (filtrare cu vacuum i degazare prin 0.45 m), la 30C cu un debit de
0.7 ml/min. Pentru fiecare prob au fost injectai 100 L, iar durata de rulare a fost de
30.0 minute pentru fiecare prob. Standardul de dextran cu masa molecular ntre 80-670
kDa a fost utilizat pentru calibrarea sistemului i a fost obinut curba de calibrare cu un
coeficient de regresie de R2 = 0.9905.

Analiza statistic. Testele ANOVA (Analiza Varianei) i Turkey HSD, cu grad

de ncredere de 95 sau 99% au fost folosite pentru a compara mediile folosind sistemul de
analiz statistic SPSS 19.0. Diferenele au fost considerate semnificative la P <0.05.
Corelaia dintre valorile greutii moleculare i valorile vscozitii a fost
determinat cu testul Pearson folosind un grad de ncredere de 95%.

V.2. REZULTATE I DISCUII

V.2.1. Coninutul proteic al soluiei de kefiran

Coninutul proteic a fost calculat prin compararea DO 595 cu curba standard,
lundu-se n considerare factorii de diluie i este prezentat n tabelul IV.1.
Proba notat: Kefiran pure2 a fost purificat prin congelare la -20C peste noapte,
procedeul a fost repetat de dou ori. Dup cum se poate remarca n tabelul V.1 coninutul
proteic scade cu creterea numrului de purificri.
n concluzie, kefiranul obinut din granulele de chefir i purificat prin metoda de
congelare (aplicnd dou etape de purificare), prezint un grad ridicat de puritate.

XVIII

Tabel V.1
Coninutul proteic al extractelor de kefiran
Proba

Coninutul
proteic
[g/100 mL]
0.247
0.152
0.056

Kefiran brut
Kefiran pur1
Kefiran pur2

Note: Kefiran pur1 - purificat prin congelare la -20C peste noapte, o

singur etap.

V.2.2. Amprenta FTIR a kefiranului

Spectrul IR al soluiei de kefiran purificat, dup cum se vede n Figura V.1
conine patru zone majore de absorbie: 1 - 3700 - 3310 cm-1, 2 - 2400-2300 cm-1; 3 1650-1630 cm-1 i 4 - 1200 - 1000 cm-1, i a fost comparat cu datele din literatur.

Figura V.1. Compararea amprentelor FTIR (750 4000 cm-1)

a soluiilor de kefiran
Not: Soluia B - Kefiran brut, nepurificat
Soluia P Soluia de kefiran brut purificat prin congelare la
-20C peste noapte i pelet rehidratat
Pelet F - pelet obinut dup purificare prin congelare

Zona amprentei din regiunea 1200 - 1000 cm-1 este specific fiecrui polizaharid,
aceast regiune este dominat de vibraiile gruprilor laterale (C-OH) i vibraiile
benzilor glicozidice (C-O-C) (Piermaria i col., 2011). n aceast ultim zon, picurile

XIX

detectate i asociate cu modelul vibraiilor indic prezena de glucoz i galactoz, care

fac parte din structura kefiranului purificat.
Aceste rezultate obinute sugereaz faptul c polizaharidul kefiranul este compus
din zaharuri sub form piranozic cu configuraii -i .

V.2.3. Identificarea i cuantificarea monozaharidelor prin HPTLC

Structura fraciunile obinute a corespuns cu standardul de zaharuri utilizate.
Valoarea Rf a probelor (Figura V.2b) arat, de asemenea, c monozaharidelor identificate
n probele analizate au fost doar glucoza i galactoza, ceea ce indic faptul c kefiranul
prezint puritate ridicat, sunt prezentate n Figura V.2.
b
Glucoz

Glucoz

Rafinoz

Figura V.2. Amprenta HPTLC pentru standarde i probe; a - Identificarea

spoturilor clare i precise pe plac dup developare i derivatizare; b - Reprezentarea
grafic 3D a zaharurilor din probele msurate la 620 nm (cu patru puncte de calibrare).
Tracks: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13 - standarde; Tracks: 2, 4, 6, 8, 10 - probe
Prin densitometrie a fost cuantificat fiecare component spotat pe plcile de
silicagel (Figura V.2a).
Rezultatele indic cea mai bun separare i identificare a monozaharidelor n
fraciune de polizaharid i diferenierea lor n funcie de calitatea acestuia. Purificarea
probelor (ndeprtarea proteinelor) este necesar pentru bun separare a monozaharidelor,
ntruc proteinele pot interfera la analiza cromatografic.

XX

V.2.4. Cuantificarea monozaharidelor kefiranului prin HPLC

n urma analizei HPLC puritatea probelor de kefiran a fost confirmat,
identificndu-se acelai tip de monozaharide (glucoz i galactoz), evideniindu-se de
asemenea c polizaharidul kefiran este un heteropolizaharid tipic.
n Figura V.3 cromatogramele HPLC sunt prezentate pentru fiecare parametru al
extraciei, cu timpul de retenie: 8.1870.107 min pentru glucoz i 8.7930.073 min
pentru galactoz.
Rezultatele hidrolizei kefiranului cu TFA 0.2 M sunt reprezentate n Figura V.4.
Experimentele au indicat faptul c evoluia eliberrii i degradrii soluiei de kefiran n
lanuri de zaharuri neutre arat diferene ntre cele dou tipuri de probe hidrolizate.
n urma analizei varianei (ANOVA) la un grad de ncredere de 5%, s-a obinut un
P <0.001 pentru concentraia de zaharuri, fapt ce indic efectul extrem de semnificativ al
timpului hidroliz.
13000
13000

12000

12000

10000
9000

mV

8000

10000
9000
8000

mV

11000

k7
k8
k9
k10
k11
k12

11000

k1
k2
k3
k4
k5
k6

7000
6000

7000
6000
5000

5000

4000

4000

3000

3000

2000

2000

1000

1000

0
5

10

15

20

25

10

15

20

25

Time (min)

Time (min)

Figura V.3. Cromatogramele HPLC ale carbohidrailor identificai n kefiran dup

hidroliza chimic; A Soluia de kefiran extras la 80C/30 minute (k1 k6); B - Soluia
de kefiran extras la 100C/5 minute (k7 k12)
Not: k1 k12 reprezint probele care au fost luate la fiecare 24 h pe durata perioadei de hidroliz (0-120
ore)

XXI

Figura V.4. Cinetica eliberrii carbohidrailor prin hidroliza chimic cu 0.2 M TFA la
80C a kefiranului

V.2.5. Distribuia masei moleculare n soluia de kefiran prin cromatografie

de excludere de nalt performan
Masa molecular a probelor de kefiran a fost co-eluat datorit diferenelor n
structurile lor de ramificare, prin urmare, distribuia masei moleculare este dependent de
condiiile de extracie (aa cum se vede n tabelul V.2).
Tabel V.2
Masa molecular a probelor de kefiran extrase n condiii diferite
Prob

Timp de retenie

E_70.100
E_80.30
E_80.60
E_80.100
E_90.20
E_100.5
E_100.60
E_100.100

9.701
9.666
9.673
9.7
9.768
9.968
10.251
10.482

Log
(Mw)
7.15
7.18
7.18
7.15
7.08
6.89
6.62
6.40

Masa molecular Masa molecular

(Da)
(kDa)
14071455
15204565
14970869
14102626
12132547
7793849
4166669
2499183

14071.455
15204.565
14970.869
14102.626
12132.547
7793.849
4167.000
2499.000

Aria
(%)
143.5
158.5
147
139
147.6
100.0
79.9
48.0

O valoare mic a masei moleculare i a vscozitii a fost atribuit probelor de

kefiran care au suferit un proces de degradare n timpul procesului de extracie.
Aceasta degradare a fost n principal datorat condiiilor de extracie agresive,
temperaturilor de peste 80C, cu o meninere ndelungat la aceast temperatur.
S-a evideniat o corelaie foarte semnificativ pozitiv (P 0.01) ntre cei doi
parametrii analizai; valoarea vscozitii i masa molecular.
XXII

V.3. CONCLUZII

Spectrele FT-IR sugereaz faptul c kefiranul este compus din zaharuri

cu

structur , - piranoz;
Rezultatele caracterizrii au demonstrat de asemenea faptul c kefiranul izolat din
granulele de chefir este un heteropolizaharid care conine glucoz i galactoz ntr-un
raport de 0.94:1.1;
Validarea metodei HPTLC aplicat a fost realizat prin metoda HPLC;
Prin urmare, investigarea compoziiei n monozaharide a kefiranului a fost
deosebit de necesar n vederea unei mai bune nelegeri a proprietile lor structurale,
pentru aplicarea pe scar larg n industria alimentar i farmaceutic;
n ceea ce privete masa molecular, cea mai mare valoare (15204.565 kDa) a fost
identificat n proba codificat E_80.30, fiind n concordan cu valoarea viscozitii;
Condiiile de extracie au o influen semnificativ asupra calitii kefiranului,
implicit n aceast aplicaie.

XXIII

CAPITOLUL VI
DEZVOLTAREA I CARACTERIZAREA BIOFILMULUI OBINUT DIN
KEFIRAN

VI.1. MATERIALE I METODE

VI.1.1. Optimizarea metodei de obinere a biofilmului

Soluia de kefiran purificat n concentraie de 10% a fost degazat sub vid timp de
5 - 10 minute pentru a elimina bulele de aer care ar putea deveni pori n structura
biofilmului. Amestecul de kefiran i glicerol n proporie de 5%, 7.5%, 10% i 15%
(m/m) ca mas au fost obinute sub agitare continu i turnarea unei cantoti de 17 - 20 g
n micro-plci cntrite n prealabil (65mm Dia.x15mm H).
Plcile de teflon cu amestecul de kefiran i glicerol au fost uscate n etuv la 45C
aproximativ 18 h, folosindu-se o etuv Memmert tip C4051358 (Memmert GmbH +
Co.KG).
VI.1.2. Coninutul n ap
Coninutul de ap din prob a fost determinat prin msurarea pierderilor de mas a
filmului nainte i dup uscare n etuv la 103 2C pn la greutate constant. A fost
folosit o etuv Memmert tip C4051358 (Memmert GmbH + Co.KG).
VI.1.3. Solubilitatea n ap
Metoda solubilitii n ap a fost descris de Motedayen i col. (2013) i Ahmadi i
col. (2012).
VI.1.4. Gradul de gonflare
Gradul de gonflare al filmelor a fost determinat conform metodelor lui Alves i
col. (2011) i Seixas i col. (2013).
VI.1.5. Grosimea filmului
Grosimea filmelor obinute a fost msurat cu un ubler digital (Tip POWERFIX
Profi, model Z22855F, versiunea 04/2010, Milomex, Bedfordshire, Marea Britanie).

XXIV

VI.1.6. Permeabilitatea la vaporii de ap

Permeabilitate la vaporii de ap a fost determinat gravimetric conform metodei
E95-96 (ASTM, 1995b), dup Hosseini i col. (2009), citai de Ahmadi i col.
(2012).WVP fost msurat gravimetric la 252C.
VI.1.7. Spectroscopia FTIR a biofilmelor obinute din kefiran
Analiza spectrelor probelor de biofilm a fost nregistrat pe o unitate cu o singur
reflexie total atenuat (ATR) la temperatura camerei folosind spectrometrul FTIR
(Shimadzu). Fiecare spectru fost nregistrat pe fracvena 4000 i 800 cm-1 i a constat din
media a 64 de scanri distincte.
VI.1.8. Microscopie electronic de baleiaj
Analiza microstructurii filmului a fost realizat prin scanare cu microscopul
electronic (SEM), tip FEI, Quanta 3D FEG.
Probele de biofilm au fost montate pe discuri de carbon dublu adezive. Filmele au
fost acoperite prin pulverizare cu Pt/Pb ntr-un strat de 10 nm grosime n atmosfer de
Argon (Automatic Sputter Coater from Agar Scientific). Seciunea fiecrui film a fost
examinat folosind o tensiune de de 30.0 kV.
Analiza statistic. Testele ANOVA (Analiza Varianei) i Turkey HSD, cu grad
de ncredere de 95 sau 99% au fost folosite pentru a compara mediile folosind sistemul de
analiz statistic SPSS 19.0. Diferenele au fost considerate semnificative la P <0.05.
Corelaia dintre valorile gradului de umflare i grosimea filmelor a fost
determinat cu testul Pearson folosind un grad de ncredere de 95%.

VI.2. REZULTATE I DISCUII

VI.2.1. Determinarea proprietilor fizice a filmelor

Tabelul VI.1 prezint proprietile fizice (procentul de ap, solubilitate n ap i
grosime) a filmelor obinute cu 7.5% glicerol.
Valoarea coninutului de ap a crescut semnificativ (p <0.01) de la 19.72% la
26.28% n probele filmelor analizate, fapt ce indic diferene privind legturile dintre
glicerol i soluia de kefiran, n funcie de gradul su de degradare i de nivelul de
XXV

interaciuni dintre moleculele de ap absorbite n matrice. Procentul de ap variaz ca

urmare a formrii legturilor de hidrogen n soluiile de kefiran extrase la temperaturi
ridicate.
Solubilitatea n ap este un indicator al hidrofilicitii unui film (Ma i col.,
2012).
Privind filmele analizate, o mai mare solubilitate a fost evideniat n cazul
filmelor obinute din soluia de kefiran extras n condiii agresive (temperatur nalt i
meninere timp ndelungat).
Uniformitatea grosimii filmului a fost evideniat prin cele mai sczute valori ale
deviaiei standard.
Table VI.1
Valorile privind coninutul de ap, solubilitatea i grosimea filmelor
Tipul de film Coninutul de ap (%) Grosime (mm) Solubilitate n ap (%)
26.280.315f
0.0930.008a
30.960.167c
F_70
19.720.278a
0.1540.010d
21.630.726a
F_80.30
23.290.181c
0.0990.015ab
30.320.033c
F_80.100
20.650.259b
0.1320.007cd
25.600.191b
F_90.20
24.030.135d
0.0980.013ab
38.510.223e
F_90.100
25.830.386f
0.1200.015bc
32.630.214d
F_100.5
24.740.137d
0.0890.004a
31.000.306c
F_100.100
Fiecare valoare de ap i solubilitate n ap reprezint media a dou determinrideviaia
standard.
Valoarea grosimii reprezint media a cinci msurtori deviaia standard.
Mediile din fiecare coloan cu aceleai litere nu sunt semnificativ diferite (P> 0.05).
Literele diferite dintr-o coloan indic diferene foarte semnificative ntre formule
(p <0.01).

Rezultatele arat c gradul de umflare indic faptul c capacitatea filmului de a

absorbi apa este dependent de grosimea i integritatea lui structural (Figura VI.1).
Dup acest test, toate probele de biofilme s-au pstrat intacte, ceea ce indic capacitatea
extraordinar a acestui biopolimer de a fi folosit la ambalarea produselor alimentare n
vederea mbuntirii duratei de depozitare a coninutului pachetului.
S-a observat o corelaie semnificativ negativ (P0.05) ntre gradul de umflare i
grosimea biofilmelor de kefiran. Aceast corelaie este dat de semipermeabilitatea
filmelor cu mai multe straturi sau a filmelor ce prezint structur omogen..

XXVI

Figura VI.1. Capacitatea de gonflare a filmelor de kefiran

Permeabilitatea la vaporii de ap (WVP). Calitatea soluiei de polizaharid poate
prezenta efecte asupra creterii WVP, prin urmare, structurile polimerice afecteaz
semnificativ proprietate de transfer a vaporilor de ap.
Valorile mari ale WVP observate sunt justificate prin utilizarea soluiilor de
kefiran cu structur modificat ca urmare a extraciei i a utilizrii glicerinei ca agent de
plastifiere.
Filmele de kefiran se prezint ca bariere moderate la permeabilitatea vaporilor de
ap, n conformitate cu clasificarea dat de Krochta i Mulder-Johnston (1997), Ahmadi
i col. (2012), Ghasemlou i col. (2011) (Figura VI.2).

Figura VI.2. Permeabilitatea vaporilor de ap n filmele de kefiran

O cretere semnificativ a valorilor WVP, n funcie de timpul de testare, a fost
observat la probele biofilmelor obinute din soluia de kefiran cu structura chimic
modificat.

XXVII

VI.2.2. Caracterizarea structurala prin spectroscopie n infrarou cu

transformat fourier
Spectrul IR al fiecrui film de kefiran, aa cum se vede n Figura VI.3b, conine
patru zone majore de absorbie: 1 - 3500-3200 cm-1 cu 2 - 3000-2800 cm-1, 3 - 1700-1540
cm-1 i ultima zon 1230 - 870 cm-1 i este comparat cu datele din literatur.
n Figura VI.3a este prezentat efectul concentraiei de glicerol n filmul de kefiran
prin analize FTIR.
Intensitatea benzilor din zona 3500 - 3100 cm-1 a crescut odat cu creterea
concentraiilor de glicerol, rezultnd astfel o intensitate mai mare a gruprilor OH
(Cerqueira i col., 2012).
4
0.49

5% Gly
10% Gly
7.5% Gly
15% Gly

0.42

0,5

0,4

0.28

Absorbance Units

Absorbance Units

0.35

1
3

0.21

2
0.14

0,3

F70.100
F100.100
F80.100
F90.20
F90.100
F100.5
F80.30
Glycerol

0,2

0,1

0.07

0.00
4000

3500

3000

2500

2000

1500

0,0
4000

1000

-1

Wavenumber cm

3500

3000

2500

2000

1500

1000

-1

Wavenumber cm

Figura VI.3. Spectrele FTIR ale filmelor de kefiran (a) creterea concentraiei de
glicerol; (b) filme obinute din soluiile de kefiran cu caliti diferite
Creterea concentraiei de glicerol conduce la un numr mare de grupri OH i de
asemenea, duce la scderea suprafeelor care corespund gruprilor CH (Cerqueira i col.,
2012).
Benzile identificate n zona 1230 - 870 cm-1 sunt caracteristice polizaharidelor.
Conform Piermaria i col. (2011), relaia dintre proprietile fizico-chimice i
spectrul FT-IR al filmelor, cu posibile aplicaii n industria alimentar, s-a concentrat pe
interaciunile dintre apa-matrice i plastifiant.

XXVIII

VI.2.3. Caracterizarea structurii prin SEM

Aa cum se observ prin analiza SEM, filmele de kefiran prezint diferene
structurale dependente de calitatea extractului.

Figura VI.4. Analiza seciunii filmelor de kefiran plastifiat cu 7.5% glicerol, n funcie
de tipul soluie formatoare de film (A - 70C/100 minute, B - 80C/30 minute; C 90C/20 minute; D - 100C/5 minute)
Proba de filmul notat cu F_80.30 (Figura VI.4.B) are o structur neted, omogen
i fr bule de aer, reprezint o matrice continu, fr fisuri i cu o bun integritate. Se
poate observa faptul c celelalte probe prezint o structur granulat, poroas, cu bule de
aer, care ar putea fi legat de formarea de canale, care pot fi observate mai ales n cazul
filmele de kefiran prezentate n Figura VI.4 A i D. Aceast modificare structural
substanial a polizaharidului este dat de profilele temperaturii utilizate n procesul de
extracie a soluiei de kefiran.

XXIX

VI.3. CONCLUZII

Filmele obtinute din soluia de kefiran extras la 80C prezint transparena, bune
proprieti fizice, structurale i de integritate; iar n timpul manipulrii nu a artat
rigiditate;
Rezultatele obinute sunt mai degrab promitoare n ceea ce privete capacitatea
soluiei de kefiran, un nou polizaharid microbian, de a produce filme biodegradabile;
Utilizarea spectroscopiei FTIR a relevat diferene ntre amprentele filmelor cu
glicerol n diferite concentraii;
Raportul optim al glicerolului, ca plastifiant, s-a dovedit a fi n concentraie de
7.5% m/m;
Rezultatele arat c prezena glicerolului poate influena proprietile fizicochimice ale polizaharidului i reorganizarea structural, dar totodat adaosul de glicerol
ca plastifiant mbuntete flexibilitatea matricei biofilmelor;
Rezultatele au confirmat faptul c structura kefiranului depinde de condiiile de
extracie, calitatea soluiei de kefiran influeneaz semnificativ proprietile biofilmului.

XXX

CONCLUZII GENERALE

Avnd n vedere obiectivele principale ale cercetrii i rezultatele obinute prin

diferite investigaii experimentale, se pot exprima urmtoarele concluzii:
1.

Potrivit primului obiectiv, a fost investigat influena condiiilor de cretere

a biomasei granulelor de chefir i monitorizarea ratei de multiplicare n diferite

substraturi nutritive.
Valoarea biomasei granulelor de chefir a crescut cu 77.55% fa de concentraia
iniial a granulelor de chefir, dup care s-a nregistrat o scdere semnificativ la
32,45%, ca urmare a limitrii substratului;
Au fost gsite efecte foarte semnificative ntre parametrii testai i rata de
multiplicare a granulelor de kefir;
Tipul i frecvena de rotaie a agitatorului are cea mai mare influen asupra
creterii biomasei granulelor de chefir, n acest bioproces este necesar meninerea
integritii granulelor, i de asemenea, o distribuie uniform a nutrienilor;
Fezabilitatea aplicrii industriale este susinut i de faptul c granulele de chefir
cresc repede, reducndu-se astfel costurile;
Influena coninutului de grsime al laptelui asupra creterii biomasei nu a fost
dovedit, dar coninutul de grsime poate prezenta un rol important n extragerea i
purificarea polizaharidului kefiran;
Optimizarea, monitorizarea i controlul produciei traditionale a biomasei
granulelor de chefir sunt strns legate de un interes tot mai crescut n utilizarea
acestora n vederea obinerii polizaharidului kefiran.
2.

Al doilea obiectiv relev producia de kefiran din granulele de chefir i din

dou tulpini de Lactobacillus. Calitatea extractului de kefiran s-a determinat prin

msurarea proprietilor reologice care au dezvluit eficiena metodelor de purificare.
S-a demonstrat faptul c granulele de chefir reprezint o surs major n producia
polizaharidului kefiran n mediul de fermentare, n principal lapte. n urma
procesului de fermentare, se obine un produs lactat fermentat, i anume chefirul,
dar i o mas important de granule cu aceeai compoziie;

XXXI

Valoarea vscozitii kefiranului este influenat n mod semnificativ de proporia

de substan uscat i valoarea pH-ului, care au demonstrat o relaie de dependen
ntre valoarea vscozitii i aceti factori testai;
S-a stabilit faptul c condiiile de extracie, cum sunt temperatura i timpul
influeneaz semnificativ calitatea extractului de kefiran;
Polizaharidul kefiran obinut din granulele de chefir are un comportament
newtonian, n soluii diluate (0.5% m/v) i comportament pseudo-plastic n soluii
concentrate (10% m/v);
Metoda de purificare a influenat calitatea polizaharidului, eficacitatea sa a fost
testat prin evidenierea prezenei altor compui, cum sunt proteinele;
Implementarea unei noi metode de purificare prin congelare repetat s-a dovedit a
fi extrem de eficient n recuperarea unui procent ridicat de kefiran pur;
Din rezultate, este evident faptul c biomasa granulelor de chefir rezultate din
industria produselor lactate acide poate fi folosit n mod eficient pentru a produce
cantiti nsemnate de polizaharid.
3.

Referitor la al treilea obiectiv, caracterizarea i cuantificarea kefiranului

obinut din granule de chefir, au fost evaluate prin investigaii fizico-chimice i

structurale.
Coninutul proteic al kefiranului scade cu creterea numrului de pasaje de
purificare;
S-a stabilit faptul c evoluia concentraiei de zaharuri totale, n extractul de
kefiran, depinde de condiiile de extracie;
Utilizarea FTIR a artat c structura polizaharidului kefiran nu este modificat ca
urmare a congelrii, ntrebuinat ca metod de purificare. Prin urmare, rezultatele
au demonstrat c FTIR este o metod eficace n caracterizarea uoar i rapid a
polizaharidului;
Metoda HPTLC a fost aplicat cu succes pentru identificarea i cuantificarea
monozaharidelor dup hidroliza chimic, rezultate similare au fost obinute prin
analiza HPLC, oferind informaii privind compoziia i puritatea probelor;

XXXII

Evoluia eliberrii lanurilor neutre de zaharuri din kefiran depinde de calitatea

extractului. n cazul concentaiei de zaharuri, efectul timpului de hidroliz a fost
extrem de semnificativ (P <0.001);
Tehnica HPSEC ofer o bun precizie n estimarea masei moleculare a probelor de
kefiran;
O corelaie pozitiv foarte semnificativ (P0.01) a fost stabilit ntre masa
molecular i valoarea vscozitii, probele fiind extrase la patru nivele de
temperatur (70, 80, 90 i 100C) cu intervale de timp diferite pentru fiecare
temperatur;
Scderea valorii vscozitii i a masei moleculare a fost atribuit gradului de
degradare al polizaharidului.
4.

Ultimul obiectiv prezint evaluarea capacitii soluiei de kefiran de a forma

filme. Calitatea acestor biofilme a fost evaluat prin determinarea proprietilor de

barier i a compoziiei structurale prin analiza FTIR i prin microscopie electronic de
baleiaj.
Rezultatele obinute indic capacitatea noului polizaharid microbian - kefiran de a
produce filme; cu o bun transparen i integritate fizic la manipulare;
Utilizarea glicerolului ca plastifiant, a dat rezultate bune n obinerea de biofilme
cu proprieti diferite, n funcie de tipul de extract utilizat;
Coninutul de ap este o proprietate important, care contribuie la stabilitatea la
depozitare a biofilmului; aceast proprietate este dependent de cantitatea de
plastifiant adugat i de calitatea polimerului;
Proprietile fizice testate indic aplicabilitatea filmului la ambalarea produselor
alimentare, iar acestea sunt legate de biodegradabilitatea acestuia;
A fost observat o corelaie negativ semnificativ (P0.05) ntre valoarea
gradului de umflare i grosimea filmului. Aceast corelare este dat de capacitatea
semipermeabil a filmelor multistrat sau a filmelor cu structur omogen;
Calitatea soluiei de polizaharid poate induce diferite efecte asupra creterii
permeabilitii la vaporii de ap, prin urmare, structurile de polimer afecteaz
semnificativ aceast proprietate;

XXXIII

Utilizarea analizei FTIR a artat c folosirea glicerolului ca plastifiant nu modific

semnificativ structura biofilmului;
Prin microscopia electronic de baleiaj s-a observat c kefiranul cu mas
molecular mare prezint bune proprieti peliculogene, ca rezultatr al legturilor
de hidrogen intra- i intermoleculare;
Cunoaterea efectelor diferitelor structuri chimice asupra proprietilor de
transport n mas a polizaharidului este important pentru industria ambalajelor.

PERSPECTIVE
Munca noastra reprezint un prim pas n ndeplinirea anumitor aspecte
metodologice i structurale. Astfel, acest studiu deschide noi perspective de continuare i
aprofundare a acestei cercetri:
Studiul structurii polizaharidului prin metode mai laborioase;
Evaluarea activitii antimicrobiene att pentru soluia de kefiran ct i pentru
biofilmele obinute din aceasta;
Studierea funcionalitii kefiranului ca gelifiant i agent de ngroare cu aplicaii
n industria produselor lactate i de panificaie;
Testarea permeabilitii la oxigen a biofilmelor, deoarece aceasta este una dintre
proprietile de transport cel mai frecvent studiat dup permeabilitatea la vaporii
de ap;
Testarea gradului de degradare a biofilmelor n diferite medii;
Studierea capacitii de a ncorpora compui bioactivi n biomasa polizaharidului.

ELEMENTE DE ORIGINALITATE
Testarea capacitii de multiplicare a granulelor de chefir, n funcie de substratul
adugat;
Optimizarea condiiilor de extracie a polizaharidului prin testarea celor patru
nivele de temperatur;
Realizarea de corelaii ntre calitatea soluiei de polizaharid i structura
biofilmului.

XXXIV

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1.

Abang Zaidel, D.N., Chin, N.L. and Yusof, Y.A., 2010, A Review on Rheological

Properties and Measurements of Dough and Gluten. Journal of Applied Sciences, 10:
2478-2490.
2.

Ahmadi, R., Kalbasi-Ashtari, A., Oromiehie, A., Yarmand, M.S., Jahandideh, F.,

2012, Development and characterization of a novel biodegradable edible film obtained

from psyllium seed (Plantago ovata Forsk). Journal of Food Engineering 109, 745751.
3.

Ahmed, Z., Wang, Y., Anjum, N., Ahmad, A., Khan, S.T., 2013, Characterization

of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 isolated from

Tibet kefir e Part II. Food Hydrocolloids 30, 343-350.
4.

Alves, V.D., Ferreira, A.R., Costa, N., Freitas, F., Reis, M.A.M., Coelhoso, I.M.,

2011, Characterization of biodegradable films from the extracellular polysaccharide

produced by Pseudomonas oleovorans grown on glycerol byproduct. Carbohydrate
Polymers 83, 15821590.
5.
Matrix

Ammar, H.O., Ghorab, M., El-Nahhas, S.A. and Kamel, R., 2009, Polymeric
System

for

Prolonged

Delivery

of

Tramadol

Hydrochloride,Part

I:

Physicochemical Evaluation. AAPS PharmSciTech, Vol. 10, No. 1.

6.

Cerqueira, M.A., Souza, B.W.S., Teixeira, J.A. and Vicente, A.A., 2012, Effect of

glycerol and corn oil on physicochemical properties of polysaccharide filmsA

comparative study. Food Hydrocolloids, 27, 175184.
7.

Cheirsilp, B. and Radchabut, S., 2011, Use of whey lactose from dairy industry for

economical kefiran production by Lactobacillus kefiranofaciens in mixed cultures with

yeasts. New Biotechnology  Volume 28, Number 6.
8.

De Vuyst, L., Degeest, B., 1999, Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria.

FEMS Microbiology Reviews 23, 153-177.

9.

Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J., 2007, Chemical and

physical methods for characterisation of biofilms. Microchim. Acta 158, 1-27.

10.

Farnworth, E.R, 2005, Kefir. A complex probiotic. Food Science Technology,

Bulletin 2 117.

XXXV

11.

Ghasemlou, M., Khodaiyan, F., Jahanbin, K., Gharibzahedi, S.M.T., Taheri, S.,

2012, Structural investigation and response surface optimisation for improvement of

kefiran production yield from a low-cost culture medium. Food Chemistry.
12.

Ghasemlou, M., Khodaiyan, F., Oromiehie, A., Yarmand, M.S., 2011a,

Characterization of edible emulsified films with low affinity to water based on kefiran
and oleic acid. International Journal of Biological Macromolecules.
13.

Ghasemlou, M., Khodaiyan, F., Oromiehie, A., Yarmand, M.S., 2011b,

Development and characterisation of a new biodegradable edible film made from kefiran,
an exopolysaccharide obtained from kefir grains. Food Chemistry 127, 14961502.
14.

Ghasemlou, M., Mohammad, S., Gharibzahedi, T., Mousavinejad, G., Khodaiyan.

F., 2010, Use of response surface methodology to achieve high levels of kefiran produced
by kefir grains grown in whey: development of optimized model and partial
characterization. International Conference on Food Innovation.
15.

Gmez-Ordez, E., Jimnez-Escrig, A., Ruprez, P., 2012, Molecular weight

distribution of polysaccharides from edible seaweeds by high-performance size-exclusion

chromatography (HPSEC). Talanta 93, 153-159.
16.

Gzel-Seydim, Z.B., Wyffels J.T., Seydim A.C. and Greene A.K., 2005, Turkish

kefir and kefir grains: microbial enumeration and electron microscopic observation. Int.
J. Dairy Technol. 58, 25-29.
17.

Kourkoutas, Y., Sipsas, V., Papavasiliou, G. and Koutinas, A. A., 2007, An

economic evaluation of freeze-dried kefir starter culture production using whey. J. Dairy
Sci. 90:21752180.
18.

Krochta, J.M., Baldwin, E.A. and Nisperos-Carriedo, M., 1994, Edible coatings

and films to improve food quality. Lancaster: Technomic Publishing Company Inc., pp.
305335.
19.

Mironescu, Monica and Mironescu, I.D., 2011, Rheological behaviour of a novel

microbial polysaccharide. Romanian Biotechnological Letters Vol. 16, No. 2.

20.

Motedayen, A.A., Khodaiyan, F., Salehi, E.A., 2013, Development and

characterisation of composite films made of kefiran and starch. Food Chemistry 136,
12311238.

XXXVI

21.

Patel, A.K., Michaud, Ph., Singhania, R.R., Soccol C.R. and Pandey, A., 2010,

Polysaccharides from Probiotics: New Developments as Food Additives. Food Technol.

Biotechnol. 48 (4) 451463.
22.

Piermaria, J., Bosch, A., Pinotti, A., Yantorno, O., Garcia, M.A., Abraham, A.G.,

2011, Kefiran films plasticized with sugars and polyols: water vapor barrier and
mechanical properties in relation to their microstructure analyzed by ATR/FT-IR
spectroscopy. Food Hydrocolloids 25, 1261-1269.
23.

Seixas, F.L., Turbiani, F.R.B., Salomo, P.G., Souza, R.P., Gimenes, M.L., 2013,

Biofilms Composed of Alginate and Pectin: Effect of Concentration of Crosslinker and

Plasticizer Agents. Chemical Engineering Transactions VOL. 32.
24.

Tamime, A. and Robinson, R., 1988, Fermented milks and their future trends: Part

II. Technological aspects. J. Dairy Res., 55, 281307.

25.

Zajek, K., Kolar, M. and Gorek, A., 2011, Characterisation of the

exopolysaccharide kefiran produced by lactic acid bacteria entrapped within natural kefir
grains. International Journal of Dairy Technology Vol 64, No 4.
26.

Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F. and Linhardt, R.J., 2007, Thin Layer

Chromatography for the Analysis of Glycosaminoglycan Oligosaccharides. Anal

Biochem. December 1; 371(1): 118120.

XXXVII