Evenimente majore in evolutia biologiei celulare

Teoria celulara:
Toate formele de viata sunt formate din una sau mai multe celule
Celulele se formeaza din celule pre-existente (diviziunea celulara)
Celula este cea mai mica forma de viata

TIPURI DE CELULE
Unitatea structurala si functionala a organismulul viu
Activitatea biochimica a celulei se desfasoara la nivelul organitelor

Celule conective

Celule epiteliale

Celule motrice

Celule nervoase

Celule rezervor
Celule sexuale

Celulele transportatoare de gaze

Fara nucleu la maturitate

Celule ale sistemulu imunitar

1. Membrana Plasmatica
2. Citoplasma (80% apa)
a Contine organite celulare
3. Nucleu

Membrana plasmatica (MP)

Consta intr-un bistrat lipidic

Regiunea
hidrofila
Regiunea
hidrofoba

MP este fluida, fosfolipidele sunt capabile sa se deplaseze in bistrat

fosfat
glicerol

Acid gras

Regiunea
hidrofilica

Regiunea hidrofobica

Structura membranei plasmatice

I. Bistratul lipidic

Proteine

colesterol

a) Locatie
-periferice
-integrale (transmembranare)
b) Functie
- transport (canale)
-enzimatica
- structurala (citoschelet)
-recunoastere (receptori)

www.highlands.edu

este strabatut de o varietate de proteine, lipide si glicoconjugati

In celula animala:
Colesterolul regleaza fluiditatea si flexibilitatea MP

II. Proteine
a) Transport- proteine transmembranare care formeaza canale
selective pentru anumiti ioni sau molecule (transport pasiv/activ)

b) Semnalizare- proteine transmembranare care au situsuri de

expuse pe fata extracelulara, pentru legarea specifica a unor
molecule ( hormoni, molecule de semnalizare= mesager
chimic). Legarea ligandului poate determina modificarea
confomatiei receptorului, ducand la initierea unei serii de reactii
in celula

c) Strucural- proteine care formeaza matricea extracelulara si

elementele citoscheletului (in interiorul celulei). Mentin forma
celulei, stabilizeaza localizarea unor proteine membranare, rol in
motilitate si interactii intercelulare.

II. Proteine
d) Activitate enzimatica- proteine transmembranare care catalizeaza
o reactie enzimatica, sau un compex de reactii intr-o anumita cale
metabolica

e) Jonctiuni intercelulare- proteine transmembranare care

interactioneaza apropiind celulele unele de altele; CAMs (cell
adhesion molecules)- importante in migrarea celulara.

f) Recunoastere intercelulara- glicoproteine transmembranare

sunt tinte specifice pentru receptori localizati pe alte celule

III. Glucide/oligozaharide/carbohidrati

Lanturile glucidice sunt atasate de proteine (glicoproteine) sau lipide membranare

(glicolipide). In numeroase cazuri sunt tinte pentru recunoasterea intercelulara.
Grupele de sange ABO sunt determinate de gruparile glucidice atasate de antigenul H
prezent pe suprafata hematiilor- recunoscute de anticorpi

Enzima A : N-acetilgalactozamintransferaza
Enzima B : Galactosiltransferaza

https://www.youtube.com/watch?v=gFuEo2ccTPA

CURS II

Structura celulei

1. Membrana Plasmatica
2. Citoplasma (80% apa)
a Contine organite celulare
3. Nucleu

Permeabilitatea membranei plasmatice

a) Difuzia simplatrecerea
moleculelor
liposolubile direct
prin bistratul
lipidic (CO2, O2)

b) Difuzia facilitata de
transportori- proteine care
isi schimba conformatia
dupa legarea ligandului
(glucoza)

c) Difuzia facilitata
de canale proteice
(ioni selectati pe
baza de marime si
sarcina electrica)

classes.midlandstech.edu

d) Osmoza-difuzia
apei printr-un canal
strict specific(aquaporin) sau
direct prin bistratul
lipidic

Liza celulara

https://www.youtube.com/watch?v=OYoaLzobQmk

Sare pe melci
Injectarea substantelor in organism

Compozitia chimica a unei celule

20%

70%
apa

E coli

ARN

Prot

Component

E.coli

Celula
mamifere

apa

70

70

Ioni

metaboliti

proteine

15

18

ARN

1.1

ADN

0.25

lipide

fosfolipide

polizaharide

Volumul
total al
celulei

2x1012cm3

4x10-9cm3

Transmiterea informatiei genetice in celula

GENA
(1)
Transcriptia
ADN

Transcript ARN(ARNm)

(104 copii)

Translatie
(105 copii)
Proteina
(TOT-109 copii)

Structura proteinelor

Reactia de condensare intre doi AA

Legatura peptidica

n funcie de capacitatea de sinteza a celulei, aminoacizii

n funcie de comportamentul n mediul apos, aminoacizii sunt
sunt clasificati astfel
clasificati astfel:

1) aminoacizi cu grupri R nepolare: Ala, Val, Leu, Ile,

Met, Pro, Phe, Trp

2) aminoacizi cu grupri R polare, dar nencrcate electric:

Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys

3) aminoacizi cu grupri R polare, dar ncrcate electric la

pH fiziologic
- ncrcare pozitiv: Lys, His, Arg
- ncrcare negativ: Asp, Glu.

Forma proteinei- determinata de

secventa de aminoacizi
In principiu-un nr.nelimitat de conformatii
Lantul adopta conformatia stabila
Majoritatea proteinelor se pliaza spontan
in conformatia stabila
Plierea este determinata de distributia
lanturilor laterale polare si nepolare

Legaturi
peptidice

Resturi
nepolare

Legaturi de H intre resturile polare

si moleculele de apa

Resturi
polare

Miez hidrofob
(Resturi nepolare)

Polipeptid nepliat

Conformatie pliata in
mediu apos

Structura proteinelor

Structuri secundare comune in proteine

Structura 3D nu se poate prezice din structura primara
Structura 3D- difractie de raze X a cristalelor de proteina sau prin RMN
Peste 100 paterne de pliere descoperite
sheet(structuri pliate )extensiv in proteinele globulare

Model IgG1(anticorp)

alpha helix- keratina, domeniile TM

Model mioglobina

Denaturarea proteinelor

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/nonmajorsbiology/pro
teinstructure.html

Codul genetic

CURS III

CITOSCHELETUL

Asigura :
-forma celulei
-modificarea formei celulare
-motilitatea celulei

Microscopie fluorescenta

COMPONENTELE CITOSCHELETULUI

Microfilamente

Filamente Intermediare

Microtubului

Microfilamente
Polimerizarea actinei

Monomer ActinaG

Legare ATP

Polimerizare Actina F

MICROFILAMENTE

Un filament are doua lanturi de actina polimerizata

Polaritate polimerizare/depolimerizare

Microscopie electronica

Microfilamentele sunt prezente in intreaga celula, dar mai concentrate in

apropierea MP
Sunt importante in miscarea, contractia, adeziunea celulara
Pot fi identificate in celula prin reactia cu faloidina- un compus fluorescent
care leaga doar actina F

MICROFILAMENTE IN ADEZIUNEA CELULARA

Focar de adeziune

FILAMENTE INTERMEDIARE (FI)

Compozitia proteica a filamentelor intermediare depinde de specie si variaza
in functie de tipul de tesut

In celule epidermale si axoni neuronali, FI sunt de cel putin 10 ori mai abundente
decat microfilamentele sau microtubulii
Principala functie este structurala, de sprijin mecanic pentru membrana plasmatica
cand celulele sunt in contact intre ele, sau cu matricea extracelulara

Spre deosebire de microfilamente si microtubuli, FI nu participa la motilitatea

celulara
FI sunt extrem de stabile, raman intacte chiar dupa extractii in detergent sau
solutii saline, in timp ce microfilamentele si microtubulii depolimerizeaza in
subunitatile constituente.

Celule epiteliale contin FI formate din keratine (peste 50 de tipuri)

Celule mezenchimale sunt bogate in FI alcatuite din vimentina
Celulele musculare au FI formate din desmina
Neuronii si celulele gliale au FI compuse din peripherina si proteina fibrilara acidica gliala
(GFAP).
- FI din lamina nucleara care formeaza reteaua fibroasa de proteine pe partea interna a
membranei nucleare. Laminele participa la atasarea cromozomilor de membrana nucleara
nuclear

DEFECTE GENETICE IN LAMINA NUCLEARA

Mutatie punctiforma la nivelul genei LMNA- codifica lamina A

>90% dintre pacienti mor din cauza complicatiilor date de ateroscleroza (stop
cardiac) inainte de varsta de 13 ani.

MICROTUBULI (MT)

Sunt formati prin asocierea dimerilor de alfa si beta tubulina

Polimerizarea microtubulilor incepe de la centrozom, localizat langa nucleu

Microtubulii sunt esentiali in miscarea organitelor

Microtubulii sunt esentiali in miscarea cililor si flagelilor

CURS IV

Metode de investigare celulara la nivel molecular

Microscopia clasica

Arhitectura celulara

Imagini de microscopie electronica

Ioni anorganici (Ca, Na, etc)

Molecule de interes

Macromolecule mari

ARN, ADN
Proteine

-Cum identificam moleculele specifice implicate in reactii celulare ?

Importante pentru caracterizarea cailor metabolice/de semnalizare, etc in stare
normala si patologica

-Cum determinam cantitativ moleculele implicate ?

Important pentru patologii. Ex. (titrul viral in infectii)

Leziuni
hepatice

Markeri cuantificati in cursul

-Cum aflam daca sinteza sau localizarea lor celulara se schimba ?

Important in patologii. EX. Fibroza cistica, mutatie la nivelul CFTR (cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator) care conduce la sinteza unui canal nefucntional sau
blocarea acestuia in RE urmata de degradare.
Normal

Fibroza cistica

Acumulare de mucus uscat- blocheaza caile respiratorii

Infectii pulmonare
Po>>

Celula pulmonara

Acumulare de mucus blocheaza caile pancreatice

Fibroza cistica: speranta de viata 37-40 ani

Maladie genetica autozomala recesiva
Incidenta 1:2500 nasteri

Metode de detectie a proteinelor

Electroforeza in gel
Metoda analitica de separare in camp electric a proteinelor in amestec in functie de masa lor

Suport pentru migrare (gel): poliacrilamida, agaroza

Polimerizare
Gelificare

Structura gelului de agaroza

Structura gelului de poliacrilamida

Mobilitatea moleculelor biologice depinde de incarcarea electrica si de masa

Proteinele sunt supuse unui tratament care sa le asigure o incarcare electrica uniforma
astfel incat mobilitatea electroforetica sa depinda doar de marimea lor.

Denaturare termica in prezenta de detergenti (SDS)

Electroforeza denaturanta in prezenta de agenti reducatori

Electroforeza proteinelor serice

Variante de electroforeza
Blue Native PAGE (BN-PAGE)

Pentru separarea complexelor proteice largi in forma lor nativa. SDS este inlocuit cu Coomassie (Brilliant) Blue G-250
(Incarcat negativ)
Zymogram PAGE
Pentru identificarea unor proteine active enzimatic (colagenaze sau alte proteaze). Substratele ( gelatina sau cazaina)
sunt inglobate in gel. Migrare in conditii nereducatoare . Colorare cu Coomassie (Brilliant) Blue R-250.

Focusarea izoelectrica
Separare in gradient de pH gradient pentru separarea proteinelor in functie de punctul isoelectric (pI).

Curs V

Detectia proteinelor prin

Western blotting
Principiu: identificarea specifica a proteinelor pe baza interactiei cu anticorpi

-+

Reactia antigen-anticorp
Anticorpi : Proteine produse de sistemul imun ca reactie de aparare fata de infectii
Anticorp (Ac)

Antigen (Ag)

Specificitatea interactiei Ag-Ac des folosita in biologia celulara

Ac primari fata de
Ag
Ag imobilizat

Ac secundari(marcati):
Ac fata de Ac primari
epitopi

Anticorpi mono-si policlonali

Anticorpii recunosc
mai multi epitopi ai Ag

Ac-recunoaste
1 singur epitop

Proteina HIV

Cum migreaza in electroforeza in conditii

reduse/nereduse? Lant H-55 KDa, Lant L-25 kDa

Policlonal

Monoclonal

Anticorpi policlonali

Ag

Antiserul contine Ac
Amestec heterogen de Ac, fiecare
produs de cite o celula B secretoare

Ag

Anticorp monoclonali
Ac-recunoaste
1 singur epitop
Propagarea unei clone
-1 singura celula B
-Obtinere de hibridoame-celule hibride

Celule B Ac

Celule B
Tumorale
imortalizate

I Fuziune
II Expandare

Ac

III Clonarea celulelor

prin dilutie seriala
IV Selectarea clonelor pozitive

Ac monoclonal

Detectia proteinelor poate fi colorimetrica sau prin chemiluminiscenta

peroxidaza

Avantaje:
Foarte specifica pentru identificarea unei anumite proteine
Detecteaza proteine si mai putin peptide
Poate confirma prezenta (determinare calitativa) dar si cantitatea unei proteine intr-o
proba data
Procesare minimala a probelor

Dezavantaje:
Proteina de interes trebuie sa fie cunoscuta
Anumiti detergenti pot da interferente
Nu este foarte ieftina (nu se aplica in teste de rutina).

Premise: VEGF (vascular endothelial growth factor) este un agent angiogenic,

implicat in permeabilitatea vasculara
VEGF creste in hipoxie si ischemie vasculara (reducerea fluxului sanguin)

Concluzii
experimentale??

Detectia proteinelor prin

IMUNOFLUORESCENTA

Presupune utilizarea unui anticorp primar, monoclonal sau policlonal, fata de o proteina specifica
Anticorpul primar poate fi direct marcat cu un fluorofor
Se pot folosi anticorpi secundari marcati cu un fluorofor
Fluorescenta emisa de proba este vizualizata cu microscopul de fluorescenta
In cazul in care detectia se face prim microscopie electronica anticorpii sunt legati de un atom metalic
greu (Au)
Aplicatii: in diagnostic clinic Identificare de celule canceroase prin evidentierea unui anumit marker;
cercetare (prezenta sau absenta unei proteine, distributia celulara, modificari de sinteza si degradare

Fluorofori excitatie-emisie

Izotiocianat de fluoresceina (FITC)

Evidentierea mai multor proteine in aceeasi

proba

Evidentierea apoptozei celulare

Uniform
suprafata celulei

CD95

Clustere

Radiatiile UV produc leziuni la nivelul ADN.

Se declanseaza un proces de reparare a leziunilor
care genereaza mutatii
Celula epiteliala mutata induce un proces de
proliferare necontrolata

cancer de piele.

Piele normala

UV
Marcare cu- anticorpi primari iepure anti- CD95
-anticorpi secundari de capra anti-IgG iepure marcati fluorescent

Clusterele de CD95 semnalizeaza celulei

declansarea apoptozei celulare.

Evidentierea tesutului malign

Sectiune prin tesut pancreatic, in verde celule

pancreatice tumorale- marker specific

Evidentierea infectiei virale

Celule hepatice infectate cu HCV, identificarea unei

proteine virale nestructurale