n 1906 Tswett a publicat un

articol, n revista de specialitate

Berichte der deutschen botanischen
Gesellschaft
n
care
descrie
separarea unor pigmeni vegetali pe
un tub ngust de sticl, umplut cu
carbonat de calciu. Pigmenii de
diferite culori au fost astfel separai
de pe carbonat prin eluie cu eter de
petrol.

Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919)

Istoric
Plinius cel Btrn (23-79 dup Cristos) n
Historia Naturalis, descrie un proces
egiptean (ca. 500 nainte de Cristos) de
separare a unor pigmeni prin depunerea
soluiei lor pe un material celulozic,
precum papirusul. Aceast tehnic poate fi
considerat a fi foarte aproape de
cromatografia pe hrtie.

n 1855 chimistul german F. F. Runge descrie cromatografia pe hrtie i include

ilustraii ale cromatogramelor n lucrarea sa, Der Bildunystrieb der Stoffe.
Richard Kuhn i Edgar Lederer (1931, separarea a dou componente din
carotenul cristalizat, privit pn n acel moment drept un singur compus chimic,
prin cromatografie de adsorbie.
Martin i Synge ( 1941, publicarea teoriei cromatografiei de partiie)
Consden, Gordon, i Martin (descrierea cromatografiei pe hrtie).
1950 dezvoltarea cromatografiei gaz-lichide (GLC), prin care se separ
compui gazoi sau volatili pe o coloan ngust umplut cu un adsorbent.
Cromatografia n strat subire (thin-layer chromatography, TLC), prin care se
separ compui prin trecerea unui solvent printr-un strat subire de o grosime
submilimetric, ntins pe un suport precum placa de sticl a fost dezvoltat n
anii 60.
Cromatografia lichid de nalt performan (high performance liquid
chromatography, HPLC), tehnic care se separ compui prin introducerea
probei ntr-o coloan ngust ncrcat cu adsorbent i forarea eluiei sale prin
presiune a fost dezvoltat n deceniul al aptelea.
Cromatografia pe hrtie i mai ales cea n strat subire sunt nc utilizate, fiind
deseori preferate cromatografiei gaz-lichid i cromatografiei lichide de nalt
performan din cauza marii lor puteri n separarea efectiv, cu echipamente
ieftine i costuri sczute.

Principala aplicaie a cromatografiei este cea de separare a unor amestecuri de

compui n scopuri analitice sau preparative.
Procesul de cromatografie poate de asemenea servi la identificarea, izolarea,
purificarea i cuantificarea unor compui individual separai.
n plus, aceste procese cromatografice pot fi aplicate n determinarea omogenitii
unor substane chimice, determinarea structurii moleculare, determinarea
produilor de reacie i a proceselor care le nsoesc.
Cromatografia cuprinde un grup important i diversificat de metode care permit
cercettorului separarea unor componeni foarte apropiai (nrudii) dintr-un amestec
complex de substane (de componente), multe dintre aceste separri nefiind posibile
prin alte tehnici.
n toate separrile cromatografice proba este transportat ntr-o faz mobil, care
poate fi un gaz, un lichid sau un fluid n stare supercritic. Aceasta faz mobil
este forat s traverseze o faz nemiscibil, faz staionar, care se gsete ntr-o
coloan sau pe o suprafa solid. Cele dou faze sunt alese n aa fel nct proba
s se distribuie ntre faza mobil i cea staionar n proporii diferite. Componentele
care sunt mai puternic reinute de ctre faza staionar se vor mica i vor curge mai
lent cu faza mobil. Din contr, componentele uor legate de ctre faza staionar
vor traversa aceast faz mai rapid. Drept consecin a acestor diferene n
mobilitate, componentele probei se vor separa n benzi ori zone discrete, care
pot fi analizate calitativ i/sau cantitativ.
Termenul de migrare utilizat n cromatografie reprezint o descriere generic a
micrii moleculelor n cromatografie i el nu trebuie confundat cu migrarea unei
specii ionice sub aciunea unui cmp electric.

Clasificarea metodelor de cromatografie pe coloan

Metodele cromatografice pot fi clasificate innd cont de dou
criterii.
Prima clasificare este bazat pe metoda fizic prin care fazele
mobil i staionar vin n contact.
Astfel, n cromatografia pe coloan, faza staionar este
reinut ntr-un tub ngust, prin care faza mobil este forat
s treac.
n cromatografia planar, faza staionar este depus pe un
suport, n interstiiile unui material poros (de tipul hrtiei de
filtru, ca exemplu). n acest caz, faza mobil se mic prin
faza staionar datorit forei capilare, sub influena forei
gravitaionale.
Se poate remarca c echilibrele care apar n cazul celor
dou tipuri de cromatografii au baze teoretice apropiate,
teoriile dezvoltate n cazul uneia dintre cele dou metode
putnd fi formalizate asemntor i uor adaptate la cealalt
tehnic cromatografic.

O clasificare mult mai fundamentat a metodelor cromatografice se bazeaz pe

tipul fazelor mobile i staionare i tipul de echilibru stabilit n transferul soluturilor
ntre cele dou faze.

ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE ELUIE PE COLOAN

Prezentarea schematic a
modului prin care dou
substane, notate A i B
sunt
separate
prin
cromatografie de eluie pe
o coloan, cu faz mobil
lichid.
Eluia
implic
splarea, trecerea speciilor
(substanelor A i B, n
spe) prin coloan, la
adugarea continu de
solvent
(faz
mobil)
proaspt (a).

o poriune unic de prob este

introdus la captul superior al coloanei
(timpul to), dup care componentele probei
se distribuie independent, ntre cele dou
faze.

(b) Semnalul nregistrat de ctre un detector n funcie de

evoluia eluiei prin coloana prezentat n (a).

Introducerea unui volum adiional de faz mobil (de

eluent) foreaz volumul de solvent care conine o
parte a probei s coboare prin coloan, unde, se
stabilete o nou partiie ntre faza mobil i cea
staionar (timpul t1). Simultan cu aceasta se
stabilete un nou echilibru i o nou partiie ntre
solventul proaspt (faza mobil nou adugat) i faza
staionar la locul iniial de adugare a probei.
Adugarea unor noi volume de solvent va avea ca
efect coborrea moleculelor de solut spre captul de
jos al coloanei printr-o serie continu de transferuri
ntre faza mobil i cea staionar. Cum micarea
solutului se poate realiza numai prin intermediul fazei
mobile, viteza medie cu care zona (banda) solutului
migreaz n josul coloanei depinde de fracia de timp
n care solutul este reinut de ctre aceast faz.
Aceast fracie este mic pentru componenta mai
puternic reinut de ctre faza staionar (compusul B,
din figur) i este mare n cazul n care retenia n faza
mobil este mai adecvat (componenta A). n mod
ideal, diferenele rezultate n vitezele diferite conduc la
separarea componentelor dintr-un amestec n benzi
sau zone localizate de-a lungul coloanei (timpul t3 din
figur). Izolarea i deci separarea speciilor A i B este
urmarea trecerii unei cantiti suficiente de faz mobil
prin coloan i care conduce la o separare individual
de zone clar distribuite ce pot fi colectate ori detectate
(timpii t3 i t4 din figur).

DILUIA ANALITULUI

Figura ilustreaz o caracteristic

important a procesului de separare,
denumit diluia analitului fenomen care
nsoete aproape ntotdeauna separrile
cromatografice. Astfel, mrimea zonei
originale care conine analiii din figur
este notabil mai mic dect cele dou
zone care conin componentele A i B i
care ajung n zona detectorului. Acest
fenomen semnificativ de diluare se
manifest
odat
cu
separarea
componentelor i din aceast cauz,
detectorii utilizai pentru separarea
analiilor trebuie adesea s prezinte o
sensibilitate mai mare dect cea care
ar fi dorit dac procesul de separare
nu ar fi necesar.

CROMATOGRAMELE

Dac un detector care rspunde la o

modificare de concentraie a solutului este
plasat la captul terminal al coloanei iar
semnalul su este reprezentat grafic n
funcie de timp (sau de volumul de faz
mobil adugat) se obin o serie de peak-uri,
prezentate n figur (b). Asemenea
reprezentri grafice poart numele de
cromatograme, care sunt utilizate att n
cromatografia analitic ct i n cea
preparativ. Poziia peak-urilor pe axa
timpului poate servi la identificarea
componentelor din prob, aria fiecruia
conducnd la determinarea cantitativ a
fiecrui component.

EFECTELE VITEZELOR DE MIGRARE I A LIMII ZONEI ASUPRA

REZOLUIEI CROMATOGRAFICE

Figura
alturat
prezint
profilurile
concentraiilor
soluilor A i B la dou etape
diferite de eluie: o etap timpurie
(momentul t1) i o etap spre final
(momentul t2).

Se poate spune ca specia B este mai puternic reinut i din aceast

cauz componentul B ntrzie mai mult pe coloan pe parcursul migrrii.
Aceast ntrziere n coborre conduce la creterea distanei dintre cele dou
zone. La acelai interval de timp, are loc aceeai lrgire a zonelor celor dou
componente, fenomen ce scade eficiena coloanei cromatografice. Cum
lrgirea zonei este inevitabil, se pot alege condiiile n aa fel ca acest
fenomen s se manifeste ct mai lent odat cu separarea benzilor. Astfel, o
separare complet i de aici o rezoluie bun, se realizeaz adesea n
condiiile n care lungimea coloanei este suficient de mare.

dou metode de mbuntire a separrii n cazul unui amestec ipotetic

de dou componente (figur, panel a).

n
figura
alturat
(b)
condiiile au fost modificate
astfel nct primul component
se deplaseaz mai repede n
josul coloanei cu vitez mai
mare n timp ce al doilea se
deplaseaz mai ncet.
(c) : vitezele de mprtiere a celor dou
zone au fost micorate. Ambele metode
conduc la o separare mai distinct a celor
dou componente

Ambele metode conduc la o separare mai

distinct a celor dou componente

(a) cromatograma original cu cele

dou
peak-uri
suprapuse;
mbuntirea separrii prin (b)
creterea
separrii
benzilor
cromatografice i (c) prin scderea
mprtierii benzii cromatografice.

Viteza de migrare a solulor

Eficiena unei coloane cromatografice

n separarea a doi solui depinde, n parte,
de vitezele relative cu care cei doi
compui sunt eluai. Aceste viteze sunt
determinate
de
magnitudinea
constantelor de echilibru ale procesului
prin care soluii se distribuie independent
ntre faza mobil i cea staionar.

CONSTANTELE DE DISTRIBUIE
Adeseori, echilibrele de distribuie implicate n cromatografie sunt descrise prin
ecuaii care implic transferul unui analit ntre fazele mobil i staionar. Astfel,
pentru speciile A de solut se poate scrie urmtorul echilibru al procesului de
adsorbie-desorbie:

Constanta de echilibru, K, pentru aceast reacie este numit constant de distribuie, raport
de partiie sau coeficient de partiie Comisia de Nomenclatur Analitic a IUPAC pentru
cromatografie recomand utilizarea termenului de constant de distribuie, Kc n loc de vechiul
termen n loc de vechiul termen de coeficient de partiie sau raport de partiie, K. Totui, n literatura
de specialitate ambii termeni sunt nc utilizai. Constanta K este definit conform formulei:
CS reprezint concentraia molar a solutului din faza staionar iar CM este
concentraia molar din faza mobil; n mod ideal, K este constant n tot
domeniul de concentraii a solutului, iar CS este proporional cu CM.
Tipul de cromatografie n care se aplic ecuaia poart denumirea de
cromatografie linear iar rezultanta ei este caracterizat printr-o simetrie de
tip Gauss a peak-urilor i a timpilor de retenie, parametrii care sunt
independeni de cantitatea de analit supus analizei. n general, studiile
teoretice se limiteaz la o astfel de cromatografie linear.

TIMPUL DE RETENIE
Figura alturat reprezint
generic o cromatogram pentru o
prob ce conine un singur analit.
Timpul necesar probei de a
parcurge
distana
dintre
momentul inoculrii pn la
detecia semnalului su de
detector este numit timp de
retenie, fiind simbolizat prin
tR. Peak-ul prezentat n partea
din stnga cromatogramei este
dat de speciile care nu sunt
reinute de ctre coloan.
Adesea, proba sau faza mobil
conine specii ce nu sunt reinute
pe parcursul migrrii pe coloan.
Astfel de specii care nu
interacioneaz
cu
faza
staionar sunt de real folos n
identificarea peak-ului analitului
de interes.

Peak-ul mic din stnga reprezint o specie care nu este reinut pe

coloan i a crei semnal apare la detector aproape imediat dup ce
eluia a fost nceput. Astfel, timpul su de eluie (tM) este
aproximativ egal cu timpul necesar fazei mobile s treac prin
coloan.

Timpul necesar speciilor nereinute s ajung la

detector se noteaz cu tM i se numete timp mort.
Viteza de migrare a speciilor nereinute este n acelai
domeniu cu viteza de micare a moleculelor fazei
mobile.

 Viteza linear medie de migrare a solutului

( ) este dat de relaia:

unde L este
mpachetate.

lungimea

coloanei

n mod similar, viteza medie linear de

micare a unei molecule de faz mobil (u)
este dat de relaia:

unde tM reprezint timpul mort, timpul necesar pentru ca o molecul

medie de faz mobil s treac prin coloan.

De exemplu, dac o coloan are un volum total de 100 ml iar faza

staionar ocup 40 ml, rezult c faza mobil ocup un volum de 60 ml.
Dac faza mobil curge cu o vitez de 5 ml/min, se poate calcula c sunt
necesare 12 minute pentru ca faza mobil s traverseze coloana, de la
injector la detectorul situat la captul terminal al coloanei.
Uneori, tM poate fi determinat prin identificarea unui mic peak la nceputul
cromatogramei, rezultat dintr-o uoar diferen dat de solventul care
provine din faza mobil ce conine proba adugat.
De asemenea tM poate fi determinat prin msurarea timpului de eluie a unei
probe care nu este reinut absolut de loc de ctre faza staionar. n cazul
unei rini schimbtoare de ioni cationice, pentru a se determina tM, se
poate utiliza o protein cu sarcin negativ.

 Se notabil de artat c exist i ali factori

precum lungimea i diametrul tubului care
conecteaz injectorul i detectorul la coloan
care pot afecta valorile tM.
Practic, considernd o coloan mpachetat de
25 cm lungime, cu un diametru interior de 1 cm,
volumul total al coloanei este de 19,6 ml (V= r2
L = 3,14 0,52 25cm). Dac faza mobil
ocup 60% din volumul coloanei, volumul
spaiului gol, care definete timpul mort este
egal cu 11,8 ml. El reprezint volumul spaiului
gol, denumit void volume = V0

RELAIA DINTRE TIMPUL DE RETENIE I CONSTANTA DE

DISTRIBUIE
n scopul prezentrii relaiei dintre timpul de retenie al
solutului i constanta sa de distribuie, se poate exprima
viteza de migrare drept o fracie a vitezei fazei mobile:

Aceast fracie este egal cu numrul mediu de moli de solut din

faza mobil, la un moment dat, raportat la numrul de moli totali de solut
din coloan, conform urmtoarei relaii:

Numrul total de moli de solut din faza mobil este egal cu

concentraia molar a solutului din faza mobil, cM, multiplicat cu
volumul acestei faze, VM.
n mod similar, numrul de moli de solut din faza staionar este
dat de produsul concentraiei cS de solut din faza staionar, multiplicat
cu volumul su din aceeai faz, VS.
Astfel se poate scrie:

Prin substituirea ecuaiei constantei

de distribuie n aceast ecuaie se obine
viteza de migrare a solutului ca funcie de
constanta de distribuie i ca funcie de
volumele fazelor staionare i mobile:

Cele dou volume pot fi estimate prin metode specifice fiecrui tip de cromatografie.

VITEZA DE MIGRARE A SOLUTULUI: FACTORUL DE RETENIE

Factorul de retenie, sau factorul de capacitate reprezint un
parametru important care este general utilizat n descrierea vitezelor
de migrare a soluturilor pe coloan. Pentru un solut A, factorul de
retenie kA este definit ca:

unde KA reprezint constanta de distribuie a speciei A.

Comisia IUPAC de Nomenclatur Analitic recomand denumirea de
factor de retenie k', ns denumirea de factor de capacitate este nc
utilizat n literatura de specialitate.

Prin substituia ecuaiei 5 n ecuaia 4 rezult:

n scopul de a defini modalitatea prin care se poate determina kA

cromatogram, se vor substitui ecuaiile 2 i 3 n ecuaia 6,

= L
tR

(2 )

ceea ce conduce la:

u= L
t
M

dintr-o

(3 )

rearanjarea acestei ecuaii

Dup cum se observ n figur, tR i

tM sunt uor de obinut dintr-o
cromatogram. n condiiile unui factor de
retenie pentru un solut mult mai mic
dect unitatea, eluia se realizeaz mai
rapid i din aceast este dificil a se
determina timpii de retenie cu acuratee.
n condiiile n care factorul de retenie
este de ordinul zecilor (de exemplu 20
sau 30), timpii de eluie devin anormal de
mari. Ideal, separarea se efectueaz n
condiiile unor factori de retenie cuprini
ntre 2 i 10.

VITEZELE RELATIVE DE MIGRARE. FACTORUL DE

SELECTIVITATE
Factorul de selectivitate
al unei coloane () pentru
dou specii, A i B este
definit prin formula:

(9)
unde KB reprezint constanta de distribuie
a speciei B, mai puternic reinut pe
coloan, n timp ce KA reprezint
constanta de distribuie a speciei A, mai
puin reinut pe coloan, i mai rapid
eluat de pe aceasta. Prin definiie, este
ntotdeauna mai mare dect unitatea.

 Prin substituirea ecuaiei 5 i a

ecuaiei
analoage
pentru
solutul B n ecuaia 9 se
obine, dup la rearanjare,
relaia de legtur ntre factorul
de selectivitate pentru cei doi
solui i factorii lor de retenie:

(10)
unde k'B i k'A reprezint factorii de retenie
ai solutului B, respectiv A.

Substituia n ecuaia 8 pentru cei doi solui din ecuaia 10 conduce la o expresie ce
permite determinarea experimental lui dintr-o cromatogram:

factorii de selectivitate i retenie se utilizeaz, la

rezolvarea problemelor referitoare la caracterizarea
unei coloane cromatografice

mprtierea zonei i eficiena

coloanei
Teoria dinamic, sau teoria cinetic a cromatografiei
explic cu succes n termeni cantitativi formele peakurilor cromatografice i efectele diverselor variabile
implicate n lirea acestor peak-uri. O discuie
detailat a acestei teorii se bazeaz pe mecanismul de
repartiie aleatorie, putndu-se da o imagine calitativ
a zonelor cromatografice i care conduce la analiza
modului de mprtiere a zonelor n condiiile deplasrii
moleculelor de solut de-a lungul unei coloane.
nelegerea acestor fenomene au ca rezultat
identificarea variabilelor ce conduc la creterea
eficienei coloanei i la reducerea mprtierii zonelor
cromatografice.

FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE

Figura 4

Figura 1

Figura 2

 Examinarea peak-urilor dintr-o cromatogram sau a benzilor pe

coloan (figurile de mai jos) relev o similaritate a erorilor normale,
repartiia realizndu-se dup un profil Gaussian, care sunt obinute
n condiiile reprezentrii grafice a valorilor determinate funcie de
frecvena repartiiei a acestora.

n unele cazuri, peak-urile cromatografice nu sunt lineare, manifestnd o

coad (tren) sau un front.
n primul caz, trena peak-ului care apare n dreapta cromatogramei
este prelung, n timp ce frontul acestuia este abrupt.
n cel de-al doilea caz, forma cromatogramei este inversat, adic
frontul este prelung n timp ce trena este extrem de scurt. Cauza comun a
apariiei frontului sau a trenei o reprezint existena unei constante de
distribuie neliniare. Frontul apare de asemenea n cazul elurii unei
cantiti mari de prob pe coloan. Distorsiunile de acest fel sunt nedorite
deoarece conduc la separri de proast calitate i la timpi de eluie cu
reproductibilitate sczut. n abordarea teoretic se consider ca fenomenul
de front sau coad cromatografic este absent sau minim.

 Dup cum se cunoate, curbele de erori normale pot fi

raionalizate prin asumarea faptului c incertitudinea
asociat cu orice msurtoare singular reprezint
nsumarea unui numr mult mai mare de erori mici,
individuale nedetectabile i de repartiii ntmpltoare,
fiecare dintre acesta avnd o probabilitate egal, pozitiv
sau negativ. Cea mai comun manifestare a acestor
incertitudini este reprezentat de anularea uneia de ctre
cealalt, ceea ce conduce la o valoare medie. Cu o mic
probabilitate, nsumarea poate conduce la un rezultat mai
mare sau mai mic dect media. Drept consecin,
distribuia valorilor este simetric, n jurul valorii medii. n
mod similar, forma Gaussian a unei zone
cromatografice ideale poate fi atribuit combinrii aditive
a micrilor ntmpltoare a moleculelor de solut n zona
cromatografic.

S considerm comportamentul unei molecule de solut, care n timpul

migrrii, trece prin mii de transferuri ntre faza staionar i cea mobil. Timpul
petrecut n fiecare faz de transfer este deosebit de neuniform, depinznd de
ctigul accidental de energie termic din mediul nconjurtor pentru a realiza
un transfer reversibil, n cealalt faz. Astfel, n unele cazuri, timpul de edere
ntr-o faz dat, poate fi tranzitoriu, n timp ce n alte faze perioada poate fi
relativ mai lung. Cum molecula este eluat numai n timpul ederii sale n faza
mobil, are ca rezultat, migrarea sa total neuniform n josul coloanei. Din
cauza timpilor variabili de edere, viteza medie cu care moleculele individuale
se mic relativ n faza mobil variaz n mod considerabil. Anumite particule
individuale traverseaz mai rapid n virtutea includerii lor accidentale n faza
mobil, majoritatea timpului de eluie. Altele, din contr, pot prezenta ntrzieri
datorit includerii lor n faza staionar, timp mai ndelungat dect timpul mediu
de eluie. Consecina acestor procese aleatoare este o mprtiere simetric a
vitezelor n jurul valorii medii, iar acesta reprezint comportamentul mediu al
moleculei.
Limea benzii componentului separat crete odat cu coborrea lui dea lungul coloanei, datorit faptului c o cretere a timpului de eluie permite
manifestarea unei mai mari mprtieri. Astfel, limea zonei este n relaie
direct cu timpul de edere n coloan i n relaie invers cu viteza de curgere
a fazei mobile.

METODE DE DESCRIERE A EFICIENEI COLOANEI

n msurarea cantitativ a
eficienei unei coloane
cromatografice n general
sunt utilizai doi termeni
nrudii:
(1) nlimea talerului
teoretic, H i
(2) numrul de talere
teoretice, N. Cei doi
parametrii sunt asociai
prin ecuaia:

N = L/H (1.12)
L, lungimea coloanei mpachetate
(dat de obicei n centimetrii)
Eficiena coloanelor cromatografice crete
cu numrul de talere teoretice: cu ct
numrul de talere teoretice este mai mare
i nlimea talerului teoretic devine mai
mic. Sunt ntlnite diferene enorme n
eficiena unei coloane, datorit diferenelor
dintre tipul de coloan i fazele mobil,
respectiv staionar, utilizate. n mod
curent, eficiena unei coloane n termen de
numr de talere teoretice, poate varia ntre
cteva sute pn la mii, iar domeniul
nlimii talerelor variind ntre zecimi pn
la miimi de centimetrii sau mai mici.

 Introducerea termenilor de nlime a talerului i a numrului de

talere este datorat studiilor teoretice ale lui Martin i Synge care
au tratat coloana cromatografic similar coloanei de distilare, unde
au loc o multitudine de procese discrete dar continue, n straturi
nguste, denumite talere teoretice. S-a considerat c la nivelul
fiecrui taler, are loc un echilibru ntre faza mobil i cea staionar.
Micarea solutului n josul coloanei a fost apoi tratat ca o treapt
de transfer ntre faza mobil n echilibru i urmtorul taler situat mai
jos.
Teoria talerului teoretic a fost aplicat cu succes la forma Gaussian a peak-urilor
cromatografice i la viteza de migrare a solutului de-a lungul coloanei cromatografice.
Ea a fost n final abandonat totui, deoarece nu a reuit sa rspund la explicarea
modului de mprtiere a zonei. Cu toate acestea, termenii originali utilizai la
descrierea eficienei unei coloane au fost pstrai n teoria vitezei de migrare. Aceast
nomenclatur este uneori neadecvat din cauza tendinei de a perpetua mitul
prezenei unor talere n coloana cromatografic, la nivelul crora se realizeaz
echilibrul ntre faze. De fapt, starea de echilibru, nu se realizeaz niciodat
deoarece faza mobil este ntr-o permanent i constant micare.

DEFINIIA NALIMII
TALERULUI
Dup cum se cunoate, limea curbei Gaussiene este ntr-o
relaie direct cu variana 2, sau cu deviaia standard , a unei
msurtori. Cum benzile cromatografice sunt n general
considerate a avea astfel de form, este convenabil s definim
eficiena unei coloane n termen de varian pe unitate de
lungime a coloanei. Astfel, nlimea talerului, H, este dat de
relaia:

DEFINIIA NLIMII TALERULUI

Definiia talerului teoretic. H = 2/ L

EVALUAREA EXPERIMENTAL A LUI H I A LUI N

Determinarea deviaiei standard din peak-ul cromatografic: W = 4.

Aceast definiie a nlimii talerului este ilustrat n figura de mai jos. Dup
cum se observ, coloana este mpachetat pe o distan de L centimetrii, n
lungime (panelul a).

Reprezentarea
grafic a definiiei
talerului teoretic.
H = 2/ L

n partea superioar a figurii (panelul b) este reprezentat schematic,

distribuia moleculelor de-a lungul colanei cromatografice mpachetate, n
momentul n care analitul prsete coloana (acesta este din punct de
vedere al timpului, timpul de retenie, tR). Modelul curbei este Gaussian,
iar localizrile parametrilor L-l i L + l sunt indicate prin linie punctat
vertical.

 De notat faptul c L este dat

n centimetrii, iar variana, 2, este
explicitat n centimetrii ptrai; H
reprezint o distan linear,
exprimat n centimetrii (ecuaia
din slide-ul anterior).

nlimea talerului poate fi

gndit ca o poriune de
coloan, situat la captul
terminal care conine fracia de
analit situat ntre L-l i L.
Cum aria, n domeniul normal
de eroare a curbei este limitat
de , fiind de aproximativ
68% din aria total, nlimea
talerului prin definiie conine
aproximativ 34% din analit.

Evaluarea experimental a lui H i N

Figura alturat reprezint
o cromatogram obinuit n
funcie de timp. Variana peak-ului
de solut poate fi obinut printr-un
procedeu grafic simplu, i are ca
unitate de msur secunde la ptrat,
fiind n mod uzual notat cu 2,
pentru a o distinge de 2, care are ca
unitate de msur centimetrii ptrai.
Cele dou deviaii standard, i
sunt legate prin relaia:

unde L/tR reprezint viteza linear medie a

solutului, exprimat n centimetrii pe
secund
Determinarea deviaiei standard, ,
din peak-ul cromatografic: W = 4.

N = L/H

(1.12)

Figura ilustreaz modul simplu de

aproximare al lui i dintr-o
cromatogram obinut experimental.
Tangentele punctelor de inflexiune de pe
cele
dou
pri
ale
peak-ului
cromatografic sunt prelungite pn la
intersectarea lor i se formeaz astfel un
triunghi cu baza pe axa timpului a
cromatogramei. Aria acestui triunghi
reprezint aproximativ 96% din aria
total a peak-ului.

n evaluarea statistic, se consider c aproximativ

96% din aria peak-ului Gaussian este inclus n interiorul
suprafeei cu o aproximaie de plus sau minus dou deviaii
standard (2) din valoarea sa maxim. Astfel, intercepiile
artate n figur se manifest la aproximativ 2 din
maximum, iar W = 4, unde W este mrimea bazei
triunghiului. Substituind aceast relaie n ecuaia 1.14 i
rearanjnd termenii, rezult:

Substituia acestei ecuaii de deviaie

standard () n ecuaia nlimii talerului
(ecuaia 1.13 ) conduce la:

formula de calcul al numrului

de talere teoretice, N:
Prin substituia formulei 1.16 n formula 1.12 urmat de rearanjarea termenilor,
se obine formula de calcul al numrului de talere teoretice, N:

N = L/H (1.12)

n
continuare,
N
poate fi calculat din
msurarea,
la
dou
momente de timp, tR i W;
iar pentru a obine H,
lungimea
coloanei
mpachetate trebuie s fie
de asemenea cunoscut.

O alt metod de aproximare a lui N, i care este

considerat de ctre unii practicieni mai sigur,
necesit determinarea a W1/2 (jumtate din limea
bazei peak-ului), Iar numrul de talere este dat de
formula:

Numrul de talere i nlimea talerului sunt general

utilizate n literatur i n caracterizarea unor coloane
produse de ctre firmele de specialitate, ca msur a
performanei acestora. Din cauza faptului c aceti
parametrii sunt semnificativi n compararea a dou coloane,
este esenial ca ei s fie determinai pentru acelai compus.

VARIABILELE CINETICE CARE AFECTEAZ MPRTIEREA ZONEI

CROMATOGRAFICE

mprtierea zonei cromatografice este consecina unei rate finite

de procese de transfer de mas care se produc n timpul migrrii
solutului, de-a lungul unei coloane cromatografice. O parte dintre
aceste viteze sunt controlabile, prin ajustarea unor variabile
experimentale, care permit astfel creterea calitii separrii.
Tabelul prezint parametrii cei mai importani care concur la rezoluia cromatografic.

EFECTUL VITEZEI DE CURGERE A FAZEI

MOBILE
Magnitudinea efectelor cinetice asupra eficienei coloanei
depinde n mod clar de lungimea timpului n care faza mobil este
n contact cu faza staionar, care, la rndul ei, este depinde de
viteza de curgere a fazei mobile. Din aceast cauz, studiile
referitoare la eficiena unor coloane sunt n general axate pe
determinarea lui H ca funcie de viteza fazei mobile, u. Aceste date
sunt exemplificate de cele dou curbe din figura urmtoare, una
caracteriznd cromatografia de lichide, n timp ce a doua este
reprezentativ cromatografiei de gaze.
Ambele curbe prezint un minim al nlimii talerului teoretic, H
(ceea ce semnific o eficien maxim) la viteze mici de curgere.
Aceast valoare minim din cromatografia lichid se manifest n
general la viteze de curgere care sunt asemntoare celei de
cromatografie de gaze i deseori sunt att de mici nct nu sunt
sesizabile n condiiile normale de operare.

Efectul vitezei de curgere a fazei mobile asupra nlimii

talerului teoretic n cazul
(a) cromatografiei de lichide i (b) gaz cromatografiei.

Teoria vitezei de mprtiere a zonei cromatografice

descrie cu acuratee i predicioneaz forma diagramei H
n funcie de u, grafic denumit adesea diagrama van
Deemter dup numele descoperitorului ei. Dup cum se
observ n figura alturat, vitezele de curgere pentru
cromatografia lichid sunt semnificativ mai mici dect
cele utilizate n cazul celei gazoase.
Din aceast cauz, separrile n gaz cromatografie
sunt mai rapide dect cele de cromatografie lichid. Mai
mult, dup cum arat figura, nlimea talerului teoretic a
unei coloane de cromatografie lichid are un alt ordin de
magnitudine fiind mult mai mic fa de cel ntlnit n
cazul coloanelor utilizate n cromatografia de gaze. Din
aceast cauz, nu este practic a se utiliza coloane de
cromatografie lichid care sunt mai lungi de 25-50 cm
(datorat presiunii picturilor), n timp ce coloanele de
gaz cromatografie pot fi de 50 de metrii sau mai lungi.
n consecin, numrul total de talere i astfel
eficiena total a coloanei sunt n general superioare n
cazul coloanelor de gaz cromatografie. n acest fel, o
prim comparaie ntre gaz cromatografie i cea lichid
arat c prima metod este capabil de separri mai
rapide i de mai mare eficien.

RELAIA DINTRE NLIMEA TALERULUI I VARIABILELE

COLOANEI

n cursul ultimilor 40 de ani, au fost elaborate nenumrate studii

teoretice i experimentale avnd ca scop dezvoltarea relaiilor
cantitative care descriu efectul variabilelor prezentate n tabel,
asupra nlimii talerului pe diverse tipuri de coloane. Au fost astfel
elaborate o serie de expresii matematice referitoare la relaia dintre
nlimea talerului i parametrii variabili ai coloanei care, aplicate
practic, au avut grade diferite de succes. Aparent nici una dintre ele
nu a rezolvat n totalitate i nu au putut s explice interaciile fizice
complexe care conduc la lirea zonei cromatografice. O serie dintre
aceste teorii, cu toat imperfeciunile lor au fost des utilizate i au
condus la creterea performanei coloanelor cromatografice.
O astfel aproximare matematic a comportamentului coloanelor
cromatografice este ecuaia van Deemter, care poate fi scris n
forma:
H = A + B/u + Cu = A + B/u + (CS + CM)u

(1. 19)

unde H este nlimea talerului dat n centimetrii, u este viteza linear a fazei
mobile dat n centimetrii pe secund, n timp ce A, B, i C sunt coeficieni referitori
la fenomenele de curgere pe multiple ci, difuzie longitudinal i transfer de mas
ntre faze. Dup cum se observ n ecuaia 1.19, coeficientul C poate fi desfcut n
doi coeficieni: unul (CS), n relaie cu faza staionar, iar cellalt, (CM), relativ la
faza mobil.
Studii teoretice ulterioare au artat c ecuaia van Deemter este destul de exact
n explicarea eficienei coloanei cromatografice. Ecuaia van Deemter conine
termeni direct i invers proporionali precum i termeni independeni fa de viteza
fazei mobile.

TERMENUL (A)
mprtierea zonei se manifest
n parte datorit multitudinii de ci de
curgere pe care moleculele (sau ionii)
le pot gsi i urma prin coloana
mpachetat. Dup cum se observ
n figura alturat, lungimea acestor
ci pot diferi semnificativ, astfel,
timpul de reziden n coloan pentru
moleculele aceleai specii este de
asemenea variabil. Moleculele de
solut pot astfel atinge captul colanei
ntr-un interval de timp care conduce
la mprtierea zonei. Acest efect,
denumit n acelai timp difuzie n
vrtej este direct proporional cu
diametrul particulelor cu care se
mpacheteaz
coloana
cromatografic i este prezentat n
coloana a treia din tabelul de mai
sus.

Modalitatea de eluie a dou molecule printr-o

coloan cromatografic.
Se poate nota c distana parcurs de molecula 2 este
mai mare dect cea parcurs de ctre molecula 1.
Astfel, molecula 2 va ajunge la punctul B mai trziu
dect molecula 1.

mprtierea prin curgere pe canale multiple poate fi

parial compensat de difuziunea ordinar, care rezult n
condiiile n care moleculele sunt transferate printr-un curent
ce urmeaz o cale sau alta. Dac viteza de curgere este
foarte mic, un numr mare de asemenea transferuri se
realizeaz iar fiecare molecul n micarea sa n josul
coloanei urmeaz o alt cale de curgere, pierznd timpi
diferii pe fiecare direcie de curgere.
Drept consecin, viteza cu care fiecare dintre molecule
se mic n josul coloanei tinde sa se apropie de medie. Se
poate spune c, la viteze mici ale fazei mobile moleculele nu
sunt semnificativ dispersate prin natura cilor multiple a
mpachetrii.

La viteze moderate sau mari, totui, nu este timp suficient

necesar pentru ca difuzia medie sa s realizeze iar mprtierea
zonei se manifest datorit lungimilor diferite ale cilor de curgere.

TERMENUL DE DIFUZIE LONGITUDINAL (B/u)

Difuzia longitudinal n cromatografia pe coloan este un proces de
mprtiere a benzii n care soluii difuzeaz dintr-un centru de concentrare spre
zone mai diluate, n faa i n spatele zonei cromatografice, unde se manifest n
sensul i n contra direciei de curgere a fazei mobile. Dup cum se observ n a
doua ecuaie din tabelul 1.3, termenul de difuzie longitudinal este direct
proporional cu coeficientul fazei mobile DM, constant egal cu viteza de migrare
sub un gradient egal cu o unitate. Constanta este denumit factor obstructiv fiind
n relaie cu mpiedicarea difuziei longitudinale de ctre modul de mpachetare al
coloanei. Astfel, n cazul coloanelor mpachetate valoarea aceste constante este de
aproximativ 0,6 n timp ce pentru coloane nempachetate valoarea sa este egal cu
unitatea.
Contribuia difuziei longitudinale este invers proporional cu viteza fazei
mobile. Aceast relaie nu este surprinztoare dac avem n vedere c analitul este
n coloan pentru o perioad mai mic la viteze de curgere nalte. n cazul unor
viteze mari de curgere, difuzia de la centru bandei spre margini se manifest mai
redus cu ct timpul de staionare este mai mic. Pantele negative la viteze de curgere
sczute prezentate n cele dou grafice din figura alturat i sunt consecine ale
difuziei longitudinale. Se poate nota c efectul este mai puin pronunat n
cromatografia de lichide din cauza faptului c aceti coeficieni de difuzie n lichide
au ordine de magnitudine mai mici dect cei gsii n cazul gazelor. De fapt, pentru
cele mai multe lichide, factorul B/u se apropie de zero n relaie cu ceilali termeni
din ecuaia 1.19. Astfel, minimul artat n figura alturat nu este uneori observat.

COEFICIENII DE TRANSFER DE MAS (CS i CM).

Necesitatea celor doi coeficieni de transfer de mas CS i CM din ecuaia 1.19 apare
datorit faptului c echilibrul dintre fazele mobil i staionar se stabilete deosebit de lent
n coloana cromatografic deoarece ea opereaz ntotdeauna n condiii de neechilibru. n
consecin, moleculele de analit aflate n partea frontal a benzii cromatografice sunt
preluate n fa, nainte de a avea timp pentru a se echilibra n faza staionar i astfel s fie
reinute de aceast faz. n mod similar echilibrul nu se stabilete la marginea situat la
trena benzii iar moleculele de analit sunt prsite ndrtul fazei staionare, datorit micrii
rapide a fazei mobile.
mprtierea benzii din cauza efectelor de transfer de masa se manifest din cauza
faptului c o multitudine de cureni de curgere ai fazei mobile din coloan i stratul care
nconjoar faza staionar au dimensiuni finite. n consecin, este necesar un timp pentru ca
moleculele de solut aflate la interfa s difuzeze dintr-o faz n interiorul celelalte faze.
Acest timp de lag rezult din persistena condiiilor de neechilibru de-a lungul coloanei
cromatografice. De altfel, dac vitezele de transfer de mas dintre cele dou faze ar fi
infinite, fenomenul de mprtiere a zonelor cromatografice nu s-ar manifesta.
Se poate nota c extensia benzii cromatografice produs att de mprtierea
longitudinal ct i de transferul de mas depinde de viteza de difuzie a moleculelor de
analitul n timp ce direcia difuziei n cele dou cazuri este diferit. mprtierea longitudinal
apare din tendina moleculelor de a se ndrepta ntr-o direcie paralel curgerii, n timp ce
mprtierea datorat transferului de mas se manifest din tendina moleculelor de a difuza
ntr-un plan perpendicular cu direcia de curgere. Drept consecin, gradul de mprtiere
longitudinal este n relaie invers cu viteza de curgere. Pentru mprtierea datorat
transferului de mas, din contr, cu ct faza mobil se mic mai repede, cu att timpul
necesar ajungerii la echilibru este mai redus. Astfel, dup cum arat ultimii doi termeni ai
ecuaiei 1.19, efectul transferului de mas asupra nlimii talerului este direct proporional
cu viteza linear, u, de micare a fazei mobile.

TERMENUL DE TRANSFER DE MAS N FAZA STAIONAR (CSU).

Ecuaia a treia din tabelul 1.3, arat c n condiiile n care faza staionar este un lichid imobilizat,
coeficientul de transfer de mas este proporional cu o funcie complex, fs(k') a factorului de retenie k', este
direct proporional cu ptratul grosimii filmului de pe particulele suport df i este invers proporional cu
coeficientul de difuzie, DS a solutului n film. Efectele acestei relaii pot fi nelese prin imaginarea modului prin
care aceti factori influeneaz frecvena medie prin care moleculele de analit care ajung la interfa sunt
transferate n faza mobil. De exemplu, n funcie de grosimea filmelor, moleculele trebuie s traverseze n medie
o distan mai mare sau mai mic pentru a atinge suprafaa; n cazul coeficienilor de difuzie mai mici, ele vor
traversa mai ncet. Consecina ambilor factori este o vitez sczut de transfer de mas i o cretere a nlimii
talerului.

Efectele acestei relaii pot fi nelese prin imaginarea modului prin care aceti
factori influeneaz frecvena medie prin care moleculele de analit care ajung la
interfa sunt transferate n faza mobil. De exemplu, n funcie de grosimea
filmelor, moleculele trebuie s traverseze n medie o distan mai mare sau mai
mic pentru a atinge suprafaa; n cazul coeficienilor de difuzie mai mici, ele vor
traversa mai ncet. Consecina ambilor factori este o vitez sczut de transfer de
mas i o cretere a nlimii talerului.
Termenul de transfer de mas n faza mobil (CMu).

Dup cum arat ecuaia a patra din tabelul 1.3,

coeficientul de transfer din faza mobil CM este o
funcie complex, f(k') a factorilor de retenie k', fiind
proporional cu ptratul diametrului particulelor din
coloana mpachetat dp i invers proporional cu
coeficientul de difuzie din faza mobil, DM.

EFECTUL VITEZEI FAZEI MOBILE ASUPRA TERMENILOR ECUAIEI

VAN DEEMTER

n figura alturat este nfiat modul de

reprezentare a ecuaiei van Deemter n cazul unui
set de date experimentale. n acest experiment,
analitul eluat a fost reprezentat de acetatul de
benzil aflat ntr-o soluie de hexan, care conine
acetat de etil. Punctele situate pe curba de
deasupra reprezint valorile experimentale n timp
ce curba cu linie continu este reprezentarea
grafic a ecuaiei van Deemter.
Diagrama van Deemter pentru o coloan de
cromatografie lichid, mpachetat. Punctele de
pe curba superioar sunt date experimentale.
Contribuiile diverilor termeni de viteze sunt
artai pe curbele situate mai jos: A, efectul
datorat cilor multicanal de curgere; B/u,
difuzia longitudinal; Cu, transferul de mas
dintre cele dou faze.
Curbele de sub aceast reprezentare arat contribuia
efectului de curgere prin canale multiple, difuzia longitudinal i
efectele combinate ale transferului de mas.

METODE DE REDUCERE A MPRTIERII ZONEI CROMATOGRAFICE

Diametrul particulelor care compun coloana i

diametrul coloanei reprezint dou variabile
importante controlabile care afecteaz eficiena
unei coloane cromatografice. Efectul diametrului
particulelor
este
demonstrat
prin
datele
experimentale prezentate n figura alturat n
timp ce pentru a beneficia de avantajul datorat
diametrului coloanei, n ultimii ani au fost introduse
n practica cromatografic coloane din ce n ce mai
nguste.
n condiiile n care faza mobil este gazoas,
viteza de difuziune lateral poate fi redus
apreciabil prin scderea temperaturii i astfel a
coeficientului de difuzie DM. n consecin,
scderea nlimii talerului este dependent de
temperaturi joase. Acest efect este n general
nesemnificativ n cazul cromatografiei lichide din
cauza faptului c difuzia este lent, astfel c
termenul de difuzie longitudinal are un efect mic
asupra nlimii talerului.

La fazele staionare lichide, grosimea stratului de

lichid adsorbit poate fi minimalizat deoarece CS din
ecuaia 1.19 este proporional cu ptratul acestei
variabile, df (ecuaia a treia din tabelul 1.3).

OPTIMIZAREA PERFORMANELOR COLOANEI CROMATOGRAFICE

O coloan cromatografic este optimizat prin variaia experimental a

condiiilor, pn cnd componentele amestecului sunt separate n mod clar,
ntr-un timp minim. Optimizarea experimentelor are ca scop (1) reducerea
mprtierii zonei cromatografice ori (2) alterarea vitezelor de migrare ale
componentelor din amestecul de separat. Dup cum s-a artat, mprtierea
zonei este crescut prin aceleai variabile cinetice care conduc la creterea
nlimii talerelor coloanei cromatografice. Pe de alt parte, vitezele de
migrare, pot fi modificate prin schimbarea acelor variabile care afecteaz
factorii de retenie i selectivitate ai soluilor.

1. REZOLUIA COLOANEI
Rezoluia, RS a unei coloane
cromatografice
conduce
la
msurarea cantitativ a abilitii
sale n separarea a doi analii.
Semnificaia acestui termen este
ilustrat n figura alturat, care
prezint cromatogramele a dou
specii moleculare, A i B, pe trei
coloane ce posed rezoluii
diferite. Rezoluia unei coloane
este definit ca:

o rezoluie de 1,5 conduce la o

separare practic complet a
celor dou componente, n timp
ce o rezoluie de 0,75 nu. La o
rezoluie de 1, zona A conine
aproximativ 4% din specia B,
iar zona B conine o cantitate
similar din solutul A. La o
rezoluie de 1,5, suprapunerea
este de aproximativ 0,3%.
Rezoluia pentru o faz
staionar dat poate fi crescut
prin lungirea coloanei, astfel
crescnd numrul de talere.
Consecina
nefavorabil
la
adugarea
de
talere
o
reprezint creterea timpului
necesar
separrii
cromatografice.

Efectul factorilor de retenie i selectivitate asupra rezoluiei cromatografice

Este foarte util a se dezvolta o relaie matematic ntre rezoluia unei coloane i
factorii de retenie, kA i kB, a factorului de selectivitate , i numrul de talere, N,
care alctuiesc o coloan cromatografic n cazul a doi solui.
Considernd c cei doi solui, A i B au timpi de retenie apropiai unul de cellalt,
se poate aproxima c:
WA = WB W

ecuaia 1.20 poate fi

scris sub forma:

Ecuaia 1.17 permite

exprimarea lui W n termeni de
(tR)B i N, care pot astfel
substituii n ecuaia anterioar,
rezultnd:

Substituind ecuaia 1.8 i rearanjnd-o, se obine exprimarea lui RS n termeni de factori de

retenie pentru A i B, dup cum urmeaz:

n continuare prin eliminarea kA din aceast ecuaie prin

substituia ecuaiei 1.10, rezult:

Adesea este necesar a se calcula numrul de talere teoretice necesare pentru a

atinge o rezoluie dorit. O exprimare a acestei cantiti este obinut prin
rearanjarea ecuaiei 1.21 ceea ce conduce la:

Formele simplificate ale ecuaiilor 1.21 i 1.22 sunt uneori ntlnite n

condiiile n care acestea se aplic unor perechi de solui ale cror constante
de distribuie sunt aproape similare

unde k' reprezint media dintre kA i kB.

Efectul rezoluiei asupra timpului de retenie

nainte de a considera n detaliu semnificaia ecuaiilor derivate mai sus, este util s
se dezvolte o ecuaie care s prezinte caracteristicile de performan a unei coloane,
adic timpul necesar pentru o complet separare a solutului A de solutul B.
n mod clar, ceea ce este dorit n cromatografie este o rezoluie posibil nalt n cel
mai scurt timp posibil. Din nefericire, aceste dou proprieti nu pot fi maximalizate n
aceleai condiii, motiv pentru care totdeauna trebuie gsit un compromis.
Timpul pentru desvrirea separrii este determnat de viteza vB
a solutului care se mic mai lent este dat de ecuaia 2.
Aceasta este:
Combinnd aceast expresie cu ecuaiile
1.6 i 1.12, rezult, dup rearanjare:

unde (tR)B este timpul necesar pentru a aduce peakul B la captul coloanei n condiiile n care viteza
fazei mobile este u.
n cazul n care ecuaia de mai sus este
combinat cu ecuaia 1.22 i rearanjnd termenii,
rezult:

Variabilele care afecteaz performanele unei coloane cromatografice

Ecuaiile alturate sunt semnificative deoarece
servesc drept ghid n alegerea condiiilor care
sunt potrivite pentru a fi urmate de utilizatorul
cromatografiei pentru a atinge ntr-un timp
determinat scopul propus cu rezultate clare.
n cercetarea condiiilor optime pentru o separare dorit trebuie avut n vedere c
parametrii fundamentali, , k' i N (sau H) pot fi ajustai mai mult sau mai puin
independent. Astfel, parametrii i k' pot fi variai mai simplu prin varierea temperaturii
sau a compoziiei fazei mobile. Utilizarea unui alt tip de mpachetare a coloanei reprezint
o modalitate mai puin convenabil. Dup cum s-a artat, este posibil a se modifica N prin
schimbarea lungimii coloanei ori de a modifica H prin modificarea vitezei de curgere a
fazei mobile, a mrimii dimensiunilor particulelor de mpachetare, a vscozitii fazei
mobile (prin modificarea DM sau DS), i a grosimii filmului de lichid adsorbit coninut n
faza staionar .
Variaia n numrul de talere, N
O cale evident de cretere a rezoluiei o reprezint creterea numrului de talere din
coloan (ecuaia 1.21). Totui urmnd aceast cale, metoda este mai puin economic din
punct de vedere al timpului necesar pentru a finaliza separarea n afara cazului n care
creterea n N este realizat mai degrab prin reducerea n H dect prin lungirea coloanei.

Variaia n nlimea talerului, H

O mbuntire semnificativ a rezoluiei poate fi realizat fr nici un cost de timp suplimentar
dac nlimea talerului se reduce.
Se poate nota c scderea mrimii particulelor de mpachetare a coloanei conduce la o
mbuntire marcant a lui H.
Pentru faze mobile lichide, unde B/u este neglijabil, reducerea nlimii talerului poate fi de
asemenea realizat prin reducerea vscozitii solventului, mrindu-se astfel coeficientul fazei
mobile.

Variaia n factorul de retenie

Adesea, o separare poate fi mbuntit semnificativ prin manipularea factorului de retenie,

kB. Creterea lui kB crete n general rezoluia (crescnd ns timpul de eluie). Pentru a determina
domeniul optim al valorilor pentru kB, este necesar a scrie ecuaiile 1.21 i
n forma:

unde Q i Q' conin restul de termeni ai celor dou ecuaii.

Figura alturat este o

reprezentare grafic RS/Q ori
(tR)B/Q' n funcie de kB,
considernd c Q i Q' rmn
aproximativ constante. Se
vede clar c valorile lui kB
mai mari de 10 nu trebuie
alese deoarece ele conduc la
o mic cretere n rezoluie
dar cu o cretere marcant a
timpului necesar separrii.
Valoarea minim a timpului
de eluie se manifest la o
valoare a kB de aproximativ
2. Astfel, n multe cazuri,
valoarea optim a kB se
stabilete lund n calcul att
rezoluia ct i timpul necesar
separrii,
adic
ntr-un
domeniu cuprins ntre 1 pn
la 5.

Efectul factorului de retenie kB asupra rezoluiei

RS i a timpului de eluie (tR)B. Se consider c Q
i Q rmn constante la variaia factorului kB.

n mod uzual, cea mai simpl cale de cretere a rezoluiei de separare o reprezint
optimizarea lui k'. Pentru faze mobile gazoase, k' poate deseori crescut prin creterea
temperaturii.
Pentru fazele mobile lichide, schimbarea compoziiei solventului permite deseori
manipularea lui k' obinndu-se astfel separri superioare. Efectele dramatice produse
prin schimbarea solventului sunt ilustrate prin exemplul prezentat n figura de mai jos.

Efectul
variaiei
solventului
asupra separrii cromatografice.
Analii: (1) 9,10-antraquinon; (2)
2-metil-9,10-antraquinon; (3) 2etil-9,10-antraquinon; (4) 1,4dimetil-9,10-antraquinon; (5) 2t-butil-9,10-antraquinon.
Se observ c o mic modificare a rapoartelor metanol/ap
conduce de la separri cromatografice nesatisfctoare (a i b) la
separri unde fiecare peak al oricrui component este bine separat
(c i d). n multe scopuri, Cromatograma artat n (c) pare a fi cea
mai bun dup cum arat raportul dintre rezoluia adecvat n
intervalul de timp.

Variaia n factorul de selectivitate

n condiiile n care atinge unitatea, optimizarea lui k' i creterea lui N nu sunt suficiente pentru a produce o separare
satisfctoare a doi solui, ntr-un timp rezonabil. Sub aceste circumstane, trebuie identificat o posibilitate de cretere a
factorului de selectivitate , cu meninerea lui k' ntr-un domeniu optim de 1-10. n acest context sunt posibile o serie de
opiuni de lucru. Astfel, scderea oportunitii n perspectiva i avantajul (comoditii) aceste opiuni includ: (1) schimbarea
compoziiei fazei mobile, inclusiv schimbarea pH-ului; (2) schimbarea temperaturii coloanei; (3) schimbarea
compoziiei fazei staionare; (4) utilizarea unor efecte specifice, chimice.
Un exemplu de utilizare a opiunii (1) a fost raportat n cazul separrii anisolului (C6H5OCH3), de benzen. Cu o faz
mobil coninnd un amestec metanol:ap 50%, k' pentru cei doi solui a fost raportat de 4,5 i respectiv 4,7, n timp ce a
fost egal cu numai 1,04. nlocuirea fazei apoase cu una care ca coninut 37% tetrahidrofuran a condus la k' de 3,9 i 4,7 i la o
valoare de 1,20. Dac suprapunerea celor dou peak-uri a fost semnificativ n primul caz, n cel de al doilea caz
suprapunerea a fost neglijabil.
Pentru separri care implic acizi sau baze ionizabile, modificarea pH-ului fazei mobile conduce deseori la
manipularea valorilor fr a schimbare major n k' ceea ce conduce la separri mai eficiente.
O metod mai puin convenabil dar deseori foarte eficient n creterea simultan cu o meninere aproape
constant a valorilor lui k' n domeniul optim este cea de alterare a compoziiei chimice a fazei staionare. Pentru
aceasta, cele mai multe laboratoare care realizeaz separri cromatografice frecvente posed mai multe coloane care pot fi
interschimbabile cu un minim de efort.
O cretere a temperaturii genereaz deseori o cretere n k' dar aceast operaiune are un efect mic asupra valorilor
lui n cazul cromatografiei lichid-lichid ori cromatografiei lichid-solid. n opoziie, n cazul cromatografiei de schimb
ionic, efectul temperaturii poate fi suficient n cazul explorrii acestei opiuni, nainte de schimbarea mpachetrii coloanei.
n fine, o alt metod de cretere a rezoluiei este ncorporarea n faza staionar a unor specii care complexeaz sau
interacioneaz cu unul sau mai muli componeni aflai n proba de separat. Un exemplu de utilizare a acestei opiuni o
reprezint impregnarea cu sruri de argint a suportului adsorbent care conduce la o mbuntire a separrii olefinelor ca o
consecin a formrii unor complexe ntre ionii de argint i compuii organici nesaturai.

Trena cromatografic
Formarea trenelor cromatografice reprezint o problem real i inevitabil la majoritatea separrilor n
cromatografia lichid. Cercettorii din domeniu au depus eforturi n dezvoltarea unor noi materiale (suporturi
cromatografice) i dei acestea reduc formarea trenelor, rareori s-a putut elimina acest fenomen. Procesul de
formare a trenei cromatografice poate cauza att probleme cantitative ct i calitative n procedurile de
cromatografie lichid, fiind important o monitorizare a formrii lor astfel nct s nu se compromit rezultatul
analizei.
Analiznd n detaliu o cromatogram se poate observa c aproape toate peak-urile cromatografice au o
oarecare tren mai mult sau mai puin lung. Dei multe dintre coloanele de cromatografie lichid actuale sunt
mai puin problematice dect predecesoarele lor, totui aceasta problem nu a fost nc eliminat.
Se consider c un peak are trena sau ca este asimetric atunci cnd forma sa deviaz de la cea ideala,
Gaussian. A doua jumtate eluat a peak-ului este mai larg dect prima, iar limea sa tinde sa se expandeze
spre baza. Dei pot aprea cozi ale peak-urilor si in jumtatea frontala a acestora, acestea sunt totui rare in
comparaie cu trenele. Deoarece trenele peak-urilor pot influenta calitatea separrii este bine ca panta trenei sa
fie cuantificata. Exista doua mecanisme de msurare universale a peak-urilor. Lucrtorii din industria farmaceutica
folosesc factorul de trenare, USP Tf (Unided State Pharmacopeea Tail factor), conform formulei 1.26.

unde a si b reprezint limea jumtii frontale si respectiv jumtii

posterioare msurate la 5% din nlimea peak-ului (figura alturat).
Majoritatea celorlali practicieni folosesc factorul de asimetrie (As).

unde a si b sunt msurate la 10% din nlimea peak-ului cromatografic din figura alturat.

Pentru valori mai mici de 2, As i USP Tf sunt aproximativ aceleai, precum se poate
observa i in tabelul de mai jos. ce reprezint msurtorile factorului de asimetrie i ale
factorului de trenare USP pentru acelai peak, n cazul figurii de mai jos.

Msurtorile factorului de asimetrie (As)

i ale factorului de trenare USP (Tf) pentru
acelai peak.
Valoarea msurat
Peak-ul din figura alturat
As

Tf

1,0

1,0

1,0

1,2

1,3

1,2

1,5

1,7

1,4

2,0

2,5

1,9

3,0

3,8

2,9

4,0

5,5

3,5

Exemple de peak-uri asimetrice i

factorul de asimetrie calculat pentru
fiecare.

n condiiile n care coloana cromatografic este nou, majoritatea

productorilor prezint criterii de trenare (factorul As) cuprinse ntre
valorile 0,9 (puin frontal) i 1,2 (puin trenat). Majoritatea utilizatorilor
care folosesc probe reale ncearc s obin un factor de asimetrie, nu
mai mare de 1,5- 2. n general, cnd As este mai mare dect 2, exist
probleme de separare, i se cerceteaz cauza acestora.

Figura alturat ne furnizeaz o serie de indicii asupra

potenialelor probleme create de trena peak-urilor, prin comparaia
unui peak ce are As = 1 cu un altul ce posed As = 4. Astfel,
comparnd aria peak-urilor, se observ o diferen elocvent; dei ea
este aceeai nlimea peak-ului cu As = 4 este de trei ori mai mic
comparativ cu nlimea primului peak. n condiiile analizelor de urme,
nlimea peak-ului devine un factor critic n determinarea limitei
minime de cuantificare, iar trenarea peak-ului conduce la rezultate clar
inferioare.
Formarea trenelor este de asemenea problematic n cazul in
care peak-urile minore se ascund n cele majore. Acest fenomen este
nedorit n condiiile analizei unor metabolii ori n identificarea unor
impuriti.
Modelele de cromatografe lichide folosite pentru analizele de
rutin, trebuie de obicei s asigure o bun rezoluie a liniei de baz a
tuturor peak-urilor iar timpul de rulare s fie ct mai mic posibil. Figura
alturat arat c rezoluia liniei de baza a peak-urilor cu tren
necesit un timp mai lung de rulare comparativ cu peak-urile ce nu au
tren sau care au o tren scurt. Aadar, peak-urile cu tren nu doar
reduc calitatea cromatogramei, dar ele reduc de asemenea abilitatea
de a cuantifica componente prezente n prob.
Cauzele apariiei trenei cromatografice se datoreaz mai ales
faptului existenei mai multor mecanisme de separare, unul dintre
acestea fiind supra-implicat. O serie dintre practicieni au tendina de a
considera separrile n faz invers, pe coloane C18, de exemplu
drept procese pure de retenie hidrofob. Aceast consideraie poate fi
adevrat dac faza staionar ar fi constituit numai din grupri C18.
totui, aproximativ jumtate din suprafaa de silice este nelegat ceea
ce conduce la permisiunea de expunere a gruprilor silanol (SiOH)
care pot interaciona cu proba.

Particulele de silice care formeaz suportul solid sunt realizate din polimer de siliciu
i oxigen. Ca i carbonul, siliciul este tetravalent, deci structura intern a lui cuprinde patru
atomi de oxigen ataai la fiecare atom de siliciu n structura polimerului tridimensional. La
suprafa, polimerul se termin cu grupri de silanol Figura de mai jos prezint diferitele
configuraii posibile ale gruprilor silanolice.

Interacii posibile la suprafaa suportului de silice

Practicienii descriu n mod curent suprafaa ca posednd grupri libere silanolice (a)
dar sunt de altfel prezeni atomi de siliciu cu dou grupri hidroxil n configuraie geminal
(b). Dac gruprile silanolice sunt poziionate una, alturi de alta, se pot realiza legturi de
hidrogen cu o grupare adiacent (c). Gruprile libere de silanol sunt mai acide dect
gruprile geminale ori asociate ele interacionnd mai puternic cu solui bazici avnd ca
rezultat formarea unei trene deseori asociat cu separarea unor solui bazici. n alte cazuri,
urme de metale (deseori fier ori aluminiu) pot fi prezente in matrixul de silicagel (d). Ionii
metalici pot aciona ca situsuri schimbtoare de ioni sau, cnd gruprile silanol libere sunt
adiacente, ei pot atrage electroni, care fac ca silanolul sa fie i mai acid (e).

In trecut, coloanele mpachetate cu silice tip A conineau toate aceste forme de silanol
prezentate n figur, totui, n ultimii ani s-a pus la punct tehnologii de obinere de suporturi de
silice de puritate nalt (silicea de tip B), ce conine un numr redus de grupri silanol libere la
suprafa i sunt lipsite de urme de metale, fiind astfel mai puin acide. Astfel de coloane ce conin
silice de tip B au o tendin mult mai mic de a genera peak-uri cu tren.
Reducerea formrii trenelor n coloane de tip.A, nseamn de obicei modificarea fazei mobile
pentru a include componente ce concur la suprimarea trenei. Adugarea de trietilamin n faza
mobil reprezint o metod curent n reducerea formrii trenelor cromatografice. Folosit la o
concentraie de 20mM sau mai mare n faza mobil, trietilamina poate reduce semnificativ trenarea
picurilor n coloane de tip A. n cazul utilizrii de silice de tip B trenarea peak-urilor reprezint o
problem mult mai rar. n condiiile utilizrii exclusiv de coloane de tip B, rareori se adaug
trietilamin la faza mobil. Ca regul general, pH-ul sczut al fazei mobile (pH < 3) acioneaz de
asemenea ca un supresor al ionizrii silanolului, care mai departe conduce la reducerea formrii
trenelor cromatografice.

Problema general a eluiei

Figura
alturat
ilustreaz
o
cromatogram ipotetic a unui amestec de
ase componeni separai teoretic n trei
perechi de componente care au constante de
distribuie i factori de retenie net diferii. n
cromatograma (a), condiiile au fost ajustate
astfel nct factorii de retenie pentru
componentele 1 i 2 (k'1 i k'2 ) sunt n
domeniul optim, de cuprins ntre 2 i 5.
Factorii corespunztori pentru ai celorlalte
componente sunt, totui, departe de valorile
optime. Astfel, pentru peak-urile 5 i 6 care
apar numai dup un interval de timp extrem
de mare i de asemenea care sunt difuzate,
este dificil de a fi identificate cu certitudine.
Dup cum se observ n cromatograma (b), schimbarea condiiilor pentru optimizarea
separrii componentelor 5 i 6, ngrmdesc peak-urile primelor patru componente n zone
cu o rezoluie nesatisfctoare. Totui, n acest caz timpul de eluie este ideal.
n cromatograma (c) este prezentat un al treilea set de condiii n care valorile lui k'
pentru componentele 3 i 4 au valori optime. Separarea celorlalte dou perechi, din nou, nu
este complet satisfctoare.

Fenomenul ilustrat n figur este ntlnit

aproape permanent, din acest motiv s-a denumit
problema general a eluiei. O soluie comun n
rezolvarea acestei probleme este cea de schimbare a
valorilor ale k' dup cum a fost prezentat mai nainte.

Aceste modificri pot fi realizate ntr-o manier n trepte ori continu. Astfel, pentru
amestecul prezentat n figur, condiiile de la nceput pot fi cele care conduc la
cromatograma (a). Imediat dup eluia componentelor 1 i 2, este necesar schimbarea
condiiilor astfel nct s se ajung la cele optime pentru separarea compuilor 3 i 4 (dup
cum se observ n cromatograma c). Odat cu apariia peak-urilor acestor compui, eluia
poate fi realizat n condiiile utilizate n cazul cromatogramei (b). Deseori, astfel de
proceduri conduc la rezolvarea satisfctoare a peak-urilor tuturor componenilor din
amestec ntr-un interval minim de timp.
n cazul cromatografiei lichide, variaiile n k' sunt produse prin variaia n compoziie a
fazei mobile n timpul eluiei (eluie n gradient sau programarea solventului).
Pentru gaz cromatografie, creterea temperaturii (programarea temperaturii) servete
la atingerea condiiilor optime necesare separrii.

relaii de legtur (1)

relaii de legtur (2)

APLICAIILE CROMATOGRAFIEI

Cromatografia a reprezentat i reprezint o prim metod de separare intim

legat de specii moleculare nrudite chimic, ce poate fi utilizat n identificri calitative
i determinri cantitative ale speciilor separate. n continuare vor fi prezentate
caracteristicile generale ale cromatografiei, ca metod de realizare a unei analize.
Analize calitative
O cromatogram furnizeaz numai o singur parte de informaie cantitativ despre
fiecare specie din prob, adic timpul su de retenie ori poziia pe faza staionar dup o
anumit perioad de eluie. n plus, datele pot de asemenea s fie derivate din cromatograme
proces implicnd faze mobile i staionare diferite ori diverse temperaturi de eluie. Pn
acum cantitatea de informaii oferite de prin cromatografie sunt mici comparativ cu cea
obinut prin tehnici precum IR, RMN sau spectrometria de mas. n plus, datele spectrale,
lungime de und sau de frecven pot fi mult mai nalt specifice care pot reprezenta un
omolog al cromatografiei (tR).Cele mai sus prezentate nu trebuiesc interpretate n sensul c
metodele cromatografice i pierd din importan n cazul aplicaiilor calitative.
ntr-adevr, cromatografia este o metod deseori utilizat n recunoaterea prezenei sau absenei unor componente
din amestecuri care conin un numr limitat de specii posibile a cror identitate este cunoscut. De exemplu, 30 sau mai muli
aminoacizi dintr-un hidrolizat proteic pot fi detectate cu un mare grad de certitudine prin metoda cromatografic. Totui pentru
a confirma identitatea este necesar o investigaie chimic sau spectroscopic a compuilor izolai. Se poate nota c totui, o
identificare pozitiv spectroscopic a speciei prezente ntr-un complex de compui ar fi imposibil fr o separare
cromatografic anterioar. Astfel, cromatografia este deseori o metod precursoare n analizele spectroscopice calitative.
Este important a se nota ns c o cromatogram nu poate conduce la o identificare pozitiv a speciilor prezente n
probe, dar poate da indicaii sigure asupra absenei unei serii de compui din respectivul analit. Astfel dac proba nu produce
un peak cu un timp de retenie asemntor unui standard analizat n aceleai condiii se poate spune c acel compus luat n
analiz este absent (sau este prezent la concentraii sub limita de detecie a metodei).

Analize cantitative

Cromatografia i datoreaz n principal dezvoltarea din

ultimii ani, n parte, vitezei sale, simplicitii i preului su
relativ sczut, aplicabilitii aproape generalizate ca o metod
de separare. Nu se poate totui afirma c ea va deveni
general dect n condiiile n care ar fi utilizat la obinerea
de informaii utile cantitative asupra speciilor separate. Este
important totui a se discuta despre o serie de aspecte
cantitative care se aplic la toate tipurile de cromatografie.
Cromatografia cantitativ pe coloan se bazeaz pe
compararea nlimii sau ariei peak-ului de analit i prin
compararea acestuia cu unul sau mai multe standarde. n
cazul cromatografiei planare, aria acoperit de speciile
separate servete ca i un parametru analitic. Dac condiiile
sunt corect controlate, aceti parametrii vor varia linear cu
concentraia.

Analize bazate pe nlimea peak-ului

nlimea peak-ului cromatografic este obinut prin msurarea liniei de

baz pe de o parte i a perpendicularei peak-ului, cobort prin vrf. Acest tip
de msurare se realizeaz,ntr-un timp rezonabil i cu o precizie de msurare
bun. Este important a se nota c,totui nlimile peak-urilor sunt invers
proporionale cu limile lor. Astfel, acurateea rezultatelor obinute din
msurarea nlimii este obinut numai dac nu apar variaii n condiiile de
eluie a coloanei, care s nu altereze limea peak-ului n perioada de eluie a
probei i a standardelor. Variabilele care trebuiesc urmrite cu grij sunt
temperatura coloanei, viteza de curgere a eluentului prin coloan i viteza de
ncrcare (injecie) a probei. n plus, trebuie avut grij s se evite a
suprancrcarea coloanei. Efectul injeciei probei este n mod particular critic
n cazul primelor peak-uri ale cromatogramei. Injecia neadecvat a probei
conduce la erorile relative de 5% pn la 10%.

Analize bazate pe aria peak-ului

Ariile peak-urilor sunt independente de efectele de mprtiere date de

variabilele menionate mai sus. Din acest punct de vedere, totui, valorile
ariilor sunt variabile analitice mult mai satisfctoare comparativ cu nlimile
peak-urilor. Pe de alt parte, nlimile peak-urilor sunt mult mai uor de
msurat n cazul peak-urilor nguste.
Majoritatea instrumentelor moderne sunt echipate cu integratoare
electronice digitale care permit estimarea cu precizie a ariei peak-ului
cromatografic. Dac asemenea instrumente nu sunt disponibile, se poate
apela la metoda manual, metod simpl care permite o bun estimare a
peak-urilor simetrice. Aceasta implic calcularea ariei prin nmulirea nlimii
peak-ului cu valoarea limii determinat la jumtate din nlimea lui. Alte
metode implic utilizarea unui planimetru sau decuparea peak-ului
cromatografic i cntrirea lui, determinnd astfel greutatea lui n relaie cu o
arie cunoscut de hrtie de nregistrare. n general, tehnicile de integrare
manual conduc la erori de 2-5%, pe cnd integrrile digitale sunt de un ordin
de magnitudine mai precise.

Calibrri i standarde

Cea mai sigur metod de analiz cromatografic cantitativ implic prepararea unei
serii de standarde prin diluia unei soluii stoc ce posed o compoziie aproximativ
asemntoare cu cea a probei necunoscute. Cromatogramele pentru standarde obinute
astfel sunt apoi reprezentate n funcie de concentraia lor. Curba rezultat care obligatoriu
trece prin origine este utilizat la determinrile de concentraie a compusului care se
dozeaz. n mod frecvent se recurge la restandardizare pentru a obine rezultate cu o mai
mare acuratee.
Cea mai important surs de erori n analize efectuate prin metoda mai sus
menionat este dat de incertitudinea legat de volumul probei; uneori, viteza de injecie,
reprezint de asemenea un factor de eroare. n mod curent probele sunt mici (de
aproximativ 1 l), iar incertitudinile legate de injectarea n condiii reproductive a unui volum
cu o sering de aceleai mrime poate conduce la scderea cu procente semnificative a
erorilor. Aceast situaie este des-ntlnit n cromatografia gaz-lichid, unde proba trebuie
sa fie injectat ntr-un dispozitiv special nclzit, unde fenomenul de evaporare care apare
la nivelul acului seringii poate fi deosebit de crescut, conducnd astfel la variaii mari ale
volumului injectat. Erorile volumului de prob pot fi reduse, cu probabil 1-2% din medie, prin
utilizarea unei valve rotative.

Metoda cu standard intern

Precizia cea mai mare n cromatografia cantitativ este obinut prin utilizarea
standardelor interne deoarece incertitudinile introduse prin injectarea probei sunt evitate.
n aceast procedur, se msoar cu atenie o substan, denumit standard intern,
care este introdus n fiecare standard sau prob, raportul dintre ariile (ori nlimea)
peak-urilor analitului i a standardului intern servind drept parametru analitic. Pentru ca
aceast metod sa aib succes, este ca peak-ul standardului intern s fie bine separat
de peak-urile celorlalte componente din prob (Rs > 1,25); peak-ul standard trebuie, pe
de alt parte, sa apar n apropierea peak-ului analitului. Cu un standard intern adecvat,
se poate crete precizia fa de alte metode, utilizate frecvent.
Metoda de normalizare a ariei
O alt abordare care conduce la scderea incertitudinilor legate de injectarea probei
este metoda de normalizare a ariei. n acest caz, este necesar eluia complet a tuturor
componentelor probei. n metoda de normalizare, ariile tuturor peak-urilor sunt calculate,
dup corecia tuturor acestor arii cu diferenele dintre rspunsul detectorului la tipurile
diferite de compui, n timp de concentraia analitului este determinat din raportul
acestor arii la aria total a tuturor peak-urilor.
Din nefericire, adesea nu este practic a aranja condiiile n aa fel ca toi compuii
din amestec s fie eluai din coloan ntr-o perioad de timp rezonabil, motiv pentru
care metoda de normalizare are aplicaii limitate.

CROMATOGRAFIA DE
PARTIIE
Dintre toate tipurile de procedee cromatografice lichide, cromatografia de partiie este cea mai
utilizat tehnic de separare. Dac n trecut cele mai multe aplicaii se adresau compuilor neionici,
celor polari cu mas molecular moderat (de obicei mai mic de 3000) astzi dezvoltarea unor
metode (procedee de derivatizare ori de tehnicile bazate pe perechi de ioni) au extins separrile
prin partiie i la compui ionici.
Cromatografia de partiie poate fi subdivizat n cromatografie lichid-lichid i cromatografie cu
faz legat. Diferena ntre cele dou tehnici constau n metoda prin care faza staionar intr n
interacie cu particulele suport, mpachetate. n cromatografia lichid-lichid, faza lichid staionar
este reinut pe suprafaa particulelor mpachetate prin adsorbie fizic. n schimb, n cazul
cromatografiei de faz legat, faza staionar este legat chimic la suprafaa particulelor de suport.
Primele tipuri de cromatografie de partiie au fost exclusiv de tip lichid-lichid; acum totui metoda cu
faz legat a devenit predominant datorit multor dezavantaje ale sistemelor lichid-lichid. Unul
dintre aceste dezavantaje l reprezint pierderea fazei staionare prin disoluia ei faza mobil, care
astfel necesit reacoperirea periodic a particulelor suport. n plus, problemele de solubilitate ale
fazei staionare interzic utilizarea fazei lichide mpachetate n cazul eluiei n gradient.

Cromatografia de partiie cu
faz legat
Suporturile pentru majoritatea tehnicilor de cromatografie de
partiie cu faz legat sunt preparate din silice rigid ori au o
compoziie pe baz de silice. Aceste solide sunt formate din particule
uniforme, poroase, cu consisten mecanic de gel, cu diametru de 3,
5, ori 10 m. Suprafaa acestora este format din silice total
hidrolizat (proces realizat prin fierberea silicei n HCl, 0,1 M timp de
una-dou zile, proces prin care rezult grupri silanol, chimic
reactive, de forma:

Si

O
Si

OH

OH

OH

OH

Si

Si

Structura suprafeei de silice.

n mod caracteristic, suprafeele de silice activat, conin aproximativ 8

moli/m2 de grupri hidroxilice. O structur mult utilizat n cromatografia cu
faz legat o reprezint siloxanii, compui rezultai prin reacia dintre suprafaa
hidroxilat cu un organoclorosilan, dup reacia:
Modalitatea de sintez a unui siloxan;
R reprezint o grupare alchil ori o
grupare alchil-substituit.
Din cauza efectelor sterice suprafaa acoperit prin silanizare este
limitat la cel mult 4 moli/m2 dup cum se observ n figura de mai jos.

Structura tridimensional a unui derivat

siloxanic.

Gruprile Si-OH nereacionate conduc din pcate la o polarizare nedorit a

suprafeei, care are ca efect apariia trenei peak-ului cromatografic, mai ales n cazul
soluilor bazici. Scderea acestui efect se realizeaz prin dezactivare cu clortrimetilsilan,
care, avnd o mas molecular mai mic, se poate lega la gruprile libere hidroxilice ale
silanolului.

TIPURI DE SUPORTURI UTILIZATE N CROMATOGRAFIA CU FAZ LEGAT

n funcie de polaritatea relativ a fazelor mobil i staionar, se pot distinge dou
tipuri de cromatografii cu faz legat. Primele lucrri de cromatografie lichid s-au bazat
pe faze staionare puternic polare precum apa ori trietilenglicolul, legate de particule de
silice ori de alumin; n continuare, un solvent relativ nepolar precum hexanul ori isopropil eterul, servesc apoi drept faz mobil. Fiind raportat prima, aceast tehnic
cromatografic de partiie a fost denumit cromatografie cu faz normal. n
cromatografia cu faz invers, faza staionar este nepolar, deseori o hidrocarbur, n
timp ce faza mobil este relativ polar (ap, metanol, acetonitril, etc.).
Relaiile dintre polaritate i timpii de
eluie n cazul cromatografiei cu faz
normal (a, b) i cea cu faz invers (c,
d) n cazul a trei componeni. a)
polaritate sczut a fazei mobile; b)
polaritate medie fazei mobile; c)
polaritate nalt a fazei mobile; d)
polaritate medie fazei mobile.
n cromatografia cu faz normal, componentul cel mai puin polar este eluat
primul, deoarece, n sens relativ, este cel mai solubil n faza mobil; creterea
polaritii fazei mobile va avea ca efect scderea timpului de eluie. n opoziie, n
metoda cu faz invers, componentul cel mai polar apare primul, iar creterea
polaritii fazei mobile crete timpul de eluie. Aceste relaii sunt ilustrate n de mai
sus.

Suporturile cromatografice cu faz

legat sunt clasificate drept cu faz
invers dac structura de suprafa a
suportului are un caracter nepolar, i
drept cu faz normal n condiiile n
care suportul conine grupri funcionale
polare. n cromatografia de nalt
presiune cel puin trei sferturi din
experimente se realizeaz pe coloane
mpachetate cu faz invers.
Structura gruprilor organice silil
ale fazei staionare difer prin mrime,
rigiditate planaritate i grad de
nesaturare dup cum se observ n
figura alturat.

Structura chimic a gruprilor organice

silil prezente n structura fazelor
staionare, utilizate n cromatografia
planar cu faz legat. Simbolurile sunt
explicitate mai jos.

Acestea includ trimetilsilil (C1), n-octildimetilsilil (C8), n-octadecildimethilsilil

(C18), 2-ciclohexiletildimetilsilil (CHE), 2-(3-ciclohexenl)etildimetilsilil (CHNE),
fenildimetilsilil (Ph), 2-feniletildimetilsilil (PE), 2-(2-naftil)etildimetilsilil (NE) i 2-(3pirenil)etildimetilsilil (PYE). Cele mai comune grupri radicalice care mbrac
suportul de siloxan este catena C8 (n-octil) ori catena C18 (n-octildecil).

DEVELOPAREA N CROMATOGRAFIA DE PARTIIE

Procesul de eluie a componentelor probei de pe suportul

cromatografic de ctre faza mobil (solvent) este denumit developare.
Aceast metod tinde a fi mai complex n cromatografia lichid dect n
cea gazoas deoarece n faza mobil lichid componentele
interacioneaz att cu faza staionar, ct i cu cea mobil, n contrast
cu gaz cromatografia unde faza mobil se comport ca i un gaz ideal,
necontribuind n procesul de separare; ea servete numai transportului
componentelor probei prin faza staionar. n acest fel, n gazcromatografie, separrile nu sunt semnificativ afectate de ctre faza
mobil, indiferent dac aceasta este reprezentat de heliu, azot, ori
hidrogen. n contrast evident cu fenomenul ntlnit n cazul gazcromatografiei, succesul unei separri prin partiie lichid este adesea
profund dependent de compoziia fazei mobile.

SELECIA COLOANEI N SEPARRILE PRIN CROMATOGRAFIE DE PARTIIE

Succesul cromatografiei cu faz mobil interactiv, necesit o balan optim a forelor
intermoleculare care implic cei trei participani activi n procesul de separare: faza mobil, faza
staionar i solutul. Aceste fore intermoleculare sunt descrise calitativ n termeni de polaritate
relativ a fiecruia dintre cei trei reactani. Polaritile diverselor grupe funcionale cresc n
ordinea: hidrocarburi < eteri < esteri < cetone < aldehide < amide < amine < alcooli. Apa este
cel mai polar compus dintre toi compuii care conin gruprile funcionale prezentate mai
sus.
Deseori, n alegerea unei coloane pentru separri cromatografice de partiie, polaritatea fazei
staionare este aproximativ aleas, n concordan cu cea a analitului, n timp ce faza mobil
aleas pentru eluie prezint o diferen considerabil din punct de vedere al polaritii. Aceast
abordare este n general mai de succes dect cea n care polaritile solutului i a fazei mobile sunt
alese diferit de faza staionar. n acest caz, faza staionar deseori nu poate competiiona eficient
pentru componentele probei, timpii de retenie devenind prea scuri n aplicaiile practice. O alt
extrem o reprezint situaia n care polaritile solutului i a fazei staionare sunt prea similare i
total diferite de cea a fazei mobile. n aceast situaie timpii de eluie devin deosebit de mari.
Se poate concluziona c polaritile solutului, fazei mobile i fazei staionare trebuiesc
cunoscute i selectate cu grij pentru a conduce la o separare de partiie eficient, ntr-un interval
de timp rezonabil. Din nefericire, teoriile interaciilor dintre faza mobil i cea staionar pentru
oricare component sunt i imperfecte motiv pentru care acestea pot doar ghida analistul n alegerea
fazei staionare pentru un tip general, dup care, este necesar a se realiza o serie de experimente
preliminarii, de identificare a fazei optime pn la obinerea unei separri satisfctoare. Dac se
constat c rezoluia tuturor componentelor ale amestecului este imposibil, se alege un alt tip de
coloan.

Selecia fazei mobile n cromatografia de partiie

n prezentarea teoretic au fost descrise trei metode de cretere a rezoluiei de
separare n cromatografia pe coloan, fiecare fiind bazat pe varierea unuia dintre cei
trei parametrii (N, k', i ) prezentai n ecuaia 1.21. n cromatografia lichid, factorul
de retenie, k', este experimental, cel mai uor de manipulat dintre toi aceti trei
factori deoarece exist o dependen puternic ntre a acestei constante funcie de
compoziia fazei mobile. Performanele optime ale factorului de retenie, k', trebuie s
fie cuprinse ntr-un domeniu ideal cuprins ntre 2 i 5, totui, pentru amestecuri
complexe acest domeniu este extins la 0,5 - 20 n scopul de a furniza timp suficient
oricrui component din amestec s fie eluat.
Uneori, ajustarea lui k' singur, nu este suficient pentru a produce o separare
clar a peak-urilor, fr suprapunere; n acest caz trebuie s se recurg la variaia
factorilor de selectivitate . n acest caz modul cel mai simplu de modificare a
factorului de selectivitate l reprezint alterarea cu grij a compoziiei fazei mobile,
pentru a pstra factorul de retenie, k' ntr-un domeniu rezonabil. Un alt mod alternativ
de schimbare a factorului de selectivitate l reprezint alegerea unui suport
cromatografic diferit.

EFECTUL TRIEI SOLVENTULUI ASUPRA FACTORILOR DE RETENIE

Solvenii care interacioneaz puternic cu soluii sunt deseori numii solveni

tari ori solveni polari. n scopul descrierii cantitative a polaritii solvenilor au
fost introdui o serie de indeci.
Dintre acetia, cel mai utilizat index n cromatografia de partiie l reprezint
P', indexul de polaritate, introdus de ctre Snyder n 1978. Parametrul P' se
bazeaz pe msurtori de solubilitate a substanei de interes n trei solveni:
dioxan (un dipol proton acceptor slab), nitrometan (un dipol proton acceptor tare)
i alcool etilic (un dipol proton donor foarte tare). Indexul de polaritate este o
msur numeric a polaritii relative a unui numr divers de solveni. Tabelul 2.1
prezint o list de indeci de polaritate, alturi de alte proprieti fizico-chimice
pentru un numr de solveni care sunt utilizai n cromatografia de partiie.
Se poate nota c acest index poate varia de la 10,2 pentru solventul cel mai
polar, apa, la -2 pentru compuii nalt nepolari de tipul fluoroalcanilor. Orice alt
index de polaritate dorit se va ncadra ntre aceste limite, fiind realizat prin
amestecul a doi solveni adecvai. n acest fel se obine indexul de polaritate P'AB
a amestecului format din solvenii A i B. Acesta este dat de relaia:

P'AB = AP'A +B P'B

unde P'A i P'B reprezint indecii de polaritate ai celor doi solveni, iar , fracia volumetric a
fiecrui solvent.

Proprietile celor mai utilizate faze mobile cromatografice.

Index de
refracie a

Vscozitate [cP] b

Punct de
fierbere [oC]

Index de polaritate,
P'

Tria eluentului c, [o]

Fluoroalcani

1,27-1,29

0,4-2,6

50-174

<-2

-0,25

Ciclohexan

1,423

0,90

81

0,04

-0,2

n-Hexan

1,372

0,30

69

0,1

0,01

1-Clorbutan

1,400

0,42

78

1,0

0,26

Tetraclorur de carbon

1,457

0,90

77

1,6

0,18

Eter i-propilic

1,365

0,38

68

2,4

0,28

Toluen

1,494

0,55

110

2,4

0,29

Eter etilic

1,350

0,24

35

2,8

0,38

Tetrahdrofuran

1,405

0,46

66

4,0

0,57

Cloroform

1,443

0,53

61

4,1

0,40

Etanol

1,359

1,08

78

4,3

0,88

Acetat de etil

1,370

0,43

77

4,4

0,58

Dioxan

1,420

1,2

101

4,8

0,56

Metanol

1,326

0,54

65

5,1

0,95

Acetonitril

1,341

0,34

82

5,8

0,65

Nitrometan

1,380

0,61

101

6,0

0,64

Etilenglicol

1,431

16,5

182

6,9

1,11

Ap

1,333

0,89

100

10,2

mare

Solvent

este calculat la o temperatur de 25oC

b centipoid-ul este unitatea de msur, comun, a vscozitii n sistem internaional, 1 cP = 1 mN s m-2.
c valorile triei solventului sunt calculate pe suport de alumin, Al 0 ; pentru silice, SiO valoarea o se multiplic
2 3
2
cu un factor de 0.8.
a valoarea

S-a artat anterior c cea mai simpl cale de cretere a rezoluiei cromatografice a
dou specii o reprezint manipularea factorului de retenie k', care poate fi variat prin
schimbarea indexului de polaritate a solventului. n cazul prezentat mai sus, ajustarea lui
P' este realizat prin utilizarea unei faze mobile ce conine un amestec format din doi
solveni. De obicei, o schimbare grosier cu dou uniti a indexului de polaritate P'
conduce la o cretere de zece ori a factorului de retenie k'. n cazul separrii prin
cromatografie de faz normal se poate scrie relaia:

unde k'2 i k'1 reprezint valorile iniiale i finale pentru un solut, n timp ce P'1 i P'2 sunt valorile corespunztoare ale lui P'.

n cazul coloanelor cromatografice cu faz invers relaia este:

Se poate accentua c dei aceste ecuaii sunt aproximative, ele pot fi

utilizate cu succes.

. APLICAII ALE CROMATOGRAFIEI DE PARTIIE

Suporturile cu faz invers cnd se utilizeaz n conjuncie cu solvenii foarte polari (deseori apoi), se
apropie de sistemul ideal, universal, pentru cromatografia lichid. Datorit aplicabilitii mari, avantajoase i
uoare, n condiiile n care factorul de retenie k' poate fi alterat prin modificarea fazelor apoase mobile, ele sunt
frecvent aplicate naintea altor separri exploratorii n cazul utilizrii unor noi tipuri de probe.
Figura de mai jos ilustreaz dou dintre miile de aplicaii ale cromatografiei cu faz legat.

Abordarea sistematic a separrii a ase steroizi. (a) i (b) utilizarea apei pentru a ajusta
valoarea factorului de retenie k'. Efectele variaiei factorul de selectivitate sunt artate n
(b), (c), (d), i (e). Coloan: 0,4 x 150 mm mpachetat cu suport C8, particule de faz invers,
5 m. Temperatura: 50C. Viteza de curgere: 3.0 cm3/min. Detector: UV 254 nm. Compui: (1)
prednison, (2) cortizon (3) hidrocortizon, (4) dexametazon, (5) corticosteron; (6)
cortoexolon.

Dou
aplicaii
ale
cromatografiei de partiie cu
faz legat. a) Analiza unor
aditivi
ntr-o
butur
nealcoolic. Coloan cu suport
polar
legat
(nitril).
Eluie
izocratic. b) Analiza unor
insecticide
organofosforice.
Coloan cu faz legat C8,
eluie n gradient. Detecie UV,
254 nm.

Formarea unor derivai ai probei

n unele cazuri este util a se converti componenii probei n derivai naintea sau
uneori cnd se ntreprinde o separare cromatografic. Acest tratament este de dorit n
condiiile n care se dorete (1) reducerea polaritii speciilor astfel c se poate utiliza mai
degrab cromatografia de partiie dect cea de adsorbie ori de schimb ionic, (2) creterea
rspunsului detectorului i astfel creterea sensibilitii pentru toate ori pentru o serie de
componente ale probei i (3) intensificarea selectiv a rspunsului la detector pentru o
serie de componente ale probei.

Cromatograma derivailor ortoftalaldehidici ai 30 de aminoacizi de importan fiziologic. Coloan:

C18, 5 m de faz invers. Solvent A: Na2HP04, 0,05 M, pH 7,4, CH30H/Tetrahidrofuran/H20.
Detector de fluorescen: excitaie 334 nm; emisie 425 nm.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE MOLECULAR

Cromatografia de excluziune steric, denumit de asemenea cromatografie de gel premeaie sau gel
filtrare reprezint o tehnic de separare de real folos n laborator, fiind aplicat n particular la separarea
speciilor cu mas molecular mare. Suportul cromatografic mpachetat utilizat n cromatografia de excluziune
steric este alctuit din particule mici, de aproximativ 10 m de silicat ori particule de polimeri care conin reele
de pori uniformi ntr-un solut i molecule de solvent difuzate n interiorul acestor pori. n interiorul porilor
moleculele sunt efectiv blocate, fiind micate prin curgerea fazei mobile. Domeniul de timp de reziden n
interiorul porilor depinde de mrimea efectiv a moleculelor de analit. Moleculele care sunt mai mari dect
media mrimii porilor suportului cromatografic sunt excluse i astfel ele nu vor fi reinute, aceste specii fiind
primele eluate. Moleculele care au un diametru semnificativ mai mic dect dimensiunile porilor pot penetra
(permea) n labirintul de pori din interiorul suportului cromatografic, fiind astfel captate, pentru un timp mult mai
ndelungat, fiind ultimele eluate. ntre cele dou extreme sunt moleculele intermediare a cror domeniu de
permeare n pori depinde de diametrele lor. Fa de acest grup de molecule are loc fracionarea, fenomen direct
legat de diametrul lor i n unele cazuri de forma molecular a lor. Se poate spune c separrile prin gel
permeaie, de excluziune pe baza masei moleculare difer de alte procese de separare prin considerentul c nu
exist interacii fizice sau chimice ntre analit i faza staionar. Din aceast cauz, este necesar eliminarea
oricrei interacii deoarece acestea conduc la scderea eficienei cromatografice. De asemenea trebuie notat c
n cazul acestui proces de separare exist o limit superioar a timpului de retenie din cauza faptului c nici o
specie de analit nu se reine mai mult dect cel care permeaz total faza staionar. De reinut c n cazul
separrii biomoleculelor n sisteme apoase, cromatografia de excluziune de denumete cromatografie de gel
filtrare, n timp ce separarea compuilor n sisteme neapoase este denumit cromatografie de gel permeaie.
Metoda cromatografic de excluziune din gel (numit de asemenea cromatografie de sitare molecular)
exploateaz masa molecular ca proprietatea fizic n scopul realizrii separrii. Astfel pot fi separate molecule
din domeniul a 100 pn la cele de mai multe milioane de daltoni. Este clar c o tehnic prin care se separ
molecule cu mas molecular cuprins ntre 10000 i 100000 este deosebit de popular printre cercettorii
biochimiti. Gel cromatografia a avut i are o importan major n purificarea a miilor de proteine, acizi nucleici,
enzime, polizaharide ori a altor biomolecule. n plus, tehnica poate fi aplicat la determinri de mase moleculare
ori la analize cantitative ale interaciilor moleculare.

Suporturi n cromatografia de gel filtrare

Faza staionar este constituit din particule inerte care conin pori mici cu dimensiuni
controlate. Examinarea microscopic a acestor particule arat un interior spongios. O soluie care
conine molecule cu diferite mase moleculare este trecut prin coloan sub influena unui solvent n
continu curgere. Moleculele de solut care sunt mai mari dect porii nu vor putea ptrunde n
interiorul sferelor de gel din cauza mpiedicrilor sterice datorate dimensiunii acestora n
comparaie cu spaiul din interiorul sferelor. Volumul coloanei care este accesibil moleculelor foarte
mari este astfel semnificativ redus. Ca rezultat, ele nu vor fi ncetinite n curgerea lor prin coloan i
vor fi eluate astfel ca o singur band (zon). Moleculele mici sunt capabile s difuzeze n i n
afara sferelor de gel, fiind necesare volume mai mari de solvent pentru a fi eluate, astfel ele
staionnd un timp ndelungat n interiorul sferelor, n consecin fiind ntrziat eluia lor din
coloan. Moleculele cu dimensiuni intermediare migreaz prin coloan cu vitez cuprins ntre cea
a moleculelor mari i cele mici. Astfel, ordinea de eluie a diverselor molecule de solut este
oarecum n relaie direct cu dimensiunile lor moleculare.

Au fost elaborate dou tipuri de suporturi pentru cromatografia de excluziune pe baza

mrimii moleculelor: microsfere de polimer i particule ce au la baz silice, ambele avnd
diametre cuprinse ntre 5 i 10 m. Ultimele au avantajul unei rigiditi crescute ceea ce
conduce la o mpachetare mai uoar, permind utilizarea lor la presiuni crescute, stabilitate
deosebit de mare, care permite utilizarea lor mpreun cu un mare numr de solveni, inclusiv
cu apa, o echilibrare mai rapid ntr-un nou solvent i o stabilitate nalt la temperaturi ridicate.

Cele mai timpurii separri efectuate prin tehnica de cromatografie de excluziune molecular sau realizat pe copolimer reticulat de stiren-divinil benzen, similar n structur cu copolimerii sulfonici
ai acestor copolimeri. Mrimea porilor acestor polimeri e controlat prin cantitatea de agent de
reticulare, n spe de cantitatea de divinilbenzen utilizat n reacia de polimerizare. Drept
consecin, au fot creai o serie de copolimeri cu diferite domenii ale porilor, sub form comercial.
Dac la nceput gelurile de stiren-divinilbenzen erau hidrofobe, i astfel neutilizabile n prezena
unei faze mobile apoase, astzi sunt disponibile geluri hidrofile, ceea ce face posibil utilizarea lor
n solveni apoi pentru separarea unor molecule mari, hidrosolubile precum zaharurile. Aceste
geluri hidrofile sunt derivai sulfonai ai divinibenzenului ori sunt poliacrilamidice.
n acest moment sunt disponibile comercial suporturi de sticl poroas ori particulele de silice
ce au domeniu de mrime al porilor cuprins ntre 40 i 2500 . n scopul reducerii absorbiei
nespecifice, suprafeele acestor particule sunt deseori modificate prin reacii cu substitueni
organici. De exemplu, suprafaa unui suport hidrofil prezint structura urmtoare:

Structura unui suport hidrofil, pe baz de silice

Proprietile unor matrix-uri pe baz de polistiren-divinilbenzen i silice utilizate n

cromatografia de excluziune pe baza mrimii masei moleculare. Limita de excluziune a
masei moleculare se refer la domeniul la care nu se manifest nici o reinere.
Tipul de suport cromatografic

Mrimea pariculei,
m

Domeniul de limit al
porilor,

polistiren-divinilbenzen

10

102
103

700
(de la 0,1 la 20) x 104

104

(de la 1 la 20) x 104

105

(de la 1 la 20) x 105

106

(de la 5 >20) x 106

125

(de la 0,2 la 5) x 104

300

(de la 0,03 la 1) x 105

500

(de la 0,05 la 5) x 105

1000

(de la 5 la 20) x 105

Silice

10

Limita de excluziune a masei

moleculare

n practica biochimic sunt utilizate cu preponderen geluri bazate pe

patru tipuri de baz: dextran, poliacrilamid, agaroz i amestecuri de
poliacrilamid cu dextran.

Primele geluri dezvoltate au fost pe baz de dextran, un polizaharid natural reticulat cu

epiclorhidrin, comercializat sub denumirea de Sephadex

Dextranul este un polizaharid compus din resturi de glucoz legate prin legturi (-1 -6) i
legturi -1,3 care confer legturi ramificate. El este biosintetizat de ctre o enzim produs de
ctre bacteria Leuconostoc mesenteroides, tulpina B-512F. Dextranul este reticulat la multiplele
sale extremiti printr-o reacie cu epiclorhidrin, ceea ce conduce la obinerea unor sfere de gel cu
poroziti diferite.
Numrul dat fiecrui tip de gel se refer la capacitatea de mbibare cu soluie apoas (water
regain) multiplicat cu 10. Sephadex-ul este oferit n diverse mrimi ale particulelor denumite
coarse, medium, fine i superfine. Gelurile pe baz de dextran nu pot fi preparate dect pentru
limite de excluziune mai mici de 600000 daltoni, deoarece mica reticulare existent n structura lor
nu este suficient pentru a preveni colapsul particulelor. n schimb, prin reticularea dextranului cu
NN'- metilen bisacrilamid, este posibil utilizarea acestor geluri la fracionri cu domenii mai mari.
Aceste geluri sunt denumite Sephacryl.
Gelurile pe baz de poliacrilamid sunt produse prin copolimerizarea acrilamidei cu NN'metilen bisacrilamid, ultimul fiind i agent de reticulare. Denumirea comercial a acestor geluri
este Bio-Gel P. Mediile pe baz de Bio-Gel sunt media sunt disponibile n 10 limite de excluziune,
n domeniul 1800 la 400000 daltoni.
Gelurile pe baz de agaroz prezint avantajul unor deosebit de mari limite de excluziune.
Agaroza, componentul polizaharidic neutru al agarului, este compus din uniti alternative de
galactoz i anhidro-galactoz (Figura urmtoare).

Agaroza este un material gelificant a cror mrime a porilor este mai mare
dect cei ai dextranului reticulat ori ai poliacrilamidei. Agaroza este un polizaharid
neutru, fracie de agar.
Ea este compus din polimer linear de D-galactopiranoz legate -14 la 3,6
anhidro-L-galactopiranoz, care este legat -13. n condiiile n care
polizaharidul este dizolvat prin fierbere i apoi este rcit, el formeaz legturi de
hidrogen inter- i intramoleculare. Mrimea porilor este controlat prin
concentraia de agaroz. Structura gelului este stabilizat mai mult prin legturi de
hidrogen dect prin legturi ncruciate covalente.

Gelurile pe baz de agaroz sunt furnizate sub denumirea comercial de Bio-Gel A i Sepharose
ori Superose. Sepharose CL este o Sepharose reticulat prin reacia dextranului cu 2,3dibromopropanol n condiii alcaline, ceea ce conduce la obinerea unui gel de agaroz cu o stabilitate
termic i chimic crescut.

Un pas nainte n tehnologia de gel filtrare s-a realizat n momentul introducerii gelurilor
compozite, prin grefarea unui polimer secundar pe un suport de gel preformat, precum de
exemplu Sephacryl (figura de mai jos), unde reticularea se realizeaz ntre alil dextran i N,N'metilen bisacrilamid ori mai recent, Superdex.

Structura probabil a polimerului Sephacryl HR

Structura Superdex-ului

Gelurile combinate de poliacrilamid i agaroz sunt furnizate sub denumirea

comercial de Ultragel. Acestea sunt compuse din poliacrilamid reticulat n ochiurile
creia se afl agaroz. Ca i n cazul Superdex, gelul de poliacrilamid confer un
grad nalt de separare n timp ce agaroza menine rigiditatea gelului ceea ce conduce
la marele avantaj al creterii vitezelor de curgere.

n definirea performanelor unui gel i a comportamentului unui solut este necesar

cunoaterea unor proprieti fizice ale acestora.
de excluziune. Ea este definit ca masa molecular a celei mai mici molecule care
nu poate difuza n interiorul volumului de matrix de gel. Toate moleculele mai mari dect
aceast mas vor fi eluate rapid, ntr-o singur zon. Limita de excluziune a unui gel tipic,
Sephadex G-50, este de 30000 Da. Toate moleculele din solut care posed mase moleculare
mai mari de aceast valoare vor trece prin coloan direct, fr a fi reinute n porii sferelor de
gel.
Domeniul de fracionare. n cazul Sephadex G-50 domeniul de fracionare este cuprins
ntre 1500 i 30000 Da. Moleculele de solut din acest domeniu, se vor separa oarecum ntr-o
relaie linear, n funcie de masa lor molecular.
Capacitatea de mbibare (water regain i bed volume). Mediile de gel cromatografie sunt
oferite cel mai adesea n form deshidratate fiind umflate apoi n solvent, de obicei ap,
nainte de utilizare. Cantitatea de ap necesar obinerii unui gram de gel este cunoscut sub
denumirea de water regain. n cazul Sephadex G-50, aceast valoare este de 5 pentru 0,3 g.
Aceast valoare nu include apa din jurul particulelor de gel i astfel nu poate fi utilizat la o
estimare exact a volumului final al coloanei mpachetate de gel. Cele mai multe companii
care comercializeaz astfel de produse furnizeaz, n plus la water regain, valoarea volumului
particulelor, bed volume. Aceast valoare reprezint volumul final de gel n condiiile umflrii
(mbibrii) a unui gram de gel uscat n ap. Pentru Sephadex G-50, bed volume-ul este de 9
pn la 11 ml/g gel uscat. n seria Sephadex-ului, denumit seria G, numerele G se refer la
cantitatea de ap care este necesar pentru nmuierea gelului, avnd grade diferite de
reticulare, deci diferite mrimi ale porilor. Sephadex G-10, cel mai reticulat dextran, posed un
water regain de aproximativ 1 ml/g de gel uscat n timp ce Sephadex G-200, cel mai ieftin
dextran reticulat are un water regain de aproximativ 20 ml/g de gel uscat.
Limita

Forma i mrimea particulei de gel. n condiii ideale, particulele de gel sunt sferice,
pentru a furniza un strat uniform de gel, cu o mare densitate a porilor. Mrimea particulelor
este definit prin mrimea ochiurilor acesteia (mesh) ori prin diametrul sferei particulei.
Gradul de rezolie oferit de viteza de curgere prin coloan depinde de dimensiunile
particulelor de gel. Particulele cele mai mari (50 la100 mesh, 100 la 300 m) ofer viteze de
curgere nalte dar o separare cromatografic cu rezoluie sczut. n caz opus se afl
particulele de gel cu dimensiuni foarte mici ("superfine," 400 mesh, 10 la 40 m). Cele mai
utilizate mrimi de particule reprezint un compromis ntre rezoluie i vitez de curgere
fiind de 100 la 200 mesh (50 la 150 m).
Volumul spaiului gol (void volume). Acesta reprezint spaiul total din jurul particulelor
de gel ntr-o coloan mpachetat. Valoarea volumului spaiului gol se determin prin
msurarea volumului de solvent necesar elurii unui solut care este complet exclus din
matricea gelului. Cele mai multe coloane pot fi calibrate n scopul determinrii acestui
parametru prin eluia a unui colorant, blue dextran 2000, care are o mas molecular medie
de 2000000 daltoni.
Volumul de eluie. Acest volum reprezint volumul de tampon de eluie necesar
ndeprtrii unui anumit solut, particular, dintr-o coloan mpachetat.

Ilustrarea fenomenului de separare prin gel filtrare.

Astfel, dup mpachetarea coloanei cu mediu

suport ce este alctuit din particule sferice de gel [1],
proba este aplicat pe coloan [2].
Tamponul (faza mobil) i proba se mic de-a
lungul coloanei [3]. Moleculele difuzeaz n i n
afara porilor matrix-ului (fenomen descris de
asemenea drept partiia probei ntre faza mobil i
cea staionar). Moleculele mai mici se vor dispersa
mai mult in interiorul porilor matrix-ului i vor rmne
un timp mai ndelungat pe coloan. Cum tamponul
trece continuu prin coloan, moleculele mai mari
dect porii matrix-ului sunt incapabile s difuzeze n
interiorul acestora, trecnd astfel prin coloan, fr a
fi reinute. Moleculele mai mici difuzeaz n interiorul
porilor i sunt astfel ntrziate n trecerea lor de-a
lungul coloanei [4]. Moleculele mai mari prsesc
primele coloana, urmate de moleculele mai mici, n
ordinea mrimii lor [5]. ntregul proces de separare
are loc la un volum total al tamponului care trece prin
coloan (echivalent cu volumul de suport
mpachetat).

ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUZIUNE MOLECULAR

n abordarea teoretic a procesului de cromatografie se ia n considerare faptul c solutul
trece printr-un strat cromatografic prin intermediul fazei mobile. Faza staionar acioneaz n
sensul ntrzierii deplasrii solutului prin strat. Solui diferii sunt ntrziai cu timpi diferii. n
cromatografia de partiie, aceast ntrziere este datorat partiionrii solutului ntre faza mobil i
cea staionar.
Viteza cu care solutul traverseaz stratul cromatografic este proporional cu o fracie de timp,
calculat pe baz statistic, n care moleculele sunt reinute n faza mobil. Aceast fracie de timp
pierdut n faza mobil este determinat ca raportul volumelor de faz mobil respectiv staionar,
alturi de un coeficient de partiie. Acest coeficient de partiie a solutului ntre faza mobil i cea
staionar guverneaz comportamentul cromatografic al solutului, prin ecuaia fundamental a
cromatografiei de partiie. O multitudine de teorii au fost emise n ncercarea de caracterizare a
acestui coeficient de partiie n cazul gel filtrrii.
Prima abordare teoretic a comportrii gelurilor n cromatografie este cea realizat, n anul
1961 de ctre P. Flodin (1961). El consider partiia moleculelor de solut ntre particulele de gel i
lichidul interstiial ca un ntreg efect steric i puncteaz c n mediul nconjurtor imediat apropiat
de catene reticulate de gel suport matrix-ul de gel ocup cea mai mare parte a spaiului. n aceste
condiii, moleculele mari nu pot penetra n aceste regiuni, n timp ce moleculele mici pot trece
bariera reticulat i astfel se pot apropia mult mai intim. Aceste restricii sterice, dup Flodin, mpart
gelul n regiuni permise i regiuni interzise moleculelor de solut. Cu ct moleculele de solut sunt
mai mari n dimensiuni, cu att numrul de regiuni interzise din reeaua matrix-ului este mai mare.
n regiunile permise, concentraia de solut este considerat a fi identic cu cea din lichidul
interstiial. Aceast teorie conduce la definirea constantei K drept un volum disponibil la o specie
molecular dat.

Pentru a realiza o separare prin gel filtrare mediul suportul (mediul) este mpachetat ntr-o
coloan sub form de perle n strat mpachetat (packed bed). Mediul este reprezentat de un matrix
poros n form de particule sferice care trebuie a fi alese n funcie de stabilitatea lor chimic i
fizic ori pe baza proprietii de a fi inerte (prin pierderea proprietilor de reactivitate sau
adsorptivitate). Coloana mpachetat este echilibrat cu tampon cu rolul de a se distribui n porii
matrix-ului i n spaiul dintre particule. Lichidul situat n interiorul porilor este uneori definit drept
faz staionar care se afl n echilibru cu lichidul din afara particulelor denumit faz mobil. Se
poate nota c probele se elueaz n condiii isocratice, nefiind necesar utilizarea tampoanelor
diferite n timpul separrii. n mod normal, o treapt de splare se realizeaz prin trecerea unui
tampon la sfritul oricrei separri pentru a facilita ndeprtarea oricrei molecule care ar fi putut fi
reinute pe coloan i pentru a pregti coloana pentru o nou separare. Figura de mai jos prezint
cei mai utilizai termeni utilizai n descrierea unei separri cromatografice prin gel filtrare.

Termeni uzuali utilizai n gel filtrare.

Ilustrarea termenilor utilizai n gel filtrare

Pentru a caracteriza comportamentul unui solut fr a avea o referin la

dimensiunile geometrice ale coloanei sunt utilizate frecvent o serie de variabile.

Ve
Volumul relativ de eluie, Vo, unde Vo reprezint volumul spaiului gol

(denumit i volumul mort), reprezint volumul de eluie pentru o substan

care este complet exclus din gel Vo este identic cu volumul lichidului
interstiial dintre sferele de suport cromatografic. n unele cazuri inversul
volumului relativ de eluie, R, constanta de retenie este de asemenea
utilizat n caracterizarea unei substane. Constanta de retenie, R este un
parametru interesant, deoarece ea este apropiat de viteza relativ de
migrare utilizat n cromatografia pe strat subire.

Msurarea volumului de eluie, Ve.

Ve
Vo

Valoarea este uor de calculat. Ea este oarecum

dependent de modul de mpachetare al coloanei. O
operare la presiune nalt care conduce la un void
volume mic poate s creasc uneori valoarea acestui
parametru. Aceast variaie are totui o importan
minor.
Ve
Raportul Vt (unde Vt reprezint volumul total al patului de
gel), este de asemenea uor de determinat.
Msurtoarea volumului total a patului de gel se
realizeaz, prin umplerea tubului pn la nivelul original
al stratului de gel mpachetat cu ap, determinndu-se
astfel acest volum. Se poate aduga c, n comparaie
cu raportul Ve, variaia raportului VeVt este mai mic.
Vo

CURBELE DE SELECTIVITATE

Utilizarea domeniului de mas molecular

pentru mpachetare n cazul cromatografiei de
excluziune
molecular
este
convenional
reprezentat n figura alturat, unde n panelul (a)
e prezentat o curb de calibrare.
n acest caz, masa molecular, care este
ntr-o relaie direct cu mrimea moleculelor de
solut, este plotat (reprezentat) n funcie de
volumul de retenie VR, unde VR este produsul
dintre timpul de retenie i viteza de curgere
volumetric. Se poate nota c scara este
logaritmic. Limita de excluziune definete masa
molecular a speciilor care depesc domeniul de
retenie i la care nu se manifest nici o reinere
pe coloana cromatografic. Toate speciile care au
o mas molecular mai mare dect limita de
excluziune nu sunt reinute de suport i vor fi
eluate mpreun, rezultnd astfel un peak comun,
peak-ul A, din panelul (b). limita de permeaie
reprezint astfel masa molecular sub care
moleculele de solut pot penetra complet n
interiorul porilor de gel. Totalitatea moleculelor sub
aceast mas molecular sunt att de mici nct
ele vor fi eluate ca o singur band, D, din panelul
(b).

Odat cu scderea masei moleculare comparativ cu

limita de excluziune, moleculele de solut vor staiona din
ce n ce mai mult, n medie, n interiorul porilor i apoi se
vor deplasa mai lent. Aceast situaie se manifest n
regiunea de permeaie selectiv, unde are loc fracionarea
solutului, ceea ce conduce la separarea pe benzi
individuale a componentelor acestuia. Acest caz este
prezentat n panelul (b), peak-urile B i C.

Curbele de selectivitate pentru Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade

i Superdex 200 prep grade.

REZOLUIA DE SEPARARE N CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE MOLECULAR

Succesul unei separri prin cromatografie de excluziune steric depinde n primul

rnd de alegerea condiiilor care conduc la o selectivitate suficient i la o contracarare a
lirii peak-ului, fenomen ce se manifest n timpul separrii. Dup selecia mediului de gel
filtrare cu o selectivitate corect, volumul probei i dimensiunile coloanei devin parametrii
critici ce afecteaz rezoluia de separare.
Rezoluia final, gradul de separare ntre peak-uri este influenat de o multitudine de
factori: raportul dintre volumul probei i volumul coloanei, viteza de curgere, dimensiunile
coloanei, mrimea particulelor suportului cromatografic, distribuia mrimii particulelor,
densitatea de mpachetare, porozitatea particulelor i vscozitatea fazei mobile. Succesul
undi separri prin cromatografie de excluziune molecular depinde n cea mai mare
msur de alegerea condiiilor care s conduc la o selectivitate suficient alturi de
contracararea efectelor de mprtiere a peak-ului n timpul separrii.

Rezoluia este funcie de selectivitatea mediului

suport cromatografic i de eficiena acestuia n
producerea unor peak-uri ct mai nguste (cu o
mprtiere minim a peak-ului) dup cum este ilustrat
n figura alturat.
Eficiena unei coloane mpachetate este definit
drept capacitatea acesteia de a produce peak-uri
nguste i simetrice n timpul eluiei. Eficiena este un
parametru deosebit de important n mod particular n
cromatografia de excluziune molecular deoarece
separarea are loc numai ntr-un volum de tampon egal
cu volumul coloanei, tampon ce traverseaz coloana.

VOLUMUL PROBEI I DIMENSIUNILE COLOANEI

Volumul probei este exprimat ca procente din volumul total al coloanei
mpachetate. Utilizarea unor probe ct mai mici conduce la evitarea
suprapunerii dac peak-urile sunt prea apropiate. Figura de mai jos arat cum
influeneaz volumul probei n cazul fracionrii de rezoluie nalt

Pentru fracionri cu mare rezoluie a probei este recomandat un volum

de prob egal cu 0,54% din volumul total al coloanei, acesta depinznd de
tipul de mediu utilizat. Pentru cele mai multe aplicaii, este preferabil ca
volumul probei s nu depeasc 2% pentru a avea o rezoluie maxim.
Funcie specificitatea probei este posibil s se introduc un volum mai mare
de prob, n particular cnd peak-urile de interes sunt bine rezolvate. Din
aceast cauz, volumul probei poate fi determinat numai pe cale
experimental.
n cazul separrilor analitice ori n cazul separrii unor probe complexe
este avantajos a se ncepe cu un volum egal cu 0,5% din volumul total al
coloanei. Un volum al probei mai mic de 0.5% nu crete n mod normal
rezoluia. Pentru a crete capacitatea de separare prin gel filtrare, proba poate
fi concentrat. Este preferabil a nu utiliza probe cu o concentraie mai mare de
70 mg/ml protein, datorit efectelor de vscozitate care astfel s conduc la
interferene n separare. Diluia probei este inevitabil datorit fenomenului de
diluie care se manifest la trecerea probei prin coloan. n scopul de a
minimaliza diluia probei, este preferabil a utiliza maximul volum al acesteia
pentru a obine rezoluia maxim necesar ntre peak-urile de interes.

nlimea patului cromatografic, mpachetat n coloan afecteaz att

rezoluia ct i timpul necesar eluiei. Rezoluia n gel filtrare crete cu
ptratul rdcinii nlimii patului cromatografic. O dublare a nlimii stratului
cromatografic conduce la o cretere a rezoluiei cu un echivalent de 2 =
1,4 (40%). n cazul fracionrilor de nalt rezoluie, sunt de preferat
coloanele lungi care vor da cele mai bune rezultate n timp ce o nlime a
patului de gel cuprins ntre 3060 cm va conduce la rezoluii satisfctoare.
O nlime suficient a stratului de gel alturi de o vitez sczut de curgere
dau suficient timp tuturor moleculelor intermediare s difuzeze n i n afara
porilor matrix-ului cromatografic conducnd astfel la rezoluii bune. Dac este
necesar o coloana este foarte lung, nlimea efectiv a patului de gel
poate fi crescut prin utilizarea mai multor coloane care conin aceleai
suport cromatografic, cuplate n serie.

SELECIA SUPORTULUI CROMATOGRAFIC

Selecia corect a gelului suport reprezint o etap critic n succesul unei separri gel
cromatografice. Cele mai multe experimente de excluziune molecular pot fi clasificate n separri de grup
i n fracionri de nalt rezoluie.
Separrile de grup pot fi divizate, funcie de solut, n dou grupe: fracionri se solui cu mas
molecular relativ mic i fracionri se solui cu mas molecular relativ mare. Exemplele specifice ale
acestora sunt desalifierea soluiilor de proteine sau ndeprtarea unor molecule mici de contaminani din
extracte de proteine sau acizi nucleici. Pentru separrile de grup, gelul trebuie ales astfel nct s conduc
la o excluziune complet a moleculelor cu mas molecular mare n void volume. n acest scop sunt
recomandate Sephadex G-25, Bio-Gel P-6, i Sephacryl S-100HR pentru cele mai multe separri de grup.
Mrimea recomandat a particulelor este de 100 - 200 mesh ori particule cu un diametru de 50 - 150 m.
Fracionarea implic separarea gupelor de solui cu mase moleculare similare dintr-un amestec
multicomponent. n acest caz, gel trebuie ales astfel ca domeniul de fracionare s includ masele
moleculare dorite a se separa din solut. Dac amestecul de solut conine macromolecule cu mase
moleculare de pn la 120000, cele mai potrivite suporturi cromatografice sunt Bio-Gel P- 150, Sephacryl
S-200 HR ori Sephadex G-150. n cazul utilizrii Bio-Gel P-100, Sephadex G- 100 sau Sephacryl S- 100
HR o serie de proteine din prob cu mas molecular mai mare vor elua n void volume. Pe de alt parte,
dac se utilizeaz dac se utilizeaz Bio-Gel P-200, Bio-Gel P-300 ori Sephadex G-200 acestea vor
scdea att rezoluia ct i viteza de curgere. n cazul n care domeniul de mas molecular a amestecului
de solut este necunoscut, este necesar o selecie empiric a suportului cromatografic. n cazul celor mai
multe fracionri se recomand utilizarea suporturilor cromatografice de 100-200 ori 200-400 mesh (20-80
m ori 10-40 m). n cazul gelurile celor mai fine este recomandabil a se selecta o vitez de curgere
optim. Pentru separri critice, gradele superfine ofer cea mai bun rezoluie dar vitezele de curgere sunt
foarte sczute.

APLICAII ALE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUZIUNE MOLECULAR

Cromatografia de excluziune molecular este subdivizat n gel filtrare i n
cromatografie de gel permeaie. Prima utilizeaz solveni apoi suporturi cromatografice
hidrofile. Cel de al doilea tip de cromatografie este bazat pe solveni organici neapoi i
suporturi cromatografice hidrofobe. Aceste metode sunt complementare n sensul c una
este aplicabil pentru probe solubile n ap, n timp ce a doua este aplicabil substanelor
solubile n solveni mai puin polari.
Una dintre cele mai utilizate aplicaii ale excluziune pe baza mesei moleculare este
separarea unor molecule cu mas molecular mare, produi naturali, de speciile de
molecule cu mas molecular mic ori de separarea lor de sruri.
De exemplu, un gel cu o limit de excluziune de cteva mii, poate separa clar,
proteine de aminoacizi i de peptide cu mas molecular mic.
O alt aplicaie a cromatografiei de gel permeaie o reprezint separarea unor
omologi ori a unor oligomeri. Aceast aplicaie este ilustrat n figura de mai jos, unde este
prezentat separarea unor acizilor grai din domeniul de mas molecular 116 - 344 pe un
suport pe baz de polistiren, mpachetat, cu o limit de excluziune de 1000.

Sephadex-ul poate fi utilizat de asemenea n cromatografia de

excluziune molecular pentru separare n prezena unor solveni
organici precum dimetilformamida, n cazul Sephadex G-10 ori a unor
amestecuri de ap cu alcooli cu caten scurt, n cazul Sephadex G10, G-25 i G-50.
Sephadex LH-20 este un suport special conceput pentru
separrile compuilor naturali care necesit prezena unor solveni
organici pentru a le menine solubilitatea. El este utilizat de asemenea
la separarea unor molecule precum sterolii, terpenoidele, lipidele i
peptidele cu mas molecular mic (pn la 35 resturi de aminoacizi).
Toi aceti compui sunt uzual separai prin cromatografie de partiie
lichid-lichid sau prin cromatografie de absorbie. Funcie de solvenii
alei, acest mediu suport poate separa de asemenea componente prin
partiie ntre faza staionar i faza mobil.
Sephadex LH-20 poate prezenta o selectivitate nalt pentru
compui aromatici ntr-o serie de solveni i poate fi utilizat att n
scopuri analitice ct i n cele industriale. El este utilizat att n scopuri
analitice ct i n cele industriale, la separarea unor specii moleculare
nrudite. Datorit proprietilor sale unice acest mediu suport poate fi
utilizat att n timpul purificrii iniiale ct i n faza final de finalizare a
purificrii, de exemplu la separarea diastereomerilor. Funcie de
solvenii alei, Sephadex LH-20 poate de asemenea separa
componente prin partiie ntre matrix i solvent organic. Sephadex LH20 manifest att proprieti hidrofilie ct i hidrofobe, ceea ce-i ofer
selectivitate special i astfel are cu o multitudine de aplicaii.

Separrile de grup: componentele probei sunt separate n dou grupuri majore, funcie de
domeniul mrimii lor. O separare de grup poate fi utilizat la ndeprtarea contaminanilor cu
mas molecular mare sau mic (cum ar fi ndeprtarea roului de fenol din fluidele, mediile,
de cultur, desalifiere sau la schimbare a tampoanelor de lucru.
Fracionarea de nalt rezoluie a biomoleculelor: componentele probei sunt separate n
funcie de diferenele n mas molecular. Fracionarea de nalt rezoluie poate fi utilizat n
izolarea unuia sau mai multor componente, la separarea monomerilor din agregate, la
determinarea masei moleculare ori la realizarea analizelor de distribuie a masei. Gel filtrarea
poate fi de asemenea utilizat la facilitarea rempachetrii proteinelor denaturate prin controlul
intim (atent) n schimbarea condiiilor de tamponare.

O cromatogram care ilustreaz

separarea de grup. Proba: =
hemoglobin, x = NaCl. Volumul
probei: a) = 10 ml, b) = 400 ml.
Hemoglobina este elutat n void
volumul coloanei (de exemplu, 370 ml)
n timp ce clorura de sodiu este eluat
cu un volum total de lichid (860 ml).
Aproape tot volumul de pori este utilizat
n desalifiere. Coloana de 85 X 4 cm
diametru interior este mpachetat cu
Sephadex G-25 Medium.

FRACIONAREA CU REZOLUIE NALT A

MACROMOLECULELOR

DETERMINAREA MASEI MOLECULARE PRIN

ANALIZE DE DISTRIBUIE

Curb de calibrare pentru determinarea masei moleculare a

proteinelor prin cromatografie de excludere steric.
Suportul cromatografic este Sephadex G-100.

CROMATOGRAFIA PLANAR LICHID-LICHID

Principial, n cromatografia de partiie lichid-lichid sunt utilizate dou faze lichide, o faz legat
la un suport inert, denumit faz staionar i o alt faz lichid, denumit faz mobil care
traverseaz faza staionar i care distribuie componente solutului, ntre aceste dou faze.
Componentele solutului prezint solubilitate n cele faze. Procesul care se produce este deseori
complicat de apariia unor fenomene de adsorbie a substanelor i a fazei mobile de ctre suportul
inert. Cromatografia de partiie se poate realiza pe coloane de pudr de celuloz, dar cele mai
comune i utilizate metode sunt cele care utilizeaz ca suport hrtia (cromatografia pe hrtie) ori un
strat subire de silicagel sau alumin depus pe un suport solid de tipul sticlei, foliei de aluminiu sau
din material plastic (cromatografia pe strat subire, thin-layer chromatography, TLC). Celuloza, ca i
ali polimeri naturali ori sintetici, poate lega o cantitate mare de ap. Astfel procesul de separare
cromatografic va implica partiia componenilor probei ntre apa (solventul apos) legat de suportul
inert (faza staionar) i solventul de developare (faza mobil). Frecvent, unul din componentele de
developare l reprezint apa. n condiiile n care ntre ap i componentul organic exist fenomenul
de nemiscibilitate, este adugat un al treilea component (solvent) care este capabil s se amestece
att cu apa ct i cu primul component organic, pentru a se crea o singur faz organic de
solvent. Este cazul etanolului din sistemul ap:etanol:nitrometan, unde etanolul este capabil s se
dizolve att n ap ct i n solventul organic, de exemplu.
Metodele de cromatografie planar includ cromatografia pe strat subire, cromatografia pe
hrtie i electrocromatografia. Oricare dintre acestea se realizeaz utilizeaz un strat subire relativ
plat care reprezint el nsui suportul cromatografic (de exemplu, hrtia) ori pe suprafaa cruia se
afl depus acest suport. Faza mobil se deplaseaz prin faza staionar sub aciunea forei de
capilaritate, a forei gravitaionale ori sub un gradient de potenial. Cromatografia planar este
uneori denumit cromatografie bidimensional dei aceast definiie nu este strict corect deoarece
faza staionar posed o nlime finit.

Cromatografia pe strat subire

Din punct de vedere teoretic al tipurilor de faz mobil i staionar utilizate n
cromatografia pe strat subire, exist o similare deosebit cu cromatografia lichid pe coloan.
O caracteristic important a cromatografiei pe strat subire (thin layer chromatography, TLC) o
reprezint faptul c ea servete drept ghid n dezvoltarea condiiilor optime de realizare a
separrii prin cromatografie lichid pe coloan. Avantajele utilizrii acestui procedeu l reprezint
viteza i preul sczut ale experimentelor exploratorii pe strat subire. O serie de
experimentatori, de fapt, efectund experimente de cromatografie pe strat subire i formeaz o
opinie n efectuarea experimentelor urmtoare pe coloan. n plus, la utilizarea acestei metode
la dezvoltarea metodelor cromatografice pe coloan, TLC a devenit o metod comun n
industria medicamentului, pentru determinarea puritii produselor. Tabelul 2.10 arat domeniile
curente de utilizare ale cromatografiei pe strat subire.
Ea este rspndit n laboratoarele clinice i reprezint baza multor studii biochimice i
biologice. n plus, metoda este larg utilizat n laboratoarele industriale. Drept consecin a
acestei largi arii de aplicare, s-a estimat c numrul de analize efectuate prin cromatografie pe
strat subire este cel puin egal cu cel realizat prin cromatografie lichid de nalt performan.
n mod clasic separrile prin cromatografie pe strat subire sunt realizate pe suporturi din
sticl, folie de aluminiu ori plastic care sunt acoperite cu un strat subire i aderent de de
particule fine; acest strat reprezint suportul inert.
Particulele sunt similare celor utilizate n cromatografia de adsorbie, partiie normal sau
invers, cromatografie de excluziune molecular. Fazele mobile sunt similare celor utilizate n
cromatografia lichid de presiune nalt.

Domeniile actuale de aplicare ale cromatografiei pe strat subire

Domenii de aplicare
Aplicaii clinice

Aplicaii industriale

Industrie alimentar

Medicin legal
Aplicaii farmaceutice

Analize de mediu

Tipul de analize
Lipide
Studii metabolice
Screening-ul unor medicamente
Control antidrog (antidopping)
Dezvoltarea proceselor i optimizarea lor
Monitorizarea unor procese
Validarea unor procese
Controlul calitii
Aditivi (de exemplu, vitamine)
Pesticide
Teste de stabilitate (expirare)
Detectarea unor documente false
Investigaii n otrviri
Analize de vopsele
Teste de control al uniformitii
Analiza identitii sau puritii
Teste de stabilitate
Ap
Sol
Analize de reziduuri

SUPORTURI CROMATOGRAFICE
Suporturile utilizate n cromatografia pe strat subire sunt comercializate n dou
forme, pentru cromatografie pe strat subire convenional i cromatografie pe strat subire
de nalt performan. Primele posed un strat subire de 200-250 m nlime cu care
conine particule cu o dimensiune de 20 m sau mai mari. Suporturile de nalt performan
posed un suport cromatografic de 100 m nlime cu diametrul particulelor de 5 m sau
mai mici. Suporturile de nalt performan, dup denumire, conduc la separri precise, n
interval de timp scurt. Astfel suporturile cromatografice convenionale posed 2000 de
talere teoretice pe o distan de 12 cm, ntr-un timp de developare ce cca. 25 minute.
Suporturile cromatografice de nalt performan prezint 4000 de talere teoretice pe o
distan de 3 cm. care necesit circa 10 minute pentru dezvoltare. Suporturile de nalt
performan au ns dezavantajul unei capaciti reduse n ceea ce privete volumul probei
adugate.

n mod diferit de cromatografia lichid de presiune nalt i de gaz cromatografie unde faza
mobil reprezint un parametru ce poate fi uor meninut la o vitez specificat, n cromatografia
pe strat subire viteza fazei mobile nu poate fi n general controlat n afar de cazul n care se
utilizeaz tehnica de developare cu curgere forat. Viteza de curgere este afectat de natura
suportului cromatografic (porozitate, mpachetare, mrimea particulelor, etc.) ct i de proprietile
fazei mobile (vscozitate, tensiune de suprafa, presiunile de vapori ale solvenilor, etc.). n
general viteza scade n timpul dezvoltrii plcii cromatografice (figura de mai jos).
Datorit fenomenului de cretere a rezistenei fazei staionare fa de curgerea fazei mobile, n
condiiile utilizrii unor suporturi de cromatografie pe strat subire de performan nalt, se pot
obine rezultate superioare numai n cazul unor distane scurte de developare.
n condiiile meninerii altor parametrii constani, rezoluia Rs a doi compui este mai
dependent de poziia lor relativ pe cromatogram (RF) dect de distana de migrare a frontului
(distana de developare).

Relaia
dintre
distana
de
developare
i
timpul
de
developare n condiiile utilizrii
unui suport de silicagel HPTLC
silicagel
60.
Faza
mobil:
toluen/acetat de etil (1) i acetat
de etil/metanol/ap/acid formic (2).

PERFORMANELE SUPORTURILOR DE
CROMATOGRAFIE PE STRAT
SUBIRE
R =
F

Majoritatea termenilor i relaiilor care caracterizeaz cromatografia pe coloan, pot

fi adaptai, uor, cu mici modificri, cromatografiei pe strat subire. Un termen nou,
factorul de retardare, RF este necesar a se prezenta n contextul cromatografiei pe strat
subire.
Cromatografia pe strat subire pentru un singur
solut este prezentat n form de cromatogram
figura de mai jos. Factorul de retardare pentru un
singur solut este dat de relaia:
unde dR i dM reprezint distanele lineare
msurate de la linia de start pn la
mijlocul spotului respectiv pn la frontul
de solvent. Valorile pentru RF pot varia de
la 1 pentru soluii care nu sunt ntrziai i
care migreaz odat cu frontul pn la o
valoare apropiat de 0, pentru soluii care
nu interacioneaz cu faza mobil. Trebuie
notat c dac spoturile nu sunt simetrice,
cum de altfel se ntmpl frecvent,
msurarea dR se efectueaz de la linia de
start pn n punctul de maxim intensitate
al spotului.

Variabilele care influeneaz factorul de retenie

Pentru a obine cele mai corecte valori ale RF, este nevoie de o precizie mare i o mare
reproductibilitate. Cei mai importani factori de care depinde exactitatea (determinare magnitudinii
RF), includ grosimea stratului de suport, deci a fazei staionare, contaminarea (coninutul n umiditate)
a fazelor mobil i staionar, temperatura, gradul de saturaie a camerei de developare cu vapori de
faz mobil ori mrimea probei. Un control complet al acestor factori variabili nu sunt n general
controlabili n condiii practice. Ameliorarea parial a acestor efecte poate fi deseori realizat totui
prin substituirea cu un factor relativ de retenie RX a factorului de retardare, RF care reprezint
raportul dintre distana parcurs de analit i distana parcurs de o substan standard.

Aplicaii ale cromatografiei pe strat subire

Datele obinute dintr-o singur cromatogram de obicei nu furnizeaz informaii suficiente

pentru a permite identificarea diverselor specii prezente ntr-un amestec din cauza variabilitii
valorilor RF cu mrimea probei, stratul subire cromatografic i condiiile existente n timpul
cromatografierii. n plus, ntotdeauna exist posibilitatea ca doi solui diferii s manifeste
proprieti cromatografice asemntoare, cu valori RF identice sau foarte apropiate n condiiile
de separare date.

Autentificarea unei substane prin utilizarea unei standard.

O metod care deseori furnizeaz date importante n tentativa identificrii
unor componente din prob este cea de aplicare pe placa cromatografic a
unui spot cu conine un compus din specia cutat purificat ce este probabil
prezent n cea necunoscut. Se compar apoi valorile RF ntre spotul
substanei necunoscute cu cel al standardului. Valorile identice ale celor dou
RF furnizeaz o dovad solid a identitii celor dou componente ale probei
(figura de mai jos). Totui, confirmarea este ntotdeauna necesar. Un test uor
de confirmare este de a repeta experimentul cu faze mobile i staionare
diferite ct i cu reactivi de vizualizare diferii.

Separarea unor derivai xantinici pe un

suport de cromatografie pe strat subire
tip C-18 de faz invers. Faza mobil:
metanol/ K2HPO4, 0,l M (55:45 v/v).
Detecie: vapori de iod. Timpul de separare
cromatografic: 1 or, valorile RF:
teobromin, 0,68; teofilin, 0,56; cafein,
0,44; 3-izobutil-1-metil xantin, 0,21.

Cromatografia planar bidimensional

Figura de mai jos ilustreaz separarea unor aminoacizi dintr-un amestec prin
cromatografiere n dou dimensiuni. Proba se plaseaz n colul unei plci cromatografice de
form ptrat. Cromatografierea se realizeaz n direcie ascendent, n solventul A. Acest
solvent este apoi ndeprtat prin evaporare iar placa cromatografic este rotit cu 90o, dup
care se cromatografiaz ascendent cu solventul B.

Cromatogram bidimensional pe strat subire

(silica gel) a unor aminoacizi. Solventul A:
toluen/2-clor etanol/piridin. Solvent B:
cloroform/alcool benzilic/acid acetic.
Aminoacizi: (1) acid aspartic, (2) acid
glutamic, (3) serin, (4) -alanin, (5) glicine,
(6) alanin, (7) metionin, (8) valine, (9)
izoleucin i (10) cistein.

Analize cantitative

O estimare semicantitativ a cantitii de component prezent

poate fi obinut prin compararea ariilor spoturilor cu cea a
standardelor. Date mai exacte pot fi obinute prin rzuirea
spotului de pe placa cromatografic, urmat de extracia sa de
pe aceasta dup care se recurge la msurarea printr-o analiz
fizico-chimic convenabil. A treia metod este cea care se
realizeaz prin scanarea cu ajutorul unui densitometru i care se
preteaz la determinri ale radiaiei emise de spot, prin
fluorescen ori prin reflecie

Cromatografia planar n laboratorul clinic

AMINOACIZI

ACIZI BILIARI

n laboratoarele clinice, estimarea acizilor

liberi n fluidele biologice i esuturi prin
cromatografiei n strat subire conduce la
punerea unor diagnostice n maladii
congenitale ale metabolismului
aminoacizilor, cistinuria clasic, cistinuria
heterozigot, aminoacidopatii, sindrom
Alport,.etc.

n scopuri clinice, msurarea acizilor biliari

din specimene biologice (bil, ser, coninut
duodenal i extracte fecale proaspete)
conduce la punerea unui diagnostic n
cazul unor maladii hepatice i intestinale

Multe maladii sunt nsoite de intensificarea eliminrii unor diverse

CARBOHIDRAI zaharuri n probele biologice. Detecia i identificarea lor constituie o
etap important n stabilirea diagnosticului.

LIPIDE

profilurile lipidice se modific n diverse patologii, ceea ce conduce la

interesul crescut n determinarea lor n diagnosticul clinic.
Investigarea lipidelor serice, n special a esterilor de colesterol reprezint
o valoare mare n diagnosticul unor maladii hepato-funcionale ori n maladiile
legate de metabolismul lipidic. n maladiile legate de stocarea lipidelor,
acumularea de colesterol se manifest la nivelul sngelui i a esuturilor. O
hiperlipidemie este corelat cu factorii de risc n maladiile cardiovasculare.
Analiza lipidelor serice este de asemenea important n maladiile pielii.

Fosfolipidele sunt lipide polare i includ fosfogliceridele i

sfingolipidele. Acestea sunt constitueni amfipatici ai membranei,
jucnd un rol esenial n sinteza lipoproteinelor plasmatice.
Determinarea fosfolipidelor este deosebit de important n
biomedicin. Fosfolipidele de suprafa au o influen important n
FOSFOLIPIDE comportamentul mecanic al plmnilor. Studiile clinice la sarcinilor de
risc crescut apeleaz deseori la determinarea satusului de maturitate a
plmnului fetal. Msurarea fosfolipidelor din fluidul amniotic precum a
raportului lecitin/sfingomielin se realizeaz prin analize de
cromatografie pe strat subire, predicionnd astfel maturitatea
plmnului fetal.

PORFIRINE

Porfirinele sunt derivai tetrapirolici cu o structur porfinic,

fiind intermediari chimici n sinteza hemoglobinei, mioglobinei ori
a altor pigmeni respiratori, precum citocromii. Detecia i
identificarea porfirinelor i ai precursorilor acestora n probele
biologice sunt de o importan terapeutic uria. Ele sunt
analizate n chimia clinic n scopul diagnosticrii unui grup de
maladii denumite porfirinemii, rezultate ale alterrii biosintezei
hemului. Acumularea i supraproducia a acestor produi
intermediari n esuturi, snge, urin ori n fecale indic blocarea
metabolic n sinteza hemului. Aceste maladii sunt asociate cu
manifestri acute i/sau cutanate.

Prostaglandine reprezint una dintre cele mai biologic active

familii de compui. Ele sunt acizi grai C20 nesaturai cu un inel
PROSTAGLANDINE ciclopentan.
Derivaii
care
conin
aceast
structur
(prostaglandine, prostacicline i tromboxani) sunt cunoscui sub
denumirea comun de prostanoizi. Prostaglandine se manifest
la concentraii de ordinul nanogramelor pn la cel al
picogramelor, n esutul uman i n fluidele corporale. Ele au
diverse aciuni biologice iar rolul lor fiziologic complet nu este nc
bine cunoscut.

Hormonii steroizi joac un rol vital n organismul uman, fiind

definii prin funcia lor biologic. Nivelurile hormonilor steroizi
activi ser i produii lor de eliminare din urin sunt de mare
semnificaie clinic. Hormonii glucocorticoizi contribuie la
activitatea adipogenic n serul uman. Maladia Addisons este
cauzat de deficien glucocorticoidic n timp ce n sindromul
Cushings se constat o secreie masiv. Concentraiile de
steroizi estrogenici din urina uman sunt importante n timpul
sarcinii.. Progesterona este de asemenea implicat n
HORMONI STEROIZI pregtirea i meninerea sarcinii. Niveluri crescute ale pregnan3, 20-diol i allopregnan-3, 20-diol urinare au fost
observate n sarcinile timpurii. Creterea 6-hidroxicortizolului
urinar este observat n timpul sarcinii ori n cazuri de
hiperadrenocorticism. Aldosterona urinar este analizat n
scopul identificrii pacienilor suferinzi de hiperaldosteronism.
Excreia urinar de metabolii andro- i glucocorticoizi este
studiat la pacieni suferinzi de cancer gastric n timp ce
excreia de dehidroepiandresteron, i n particular
eticolanolon reprezint un marker n cancerul de sn.

ALI COMPUI DE INTERES CLINIC

Gangliozidele reprezint un grup variat de glicosfingolipide compuse dintr-o caten

lung de baz i acid gras, care mpreun formeaz partea ceramidic (Nacilsfingozina). Aceasta este legat de un carbohidrat. Gangliozidele sunt caracterizate
de prezena uneia sau mai multor uniti de acid sialic n catena oligozaharidic.
Compuii de baz sunt acidul N-acetilneuraminic (Neu5Ac) i acidul N-glicolilneuraminic
(Neu5Gc), despre care se cunoate c joac roluri cruciale n diverse funcii biologice.
Gangliozidele sunt localizate pe partea extern a membranei plasmatice, reprezentnd
un mic procent din lipidele totale. Ele au fost de asemenea identificate n asociere cu
organitele celulare. Gangliozidele au un rol important n recunoaterea celul-celul,
adeziune celular, modularea proliferrii i difernierii celulare, fiind expresate la niveluri
nalte pe suprafaa celulelor umane, cel mai adesea n esuturile nervoase.

STUDII DE BIODISPONIBILITATE
Exist o experien deosebit n utilizarea cromatografiei pe stat subire n analiza
medicamentelor ori a drogurilor din probe biologice din medicin, toxicologie, farmacologie,
medicin legal, etc. Analizele de medicamente ori droguri se realizeaz n probe biologice diverse:
snge, urin, saliv, coninut gastric, esuturi, etc. iar tipul i cantitatea de prob luat n analiz
este funcie de substana care se dorete a fi determinat. De exemplu, n screening-ul abuzului de
medicamente se utilizeaz urina deoarece modalitatea de achiziie a specimenului este noninvaziv iar cele mai multe medicamente pot fi detectate chiar dup o durat rezonabil de timp de
la ingestie.
Analiza drogurilor n laboratoare clinice se realizeaz prin numeroase tehnici precum
imunoanaliza, metode cromatografice ori de spectrometrie de mas; alegerea optim de analiz
depinde de cost, efort uman ori tipul de medicament. Dintre tehnicile cromatografice, cromatografia
pe strat subire cu suport de silicagel este deosebit de utilizat n cazul programelor de screening
pentru medicamente. Toate probele care se analizeaz, sunt supuse unei trepte de pre-purificare,
naintea trimiterii lor la analizele cromatografice. S-a dezvoltat o metod computerizat de
identificare a post cromatografic a tipurilor de compui, procesul fiind utilizat la studiile de
screening a unor noi medicamente. Programul computerizat prelucreaz datele cromatografice
obinute experimental cu cele obinute pentru medicamente ori droguri cunoscute ori a metaboliilor
acestora regsii n ser, urin, ori alte specimene.

Cromatografia pe strat subire rmne cea mai utilizat tehnic n studiile de

toxicologie i n programele de screening de abuz de drog/medicament.
Sistemele de eluie recomandate sunt: acetat de etil/metanol/hidroxid de
amoniu pentru opioizi i droguri de baz, cloroform/aceton pentru
barbiturice i alte droguri acide, heptan/eter etilic/acid acetic i
cloroform/metanol/hidroxid de amoniu pentru canabinoizi.

APLICAII MODERNE ALE CROMATOGRAFIEI PLANARE

Cromatografia pe strat subire reprezint metoda cea mai utilizat

metod de detecie, separare i monitorizare a fosfolipidelor i a
glicosfingolipidelor precum i a unor compui de sintez ori a unor metabolii
ai acestora. n particular, procedeul cromatografic pe strat subire acoperit
cu anticorpi monoclonali a contribuit la dezvoltarea analizelor structurale a
glicosfingolipidelor. Exist o serie de dificulti n extracia lipidelor prin
utilizarea suporturilor cromatografice pe strat subire de performan nalt
deoarece contaminarea silicagelului i datorit scurgerii stratului subire de
silicagel n timpul tratamentului. Dac glicosfingolipidele sunt transferate de
pe placa HPTLC pe o membran de plastic cu proprieti hidrofobe, aceast
dificultate este surmontat.
Folosind avantajul unei bune separri a lipidelor pe un suport HPTLC i
de imobilizare a acestora pe o membran s-a dovedit c transferul optim se
realizeaz pe membrane de difluorur de poliviniliden (PVDF), comparativ
cu membranele de nitroceluloz, utilizate iniial care s-au dovedit a avea o
eficien de transfer sczut, fr reproductibilitate. Membranele de PVDF
sunt foarte stabile la nclzire i la diferii solveni organici iar n plus rein
lipidele cu o eficien deosebit.

Reprezentarea schematic a metodei de transfer

de pe suportul cromatografic pe o membran
sintetic, TLC blotting

Aceast metod a fost de numit tehnica de transfer de pe suportul

cromatografic, pe membrane sintetice, TLC blotting. Procedeul este
utilizat n studiul complexelor lipidice i este aplicabil n cercetarea
biochimic a lipidelor. Printre utilizrile procedeului amintim:
Purificri de laborator a complexelor lipidice;
Analize de spectrometrie de mas a complexelor lipidice, pe
membrane PVDF;
Analize de legare a microorganismelor pe membrane cu un lipid
imobilizat;
STUDIUL INTERACIILOR LIPIDPROTEIN PE MEMBRANE, CU UN LIPID
IMOBILIZAT.

IMUNOCOLORAREA MEMBRANELOR DE DIFLUORUR DE POLIVINILIDEN.

Antigenii lipidici pot fi imunocolorai, direct pe membran. Dup transfer,

membranele de difluorur de poliviniliden sunt imersate ntr-o soluie de albumin
seric bovin pentru a bloca legarea nespacific a proteinelor dup care se
incubeaz peste noapte n soluia anticorpului primar. Legarea primului anticorp la
antigenul lipidic se detecteaz prin reacia cu un al doilea anticorp (de obicei IgM
anti-oarece) ce este cuplat cu peroxidaz. Tratamentul cu substrat al acestei
enzime conduce la produi colorai care se vor evidenia specific la locul de legare
al primului anticorp. Limita inferioar de detecie pe membrane de PVDF este de
aproximativ 1/5 din antigen, din cea de detectare pe placa cromatografic ceea ce
indic faptul c glicosfingolipidul este concentrat numai pe o parte a membranei
alturi de faptul c nu se manifest nici un fenomen de natur chimic n timpul
procesului de transfer.

TLC BLOTTING N PURIFICAREA COMPLEXELOR LIPIDIC

A fost dezvoltat o tehnic de purificare a glicosfingolipidelor i a
fosfolipidelor, care utilizeaz tehnica de TLC blotting de pe plcile de
cromatografie pe strat subire de performan nalt. Astfel, glicosfingopidele
sau fosfolipidele separate pe plci HPTLC sunt evideniate cu un reactiv pe
baz de primuline (C21H14N3NaO3S3, alte denumiri comerciale Direct Yellow 59,
Primuline Yellow, etc.) care permite detecia cu mare sensibilitate a
componentelor lipidice (figura de mai jos.). Primulinele sunt derivai de
dehidrotiotoluidin, formai printr-o reacie de fuziune cu para toluidin i sulf, la
temperatur nalt.

ANALIZE TLC BLOTTING/SPECTROMETRIE DE MAS

ANALIZE DE LEGARE A MICROORGANISMELOR PE MEMBRANE CU LIPID

IMOBILIZAT

STUDII ALE INTERACIEI LIPID-PROTEIN PE MEMBRANE, CU LIPID

IMOBILIZAT

Gel-filtrarea pe strat subire

Caracterizarea structural a prii carbohidrat a unei glicoproteine implic
determinarea a mrimii unitii zacharidice. Acest parameteru este uzual calculat din
compoziia i masa molecular a glicopeptidelor care sunt obinute dup degradarea
proteolitic a glicoproteinei intacte. Masa molecular este n mod obinuit estimat prin
metode precum echilibrul de sedimentare prin ultracentrifugare i cromatografia de gel
filtrare.
Tehnica de gel filtrare pe strat subire a devenit o alternativ atractibil de
determinare a maselor moleculare a glicopeptidelor datorit vitezei, adaptabilitii la
cantiti mici de prob, marii puteri de rezoolvare, posibilitii de utilizare a unor solveni
denaturani, i a utilizrii unei aparaturi ieftine. Aceast tehnic a fost dezvoltat pentru
estimarea masei moleculare a unor proteine (> 12.000 daltoni) utiliznd solveni
nedenaturani ori denaturani.

CROMATOGRAFIA CU FAZ INVERS PE COLOAN A PROTEINELOR

Cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers reprezint o tehnic bine stabilit de izolare,
analiz i de elucidare a structurii peptidelor i proteinelor. Utilizarea sa n izolarea unei proteine ori
de purificare a prezentat un maximum de interes n purificarea unor proteine pn n momentul
dezvoltrii unor suporturi de cromatografie de schimb ionic ori de interacie hidrofob de nalt
eficien, care n momentul de fa sunt apte a realiza nivele de rezoluie echivalente cu cele
obinute prin cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers, fr a prezenta riscul de denaturare
a probei i astfel de pierdere a activitii biologice. Cu toate acestea exist o multitudine de aplicaii
n care denaturarea poate fi neglijat ori pot fi tolerate concentraii crescute de modificator organic
(este cazul analizelor de puritate, studii structurale ori purificri micropreparative naintea
microsecvenierii). Tehnica este deseori utilizat n biotehnologie n monitorizarea unor procese,
studii de puritate sau de determinri ale stabilitii.

Principiul separrii n cromatografia de nalt rezoluie cu faz

invers
Aplicarea unui gradient de solvent este n mare superioar eluiei izocratice deoarece se
realizeaz ntr-un cadru de timp rezonabil iar mprtierea peak-ului este redus, ceea ce crete
sensibilitatea metodei. n eluia n gradient n cazul cromatografia de nalt rezoluie cu faz
invers, proteinele sunt reinute esenial pe baza caracterului lor hidrofob. Mecanismul de retenie
poate fi considerat att un fenomen de adsorbie a solutului la suprafaa fazei staionare hidrofobe
ct i un proces de partiie ntre faza mobil i cea staion.
n primul caz, retenia este legat de suprafaa total interfacial a suportului mpachetat de
faz invers, fiind exprimat prin coeficientul de adsorbie, KA. Retenia se bazeaz pe asocierea
hidrofob ntre solut i liganzii hidrofobi de pe suprafa. Prin creterea triei solventului a fazei
mobile, forele de atracie sunt din ce n ce mai reduse proces ce conduce la eluia solutului.
Procesul poate fi privit ca fiind condus n mod entropic i endotermic, de exemplu, att S ct i H
sunt pozitive. Prin relaia dintre factorul de capacitate a solutului k i proprietile fazelor mobil i
staionar, teoria solvofobic permite predicia efectulului modificatorului organic a fazei mobile,
tria ionic, reactivul de mperechere a ionului, tipul de ligand al suportului mpachetat precum i
alte variabile ce implic retenia cromatografic a proteinelor.
n al doilea caz se consider o partiionare a solutului ntre fazele mobil i staionar, ultima
fiind vzut ca o faz ncrcat hidrofob. Acest sistem se aseamn cu un sistem bifazic noctanol/ap a crui selectivitate este exprimat prin coeficintul de partiie P a solutului. n esen,
procesul efectiv este n mare parte dependent de organizarea molecular a catenei n-alchil a
catenei legate n structura suportului de faz invers n stare solvatat, de mrimea i conformaia
solutului.

Retenia proteinei n cazul cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers

este guvernat n principal de suprafaa proteinei i nu de chimia suprafeei
suport. Dei o serie de proteine prezint o pierdere a activitii n timpul
cromatografiei de nalt rezoluie cu faz invers, altele i menin total
activitatea biologic. Astfel, forele hidrofobe necesare legrii de faza invers
competiioneaz cu cele necesare meninerii structurii secundare i teriare a
proteinei. Prin constrngeri sterice, hidrofobe i ionice aceste proprieti
structurale definesc o suprafa cromatografic sau o amprent a proteinei
care la rndul ei definete legarea de faza invers. Acest concept al atarii
multipunctuale a proteinei la suprafeele de adsorbent este consecvent cu o
amprent cromatografic relativ mare pentru o protein comparativ cu cea a unei
molecule mici.

Componentul organic al fazei mobile

Cei mai populari solveni organici sunt acetonitrilul, 1-propanolul i 2-propanolul (alcoolul
izopropilic). Propanolii sunt mult mai vscoi dect acetonitrilul, ceea ce conduce la o mai mare
presiune pe coloan ns acest fenomen nu este important n condiiile n care se utilizeaz viteze
de curgere mici i coloane cromatografice scurte. Concentraia de acetonitril necesar eluiei unei
proteine este considerabil mai mare dect concentraia echivalent de 2-propanol, aproximativ
jumtate fa de primul solvent. S-a evideniat de asemenea c acetonitrilul este n mod intrinsec
mult mai denaturant dect alcoolii, procesul de recuperare fiind deseori mai mare cnd se utilizeaz
faze mobile care conin propanol, n special n cazul n care se separ o serie de proteine precum
ovalbumina. Acetonitrilul i 2-propanolul pot fi ngheai n amestecuri ghea carbonic/amestecuri
de alcooli i astfel proba poate fi liofilizat. Toi solvenii trebuie s fie de cea mai nalt caltate
posibil.
Aditivi minori la faza mobil
Componenii minori cei mai utilizai n cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers sunt
acizii perfluoroalcanoic (acid trifluoroacetic - TFA i acidul heptafluorobutiric, de exemplu). Acetia
par a disocia - solubiliza proteinele n majoritatea solvenilor organici utilizai n mod curent. TFA
este preferat n comparaie cu ali acizi disociatori deoarece este complet volatil i nu va coroda
coloana de oel. TFA acioneaz de asemenea ca un agent de mperechere de ioni, slab hidrofob.
Cele mai multe coloane utilizate n cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers sunt pe baz
de silice i pe lng supresia ionizrii silanolului n condiii acide (i n consecin eliminarea
interaciilor ionice) ele sunt mult mai stabile la valori sczute de pH. Totui, trebuie avut n vedere
c multe polipeptide i vor pierde structura teriar la aceste pH-uri.

Cromatografia cu faz invers ofer dou capabiliti importante n purificarea i izolarea unor
proteine sau peptide pentru analizele de proteomic, dup cum urmeaz:

nalt rezoluie.

Compatibilitate cu spectroscopia de mas.

Proteinele i peptidele ce difer printrun singur rest de aminoacid pot fi deseori separate prin
cromatografie de nalt performan cu faz invers (RP-HPLC), dup cum se observ n figura de
mai jos.
Literatura tiinific conine multe exemple de separare a unor polipetide similare precum
separarea factorului insulin-like de cretere ce difer printr-o metionin oxidat de analogul
neoxidat ori a interleukin-2 muteinelor ce difer printr-o substituie la un singur aminoacid. n alt
caz, s-au separat variante de insulin care posed uoare diferene n secvena de aminoacizi.

Separarea variantelor de insulin (n ordinea

de eluie: pui, bovin, ovin, de iepure, de om,
porcin, de obolan tip I i de obolan tip II).
Insulina de iepure conine o reonin, iar cea
de om o serin, o diferen de o grupare metil
ntr-o protein de 5300 daltoni. Condiii de
separare prin RP-HPLC: coloan C4, separare
n gradient de acetonitril cuprins ntre 27% i
30% acetonilitril in H2O, n prezena a 0,1%
TFA, vitez de curgere 1,5 ml/min.

Mecanismul separrii polipeptidelor prin cromatografie cu faz invers

Cromatografia cu faz invers separ polipeptide printr-un mecanism de adsorbie,

cu toate c n cazul moleculelor mici, acestea sunt separate printr-un mecanism de
echilibru care distribuie moleculele ntre fazele staionar i mobil n timpul trecerii
lor prin coloan, n timp ce polipeptidele mici fiind prea mari pentru a ptrunde n
faza staionar hidrofob, sunt adsorbite de suprafa i desorbite odat cu
creterea concentraiilor de faz mobil (figura de mai jos).

Mecanismul reteniei de proteine prin RPC. Proteinele ptrund n coloan i sunt adsorbite la
suprafaa hidrofob. Datorit mrimii lor, numai o poriune a acestor proteine braul
hidrofob se leag la adsorbent. La adugarea unor concentraii precise de solvent organic
proteinele sunt eliberate i prsesc suprafaa cobornd de-a lungul colonei.

n momentul injectrii pe coloan, polipeptidele se leag la suprafaa

adsorbentului i se desorb numai cnd solventul organic atinge o concentraie
specific i unic. Odat desorbite, ele vor interaciona foarte slab cu suprafaa
adsorbentului fiind astfel eluate le-a lungul coloanei. Polipeptidele pot fi
imaginate ca o aluviune pe faza staionar, cu cea mai mare parte a moleculei
expus la faza mobil i numai o parte a moleculei, denumit picior hidrofob, n
contact cu suprafaa de faz invers.
Diferenele n braul hidrofob al polipeptidelor rezult din secvena de
amioacizi i din diferenele de conformaie (fenomen discutat n cazul
hidrofobicitii proteinelor). Desorbia are loc ntr-o fereastr ngust de
concentraie al unui modificator organic. Astfel, retenia polipeptidelor este
complet pn la atingerea unei concentraii critice de modificator organic cnd
acestea sunt rapid desorbite. Sensibilitatea desorbiei unui polipeptid la o
concentraie precis de modificator organic conduce la selectivitatea RPC n
separarea polipeptidelor, n peak-uri n general nguste. Peptidele mici se
desorb mai rapid odat cu schimbarea concentraiei de modificator organic
dect moleculele mici, totui, ele se desorb mai gradual dect proteinele ceea
ce sugereaz un mecanism hibrid de separare.

CROMATOGRAFIA CU PERECHI DE IONI

Cromatografia cu perechi de ioni este un tip de cromatografie de faz invers
utilizat la separarea i determinarea unor specii ionice. Faza mobil n cromatografia
cu perechi de ioni este constituit din tampoane apoase care conin un solvent
organic precum metanolul ori acetonitrilul i un compus ionic care conine un
contraion cu sarcin opus analitului. Contraionul este un ion care se combin cu ionii
analitului pentru a forma o pereche de ioni, neutr, specie care se reine pe un suport
de faz invers.

Sisteme cromatografice cu faz invers pentru perechi de ioni.

Faza mobil

Proba

Contraion

Tipul fazei
staionare

Amine

HClO4, 0,1 M /H2O/acetonitril

H2O/CH3OH/H2SO4

CIO4C12H25SO3-

FLa
FL

Acizi carboxilici

pH 7,4
pH 7,4

(C4H9)4N+
(C4H9)4N+

FL
Lb

Acizi sulfonici

H20/C3H7OH
pH 7,4
pH 3,8

(C16H33)(CH3)3N+
(C4H9)4N+
Bis-(2-etilhexil)fosfat

FL
Lb
Lc

Colorani

pH 2-4;H20/CH3OH

(C4H9)4N+

FL

CROMATOGRAFIA DE ADSORBIE
Cromatografia de adsorbie, ori cromatografia lichid-solid, reprezint forma clasic a
cromatografiei lichide, care a fost introdus, pentru prima dat, de ctre Tswett, la nceputul
secolului douzeci. n ultimii ani ea a fost adaptat, devenind o metod important n cromatografia
lichid de nalt presiune (HPLC).
n cromatografia de adsorbie compuii ce se doresc separai sunt adsorbii pe suprafaa unui
material solid, fiind apoi desorbii din solidul adsorbent prin eluie cu un solvent. Separarea
compuilor depinde de balana relativ dintre afinitatea compuilor pentru adsorbent i solubilitatea
lor n solventul utilizat. Afinitile relative ale compuilor ce se doresc separai sunt funcie de natura
chimic a substanei, de natura solventului i de natura adsorbentului. Studiile de cromatografie au
artat c adsorbenii cei mai utilizai sunt silicagelul, crbunele, celuloza, amidonul, gelurile de
fosfat de calciu, hidroxilapatita i sucroza. Cei mai utilizai solveni sunt: hexanul, benzenul, eterul
de petrol, eterul etilic, cloroformul, clorura de metilen, diveri alcooli (alcoolii etilic, propilic, n-butilic
i t-butilic), diverse tampoane apoase ori soluii de sruri, unele n combinaii cu solveni organici.
Cromatografia de adsorbie: A = adsorbent, S = prob,
ES = solvent de eluie. (1) aplicarea probei la captul
superior al coloane cromatografice; (2) adsorbia
probei pe suportul adsorbent. (3) adugarea de solvent
de eluie;. (4) i (5) fracionarea parial a
componentelor 2 si 3; (6) fracionarea complet a
probei; (7) i (8) Separarea tuturor celor trei
componente la diverse stadii de eluie; (9) eluia
primului component de pe coloan.


Adsorbenii solizi utilizai n mod obinuit sunt alumina, silicagelul, crbunele,
celuloza, amidonul, gelurile de fosfat de calciu, hidroxilapatita i sucroza. n
cromatografia modern fazelele staionare cel mai mult utilizate n sunt silicea i
alumina, ultima dintre acestea fiind cea mai preferat n cele mai multe aplicaii
datorit capacitii sale nalte de ncrcare cu prob i datorit domeniului larg de
forme utilizabile. Solvenii obinuit utilizai sunt: hexanul, benzenul, eterul de
petrol, dietil eterul, cloroformul, clorura de metilen, diveri alcooli (etil, propil, nbutil i t-butil alcooli), alturi de diferite tampoane apoase i sruri, unele n
combinaie cu solvenii organici.

Cu puine excepii, caracteristicile de adsorpie a dou substane se pot

compara, ordinea timpilor de retenie fiind: olefine < hidrocarburi aromatice <
halide, sulfuri <eteri < nitro-compui < esteri aldehide cetone < alcooli amine
< sulfone < suloxizi <amide <acizi carboxilici (suprafeele de silice i alumin sunt
nalt polare, eluiile efectundu-se n mod obinuit cu faze mobile oarecum mai
puin polare. Astfel, o serie de cercettori trateaz cromatografia de adsorpie
drept un tip de cromatografie de faz normal.

APLICAII ALE CROMATOGRAFIEI DE ADSORBIE

Tehnica cromatografie de adsorbie este cea mai fezabil pentru compui nepolari
care posed mase moleculare mai mici de 5000.
Cu toate c exist o suprapunere ntre cromatografia de adsorbie i cea de
partiie, metodele tind a fi complementare.

O
aplicaie
caracteristic
a
cromatografiei
de
adsorbie
n
separarea cis- i trans-pirazolinelor.
Coloan: 100 x 0.3 cm, suport silice
pelicular. Faz mobil: clorur de
metilen/izooctan 50%. Temperatura:
ambiant. Vitez de curgere: 0,225
mL/min. Detector: UV, 254 nm.

CROMATOGRAFIA PE HIDROXIAPATIT

O condiie necesar n oricare strategie de purificare a proteinelor o reprezint

combinarea tehnicilor care exploateaz diferite principii de separare n
scopul atingerii purificrii celei mai nalte utiliznd un numr ct mai redus
de trepte de purificare. n general, combinri ale unor tehnici precum
cromatografia de schimb ionic, cromatografia de interacie hidrofob, cromatografia
de afinitate, cromatografia de afinitate cu metal chelat, cromatografia de excluziune
molecular i cromatografia de faz invers ofer cele mai versatile abordri n
design-ul unui protocol de purificare a proteinelor. Aceasta este datorat faptului c
metodele de separare au la baz principii bine caracterizate i predictibile. Pentru o
multitudine de raiuni, cromatografia pe hidroxilapatit (HAP) a cptat numai o
popularitate marginal ca metod de purificare a proteinelor. Ea prezint
comportament cromatografic nepredictibil, o capacitate relativ mic de ncrcare a
probei i proprieti de manipulare relativ dificile. Pentru aceste raiuni, HAP este
deseori considerat drept ultima alegere in metodologia de separare a proteinelor.
Pe de alt parte, cum procesele de adsorbie-desorbie a proteinelor difer
semnificativ de alte tehnici precum de exemplu cromatografia de schimb ionic,
uneori este posibil de a obine fracionri a cror calitate nu poate fi realizat prin
alte tehnici cromatografice, unde deseori tehnicile cromatografice convenionale pot
fi de nefolosit.

Fosfatul de calciu a fost deseori utilizat n purificarea proteinelor i a enzimelor cu succese

diferite nc de la nceputul cercetrii tiinifice n domeniu, de ctre Brucke (1861) n purificarea
pepsinei. n anul 1956, Tiselius i colaboratorii (1956) au artat c un suport cromatografic mai
adsorbent de proteine este realizat prin conversia brushitei, Ca3(PO4)2, la hidroxiapatit,
Ca5(PO4)3OH, (Ca10(PO4)6(OH)2) prin fierbere ntr-o soluie de NaOH 1% timp de 1 or. n
continuare, cristalele fine de hidroxiapatit pot fi separate prin decantare nainte de
mpachetarea coloanei. Hidroxiapatita leag mai puternic proteinele native, dar capacitatea de
retenie scade semnificativ n cazul proteinelor supuse procesului de denaturare. Retenia
proteinelor pe suportul de hidroxiapatit nu este uor predictibil, precizabil. Dei hidroxiapatita
leag att proteine acide ct i pe cele bazice nu se poate vorbi de un mecanism simplu
de cromatografie prin schimb ionic n comportamentul cromatografic observat. Structura
de suprafa a cristalelor de hidroxiapatit este reprezentat de un mozaic de situsuri de
adsorbie pozitive (ionii de calciu) i negative (ionii fosfat). Adsorbia unor componeni
anionic se realizeaz la domeniul de sarcini pozitive reprezentat de ionii de calciu (situs C), n
timp ce domeniile de sarcini negative ce cuprind ionii fosfat (situsurile P) pot fi considerate drept
schimbtoare de cationi. Se poate considera astfel HAP drept o tehnic cromatografic de
"pseudo-afinitate" sau drept o metod de cromatografie de schimb ionic de tip "mixt". La valori de
pH neutre i alcaline, suprafaa de hidroxiapatit este ncrcat negativ datorit gruprilor fosfat.

MECANISMUL LEGRII PROTEINELOR LA HIDROXIAPATIT

Mecanismul legrii proteinelor la hidroxiapatit i de eluie de pe aceasta a fost
explicitat de ctre Gorbunoff. El se manifest prin:
(1) complexarea specific a gruprilor carboxil proteice cu locii de calciu ale cristalelor
de hidroxiapatit (de exemplu complexe, [HACa-OOC - protein]) i prin
(2) atracia nespecific dintre gruprile amino ncrcate pozitiv ale proteinelor i
sarcinile negative ale hidroxiapatitei (complexe de tipul [HAPO3---H3+N-protein]).
Astfel, suprafaa cristalelor de hidroxiapatit prezint un mozaic de situsuri pozitive (de
calciu) i negative (de fosfat), suprafaa coloanei de hidroxiapatit poate fi vzut ca
negativ la un pH egal cu 6.8, la care coloanele de HAP se manipuleaz n general,
datorit neutralizrii pariale a locilor pozitivi de calciu de ctre ionii fosfat (figura de mai
jos).

Legarea proteinei la hidroxiapatit. A reprezint o

protein bazic n timp ce B este o protein acid.
Parantezele duble indicat fenomenul de repulsie n
timp ce liniile punctate sunt legturile ionice. Sgeata
triunghiular indic legturile coordinati

n aceste condiii, eluia de pe coloan poate fi afectat att ca rezultat

al interaciilor nespecifice ionice de (de tipul Debye-Huckel) ori ca rezultat
al dezlocuirii specifice ale gruprilor proteice de pe situsul C al
hidroxiapatitei cu care au fost complexate. Din aceste consideraii rezult
c:
Proteinele bazice pot fi eluate de pe mediile de hidroxiapatit cu soluii
cu molariti foarte sczute (de exemplu 0,005M) de sruri de Ca2+ i de
Mg2+,
Proteinele cu valori ale pI cuprinse ntre 5 i 8, cu soluii de MgCl2 1,0
M, i,
Proteinele acide cu soluii fosfat 0,3 M.
n general, HAP este realizat prin eluie n gradient linear (deseori creat n
domeniul 10 pn la 400 mM) tampon fosfat, la un de pH 6,8, alctuit din
amestecuri echimoleculare de fosfai sodiu ori potasiu mono i dibazici.
Deoarece hidroxiapatita este stabil numai la valori ale pH-ului mai mari de 5,
tampoanele de eluie cu pH acid nu trebuiesc s fie utilizate.

APLICAII ALE CROMATOGRAFIEI PE HIDROXIAPATIT

n tehnicile de cromatografie pe hidroxiapatit, coloana este de obicei echilibrat, n timp ce
proba este aplicat la o concentraie mic de tampon fosfat la un pH de 6,8. Proba de pe coloan
este apoi developat cu un gradient de concentraie de tampon fosfat. n funcie de aplicaie, n
unele cazuri, un foarte ngust gradient (de exemplu ntre 0,02 la 0,05 M fosfat) conduce la rezultate
excelente, n timp ce n alte situaii este necesar un gradient mare, cuprins de exemplu ntre 0,02 i
0,35 M fosfat pentru a separare optim. Figura urmtoare. ilustreaz tehnica de purificare a
ovomucoidului comercial prin cromatografie pe coloan de HAP.

Purificarea
ovomucoidului
comercial pe o coloan de
hidroxiapatit. Treapta I conine
material inactiv cu un maximum de
absorbie la 260 nm; pe parcursul
treptei a II a se separ ovomucoidul
n form activ; volumul III conine
lizozim; ulima treapt - IV conduce
la separarea unor impuriti, de
tipul tripsinei i chimotripsinei.

Ovomucoidul comercial conine o multitudine de impuriti precum

lizozim, ovoinhibitor, conalbumin i ovalbumin. Profilul cromatografic din
figur arat c la aplicarea a dou probe de ovomucoid la o coloan de
HAP echilibrat cu 0,001 M NaCl, splarea coloanei cu NaCl 0,001 M,
urmat de eluia n trepte cu 0.01 M PO4, pH 6,8 (pentru a elua
ovomucoidul, o glicoprotein cu o structur deschis), 0;5 M NaCl (pentru a
elua proteinele bazice precum lizozimul i ovoinhibitororul) i 0,5 M PO4
(pentru a epuiza coloana de alte proteine acide) conduce la obinerea
ovomucoidului ntr-o form nalt purificat.

ghid de utilizare a HAP n cromatografie

n cazul amestecurilor de proteine n mare parte bazice sau dac se dorete reinerea
proteinelor bazice fr o pierdere a proteinelor acide, coloanele se echilibreaz cu fosfat,
0,001 M, pH 6.8.
n scopul separrii unor amestecuri de proteine n general acide n special n cazul
glicoproteinelor (sau dac una din proteinele pe care dorim a se reine este acid, n timp ce
este posibil pierderea unor proteine neutre i acide, se utilizeaz coloane echilibrate cu NaCl
(NaCl 0,001 M netamponat).
Se utilizeaz coloane echilibrate cu MgCl2 sau CaCl2 (MgCl2 0,001 M sau CaCl2
netamponate) numai pentru proteinele acide care nu se leag la coloane echilibrate cu NaCl.
Dac proba a fost ncrcat, coloana trebuie s se spele utiliznd acelai tampon care a
fost utilizat la echilibrarea coloanei. n general n procedurile de eluie este necesar a se
urmri separarea proteinelor n ordinea: proteinele bazice se elueaz nti, apoi proteinele
neutre i n final cele acide.

Dac se urmrete purificarea unor proteine individuale se utilizeaz n general

sistemul de tampon fosfat, la o concentraie potrivit (cu sau fr prezena unei alte
sruri). Deoarece NaCl nu reuete de multe ori s elueze multe proteine neutre ori
acide, este necesar deseori a se crea un gradient de NaCl, de obicei cuprins ntre 0,01 0,5 M NaCl, n cazul purificrii proteinelor bazice de pe HAP.
n unele cazuri, deoarece att NaCl ct i sulfatul de amoniu nu afecteaz eluie
proteinelor neutre sau acide pe HAP, o prob proteic provenit de pe o coloan de
schimb ionic developat cu un gradient de NaCl poate fi ncrcat direct pe o coloan
de HAP. n acest context se poate exemplifica purificarea proteazelor din
microorganisme halofile prin cromatografie pe HAP n prezena unei soluii de NaCl de o
concentraie de 3,4 M. Alte exemple de purificare a proteinelor pe coloan de HAP sunt
reprezentate de izoformele ceruloplasminei umane, anticorpi monoclonali, tubulin,
histone din cromatin, fumarazele citosolice i mitocondriene din drojdia de bere, etc.
Hidroxiapatita a fost utilizat cu succes n prezena detergenilor neionici (de
exemplu, Triton X-100) pentru purificarea proteinelor membranare precum i a proteinei
transportoare ADP/ATP, proteinei transportoare a ionului fosfat, a ubiquinol:citocrom c
reductaza ori a citocrom c oxidaza.

CROMATOGRAFIA DE INTERACIE HIDROFOB.

Adsorbia proteinelor prin cromatografie de interacie hidrofob (Hydrophobic Interaction

chromatography, HIC) este favorizat de concentraii nalte de sruri care structureaz apa. n mod
echivalent, contribuia srurilor a fost aplicat i altor clase de adsorbeni amfifilici ce nu sunt
analogi direci HIC.
n 1990, Porath a introdus termenul de cromatografia de adsorbie promovat de condiiile
saline (salt-promoted adsorption chromatography, SPAC) pentru a regrupa aceste tehnici
cromatografice ce necesit concentraii nalte de sruri pentru a determina adsorbia unei proteine.
Cromatografia de adsorbie tiofilic (thiophilic adsorption chromatog-raphy, TAC),
cromatografia donoracceptor de electron (electron donoracceptor chromatography, EDAC) i
cromatografia de interacie hidrofob (HIC) au fost aadar incluse n aceast familie. Efectul srii
asupra adsorbiei proteinei a fost explicat ca fiind rezultatul unor creteri nefavorabile ale energiei
libere, G, pentru proteinele nelegate n prezena unor concentraii nalte de sruri. Consecina
termodinamic a acesteia o reprezint favorizarea legrii proteinei la un ligand din cauza unei arii
de suprafa mai mic a complexului expus solventului i a cosolventului, altfel spus, forma legat a
proteinei este termodinamic mai stabil. Eluia proteinei de pe matrice este apoi realizat simplu,
prin suprimarea srii din tamponul de adsorbie. n HIC, interaciile hidrofobe se manifest ntre
zone hidrofobe aflate pe suprafaa proteinei i liganzii hidrofobi, legai la suport.
Primele geluri cu aplicaii practice pentru HIC au prezentat un caracter mixt, hidrofob.
Adsorbenii neutrii (alchil i aril eteri) au fost apoi preparai, ultimii conducnd la introducerea
suporturilor octil- i fenil- activate, curent utilizate n acest moment.

Porath i colaboratorii au descoperit adsorbia tiofilic pe suporturi

mercaptoetanoldivinil sulfon agaroz (geluri T). Mecanismul de adsorbie a fost
interpretat ca implicnd ataarea proteinei n dou puncte, la -mercaptoetanol i la
braul de spaiere divinlsulfonic, posibil printr-o interacie electron donoracceptor tiofilic.
Studii ulterioare au demonstrat caracteristici similare de adsorbie la geluri activate cu
epiclorhidrin la care s-a cuplat 2-mercaptopiridin. S-a mai artat c adsorbia
promovat de condiiile saline a fost eficient n favorizarea adsorbiei proteinelor pe un
gel cyanocarbon substitut, tricyanoaminopropendivinil hidroxipropilsulfon agaroz
(DVSTCP gel) prin intermediul unor interacii electron donoracceptor.
Toate gelurile sus-menionate necesit concentraii mari de sruri structurale de ap
pentru a favoriza legarea proteinelor, cu toate c mecanismele de interacie sunt diferite:
adsorbie specific hidrofob, interacie tiofilic, respectiv interacie electron donor
acceptor.

Cromatografia de interacie hidrofob posed avantajul c hidrofobicitatea

proteinelor conduce la separarea lor pe baza interaciilor hidrofobe dintre liganzi
hidrofobi imobilizai i regiunile nepolare de pe suprafaa proteinelor. Adsorbia
crete odat cu creterea concentraiei de sare n faza mobil iar eluia se
realizeaz prin scderea concentraiei de sare a eluentului. Din acest motiv, se
poate utiliza i termenul de adsorbie dependent de sare pentru acest tip de
cromatografie.

Diferitele tipuri de eluie pot fi utilizate pentru purificarea amestecurilor complexe de proteine
care ar fi dificil de separat utiliznd alte tehnici cromatografice. De fapt, HIC a fost utilizat cu
succes n scopuri de separare pe baza existenei unor caracteristici complementare de legare fa
de alte tehnici de cromatografiere a proteinelor. Van Oss i colaboratorii au artat c forele van der
Waals sunt factorii majori ce contribuie la interaciile hidrofobe (fore interfaciale) n ciuda
mecanismului complex implicat. Astfel, alterarea structural a biomoleculelor este minim i
activitatea lor biologic este meninut prin utilizarea HIC, dat interaciei mai slabe dect
cea regsit n cazul interaciei afine, schimbului de ioni sau a cromatografiei de faz
invers (RPC). HIC reprezint o cale alternativ de exploatare a proprietilor hidrofobe a
proteinelor, realizat ntr-un mediu mai polar i mai puin denaturant dect RPC, dup cum aceast
tehnic necesit utilizarea unor solveni nepolari pentru eluia proteinelor datorit legrii puternice la
adsorbent.
Cromatografia de interacie hidrofob a fost descris pentru prima dat de ctre Tiselius n
1948, care a notat faptul c o serie de compui precum coloranii pot fi reinui de ctre hrtia de
filtru n prezena unor soluii de sulfat ori de fosfat, fenomen denumit cu expresia de cromatografie
de extracie cu ajutorul srurilor (salting-out chromatography). Dup cum i numele o sugereaz,
HIC este o tehnic de separare bazat pe interaciile dintre proteine i o faz staionar
insolubil, nepolar imobilizat. HIC este complementar cromatografiei de schimb ionic i
cromatografiei de excludere molecular, iar mpreun cu tehnicile de separare mai sus
enumerate reprezint cele trei mecanisme distincte i generale de retenie disponibile unui
biochimist pentru purificarea proteinelor n aplicaiile proteomice. Cromatografia lichid de
nalt performan cu faz invers (RPC) poate fi aplicat serial la fraciile colectate dup HIC i
cromatografia de schimb ionic pentru purificarea ulterioar sau de ndeprtare a srurilor.

Cu toate c att HIC ct i cromatografia cu faz invers sunt metode de separare bazate pe
interacia proteinelor cu gruprile hidrofobe ale fazei staionare sunt bine de cunoscut diferenele
fundamentale ce exist ntre ele. n HIC, interaciile slabe hidrofobe dintre proteine i faza nepolar
staionar sunt mediate prin concentraii mari de sruri antichaotrope (Figura de mai jos) n timp
ce n cromatografia de faz invers (RPC) aceste interacii sunt mediate prin intermediul
modificatorilor organici.

Reprezentarea schematic a principiului de

separare prin HIC. Dup cum srurile neutre conduc la
precipitarea proteinelor, concentraiile mari de sruri
conduc la apariia unor interacii ntre zonele
hidrofobe de pe suprafaa proteinelor ceea ce are ca
rezultat precipitarea acestora din soluiile apoase.
Totui, prin creterea concentraiei de sruri chiar
pn la punctul de precipitare, prin utilizarea unor
concentraii mai diluate de protein i prin expunerea
soluiei proteice la o matrice slab hidrofob
imobilizat, proteinele se leag la matricea de pe
coloan mai uor dect s precipite. Sub aceste
condiii proteinele i menin conformaia nativ (de
exemplu proprietatea biologic). Aceasta este o
consideraie important n condiiile purificrii unor
enzime, eficiena separrii putnd fi realizat prin
monitorizarea activitii lor.

Mai puin probabil n cazul RPC, unde fazele mobile i organice au tendina
de a deplia (dezmembra, denatura) proteinele, faza staionar mpachetat i
condiiile de operare ale HIC sunt alese astfel nct menin proteinele n
conformaiile lor native, biologic active. n HIC, liganzii slab hidrofobi (comparativ
cu mpachetrile din RPC), cum ar fi gruprile nepolare cu caten scurt fenil ori
octil, sunt ataate chimic la matrice hidrofile, cnd se manifest interacii distincte
ntre proteine i suprafaa fazei staionare, prin utilizarea unei faze mobile ce
conine sruri antichaotrope de trie ionic mare. Contrar RPC, n cazul HIC sunt
utilizate densiti sczute de ligand pe matricea mpachetat (deseori o zecime
fa de suporturile utilizate n RPC).
n decursul ultimilor ani, HIC a fost dezvoltat de ctre muli cercettori iar
astzi reprezint o tehnic bine stabilit i deosebit de util n tehnicile de
separare cromatografic din laborator sau n procesele industriale de purificare a
proteinelor. Dezvoltarea unui numr mare de faze staionare diferite a condus la o
cretere a aplicaiilor HIC n purificarea unor biomolecule, precum proteine serice,
proteine nucleare, hormoni, proteine recombinante i enzime.

CROMATOGRAFIA DE ADSORBIE TIOFILIC

Importana atomilor de sulf pentru n cromatografia de adsorbie prin intermediul

unui ligand a fost recunoscut acum 40 de ani. Adsorbia aromatic a fost atunci un
fenomen studiat i s-a descoperit c ea este mediat prin imobilizarea de grupri 2,4dinitrofenil n timp ce un efect sinergistic de adsorbie a fost evideniat n condiiile n
care ligantul a coninut un atom de sulf n locul unuia de oxigen, aflat n apropierea
inelului aromatic. Aceasta a fost una dintre primele indicaii c atomul de sulf, ca parte a
ligandului are un efect de adsorbie a solutului. Tria acestei interacii a aprut
dependent de substituenii electrofili i nucleofili ai inelului aromatic; n fapt, s-a dovedit
c adsorbia are la baz formarea de complexe electron donoracceptor.
Asocierea dintre sorbenii tiofili i separarea imunoglobulinelor s-a realizat odat cu
demonstrarea acestei proprieti de ctre Porath i colaboratorii (1985) i a fcut
posibil fracionarea proteinelor plasmatice prin cromatografie pe sorbeni, derivai din
agaroz, realizai n urma reaciei dintre divinilsulfon i 2-mercaptoetanol. Dup
aceasta, acest mod de separare a fost deseori aplicat n purificarea anticorpilor
deoarece sorbentul prezint specificitate clar pentru acest tip de proteine. Aceast
descoperire a reprezentat o etap important n dezvoltarea metodelor de separare a
anticorpilor implicnd, drept liganzi cromatografici, o mare varietate de structuri chimice
care conin atomi de sulf i de azot, avnd diferite nivele de selectivitate.

Structural, cei mai obinuii sorbeni pentru cromatografia de adsorbie tiofilic deriv din
aa-numitul gel B; care conine liganzi lineari, cu doi atomi de sulf. Aceti derivai au fost gsii
destul de buni n legarea selectiv a imunoglobulinelor, n prezena unor concentraii mari de
sruri formatoare de structur a apei, denumite de altfel sruri liotrope, de tipul sulfatului de
amoniu sau sulfatului de sodiu. Din punct de vedere al acestei trsturi, cromatografia de
adsorbie tiofilic se aseamn cu cromatografia de interacie hidrofob: adsorbia este
favorizat de concentraii mari de sruri, eluia realizndu-se n condiiile n care concentraia lor
este redus. Totui, n cazul cromatografiei de adsorbie tiofilic nu se pot manifesta asocieri
hidrofobe sau interacii ionice cu sorbenii tiofilici deoarece structurile tio-etilsulfonice nu posed
o hidrofobicitate pronunat, pe de o parte i nu conin sarcini electrice, pe de alt parte.
Cromatografia de adsorbie tiofilic, descris de ctre Porath, s-a artat a fi de real folos n
purificarea anticorpilor monoclonali i n general n fracionarea proteinelor.
Matricele tiofilice de afinitate sunt cuplate cu ajutorul unor liganzi cu urmtoarea
structur chimic:

(M)atrice-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-X-Y
unde M reprezint matricea de agaroz iar X reprezint S, N ori O, iar Y este un rest
mic, alifatic, sau un heteroatom

Principiul operaional care st la baza cromatografiei de adsorbie tiofilic se

aseamn cu cel al cromatografiei de interacie hidrofob. Astfel, proteinele sunt legate
la trii ionice mari i eliberate n urma scderii triei ionice. Fa de matricele tradiionale
hidrofobe precum fenil-Sepharose sau octil-Sepharose, matricele tiofilice conduc la
randamente nalte de separare ct i la separri n zone nguste, avnd drept
caracteristic o afinitate nalt fa de imunoglobulinee i sczut fa de
albumine.

Cromatografia de adsorbie tiofilic este descris ca o metod de purificare a

anticorpilor monoclonali murini din supernatantul unor culturi celulare. n acest caz se
utilizeaz sulfat de potasiu n concentraie de 0,5M n tamponul de legare, obinnduse imunoglobuline de nalt puritate. Totui datorit concentraiei tipice sczute
anticorpilor monoclonali din supernatantul unor culturi celulare, capacitatea matrix-ului
este n consecin, de asemenea sczut. Capacitatea de legare a anticorpilor
monoclonali diluai poate fi crescut cu un factor de 10 sau mai mult prin schimbarea
srii liotrope din tamponul de legare, adic prin utilizarea sulfatului de amoniu i n
acelai timp prin creterea concentraiei sale pn la 1,0-1,2M

Purificarea anticorpilor monoclonali prin cromatografie de adsorbie tiofilic. Se ilustrareaz

legrea, splarea i eluia. Etape: I Legarea la concentraie mare de (NH4)2SO4, de exemplu,
1,2M (NH4)2SO4 II eluia la o concentraie sczut de (NH4)2SO4, de exemplu 0,8M (eluia
impuritilor). III eluia anticorpului monoclonal purificat realizat cu TRIS/HCI 0,05M, pH 9,0.

CROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC

Cromatografia de schimb ionic (ion-exchange chromatography, IEC), denumit uneori i
cromatografie ionic (IC), se refer la metodele moderne i eficiente de separare i determinare
a speciilor ionice, pe rini schimbtoare de ioni. Cromatografia de schimb ionic a fost iniial
dezvoltat la miljocul anilor 70 cnd s-a artat c un amestec de anion ori de cationi poate fi rapid
rezolvat pe coloane de cromatografie ori de nalt performa, mpachetate cu un suport alctuit
dintr-o rin schimbtoare de ioni, anioni ori cationi. n acel moment, detecia se realiza n general
prin msurtori conductometrice. Astzi, sunt disponibile diverse detectoare utilizate n
cromatografia de schimb ionic.
Schimbul ionic este probabil cea mai frecvent utilizat tehnic cromatografic pentru
separarea i purificarea proteinelor, polipeptidelor, acizilor nucleici, polinucleotidelor, a altor
biomolecule ncrcate electric. Raiuniunea pentru succesul cromatografiei de schimb ionic este
reprezentat de generala sa aplicabilitate, puterea sa matre de rezoluie i marii sale capaciti, a
simplicitii, reproductibilitii i controlabilitii ei.

Cromatografia de schimb ionic reprezint o variant a cromatografiei de adsorbie n

care adsorbentul solid posed grupri chimice ncrcate electric legate covalent la un
suport solid, inert. Ionii sunt legai electrostatic la gruprile ncrcate electric; aceti ioni
pot fi schimbai cu ionii aflai ntr-o soluie apoas. Schimbtorii de ioni sunt cel mai
frecvent utilizai n coloane, pentru a separa moleculele funcie de sarcin; deoarece
moleculele ncrcate electric se leag la schimbtorul de ioni reversibil i astfel ele pot fi
legate ori eluate prin schimbarea triei ionice sau a pH-ului solventului de eluie.

Dou tipuri de schimbtori de ioni sunt disponibile: unii care posed grupri funcionale legate
chimic, cu sarcini electrice negative denumii schimbtori cationici i alii care posed grupri
funcionale cu sarcini electrice pozitive denumii schimbtori anionici. Sarcinile de pe schimbtori
sunt balansate de ctre contraioni de tipul ionilor clorur n cazul schimbtorilor anionici i de ioni
metalici n cazul schimbtorilor cationici. Moleculele din soluie, care vor fi adsorbite pe schimbtori
au de asemenea sarcini nete care sunt i ele balansate de ctre contraioni. De exemplu, dac se
analizeaz un proces de schimb ionic i se consider c moleculele din soluie au sarcini negative
(X-), acestea sunt contrabalansate de ionii de sodiu (Na+). Astfel de molecule ncrcate electric
negativ pot fi cromatografiate pe un schimbtor anionic (A+), care posed ioni de clorur drept
contraioni pentru a se neutraliza i a produce A+Cl-. Cnd moleculele (Na+X-) din soluie
interacioneaz cu un schimbtor de ioni, X- dislocuie ionul clorur, Cl-, de pe schimbtor i se
leag electrostatic, formndu-se A+X-, simultan cu eliberarea ionilor de sodiu. Acest proces de
schimb ionic este ilustrat n figura de mai jos. Un proces similar, dar opus, se va produce pentru
molecule ncrcate pozitiv (Y+CI-), care se vor cromatografia pe un suport cu sarcini electrice
negative. Acesta este cazul schimbtorilor cationici (C-Na+), unde schimbtorii cationici vor lega
moleculele ncrcate pozitiv din soluie.

Schema unui proces de schimb ionic:

moleculele
(Na+X-)
din
soluie
interacioneaz cu un schimbtor de
ioni, X- dislocuie ionul clorur, Cl-, de pe
schimbtor i se leag electrostatic,
formndu-se
A+X-,
simultan
cu
eliberarea ionilor de sodiu.

ECHILIBRUL DE SCHIMB IONIC

Procesele de schimb ionic se bazeaz pe un echilibru de schimb dintre ionii din soluie
i ionii de acelai semn de pe suprafaa unui suport insolubil, cu mas molecular mare.
Schimbtorii naturali de ioni precum cleiurile i zeoliii au fost recunoscui i utilizai de
mult vreme. Rinile schimbtoare de ioni sintetice au fost produse pentru prima dat
la mijlocul anilor 1930 pentru dedurizarea i deionizarea apei ori pentru purificarea unor
soluii. Cele mai comune situsuri active ale unor rini schimbtoare de cationii sunt
gruprile sulfonil acide - SO3H+, puternic acid i carboxil acid, -COO-H+, slab acid.
Schimbtorii anionii conin grupri amino teriare -N(CH3)3OH-, puternic bazic, ori
grupri amino primare -NH3OH-, slab bazic.
n cazul n care un schimbtor de ioni de tipul acid sulfonic este adus n contact cu un solvent
apos care conine un cation, Mx+, se produce un echilibru de schimb ce poate fi descris prin reacia:
x RSO 3 H+ +

solid

x+

solutie

(RSO 3) x

x+

M + xH
solutie
solid

unde RSO-3H+ reprezint una din multitudinea

de grupri sulfonice ataate pe o
macromolecul polimeric.

n mod similar, un schimbtor bazic puternic interacioneaz cu un anion Ax- dup reacia:

xRN(CH3)OH + Axsolid
solutie

x-

[RH(CH3) 3]x A + xOH

solid
solutie

Ca un exemplu de aplicare a legii masei la un echilibru de schimb ionic, se consider pe

coloan are loc o reacie ntre un ion monovalent, B+ cu o grupare acid-sulfonic prezent pe
suportul cromatografic. Din considerente de neutralizare, retenia iniial a ionilor B+ se realizeaz
la captul superior al coloanei dup reacia:
unde (s) i (aq) delimiteaz faptul c sistemul conine o faz solid, respectiv apoas. Eluia
cu o soluie diluat de acid clorhidric, de exemplu, modific echilibrul din ecuaia 1 n partea
stng, ceea ce conduce la transferul parial a ionilor B+ din faza staionar n faza mobil. Aceti
ioni coboar apoi de-a lungul coloanei printr-o serie de transferuri ntre fazele staionar i mobil.
Constanta de echilibru Kex, pentru reacia de schimb prezentat n ecuaia 1 ia forma:

Dup rearanjare rezult:

unde [RSO3B+]s i [RSO3H+]s

reprezint concentraiile (strict sub
form de activiti) ale ionilor B+ i H+
n faza solid.

n timpul eluiei, concentraia ionilor de hidrogen din faza apoas este mult mai mare dect
concentraia ionilor de compus B, monovalent din faza mobil. Pe lng aceasta, schimbtorul
posed un numr enorm de situsuri de schimb ionic comparativ cu numrul de ioni B+ ce pot fi
reinui. Astfel, concentraia total a ionilor, [H+]aq i [RSO-3H+]s nu este afectat de schimburile din
ecuaia 1 ce descrie reacia global. Pentru acest motiv, n condiiile n care [RSO-3H+]s >> [B+]aq
termenii din dreapta ecuaiei 3 sunt n mod substanial constani i astfel se poate scrie:
unde K reprezint constanta ce corespunde
constantei de distribuie descris anterior. Astfel,
toate ecuaiile descrise n tratarea teoretic din
primul capitol pot fi aplicate cu succes.

Se poate nota c Kex din ecuaia 2 reprezint afinitatea rinii pentru ionul B+ comparativ cu un
alt ion (n cazul de fa, H+). n condiiile n care Kex este mare, se poate spune c exist o
puternic tendin a fazei solide de a reine B+; n cazul n care Kex este mic, efectul este diametral
opus. Prin selecia unui ion comun de referin precum H+, se pot compara experimental rapoartele
de distribuie pentru diveri ioni pe un tip dat de rin schimbtoare de ioni. Experimentele relev
c ionii polivaleni sunt mai puternic legai dect speciile cu o singur sarcin electric. Pentru un
numr de sarcini date, totui, apar diferene care sunt legate de mrimea ionului hidratat precum i
de alte proprieti. Astfel, pentru o rin schimbtoare de ioni sulfonat, clasic, obinuit, valorile
Kex scad n ordinea: Tl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+. Pentru cationii divaleni,
ordinea este: Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO22+.
n cazul anionilor, Kex pentru o rin bazic scade n ordinea: SO42-> C2O4- > I- > NO3- > Br- >
Cl- > HCO2- > CH3COO- > OH- > F-. Aceast serie este oarecum dependent de tipul de rin i
de condiiile de reacie, putnd fi considerat numai aproximativ.

Separarea prin cromatografie de schimb ionic depinde de adsorbia reversibil a

moleculelor de solut ncrcate electric la gruprile de semn contrar imobilizate pe
schimbtorul de ioni. Cele mai multe experimente sunt realizate n cinci etape
importante, ilustrate n figura urmtoare.

Principiul comatografiei de schimb

ionic realizat prin eluie n gradient de
sare (salin)

Prima etap o reprezint echilibrarea n care schimbtorul de ioni este adus n starea de start
n termeni de pH i trie ionic, stare ce va permite legarea moleculelor de solut. Gruprile
schimbtoare de ioni sunt asociate n acest moment cu contraionii de schimb (uzual anioni ori
cationi simplii, precum ionii clorur sau de sodiu).
Cea de a doua etap o reprezint aplicarea i adsorbia probei, n care moleculele de solut
care posed sarcini corespunztoare, ajung i dislocuie contraionul, legndu-se reversibil la suport.
Substanele nelegate vor fi eluate de pe schimbtor utiliznd acelai tampon de start.
n etapa a treia, substanele sunt ndeprtate de pe coloan prin schimbarea condiiilor de
eluie nefavorabile pentru legarea ionic a moleculelor de solut.
Aceast eluie implic n mod normal creterea triei ionice a tamponului de eluie sau
schimbarea pH-ului acestuia. n figura de mai sus, desorbia se realizeaz prin introducerea unui
gradient cresctor de sare, ceea ce conduce la eliberarea moleculelor de solut de pe coloan n
ordinea triei legrii lor, substanele cele mai slab legate elund primele.
Etapele a patra i a cincea sunt cele de ndeprtare de pe coloan a substanelor care nu au
fost eluate n condiiile experimentale anterioare i de reechilibrare a coloanei pentru un nou proces
de purificare.

Separarea este astfel obinut datorit diferenelor

de interacii dintre un schimbtor de ion cu molecule cu
densiti diferite de sarcin i de distribuie a acestora pe
suprafaa lor. Figura alturat prezint schematic modul
de legare a unor molecule cu sarcini diferite. Aceste
interacii pot fi controlate prin variaia condiiilor precum
tria ionic ori a pH-ului. Diferenele n proprietilor
electrice ale compuilor biologici sunt deseori
considerabile, din aceast cauz cromatografia de
schimb ionic este capabil s separe specii cu foarte
mici diferene n proprieti, de exemplu dou proteine
care difer numai printr-un aminoacid ionizabil, motiv
pentru care aceast tehnic este deosebit de important
n analiza biochimic.

Reprezentarea schematic a diferenei de legare i

de eluie ale unor molecule cu densiti diferite de
sarcin precum i de distribuie a sarcinilor pe
suprafaa lor.

FACTORUL DE CAPACITATE A L UNUI SCHIMBTOR DE IONI

Factorul de capacitate sau de retenie, k, este o msur a reteniei unui component netrebuind
a fi confundat cu capacitatea de ncrcare (mg prob/ml) ori cu capacitatea ionic (mmol/ml).

O cromatogram posibil pe baza

creia se poate calcula factorul de
capacitate
k,
a
unui
peak
cromatografic. Legend: V0 = void
volume, VR1 = volumul de eluie a
peak-ului 1, VR2 = volumul de eluie a
peak-ului 2, Vt = volumul total, wR1 =
limea peak-ului 1, wR2 = limea
peak-ului 2.
Factorul de capacitate se calculeaz pentru fiecare peak individual. De exemplu, factorul
de capacitate k pentru peak-ul 1 din figura alturat este derivat din ecuaia:

Tehnica de adsorbie precum cea de cromatografie de schimb ionic ofer factori mari de
capacitate dup cum condiiile experimentale pot fi alese astfel nct s conduc la volume de
retenie a peak-ului mari n exces a Vt, opus tehnicii de gel filtrare unde capacitatea este limitat
deoarece toate peak-urile trebuiesc eluate cu un volum egal cu (Vt - V0).

Capacitatea unui schimbtor de ioni este o msur cantitativ a abilitii sale de a

mbunti schimbul de contraioni, din aceast cauz fiind un parametru deosebit de important.
Capacitatea poate fi exprimat ca i capacitate ionic total, capacitate disponibil sau capacitate
dinamic.
Capacitatea ionic total reprezint numrul de grupri ncrcate electric substituite per gram
de schimbtor uscat ori per gram de schimbtor mbibat. Capacitatea ionic total poate fi
msurat prin titrare cu un acid sau o baz puternic.
Cantitatea total de protein care poate fi legat la un schimbtor de ioni, n condiii
experimentale definite, determin capacitatea disponibil pentru gel. Dac condiiile definite includ
i viteza de curgere la care gelul opereaz, cantitatea legat se refer la capacitatea dinamic
pentru schimbtorul de ioni. Capacitatea disponibil i cea dinamic depind de:
proprietile proteinei;
proprietile schimbtorului de ioni;
condiiile experimentale alese;

Proprietile proteinei care determin disponibilitatea sau capacitatea sa dinamic pe o

matrice schimbtoare de ioni particular sunt mrimea sa i raportul dintre sarcina sa/pH.
Proprietile matricei schimbtoare de ioni care determin capacitatea lui de disponibilitate
pentru o protein aleas sunt limita de excluziune, tipul i numrul de grupri funcionale de schimb
ionice substituite. O capactitate nalt de disponibilitate este obinut n condiiile unei matrice care
estre macroporoas i nalt substituit cu grupri ionice care i menin sarcina ndr-un domeniu
larg de condiii experimentale. Matrix-urile neporoase au o capacitate considerabil de mic
comparativ cu matrix-urile poroase, dar i o mare eficien datorit distanelor mai mici de
difuziune.
Condiiile experimentale care afecteaz capacitatea observabil sunt pH-ul, tria ionic a
tamponului, natura contraionului, viteza de curgere i temperatura.

GRUPRI SCHIMBTOARE DE IONI

Prezena gruprilor schimbtoare de ioni este o proprietate fundamental a oricrui
schimbtor de ioni. Tipul de grupare determin tipul i tria schimbtorului de ioni, numrul
total al acestora i disponibilitatea determinnd capacitatea de schimb. Exist o varietate de
grupri care au fost selectate pentru a fi utilizate n procesul de schimb ionic, o serie dintre
acetia fiind prezentai n tabelul de mai jos.
Gruprile sulfonice i amino-cuaternare sunt utilizate pentru a forma schimbtori de ioni
puternici, celelalte grupe funcionale formnd schimbtorii de ioni slabi. Termenele de
puternic i slab se refer la msura variaiei de ionizare cu pH-ul i nu la tria legrii.
Schimbtorii de ioni puternici sunt complet ionizai pe un domeniu mare de pH, n timp ce la
schimbtorii de ioni slabi gradul de disociere i astfel capacitatea de schimb variaz mai puin
marcant cu pH-ul.
Schimbtori anionici

Grupare funcional

Dietilaminoetil (DEAE)

-O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Aminoetil cuaternar (QAE)

-O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Ammoniu cuaternar (Q)

-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2N+(CH3)3
Grupare funcional

Schimbtori cationici
Carboximetil (CM)

-O-CH2-COO-

Sulfopropil (SP)

-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-

Metil sulfonat (S)

-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOHCH2SO3-

Grupri funcionale existente

pe schimbtorii de ioni.

Schimbtori de ioni pe baz de dextran

Schimbtorii de ioni pe baz de dextran sunt produi prin introducerea unor grupri
funcionale pe scheletul acestuia, o matrice de detran, reticulat. Aceste grupri sunt ataate
la unitile de glucoz din structura matricei prin legturi eterice, stabile.
Domeniul complet al schimbtorilor de ioni pe baz de Sephadex este prezentat n
tabelul de mai jos. Schimbtorii de ioni anionici i cationici sunt desemnai ca A-25 ori A-50 i
C-25 ori C-50, respectiv, depinznd de porozitatea matrix-ului.

Schimbtori de ioni pe baz de Sephadex

Tipuri

Descriere
A-25

DEAE Sephadex

QAE Sephadex

CM Sephadex

C-50

Dietilaminoetil-

Clorur

Dietil-(2-hidroxipropil)aminoetil-

Clorur

Carboximetil-

Sodiu

Sulfopropil-

Sodiu

Schimbtor de ioni slab acid

C-50
C-25

SP Sephadex

Schimbtor de ioni bazic tare

A-50
C-25

Contraion

Schimbtor de ioni slab bazic

A-50
A-25

Grupare funcional

Schimbtor de ioni acid tare

Schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex sunt insolubili n orice solvent. Ei sunt stabili n ap, soluii saline,
solveni organici, soluii slabe acide i alcaline. n soluii puternic acide se pot manifesta procese de hidroliz a
legturilor glicozidice din care cauz valori ale pH-ului mai mici de 2 trebuiesc ocolite, n particular la temperaturi
crescute. Schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex pot fi de asemenea utilizai n prezena solvenilor denaturani
proces ce poate fi important n condiiile separrii unor substane numai pe baza proprietilor lor electrostatice. n
timpul regenerrii schimbtorul de ioni poate fi expus pentru timp sczut la o soluie de NaOH, 0,2 M, fr o
hidroliz apreciabil. Schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex sunt susceptibili la atacul unor dextranaze, motiv
pentru care este nevoie ca n condiiile de stocare s fie prezent i un agent antimicrobian. Proprietile fizice ale
acestor schimbtori sunt prezentate n tabelul urmtor:
Stabilitatea fizic

Schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex pot fi sterilizai prin autoclavare, (121C), pn la 30 minute, la
unpH neutru, n form de sare. n timpul autoclavrii totui, se elibereaz o cantitate de carbohidrai.

Capacitatea de umflare

Proprietile de umflare ale schimbtorilor de ioni pe baz de Sephadex sunt asemntoare cu cele ale
Sephadex-urilor de tip G de la care provin. n plus, Schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex de tip 50 se
umfl mai puternic dect cei de tip 25. datorit prezenei gruprilor ionice de schimb, pe matrice, umflarea
(mbibarea) variaz cu tria ionic i cu pH-ul.

Dependena de tria ionic

La trii ionice sczute, repulsia dintre gruprile ce poart aceeai sarcin pe matrice sunt maxime, din aceast
cauz umflarea gelului n aceste condiii, este mare. Gradul de umflare scade cu creterea triei ionice. Se
poate nota c schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex nu trebuie umflai n ap distilat deoarece, datorit
puternicelor interacii ionice care e manifest n aceste condii, structura perlat se distruge.

Dependena de pH

Gradul de disociere i de aici extensia cu care un schimbtor de ioni este ncrcat electric este dependent de
pH. Repulsia dintre gruprile schimbtoare de ioni este maxim la valori ale pH-ului la care gruprile
schimbtoare de ioni sunt total disociate, scznd la valori de pH apropiate de pK ale gruprilor schimbtoare
de ioni. Se poate nota c schimbtori tari precum QAE Sephadex i SP Sephadex au proprieti de umflare
practic independente de pH deoarece sunt ncrcai electric pe un mare domeniu de pH.

Capacitatea

Datorit diferenelor n caracteristicile de umflare, schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex G-25 au o

capacitate ionic mai mare have per ml gel dect cei pe baz de Sephadex G-50. Astfel, pentru biomolecule
mai mici (masa molecular < 30 000) schimbtorii de ion de tip A-25 i C-25 au o capacitate de
disponibilitate mai mare. n domeniul de mase moleculare cuprins ntre 30 000 i 100 000 totui, schimbtorii
de ion de tip A-50 i C-50 posed o capacitate de disponibilitate mai mare datorit existenei unor pori mai
mari. n condiiile lucrului cu macromolecule mai mari de 100 000, s-a observat frecvent o mai mare
capacitate de disponibilitate la tipurile A-25 i C-25 dei, la aceste mase moleculare, legarea se realizeaz
numai pe suprafaa perlei de schimbtor de ioni.

Celuloza este utilizat ca matrice, dup introducerea unor grupri schimbtoare de ioni,
de tipul dietilaminoetil (DEAE) ori carboximetil (CM), ceea ce conduce la obinerea unor
schimbtori de ioni anionici respectiv cationici.
DEAE celuloza comercializat sub denumirea de DEAE Sephacel este macroporoas i are o
limit de excluziune a proteinelor cu mas molecular de aproximativ 1 x 106. Interacia ionic a
macromoleculelor cu mas molecular mult mai mare de 1 x 106 este restiricionat doar la
sarcinile electrice situate pe suprafaa perlelor de schimbtor.
DEAE i CM Sepharose CL-6B sunt disponibile sub form prenmuiat, putnd fii
utilizate imdeiat pentru ncrcare (mpachetare) pe coloan. n privina capacitatii, se
poate spune c deoarece DEAE i CM Sepharose CL-6B sunt schimbtori de ioni slabi,
numrul de grupri ionice legate care sunt schimbate i deci capacitatea pentru
macromolecule este dependent de pH. Aceast dependen se ilustreaz cu ajutorul
curbelor de titrare. Domeniul de pH la care se lucreaz cu DEAE Sepharose CL-6B este de
2-9 n timp ce pentru CM Sepharose CL-6B este de 6-10.

SELECIA GRUPRII SCHIMBTOARE DE IONI

n selecia suportului cromatografic trebuie avut n vedere c nu exist un singur schimbtor de ioni perfect
pentru oricare separare. Alegerea matrix-ului i a gruprii ionice substituite depinde de:

necesitile specifice aplicaiei;

mrimea molecular a componentelor probei;

punctul izoelectric al componentelor probei.

Substanele se leag la schimbtorul de ioni n momentul n care posed o sarcin opus celei prezentate
de suportul cromatografic. Aceast legare este electrostatic i reversibil.
n cazul n care substanele ce doresc a fi separate posed numai un tip de sarcini electrice, alegerea
schimbtorului este clar. n condiiile separrii unor substane cu ncrctur mixt, ce prezint sarcini att
pozitive ct i negative, substane denumite amfotere, sarcina net va depinde de pH. n consecin la o anumit
valoare a pH-ului, o substan amfoter va avea o sarcin net egal cu zero. Aceast valoare este denumit
punct izoelectric (pI) i n acel punct substanele nu se vor lega nici de schimbtorul anionic nici de cel cationic,
dup cum se observ schematizat n figura de mai jos.

Curb de titrare. Sarcina net a unei

proteine ca funcie de pH

Astfel, pH-ul unui tampon determin sarcina unor molecule amfotere n timpul unui
experiment. Din acest motiv, n principiu, se poate utiliza att un schimbtor anionic ori unul cationic
pentru a lega substana amfoter, prin selectarea unui pH optim. n practic totui, alegerea este
bazat pe un tip de schimbtor i un anumit pH, care conduc la cea mai bun separare a
moleculelor de interes, fr constrngeri referitoare la stabilitatea lor la acel pH.
O multitudine de macromolecule biologice se denatureaz ori i pierd din activitate n afara
unei domeniu bine stabilit al pH-ului i astfel, alegerea schimbtorului de ioni poate fi limitat de
stabilitatea probei. Sub valoarea punctului su izoelectric o protein are o sarcin net pozitiv,
schimbul i astfel adsobia realizndu-se pe un schimbtor cationic. Deasupra pI-ului su proteina
are o sarcin net negativ, putndu-se adsorbi pe schimbtori de ioni anionici. Totui, ea este
stabil numai n domeniul de pH cuprins ntre 5 i 8, astfel se va utiliza un schimbtor de ioni
anionic.
Se pot trage urmtoarele concluzii:

Dac componentele probei sunt mult mai stabile mai mici dect valoarea pI, trebuie utilizat un
schimbtor cationic.

Dac ele sunt mai stabile n jurul valorilor pI, trebuie utilizat un schimbtor anionic.

Dac stabilitatea componentelor este mare pe tot domeniul de pH, pe ambele laturi ale pI, se
poate utiliza oricare schimbtor de ioni.

Metode de testare n tub a condiiilor de selecie a schimbtorului de ioni

CROMATOGRAFIA DE AFINITATE
Conform Uniunii Internaionale de Chimie Pur i Aplicat (IUPAC), cromatografia de afinitate
este definit ca o tehnic cromatografic lichid care se bazeaz pe o interacie biologic pentru
separarea i analiza unui analit specific dintr-o prob. Exemple ale acestor interacii includ legarea
unei enzime la un inhibitor sau al unui anticorp la un antigen. Astfel, cromatografia de afinitate
presupune, n prim faz obinerea unui agent de legare cunoscut sub termenul de ligand afin, care
interacioneaz selectiv cu analitul dorit, acesta fiind apoi plasat pe un suport solid ntr-o coloan
cromatografic. Odat preparat ligandul imobilizat el poate fi utilizat la izolarea ori la cuantificarea
unui analit.
Ligandul imobilizat este factorul cheie care determin succesul oricrei metod de
cromatografie afin. Dup definiia dat anterior n cromatografia de afinitate cei mai muli liganzi
au origine biologic, totui termenul de cromatografie afin este de asemenea utilizat de mult
vreme pentru a descrie o serie de coloane care conin drept liganzi selectivi cu origine nebiologic.
Exemple ale acestor liganzi nebiologici sunt boronaii, complexe de ioni de ioni metalici imobilizai,
colorani sintetici. Termeni precum cromatografie de bioafinitate i de adsorbie biospecific sunt
utilizai ocazional pentru a specifica dac ligand afin estre un compus biologic real. n ceea ce
privete originea ligandului, utilizat pentru a divide tehnicile afine de cromatografie se pot meniona
diverse subcategorii precum cromatografia cu lectine imobilizate, cromatografia de imunoafinitate,
cromatografia cu ligand colorant de sintez, ori cromatografia de afinitate cu ion metalic imobilizat.
Aceste tehnici afine vor fi examinate n continuare.
Un alt factor utilizat pentru a se face distincie ntre o metod afin de alta este tipul de suport
utilizat n coloan. n cromatografia de afinitate cu performan sczut (sau pe coloan), n mod
uzual, suportul utilizat are un diametru mare iar gelul nu estre rigid. Este cazul suportului de
agaroz, dextran, ori celuloz.

Ca mecanism de separare cromatografia de afinitate separ proteinele pe baza unor interacii

reversibile dintre o protein (ori un grup de proteine) i un ligand specific cuplat la o matrice
cromatografic.
Tehnica este ideal n capturarea (extracia) sau ca treapt intermediar ntr-un protocol de
purificare i poate fi utilizat oriunde este disponibil un ligand potrivit pentru proteina (proteinele) de
interes. Cu o selectivitate nalt i de aici o rezoluie mare, o mare capacitate pentru proteina
(proteinele) de interes treptele de purificare realizeaz mari factori de recuperare, de ordinul a
sutelor i chiar miilor de ori. Proteina (proteinele) int sunt colectate ntr-o form purificat,
concentrat.
Interaciile biologice dintre ligand i molecula int pot fi rezultatul unor interacii electrostatice
sau hidrofobe, a unor fore van der Waals' i/sau legturi de hidrogen. Pentru a elua molecula int
de pe mediul afin interacia poate fi reversat att prin metode specifice, de utilizare a unui ligand
competitiv ct i nespecific prin schimbarea pH-ului, a triei ionice sau a polaritii. Astfel, ntr-o
singur etap, purificarea prin cromatografie de afinitate poate oferi un imens avantaj din punct de
vedere a timpului de realizare comparativ cu procedurile de separare n etape multiple. Efectul de
concentrare conduce la posibilitatea procesrii unui volum mare de prob, i n final, proteina
(proteinele) int putnd fi capturat dintr-un amestec biologic complex; formele native de pot fi
separate de formele sale denaturate, putnd fi purificate din volume mici de material biologic, cu un
nivel nalt de ndeprtare a substanelor contaminante.
Succesul purificrii prin cromatografie de afinitate presupune existena unui ligand biospecific
care poate fi ataat covalent la matricea cromatografic, ligandul cuplat trebuind s rein prin
legare specific afin i reversibil molecula int i astfel, s permit moleculei int s fie eluate n
forma sa activ. Orice component poate fi utilizat ca i ligand pentru purificarea partenerului su
respectiv de legare.

Interacii biologice utilizate n selectarea ligandului respectiv a moleculei int,

utilizate n cromatografia de afinitate

Enzim

Substrat analog, inhibitor, cofactor

Anticorp

Lectin

Antigen, virus, celul.

Polizaharide, glicoproteine, receptor celular de suprafa,
celul.

Acid nucleic

Secvena de baze complementar, histone, polimeraza acidului

nucleic, proteina de legare a acidului nucleic.

Hormon,
vitamin

Receptor, protein transportoare (carrier)

Glutation

Glutation-S-transferaz ori proteine de fuziune GST

Ioni metalici

Proteine de fuziune poli (His), proteine native cu histidin,

cistein i/sau resturi de triptofan pe suprafaa lor.

O reprezentare schematic a unui proces de separare prin cromatografie de afinitate

Reprezentarea schematic a unui proces de separare prin cromatografie de afinitate. a) mediul

afin este echilibrat cu tamponul de legare; b) proba este aplicat n condiii care favorizeaz
legarea specific a moleculei (moleculelor) int la substana complementar de legare (ligandul).
Substanele int se leag specific, dar reversibil, la ligand, n timp ce componentele care nu
prezint afinitate pentru ligand sunt ndeprtate prin eluie (splare) de pe coloana afin; c)
proteina int este recuperat prin schimbarea condiiilor ce au favorizat legarea la ligandul
imobilizat. Eluia se realizeaz specific, prin utilizarea unui ligand competitiv ori nespecific prin
schimbarea pH-ului, a triei ionice ori a polaritii. Proteina int este astfel colectat ntr-o form
purificat i concentrat; d) mediul afin este reechilibrat cu tampon de legare

Reprezentarea schematic a procesului de cromatografie afin.

Etapele a), b), c), i d) sunt prezentate n figura prezentat mai sus.

Condiii de eluie n cromatografia de afinitate

Metode de eluie: Metoda 1, cel mai simplu caz: o schimbare n compoziia

tamponului conduce la eluarea substanei legate, fr a o altera i fr a
denatura ligandul. Metoda 2. Se utilizeaz pH-uri extreme ori concentraii
mari de ageni chaotropi pentru eluie, ns acest procedeu poate conduce la
alterarea temporar ori permanent a moleculei int ori a ligandului.
Metodele 3 i 4. Se realizeaz o eluie specific prin adugarea unei
substane care competiioneaz la legarea de ligand. Aceste metode pot
crete specificitatea mediilor care utilizeaz liganzi specifici de grup.

ALEGEREA MATRICEI CROMATOGRAFICE

Alegerea matricei optime reprezint o etap foarte important n orice proces

cromatografic. O matrice bun pentru a fi utilizat n cromatografia de afinitate trebuie sa
posede urmtoarele proprieti:
1. Hidrofilicitate: s posede proprieti specifica care s-i confere interacii nespecifice
reduse.
2. Pori mari: s permit tuturor spaiilor matricei s fie disponibile la cele mai multe
molecule din amestecul de separat. O serie de matrici permit legarea numai la suprafaa
extern, fiind utilizate mai ales n separarea unor molecule foarte mari, a unor celule sau a
unor virui.
3. Rigiditate: matricea trebuie s reziste la presiunile de mpachetare i de curgere a
solventului n timpul eluiei sau a splrii.
4. Inerie: matrice nu trebuie s contribuie la procesul de separare cromatografic.
5. Stabilitate chimic: matricea trebuie s fie stabil la toi solvenii utilizai n
separarea cromatografic.
O matrice optim trebuie s posede o structur macroporoas cu o mare stabilitate
chimic i fizic, cu o ct mai mic adsorbie nespecific, care s faciliteze o capacitate
nalt de legare i de recuperare a probei, alturi de o rezisten mare fa de eluiile n
condiii dure sau condiiile de splare.

CROMATOGRAFIA DE AFINITATE CU ION DE METAL IMOBILIZAT

La mijlocul anilor 70, echipa de cercettori condus de Porath a introdus un nou tip de
cromatografie ce a fost atunci denumit iniial cromatografie cu metal chelat, dup care s-a
redenumit cromatografie de afinitate (adsorbie) cu metal (ion) imobilizat (immobilized metal
affinity chromatography, IMAC). Tehnica se bazeaz pe diferenele de afinitate ale proteinelor
fa de ioni metalici legai de substane ce au proprieti chelatoare, care sunt imobilizate pe
un suport (rin) cromatografic.
Cu toate c bazele acestei metode nu au fost noi, Porath i colaboratorii s-au focusat pe
utilizarea acestei noi tehnici n separarea proteinelor. Aceast caracteristic de bio-afinitate
a captat atenia biochimitilor, chimitilor i biologilor care au utilizat IMAC i au descoperit
noi valene n aplicaii particulare a metodei.
Cea mai cunoscut mbuntire o reprezint aplicaiile ce utilizeaz o coad (tag) de
poli-histidin la separarea polipeptidelor recombinante care consist din inseria unei
secvene terminale de resturi histidinice att la captul N- ori la cel C-terminal al proteinei ori
al peptidei. Utilizarea unor astfel de histidine sau a altor secvene ce posed afinitate pentru
metale n IMAC a dovedit a reprezenta o metod deosebit de util n recuperarea proteinelor,
n special n condiiile n care se urmrete o producie mare i a unui randament crescut de
proteine. n consecin, IMAC a aprut drept o metod major utilizat n purificarea
proteinelor, pornind din faza de laborator pn la cea de pilot ori industrial.
Au fost publicate o multitudine de studii referitoare la IMAC, unele dintre ele prezentnd
noi aplicaii ale metodei ori de introducere a unor noi posibile arii de utilizare, n care aceast
tehnic poate fi exploatat.

Interaciile dintre
resturile nvecinate ale
secvenei hexahistidinice i matricea
Ni-NitriloTetraAcetat.

Utilizarea diferenelor de afinitate n interacia protein ion metalic

Legarea proteinelor (ori a peptidelor) la ionii metalici se bazeaz pe interaciile
dintre gruprile donoare de electroni prezente pe suprafaa proteinelor i un ion
metalic care prezint unul sau mai multe situsuri de coordinare, mai mult sau mai
puin accesibile, expuse. IMAC se realizeaz ntre un sorbent, ori un matrix, la care
se ataeaz covalent grupri metalice, chelatoare (Figura de mai jos).

Reprezentarea schematic a
mecanismelor implicate n
adsorbia
i
desorbia
proteinelor n cromatografia
de afinitate cu metal (ion)
imobilizat (IMAC). Se prezint
interaciile specifice ce se
stabilesc ntre ionul de metal
chelator, suportul chelator i
secvena polihistidinic.

n condiiile n care ionii metalici sunt adugai (ncrcai), chelatorii multidentai i ionii metalici
formeaz complexe n care ionii metalici sunt fixai pentru interacia urmtoare cu compuii ce
trebuie s fie rezolvai. La sfritul acestei etape, ionii metalici aflai n complexe trebuie s posede
situsuri de coordinaie libere la care se vor lega solventul ori moleculele de solut dup interacia
dintre proteine i ionii metalici, proteinele legate pot fi eliberate prin utilizarea unui dezlocuitor
(precum imidazolul).

Tria legturii metalprotein variaz de la o protein la alta ceea ce

conduce n majoritatea cazurilor la o difereniere ntre proteine,
proces ce poate fi exploatat efectiv n randamente mari de separare
ori n izolarea unor proteine specifice.

Ioni metalici utilizai n mod comun n IMAC

Diferenele n afiniti ale proteinelor pentru un metal pot fi explicate, cel puin n parte, pe
baza principiului acizilor ori bazelor tari sau slabe, descrise de ctre Pearson. n aceast teorie
se statueaz c dac doi atomi formeaz o legtur, un atom acioneaz ca un acid Lewis iar
cel de al doilea atom ca o baz Lewis. Tria legturii este guvernat de valorile intrinseci tari
ori slabe ai atomilor implicai. Teoria acizilor tari sau slabi ori a bazelor tari i slabe dicteaz c
legturile dintre atomi cu o poziie similar, de exemplu un acid tare combinat cu o baz tare
sunt cele mai puternice. Urmnd conceptul de mai sus, ionii metalici precum K+, Ca+2, Mg+2 i
Fe +3 sunt clasificai drept acizi Lewis tari, n timp ce ionii monovaleni ai metalelor precum Ag+ i
Cu+ sunt categorisii drept acizi Lewis slabi. Ionii metalelor tranziionale de tipul, Co+2, Zn+2, Cu+2
i Ni+2, sunt considerai acizi de limit. Aceti ioni metalici sunt cel mai adesea utilizai n
IMAC, n particular Ni(II), care confer la un numr de coordinaie egal cu ase, posed o
stabilitate electrochimic n condiii cromatografice, o polarizabilitate limit i o
stabilitate redox. Ionii metalici chelatori manifest variaii n afinitate fa de proteine, care
poate fi precizat prin utilizarea teoriei descrise de Pearson.
Aceast teorie a acizilor i bazelor tari i slabi postuleaz c exist trei tipuri majori de
liganzi. Acei liganzi care conin oxigen (de exemplu carboxilat), azot alifatic (precum asparagina
i glutamina) i fosfor (de exemplu aminoacizi fosforilai) sunt clasificai drept baze Lewis tari.
Liganzii care conin sulf (de exemplu cisteina) sunt clasificai drept baze slabe, acei care conin
azot aromatic (de exemplu histidina i triptofanul) sunt considerai baze de limit. Acizii aflai la
limit i care conin Co+2, Zn+2, Cu+2 i Ni+2, coordineaz n mod favorabil cu atomii de azot
aromatici (baze la limit) i de asemenea cu atomii de sulf (baze slabe).

n interaciile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizai i resturile de
aminoacizi de pe suprafaa proteinei, gruprile funcionale imidazolil, tiol i indolil sunt
principalele inte pentru ionii metalici. Gruprile funcionale carboxil i fosfat sunt
principalele inte pentru ionii metalici tari precum Fe(III) i Mg(II). Un concept acceptat
este acela al distribuiei spaiale a resturilor de histidin pe ntreaga suprafa a unei
proteine n timp ce accesibilitatea acestora va influena caracteristicile de retenie ale
moleculei proteice. Au fost descrise n literatura de specialitate o serie de peptide cu
mare afinitate pentru metal dup cum s-au prezentat motife din structura proteic de
legare a metalului nenvecinate precum cele gsite n prolactin sau n hormonul de
cretere. Este de remarcat c existena unui motif de legare al metalului nu este
ntotdeauna garania pentru succesul IMAC, dup cum exist un numr de enzime cu
afinitate pentru metal care se leag la matrix-ul chelator prin intermediul unui situs care
nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie de seciuni de legare a metalului la
protein, chiar dac sunt expuse, pot contribui foarte puin la tria net a reteniei a
proteinei n IMAC.

Chelatori de metale i matrix-uri polimerice de chelare

Majoritatea gruprilor chelatoare utilizate n IMAC sunt compui chelatori multidentai ce
furnizeaz tria complexului format de ctre protein, ion metalic i gruparea chelatoare. Aceste
substane chelatoare sunt ataate pe o suprafa de sorbent prin intermediul unor grupri de legare
(brae, spacere) care pot varia n lungime ori n compoziie. Structura final format dup ce ionul
metalic este chelatat de ctre gruparea chelatoare trebuie s permit o oarecare libertate situsurilor
de coordinaie n ion metalic pentru adsorbia ori legarea proteinelor i a moleculelor de solvent.
Diferenele n numrul de situsuri de coordinaie libere poate explica n parte de ce o serie de
substane chelatoare (acidul iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezint
selectiviti diferite i activiti de adsorbie fa de proteina int, dat. n tridentatul IDA, metalul se
va lega la atomul de azot i de doi atomi de oxigen din gruprile carboxilat, lsnd trei situsuri
libere pentru molecula de protein ori solvent (n condiiile utilizrii Ni+2 ca metal chelator, acesta
putnd da o trie metal-chelatoare superioar, dar pe de alt parte, o slbire a puterii de reinere a
proteinei. O alt nsuire a chelatorului ar fi reprezentat de o scdere a riscului de scurgere
(pierdere) a metalului chelat. Figura de mai jos arat un model al celor mai comuni i utilizai
chelatori, IDA i NTA legai la atomii de Ni.

Structurile a doi dintre cei mai comune rini chelatoare

ncrcate cu ioni de Ni(II): Ni(II) acid iminodiacetic, Ni(II)
IDA (a) i Ni(II) acid nitrilotriacetic, Ni(II) NTA (b) precum i
o comparaie a interaciilor dintre matricele chelatoare cu
ionii de nichel (c, d).

Acidul iminodiacetic, IDA, reprezint standardul, cel

mai comun agent ligand chelator de metal pentru
imobilizarea ionilor metalici n suporturile IMAC. Muli ali
chelatori (adsorbeni) utilizai n IMAC au fost proiectai n
ultimele decade, fiecare avnd propriile lor avantaje i
limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate
precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic
carboximetilat (CM-ASP). Un alt chelator foarte utilizat n
IMAC este NTA, mai recent dezvoltat.
Dezvoltarea unor ageni chelatori poteniali noi cu
afinitate pentru metal nu este limitat la o grupare
funcional ceea ce va conduce la apariia unor noi clase
de compui cu proprieti de ancorare a metalului utilizate
n IMAC. O serie de compui, nenrudii structural cu
aminele carboximetilate, sunt relativ utilizai n prezent.

Compoziia tamponului de eluent folosit variaz n mare msur

n condiiile identificrii condiiilor optime pentru o separarea unei
proteine date i n multe cazuri, reprezint factorul principal al
specificitii atinse ntr-un protocol de purificare prin IMAC.

Factorii care contribuie la legtura proteinmetal

O multitudine de studii indic histidina drept aminoacidul care posed cea mai puternic
afinitate pentru ionii metalici. Este general acceptat c histidina, asemeni resturilor de triptofan i
cistein ca rezultat al interaciilor puternice cu ionii metalici sunt compuii cheie n legarea
proteinelor n IMAC. Aceti trei aminoacizi au cele mai mari retenii, comparativ de exemplu, cu
resturile glutamat i aspartat, care esenial nu prezint nici o retenie. Studiile efectuate au corelat
reteniile unui mare numr de peptide sintetice ori biologic active pe Ni(II), Zn(II) i Cu(II) chelai pe
IDA, cu profilurile lor n aminoacizi n scopul de a evalua proprietile de adsorbie ale aminoacizilor
implicai n retenia peptidelor. Alte investigaii au relevat c proprietatea de retenie a unor proteine
este n mare parte guvernat de resturile de histidin expuse pe suprafaa proteinei.
Cisteina prezint de asemenea o afinitate puternic fa de metal, dei oarecum mai sczut dect
histidina. Afinitatea pentru metal a acestor doi aminoacizi poate fi atribuit n general gruprilor lor
funcionale, n particular a gruprilor imidazol i tiol, ale histidinei respectiv cisteinei. n cazul
histidinei, alte grupri funcionale precum gruprile carboxil i amino, joac de asemenea un rol n
procesul de legare la metal. Ali aminoacizi care pot s posede o afinitate substanial fa de metal sunt
triptofanul, fenilalanina i tirozina care acioneaz direct prin intermediul catenelor lor aromatice, n timp
ce arginina, lizina, asparagina, glutamina i metionina, acioneaz indirect prin efecte individuale sau
combinate pe accesibilitatea histidinei. Cu toate c retenia proteinelor ori a peptidelor este n mod primar
(cauzal) dat de afinitatea fa de metal a aminoacizilor constitueni, ali factori pot contribui profund
alturi de afinitatea fa de metal, factori ce includ secvena n aminoacizi (poziia aminoacizilor n
caten, structura primar), plierea proteinei ori proprietile suprafeei acestora. Se poate spune faptul
c aceste caracteristici de retenie ale proteinelor n IMAC nu este uor de precizat.

n interaciile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizai i

resturile de aminoacizi de pe suprafaa proteinei, gruprile funcionale
imidazolil, tiol i indolil sunt principalele inte pentru ionii metalici. Gruprile
funcionale carboxil i fosfat sunt principalele inte pentru ionii metalici tari
precum Fe(III) i Mg(II).
Un concept acceptat este acela al distribuiei spaiale a resturilor de
histidin pe ntreaga suprafa a unei proteine n timp ce accesibilitatea
acestora va influena caracteristicile de retenie ale moleculei proteice. Au
fost descrise n literatura de specialitate o serie de peptide cu mare afinitate
pentru metal dup cum s-au prezentat motife din structura proteic de legare
a metalului nenvecinate precum cele gsite n prolactin sau n hormonul de
cretere. Este de remarcat c existena unui motif de legare a metalului nu
este ntotdeauna garania pentru succesul IMAC, dup cum exist un numr
de enzime cu afinitate pentru metal care se leag la matrix-ul chelator prin
intermediul unui situs care nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie
de seciuni de legare a metalului la protein, chiar dac sunt expuse, pot
contribui foarte puin la tria net a reteniei a proteinei n IMAC.

Chelatori de metale i matrix-uri polimerice de chelare

Majoritatea gruprilor chelatoare utilizate n IMAC sunt compui chelatori multidentai ce
furnizeaz tria complexului format de ctre protein, ion metalic i gruparea chelatoare.
Compoziia tamponului de eluent folosit variaz n mare msur de condiiile optime identificate
pentru separarea unei proteine date i n multe cazuri, reprezint factorul principal al specificitii
atinse ntr-un protocol de purificare prin IMAC. Aceste substane chelatoare sunt ataate pe o
suprafa de sorbent prin intermediul unor grupri de legare (brae, spacere) care pot varia n
lungime ori n compoziie. Structura final format dup ce ionul metalic este chelatat de ctre
gruparea chelatoare trebuie s permit o oarecare libertate situsurilor de coordinaie n ion metalic
pentru adsorbia ori legarea proteinelor ori a moleculelor de solvent. Diferenele n numrul de
situsuri de coordinaie libere poate explica n parte de ce o serie de substane chelatoare (acidul
iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezint selectiviti diferite i activiti de
adsorbie fa de proteina int, dat. n tridentatul IDA, metalul se va lega la atomul de azot i de
doi atomi de oxigen din gruprile carboxilat, lsnd trei situsuri libere pentru molecula de protein
ori solvent (n condiiile utilizrii Ni+2). n acelai mod, tetradentatul NTA este considerat a lega ionul
meztalic cu un oxigen extra carboxilat, acesta putnd da o trie metal chelatoare superioar, dar pe
de alt parte, o slbire a puterii de reinere a proteinei. O alt nsuire a chelatorului tetradentat ar fi
reprezentat de o scdere a riscului de scurgere (pierdere) a metalului chelat.

Figura arat un model al celor mai comuni i utilizai chelatori, IDA i NTA legai la atomii
de Ni.

Structurile a doi dintre cei mai comune

rini chelatoare ncrcate cu ioni de
Ni(II): Ni(II) acid iminodiacetic, Ni(II)
IDA (a) i Ni(II) acid nitrilotriacetic,
Ni(II) NTA (b) precum i o comparaie a
interaciilor dintre matricele chelatoare
cu ionii de nichel (c, d) .

Acidul iminodiacetic, IDA, reprezint standardul, cel mai comun agent ligand
chelator de metal pentru imobilizarea ionilor metalici n suporturile IMAC. Muli ali
chelatori (adsorbeni) utilizai n IMAC au fost proiectai n ultimele decade, fiecare
avnd propriile lor avantaje i limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate
precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic carboximetilat (CM-ASP). Un
alt chelator foarte utilizat n IMAC ar fi NTA, mai recent dezvoltat. Dezvoltarea unor
ageni chelatori poteniali noi cu afinitate pentru metal nu este limitat la o grupare
funcional ceea ce va conduce la apariia unor noi clase de compui cu proprieti
de ancorare a metalului utilizate n IMAC. O serie de compui, nenrudii structural cu
aminele carboximetilate, sunt relativ utilizai n prezent.

Structuri ale unor noi grupri

chelatoare utilizate n IMAC

De exemplu dye-resistant yellow 2KT, O-fosfoserina (OPS) i 8-hidroxiquinolina (8-HQ).

Selectarea unei combinaii optime de chelator i de ion de metal este important dup cum i
rina chelatoare poate avea efecte adverse n retenia proteinei. S-a observat c diferit de
metalul utilizat, rina chelatoare poate avea un efect important n retenia proteinei,
sugerndu-se c, prin utilizarea unei rini diferite, retenia proteinei poate fi alterat ca
rezultat al interaciilor dintre complexul proteinmetal i rina chelatoare utilizat.

Suportul polimeric utilizat trebuie s ndeplineasc o serie de caracteristici fizico-chimici

n scopul de a fi corespunztor procesului IMAC. Astfel un suport ideal trebuie s fie:
uor de derivatizat;
s nu manifeste adsorbie nespecific;
s prezinte proprieti fizice, mecanice bune i o bun stabilitate chimic;
s posede o porozitate nalt care s conduc la o accesibilitate uoar a ligandului;
s poat fi utilizat la viteze mari de curgere;
s fie stabil la elueni, inclusiv, n ultim instan la compui denaturani;
s permit regenerarea coloanei fr o degenerare a matrix-ului;
s furnizeze geluri stabile care s nu-i modifice volumul prin deshidratare ori umflare n
timpul procesului cromatografic.

Factorii care guverneaz adsorbia i desorbia

proteinelor
numrul de legturi dintre ionul de metal i un un chelator de metal imobilizat guverneaz
afinitatea total a complexului chelatorion de metal pentru proteine ori peptide. Chelatorul trebuie
s aib o puternic afinitate pentru ionul de metal (pentru a preveni, de exemplu, efectul
transferului de ion de metal), dar trebuie s lase de asemenea o serie de situsuri de coordinare
libere pentru a fi capabile s lege proteina la ionul de metal. Se pare c stabilitatea structurii
chelatorion de metal depinde de tipul de ion de metal i de compoziia tamponului eluent utilizat.
Un numr de caracteristici ale chelatului pot s influeneze selectivitatea legrii metalprotein:
geometri de coordinare a complexului, sarcina, volumul steric i chiralitatea.
FAZA MOBIL: pH-ul, TRIA IONIC I CAPACITATEA DE TAMPONARE

Selectivitatea unei IMAC pentru o protein poate de asemenea s depind de

compoziia fazei mobile. Creterea triei ionice a tampoanelor poate s conduc
la o supresie a interaciilor secundare, electrostatice nedorite cu o cretere a
legrii proteinei la complexul chetator dup cum o scdere a concentraiei saline
poate conduce uneori la o mai slab adsorbie a acesteia. Clorura de sodiu (la
concentraii de 0,11,0 M) este n mod constant inclus n tampoanele IMAC
pentru a suprima interaciile ionice dintre prob i matrix, ca i cele dintre proteine.

Utilizarea valorilor crescute de pH (7 ori 8) i a unei trii ionice mari conduce la particularizarea
IMAC fa de alte tehnici cromatografice, precum cea de schimb ionic. IMAC se aseamn cel mai
bine cu cromatografia de interacie hidrofob (HIC) deoarece se realizeaz cu tampoane ce conin
concentraii crescute de sruri.

Adsorbia unei proteine n IMAC se realizeaz la un pH dat la care gruprile

donore de electroni de pe suprafaa unei proteine sunt parial neprotonate. Este
deseori ntlnit n practic inducerea adsorbie proteinei pe un suport IMAC sub
condiii uor alcaline, n prezena unei trii ionice crescute a tamponului.
Tampoanele fosfat i acetat sunt cele mai utilizate n IMAC. Rolul pH-ului este
deosebit de complex n eluia i adsorbia proteinelor, deoarece el influeneaz un
numr de proprieti, inclusiv caracterul nucleofil al componentelor tamponului,
proprietile electron-donor acceptor ale soluilor i stabilitatea ionului de metal.
Domeniul de pH cuprins ntre 6 i 8 favorizeaz retenia resturilor histidinice i
cisteinice; ntr-un domeniu mai alcalin, coordinaiile dintre gruprile amino
funcionale sunt favorizate, ceea ce conduce la o scdere a selectivitii.
Aditivi i dezlocuitori de proteine
Detergenii pot fi utilizai n IMAC drept amplificatori de selectivitate. Tween-ul-80, la o concentraie
de 0,01% (v/v) a fost utilizat n purificarea prolactinei recombinate umane ori a prolactinei de la
primate, dovedind a fi deosebit de util n diminuarea interaciilor nedorite. Uneori, un solvent organic
este adugat la tampon pentru a ajuta la ndeprtarea endotoxinelor fr efecte duntoarea asupra
mpachetrii corecte a proteinelor, ori n scopul eliminrii unor contaminani n cazul purificrii
albuminei din extracte proteice

Avantajele i dezavantajele cromatografie

de afinitate cu metal imobilizat
IMAC se realizeaz deseori ntr-o singur treapt de purificare;
Capacitatea de ncrcare cu protein este relativ nalt, comparativ cu alte tehnici
de cromatografie de afinitate (0,110 mM/ml gel);
Ionii de metal pot fi uor de ndeprtat de pe rin cu ajutorul unui agent chelator
mai puternic, EDTA sau EGTA. Ionii de metal diferii pot fi astfel testai utiliznd aceeai
rin chelatoare, pentru a determina ligandul ce d cele mai mari satisfacii n
separarea unei proteine de interes;
Trecerea la scal mare a procesului IMAC este extrem de uoar i reproductibil,
ceea ce face din aceast tehnic un candidat n aplicaiile industriale;
IMAC este utilizat n concentrarea soluiilor diluate de proteine;
IMAC este compatibil un numr mare de tampoane cu for ionic crescut i care
conin componente chaotrope;
n general, IMAC nu are efecte adverse asupra structurii proteice, fiind raportate
puine cazuri n care metaloenzimele care posed un ion de metal esenial a fost extras.
Un caz a fost de asemenea raportat n pentru o protein separat prin IMAC pe o
coloan Cu(II) IDA, dar alterarea a fost cauzat de ctre agenii reductori care au
cauzat proteoliza oxidativ catalizat de ionul de Cu(II);
Efectuarea unei treceri (pasaj) printr-o coloan nencrcat de IMAC, conduce la
obinerea unor soluii tranzitoriu sterile deoarece toi ionii de metal eseniali creterii
bacteriene sunt ndeprtai prin chelatare;
O rin IMAC pot fi regenerate de foarte multe ori, fr o pierdere a
caracteristicilor cromatografice. Gelurile utilizate n IMAC sunt extrem de robuste cu
condiia ca valori de pH sub 4 s nu fie utilizate.

O comparaie ntre IMAC i procedeele standard de cromatografie de

afinitate

Stabilitatea ligandului

Afinitatea
metal
nalt

ncrcarea cu protein

nalt

Sczut

Condiii de eluie

Blnde

Deseori extrem

Caracteristic

Recuperarea ligandului dup Complet

regenerarea coloanei

pentru Biospecificitate/
bioafinitate
Sczut

n general incomplet

Selectivitate

Sczut-medie

nalt

Cost

Sczut

nalt

dezavantajele utilizrii IMAC

Fenomenul de transfer al ionului de metal conduce la pierderi de protein i la randamente mici n

recuperare. O alt problem ar fi dac proteina int reine ionul de metal capturat n structura sa. n acest caz
ionul capturat poate afecta sau chiar aboli bioactivitatea proteinei. Sechestrarea ionului de metal de ctre protein
este de asemenea periculoas dac se intenioneaz a o utiliza n scop terapeutic, deoarece o serie de metale n
mod curent utilizate n IMAC sunt considerate a fi carcinogene. Ionii metalici de Co(II) ori Ni(II), aproape generaal
utilizai n IMAC, sunt cunoscui a fi ageni carcinogeni, dei ei sunt considerai mutageni slabi, comparativ cu
arsenul ori cromul hexavalent. Nichelul a fost legat de o expresie anormal a unui numr mare de gene
considerate a fi implicate n inducia cancerului. Acest fenomen poate fi remediat prin alegerea unui alt ion metalic
chelator care interacioneaz cu proteina int. O alt cale care poate fi urmat este cea n care se utilizeaz un
agent chelator adsorbent puternic, de tipul TED [tris(carboximetil)-etilen diamin].

Scurgerea de ion de metal de pe rin conduce la contaminarea cu acesta a produsului final, problem
deosebit de important n cazul preparatelor terapeutice. O problem aparte n acest caz este cea datorat chiar
de interacia dintre ionul metalic i proteina nsi,, mai ales n cazul proteinelor cu uz terapeutic, dup cum este
cunoscut faptul c ionii de metal nu numai c sunt catalizatori ai reaciilor oxidative ci i afecteaz negativ
stabilizarea preparatelor proteice liofilizate, dei se tie c ionii de metal au fost utilizai drept aditivi alturi de
zaharide n creterea stabilitii proteinelor n decursul liofilizrii. n acest caz, n care ionul de metal este un factor
destabilizator, creterea stabilitii preparatului proteic se poate realiza prin adugare de ageni chelatori. Probele
proteice care conin ion metalici contaminani dup o treapt de IMAC pot fi n continuare supuse unor alte etape
de purificare care n final conduc la preparate necontaminate, cu uz terapeutic. n cazul n care se dorete
eliminarea urmelor de metal ntr-o singur treapt se poate recurge la o coloan de tipul de tipul TED n scopul
capturrii ionilor de metal contaminani din preparatul proteic. O alt cale elegant de eliminare a scurgerii de ion
de metal o reprezint utilizarea unor suporturi de imobilizare a metalului cu constante mari de legare a acestuia, i
astfel se poate preveni pierderea ionului de metal.

Utilizarea condiiilor oxidative i catalitice n timpul procesului de separare n condiiile n care ionii metalici
sunt imobilizai sunt nedorite datorit apariiei unor procese redox care conduc la alterarea proteinei.

Utilizarea cromatografiei de afinitate pentru ion de metal n conjunctie

cu alte tehnici cromatografice

SECVENELE TERMINALE CU AFINITATE PENTRU

METAL: AVANTAJE I APLICAII

Identificarea proteinelor de fuziune

Creterea vitezei procesului de purificare
imobilizarea unei proteine pe o suprafa
Utilizarea secvenelor tag
creterea stabilitii proteinei i de cretere a nivelului de
exprimare

CROMATOGRAFIA CU IONI DE ARGINT INCLUI

Cromatografia cu ion de argint (denumit uneori i cromatografie de

argentare) reprezint o tehnic care se bazeaz pe o proprietate a ionilor de
argint de a forma complexe polare i reversibile cu centrii nesaturai prezeni ntro serie de molecule organice precum cele din lipidic ori flavonoidic. Se face astfel
posibil separarea pe baza numrului, configuraiei geometrice i a poziiei
legturilor duble. n practica cromatografic aceasta se realizeaz n conjuncie
cu una dintre procedurile cromatografice stabilite: prin TLC, n cele mai multe
experimente realizate n trecut sau mai recent, prin HPLC ori prin cromatografie
de fluid supercritic.
Sistemul, n mod uzual utilizat, implic ncorporarea ionilor de argint ntr-un
suport solid i uneori, n cazul cromatografiei cu faz invers, utilizarea unei faze
mobile n care au fost dizolvai ioni de argint. Celelalte componente ale
aranjamentului cromatografic de baz sunt similare cromatografiei convenional.
O multitudine de metode de cromatografie cu ion de argint sunt general
aplicabile la o varietate de probe n timp ce altele, sunt mult mai specifice.

PRINCIPIUL I MECANISMUL CROMATOGRAFIEI CU IONI DE ARGINT INCLUI

Cromatografia cu ioni de argint inclui se bazeaz pe principiul c moleculele

organice nesaturate reacioneaz reversibil cu metale tranziionale precum argintul,
formnd complexe polare cu sarcin transferat. Astfel, se formeaz o legtur sigma
ntre electronii 2 p * ai legturii duble i orbitalii 5s i 5p liberi ai ionului de argint.
Este implicat de asemenea o legtur ntre electronii de antilegtur 2 p * ai
legturii duble i orbitalii 4d ocupai ai ionului de argint. Tria complexului este
determinat de accesibilitatea electronilor n orbitali i de inhibiiile sterice ale
acestora.
Se cunoate mai mult despre stabilitatea acestor complexe realizate n studii de
interacie a ionilor de argint cu diverse olefine cu caten scurt.
n cazul cromatografiei cu ioni de argint inclui n suportul cromatografic, a
acizilor grai este cunoscut c, n cazul dienelor cu grupri metilen ntrerupte,
stabilitatea complexelor crete odat cu creterea numrului de legturi duble,
izomerii cu legturi duble aflate n poziie cis sunt mai puternic reinut dect izomerii
trans, iar stabilitatea scade odat cu creterea lungimii catenei, i tinde odat cu
creterea iniial a distanei dintre legturile duble s devin mai mare. Dienele
conjugate sunt reinute mai puin puternic dect dienele cu grupri metilen ntrerupte
i monoenele care sunt mai puternic reinute comparativ cu monoinele.

Coloanele HPLC de tipul n care ionii de argint sunt legai prin

intermediul legturilor ionice la resturi de acid fenilsulfonic, legate la
rndul lor de matricea de silice posed proprieti chimice relativ bine,
numeroi factori n special cei legai de compoziie, de temperatur a
coloanei i de viteza de curgere a fazei mobile pot fi controlai cu
acuratee. Acest sistem a fost utilizat n obinerea unor informaii
cantitative asupra mecanismului de interacie ntre ionii de argint i
legturile duble. S-a constatat c cromatografia cu ion de argint inclus
poate implica un mecanism mixt de retenie, chiar n acest sistem. De
exemplu, aa cum ionii de argint particip la complexarea legturilor
duble, gruprile libere de silanol interacioneaz cu gruprile esterice
ale acizilor grai.

CROMATOGRAFIA CU FAZ STAIONAR CHIRAL

Enantiomerii, dup cum bine se cunoate, posed proprieti fizico-chimice identice pn n
momentul n care sunt plasai ntr-un mediu care este nsui chiral. Din acest motiv, ei trebuie s
posede o retenie egal n interacia cu orice faz staionar achiral, neputnd fi separai cu
ajutorul sistemelor cromatografice achirale. Pentru a crea un mediu chiral, se poate aduga o
component chiral adiional la sistemul cromatografic, aa-numitul selector chiral. Selectorul
chiral poate fi prezent n faza mobil (tehnic denumit faz mobil chiral) ori n faza staionar
(faz staionar chiral). Totui, n cazul general, selectorul chiral este prezent n ambele faze iar
recunoaterea chiral se manifest simultan, n fazele mobil i staionar.

FAZE STAIONARE CHIRALE

Majoritatea acestora sunt realizate pe suport de silicagel ce este
acoperit cu un material polimeric de care este legat un izomer optic
activ. De exemplu, forma L a prolinei se leag la un copolimer reticulat
polistiren-p-divinilbenzen pentru a se produce o faz staionar optic
activ necesar separrii a unor amestecuri racemice de aminoacizi.
n aceast aplicaie, ionii de cupru sunt introdui n soluia
enantiomeric de analit ce urmeaz a fi separat. Dup cum se
observ n figura urmtoare are loc formarea unui complex teriar
ntre faza staionar, anionii de aminoacid i cationii de cupru.
Constanta de formare a acestui complex difer de formele D i L ale
aminoacidului analit ceea ce face posibil separarea acestora.

Reprezentarea schematic a complexului

ternar format ntre L-prolin legat la faza
staionar, un aminoacid prezent ntr-un
analit i ionul bivalent de cupru.

Au fost dedicate o serie de studii pentru dezvoltarea unei mai bune

metodologii n cromatografia chiral, enantioselectiv, ceea ce a condus la
identificarea unor noi faze staionare chirale. O serie de ageni chirali au fost
derivatizai i imobilizai pe suprafaa suportului cromatografic (deseori
reprezentat de silicagel) servind drept discriminatori chirali n timpul procesului
cromatografic. De multe ori fazele staionare chirale sunt de preferat n
procesul de separare cromatografic datorit vitezei de analiz, posibilitatea
analizrii ori a purificrii unor enantiomeri dintr-un amestec complex, a
reproductibilitii analizei precum i a flexibilitii ei. n plus, sistemele
cromatografice analitice pot fi adaptate la separri preparative cnd se pot
colecta enantiomeri n form pur.
Aceast tehnic cromatografia cu faz staionar chiral are drept
aplicabilitate practic studiile de recunoatere molecular, dup cum retenia
diferenial a enantiomerilor n sistemul cromatografic care utilizeaz faze
chirale staionare poate fi datorat discriminrii chirale la nivelul situsurilor
chirale, interacii care se pot explora.
S-a artat c parametrii cromatografici obinui prin fazele staionare
chirale pot fi deosebit de sensibili, ceea ce conduce la separri n cazul unor
enantiomeri cu proprieti foarte apropiate. n plus, fazele staionare chirale pot
fi utilizate n studii specifice de recunoatere chiral ntre molecule. O alt
aplicaie a cromatografiei cu faz chiral o constituie studiul unor medicamente
cu structur chiral.

O clasificare convenional a tipurilor de

faze staionare dup modul de interacie
ntre faza staionar i enantiomer este
prezentat n tabelul alturat
Tip de interacie

Exemple

Afinitate chiral a proteinelor

albumina
seric,
glicoproteina
a1-acid
(orosomucoid), ovomucoid i chimotripsina.

Acces stereoselectiv
chirali helicai

Polizaharide derivatizate ori libere.

la

polimeri

Interacii sterice - ntre un donor i

un acceptor de tip chiral cu grupri Interacii Pirkle.
amido aromatice
Interacii gazd-macromolecul
interiorul unei caviti chirale
Schimb de ligand

Ciclodextrine, eteri coroan i polimeri legai.

Ioni de cupru complexai cu zone moleculare
chirale.

Dei -1 glicoproteina acid (AGP, orosomucoid) i ovomucoidul (OVM) au cel mai mare cmp
de aplicaii, multe rapoarte tiinifice au descris separarea cromatografic i/sau studii de legare
prin utilizarea albuminei serice bovine (BSA), a albuminei serice umane (HSA) i a celobiohidrolazei
I (CBH I) drept selectori chiral imobilizat. Toate aceste coloane sunt disponibile comercial la fel ca i
coloanele chirale cu avidin ori pepsin, legate. Se poate evidenia c proteine precum proteina de
legare a riboflavinei, ovoglicoproteina (fracia activ a preparatelor proaspete de ovomucoid) i
amiloglucozidaza reprezint sunt candidai promitori n separarea chiral a compuilor activi. Alte
faze chirale staionare descrise n literatur utilizeaz tripsina imobilizat -chimotripsina,
conalbumina (ovotransferina) i lizozimul ns aplicabilitatea lor este relativ limitat.
Se mai poate nota c numrul de proteine care pot fi utilizate drept selectori chirali
imobilizai n electroforeza capilar ori n alte tehnici nrudite este mult mai mic dect cel utilizat
n cromatografia lichid. Au fost descrise separri chirale prin electrocromatografie n tuburi
deschise capilare (open tubular capillary electrochromatography, OTCEC) cu proteine adsorbite
pe perete (lizozim, avidin, albumina seric bovin - BSA, orosomucoid, albumina seric uman
- HSA) ca faze staionare. n paralel la aceste studii au fost testate reele de BSAdextran i
geluri reticulate de BSA i celobiohidrolaz I n geluri de electroforez de afinitate.
n concluzie, aceste faze staionare se realizeaz din proteine naturale legate la matricea
de silice. Caracteristica de baz o reprezint faptul c aceste proteine conin un mare numr de
centrii chirali recunoscui a reaciona puternic cu analiii mici manifestnd o selectivitate chiral
puternic. S-au evideniat situsuri interactive specifice care conduc la selectivitatea chiral, dar,
sunt prezente mult mai multe situsuri ce numai contribuie la retenia general. Aceste alte
situsuri pot fi dezactivate de ctre aditivii prezeni n faza mobil (de exemplu octilamina) care
reduc astfel retenia general dar cresc selectivitatea chiral.

Cel de al doilea tip se bazeaz pe interacii chirale ntre solut i polimeri naturali i a fost
dezvolt de ctre Okamato i colaboratorii ce au descris n anul 1987 prima preparare de
suport chiral la care polizaharidele au fost legate de gelul de matricea solid activat cu
amino-propil-silice. Metoda de fixare const din utilizarea diizocianatului.

Fixarea 3,5-dicloro- i a 3,5dimetilfenil carbamatatului

la celuloz pe gel de
aminopropilsilice.

Dintre diversele tipuri de polimeri polizaharidici precum celuloza, amiloza, chitosanul, xilanul,
curdlanul, dextranul i inulina, celuloza i amiloza au fost utilizate n prepararea i comercializarea
suporturilor cromatografice de separare chiral. Celuloza i amiloza ca atare nu pot i nu sunt
comercializate drept suporturi cromatografice de separare chiral datorit capacitii lor sczute n
rezoluie ca i din cauza problemelor ce apar n manipularea lor. Din aceast cauz aceti polimeri
au fost derivatizai sub diverse forme (precum tricarbamai ori triesteri). Aceti derivai sunt apoi
legai pe suportul de silice.
Catenele polimerice ale unitilor de D(+) glucoz conin legturi -1,4 n cazul celulozei i
respectiv 1,4 n cazul amilozei. Aceste catene se afl ntr-o parte i n alta n form linear n
cazul celulozei i n form elicoidal n cazul amilozei.
Suporturile cromatografice de separare chiral pe baz de polizaharide sunt disponibile att n
modul de cromatografiere n faz normal ct i n cel de faz invers.

Structurile tridimensionale ale celulozei

i ale amilozei

Mecanismul de recunoatere chiral la nivel molecular a interaciei chirale n cazul suporturilor

cromatografice chirale pe baz de polizaharide rmne nc neclar dei s-a raportat c rezoluia chiral realizat
pe baza acestora este realizat prin interacii de hidrogen, interacii , interacii dipol dipol induse, ntre
suportul chiral i enantiomeri.
S-a observat c legarea coordinativ contribuie de asemenea la rezoluia chiral a enantiomerilor ce conin
atomi de sulf n cadrul moleculei. n plus fa de aceste legturi, efectele sterice guverneaz de asemenea
rezoluia chiral pe aceste suporturi pe baz de polizaharide. Aadar, structura tridimensional a racemailor (care
conin grupri funcionale i inele aromatice) se asambleaz stereogenic n diverse moduri n cavitile chirale ale
fazei staionare, care se stabilizeaz prin aceste legturi de magnitudini diferite att pentru enantiomerii (+) ct i
pentru cei () i astfel are loc ori se manifest rezoluia enantiomerilor.

Structurile chimice i ale celor mai utilizate

suporturi cromatografice de separare chiral pe
baz de polizaharide (celuloz i amiloz). Esteri de
celuloz: celuloz triacetat (1); celuloz tribenzoat
(2); celuloz tri-4 metilbenzoat (3); celuloz
tricinamat (4); celuloz tri-3-metilbenzoat (5);
Carbamai ai celulozei: celuloz trifenil carbamat
(6); celuloz tri-3,5-dimetilfenil carbamat (7);
celuloz 4-clorofenil carbamat (8); celuloz tri-4
metil fenilcarbamat (9); Carbamai ai amilozei:
amiloz tris 3,5-dimetilfenil carbamat (10); amiloz
tris (S)- metilfenil carbamat (11); amiloz tris (R)-
metilfenil carbamat (12).

Cel de al treilea tip este reprezentat de substanele chirale cu o mas molecular relativ mic
legate la silice. n acest caz fazele chirale staionare de tip Pirkle sau nrudite cu acest tip de faze
sunt compuse din selectori chirali mici, sintetici ori molecule chirale care sunt ataate la gruprile
silanol ale suportului de silice prin brae (spacere) achirale.
Selectorii chirali conin grupri ori pri aromatice (fenil, dinitrofenil, naftil, etc.), capabile s
interacioneze printr-o interacie n trei puncte ce are loc ntre selectorul chiral i analit. n plus fa
de interaciile prin legturi de hidrogen i cele dipol-dipol, interaciile dintre prile aromatice
din structura selectorului chiral i analit, joac un rol predominant.
Fiecare dintre gruprile legate are un numr limitat de centrii chirali dar, datorit mrimii lor
mici, se pot lega un numr mare de grupri la silice (opus cazului n care complexelor mai mari cu
pri chirale). Din aceast cauz apare o probabilitate relativ nalt de meninere a interaciei dintre
solut i centru chiral. Avantajul fazelor chirale Pirkle este acela c per total, cum molecula care
interacioneaz este mic, soluii nu sunt puternic reinui i astfel selectivitatea chiral devine
factorul dominant.

William Pirkle este cel care a descoperit i dezvoltat acest tip de faze staionare chirale. n
raionamentul su, Pirkle s-a bazat pe faptul c dac o molecul chiral are afiniti diferite
pentru enantiomeri, ea trebuie s posede un minimum de trei puncte de interacie; dintre
acestea, cel puin unul este stereochimic dependent.
n condiiile utilizrii fazei staionare chirale de tip Pirkle, recunoaterea chiral se
manifest la ambele situsuri de legare. Situsurile majore de legare sunt clasificate astfel: inele
aromatice - bazice; inele aromatice acide; situsuri acide; situsuri bazice; situsuri acide;
situsuri de interacie steric.
Inelele aromatice sunt potenial realizatoare de interacii . Situsurile acide furnizeaz
hidrogenii pentru formarea punilor intermoleculare poteniale dintre acetia. Situsurile bazice,
ca i electronii , pot de asemenea forma puni de hidrogen. Interaciile sterice se pot manifesta
de asemenea ntre dou grupri mari.
Suporturile de cromatografie chiral prin interacie Pirkle se divid n trei clase:
acceptori de electroni; donori de electroni; acceptori de electroni i donori de electroni .
Figura de mai jos prezint schematic mecanismul de legare chiral prin interacie Pirkle.

Reprezentarea schematic a mecanismului de

legare chiral prin interacie Pirkle. A= grupare
acid; B= Situs acid; C= Situs bazic.

Un mare avantaj n utilizarea fazelor staionare chirale de tip Pirkle o

reprezint capacitatea de a inversa ordinea de eluie prin utilizarea aceluiai
tip de faz staionar chiral, dar cu configuraie absolut inversat. Este
astfel posibil a elua n urme enantiomerul, naintea celui major, o trstur
dorit n cazul determinrii puritii enantiomerilor. Pentru separri preparative
este benefic a elua compusul dorit, primul.
Fazele staionare chirale de tip Pirkle pot separa o multitudine de
enantiomeri din numeroase grupe de compui, precum: medicamente din
clasa acidului aril propionic, compui antiinflamatori nesteroidici, compui cu
importan n agricultur, produse naturale, - blocante, o multitudine de
compui farmacologici activi, etc.

Al patrulea tip de faze staionare chirale este reprezentat de suporturi ce conin n

structura lor glicopeptide macrociclice i a fost introdus n cromatografie de ctre
Armstrong, n anul 1994.
Acestea sunt compui chimici care conin de asemenea un numr mare de centrii
chirali, mpreun cu o serie de caviti moleculare n care moleculele de solut pot intra i
astfel interaciona cu grupri aflate n aceste zone. Caracterul spaial al solutului va
determina gradul de ptrundere i n consecin proximitatea interaciei care, n schimb,
va determina energia de interacie i magnitudinea reteniei.
Antibioticele macrociclice posed o serie de caracteristici care le permit s interacioneze cu
analiii i astfel s serveasc drept selectori chirali. Ele posed un numr de centrii stereogenici i
grupri funcionale, care particip la multiplele interacii cu moleculele chirale.
Antibioticele macrociclice posed o mas molecular cuprins ntre 600 - 2200 i au deseori
numeroase grupri funcionale inserate pe structura lor. Ele pot fi acide, bazice ori neutre, neavnd
ori avnd o absorban redus n domeniul UVVIS. Un serie dintre aceste proprieti fizicochimice sunt prezentate n tabelul 3.30.
Antibioticele macrociclice pot interaciona prin interacii hidrofobe, dipoldipol, interacii ,
legturi de hidrogen precum i prin repulsii sterice. Una dintre cele mai importante interacii sunt
cele ionice ori cele de schimb de electroni. n plus fa de prile hidrofobe, aceste molecule
posed grupri hidrofile precum i un numr de grupri ionizabile, ceea ce permite o bun
solubilitate n soluii apoase. Cele mai de succes i mai utilizate antibiotice macrociclice ca i
selectori chirali sunt glicopeptidele. Ansamicinele, polipeptida tiostrepton i aminoglicozidele,
fradiomicin, kanamicin i streptomicin, au fost de asemenea utilizate drept selectori chirali.

UTILIZATAREA UNOR ANTIBIOTICE CA FAZE STAIONARE CHIRALE

Ansamicinele, rifamicina B i rifamicina SV, au o semnificaie istoric, deoarece
ele au fost utilizate la nceput drept selectori chirali exclusiv n electroforeza
capilar, nainte de a fi utilizate n cromatografie. Rifamicina B a fost primul
dintre compuii ansa utilizai n electroforeza capilar pentru separarea efectiv
a unei varieti de analii ce conin grupri amino. Aceste au o structur
caracteristic ansa ce cuprinde o structur de inel ori un cromofor ce este nepat
de o caten. Catena alifatic poate fi nalt substituit din care cauz
ansamicinele difer prin tipul i poziia substituenilor pe inelul
naftohidroquinonic, dup cum se observ n figur

Structurile chimice, numerotare

(A, B) i reprezentarea schematic
spaial (C, D) a rifamicinei B i a
rifamicinei SV.

Catena alifatic a ambilor compui prezint un etil ester la C21 i un metil eter la C23.
ansamicinele cele mai des utilizate n separri chirale sunt rifamicina B i rifamicina SV. S-a artat
c rifamicina B prezint enantioselectivitate fa de compui cationici, n timp ce rifamicina SV este
enantioselectiv fa de solui neutrii ori oarecum anionici.
Ansamicinele rifamicina B i SV, absorb puternic n regiuni spectrale UV i vizibile din cauza
inelului naftohidroquinonic. Fiecare compus are maximum de absorbie la 220, 304 i 425 nm. Din
aceast cauz rifamicinele sunt utilizate la concentraii relativ nalte (2025 mM), separrile fiind n
monitorizate (urmrite) cel mai adesea prin detecie indirect. Detecia indirect se realizeaz n
general, prin analiza peak-urilor negative, proces datorat reducerii absorbanei comparativ cu
semnalul de fond (semnal background).

Glicopeptide
Antibioticele macrociclice de natur glicopeptidic par a fi cei mai buni selectori chirali
descoperii pn n prezent. Ele includ avoparcina, ristocetina A, teicoplanina, vancomicina i doi
analogi derivai ai vancomicinei.

Structurile chimice ale antibioticelor

macrociclice de natur glicopeptidic
utilizate n cromatografia cu faz
chiral: (A) vancomicina, (B)
teicoplanina, (C) avoparcina, (D)
ristocetina A.

Polipeptide i aminoglicozide

tiostreptona
Kanamicin sulfat
Streptomicina
fradiomicina

O dat cu introducerea fazelor legate ce conin antibiotic macrociclic acestea au devenit

extrem de populare deoarece s-au dovedit deosebit de utile ca n separrile chirale prin
cromatografie lichid, n special de nalt performan. Antibioticele macrociclice vancomicina,
ristocetina A, teicoplanina, avoparcina, rifamicina B i tiostreptona au fost utilizate pentru
separri chirale. Antibioticele macrociclice de natur glicopeptididic, vancomicina, ristocetina A,
teicoplanina i avoparcina par a avea o enantioselectivitate mai larg comparativ cu cea a
ansamicinelor ori a polipeptidului tiostrepton. Antibioticele macrociclice sunt legate covalent la
gelul de silice prin intermediul unor variate puni de natur chimic ce le asigur stabilitatea cu
meninerea proprietilor de recunoatere chiral.
Antibioticele macrociclice de natur glicopeptididic i tiostreptona sunt ataate la gelul de
silice prin reacia gruprilor lor carboxilice cu organosilani, n timp ce antibioticul macrociclic
rifamicina B poate fi ataat prin intermediul reaciei dintre gruprile aminice cu organosilani.
Antibioticele macrociclice de natur glicopeptidic pot fi de asemenea ataate prin reacie de
epoxilare similar metodei utilizate pentru imobilizarea ciclodextrinelor, ori pot fi imobilizate prin
metoda cu izocianat, n mediu anhidru de dimetilformamid.

Fazele cu glicopeptide legate pot fi utilizate n modul de faz normal, faz invers ori n solveni
organici polari pentru a atinge diferite enantioselectiviti sau pot fi derivatizare pentru a li se altera
enantioselectivitatea.
Fazele cu antibiotice macrociclice legate realizeaz criteriul general pe care cele mai utilizate faze
legate l ndeplinesc, adic sunt suficient de efective ca medii de separare, manifest o bun rezisten
mecanic, alturi de un pre accesibil. Fazele legate cu antibiotice macrociclice sunt similare fazelor
staionare chirale cu proteine legate i au o capacitate mai mare alturi de o mai bun stabilitate.
Enantioseparrile se realizeaz printr-o multitudine de interacii precum complexri , legturi de
hidrogen, incluziuni hidrofobe, interacii dipol-dipol, repulsii sterice, precum i combinaii ale acestor
interacii. n timp ce cu alte faze staionare se pot produce o serie din interacii asemntoare, ele nu sunt
n mod normal accesibile pentru o singur faz legat cu o proximitate nchis.
n opoziie la fazele staionare chirale cu proteine legate, cele pe baz de antibiotice macrociclice pot
fi utilizate n procedeul cu faz normal fr nici o modificare ireversibil n enantioselectivitate, proces
datorat n primul caz denaturrii proteinei legate. Aceste faze pot fi utilizate i n separri preparative.
Vancomicina, rifamicina B i tiostreptona au fost primele antibiotice macrociclice introduse sub form
legat n cromatografia cu faz staionar chiral. Dintre acestea trei, numai vancomicina a demonstrat un
potenial larg de aplicare, fiind folosit att n procedeul cromatografic cu faz invers ct i n cel cu faz
normal. Vancomicina a fost de asemenea derivatizat cu 3,5-dimetil - fenilizocianat (DMP) i evaluat
apoi din punct de vedere al calitilor de faz chiral. Faza staionar cu DMP - vancomicin a fost
capabil s rezolve o serie de compui pe care suportul chiral cu vancomicin nu a reuit, n special n
cazul hidroxizinei i a altiazidei.
Suportul chiral cu vancomicin legat a fost utilizat ntr-un mare numr de aplicaii, pentru separarea
multor compui optic activi. Acest suport chiral a fost utilizat la rezolvarea unor amestecuri racemice de
piridone (derivai ai piridinei cu una sau mai multe grupri cetonice pe un inel), arildihidropirimidin
carboxilai (analogi dihidropiridinici ai modulatorilor canalelor de calciu de tip nifedipinic, un agent clasic
coronaro vasodilator i blocant al canalului de calciu, care reduce accesibilitatea ionilor de calciu la
nivelul musculaturii netede i a inimii, utilizat n tratamentul anginei pectorale); enantiomeri ai
citalopramului (medicament utilizat n tratamentul depresiilor) ori ai metaboliilor demetilai derivai ai
acestuia din plasma uman, a aminoacizilor i dansil derivailor acestora; imide ciclice, barbiturice,
piperdin-2,6-dione i produi de semisintez din alcaloizi izolai din ergot.

Teicoplanina s-a utilizat ca faz chiral legat n separarea a peste de

compui 90 optic activi printre care aminoacizi i peptide, salbutamolului (un
agent simpatomimetic utilizat drept bronhodilator, n special n tratamentul
astmei) i ai metaboliilor lui din matrix-uri biologice, n determinarea
enantiomerilor albuterolului (un stimulant -adrenergic utilizat drept
bronhodilator n tratamentul astei i a altor boli obstructive de pulmon) din
plasm, n separarea unor aminoacizi rari aromatici. Aceasta din urm difer de
vancomicin printr-o coad hidrofob, ceea ce-i confer proprieti chirale
diferite. Teicoplanina a fost deseori utilizat mpreun cu vancomicina n
separarea unui mare numr de solui.
Ristocetina A reprezint unul din ultimele glicopeptide utilizate n
cromatografia cu faz chiral. Prin utilizarea ei s-au separat peste 230 de
amestecuri racemice, n sistem de faz normal ori faz invers. Din punct de
vedere al caracteristicilor de retenie, al stabilitii coloanei, se pare c acest
suport chiral este complementar primelor dou glicopeptide prezentate mai sus,
vancomicina i teicoplanina.
Avoparcina a fost izolat din pui de gin i a fost utilizat la drept faz
chiral legat la gelul de silice n analizele HPLC, fiind utilizat n condiiile n
care alte faze staionare chirale nu pot rezolva n totalitate o serie de
amestecuri racemice, precum n cazul verapamilului (un vasodilator calciu
blocant utilizat n tratamentul hipertensiunii, anginei pectorale i a unor aritmii
cardiace), tiroxinei (un hormon ce conine iod secretat de ctre glanda tiroid i
care amplific viteza metabolismului celular, reglnd creterea), ori a
mefenitoinei (un medicament toxic anticonvulsiv cu denumire comercial
mesantoin utilizat n tratamentul epilepsiei n condiiile n care alte medicamente
anticonvulsive devin ineficace).

Al cincilea tip de cromatografie cu faz chiral legat se refer la cea de schimb

enantioselectiv de ligand, tehnic sugerat de Davankov i colaboratorii spre sfritul
anilor 70, fiind utilizat la rezolvarea unor amestecuri de racemici n enantiomerii
constitueni, fiind astfel prima tehnic de cromatografie lichid care conduce la o
separare complet i cert a stereoizomerilor din cele mai importante clase de compui
naturali ori de sintez, precum aminoacizii, hidroxiacizi, aminoalcooli i a multor altora.
Introducerea cromatografiei cu schimb de ligand a condus la o dezvoltare n cercetarea
chimic (studii stereochimice, sinteze asimetrice, cataliz enantioselectiv) i n cea
farmacologic.
Principiul de baz al separrii enantioselective prin cromatografie cu schimb de
ligand a fost demonstrat de ctre un selector chiral chimic legat la o matrice polimeric
precum un complex al Cu (II) cu o serie de aminoacizi naturali care formeaz n anumite
condiii complexe ternare compuse din ligandul chiral din faza staionar, ionul de Cu (II)
i analit. Enantioselectivitatea formrii de complexe ternare, de exemplu diferena n
stabiliti termodinamice a dou structuri diastereoizomerice ce cuprind enantiomeri (R)
sau (S) ai analitului este extrem de mare.
Implicarea a doi enantiomeri ntr-un proces de complexare este aproape identic iar
n ceea ce privete mrimea i sarcina celor dou complexe diastereomerice ternare
formate acestea sunt exact identice. Dou specii diastereomerice pot diferi numai prin
forma spaial a lor, singura diferen care poate afecta n mod dramatic reprezentnd-o
adsorbia lor pe suprafee solide ori pseudo-solide. Acest fenomen reprezint baza fizic
a procesului de discriminare chiral

Metode de separare

Cromatografia

Elec tro foreza

de atingere a s tarii de echilibru

(steady state, displacement electrophoresis)

frontal, liber, de migrare n s olutii (tampon)

moving boundary electrophoresis

is otachophoreza
focus are (focalizare) is oelectrica
n medii s tabilizate, zonalisoelectric focusing
(zone electrophoresis)
suportul stabilizeaz zonele de migrare
si permite o mai bun separare
suporturi chimic active

medii suport cu structur capilar

medii suport cu structur reticular
pe strat subtire
pe hrtie
pe poliacrilamid
pe folii de acetat de celuloz
pe agar, agaroz
pe amidon

imunoelectroforeza
electroforeza de afinitate

Istoric

600 i. C. - Thales din Milet

1908- Reiss
1909 Michaelis
1937 Tiselius
1947 Martin & Synge - definesc
ionoforeza

Concepte de baza in electroforeza

Fenomenele electrocinetice de transport se tine cont de
faptul de:
Particula care migreaza (coloidul de dispersie)
Mediul de dispersie
Coloizii de dispersie sunt putatori de sarcina electrica
Cohen-la contactul dintre dou faze, faza cu constanta
dielectric mare se ncarc pozitiv
Graham- chemosorbtie

qs reprezint densitatea electric superficial

d2 este grosimea stratului dublu
este constanta dielectric a mediului
(zeta)=potenial electrocinetic care apare la
suprafaa particulei din mediu i care
genereaz separarea electroforetic
k-1 = grosimea stratului dublu electric (sau
lungimea Debye)
kB = constanta Boltzmann
T= temperatura
e = sarcina electric
F = constanta Faraday
I = tria ionic
zi ; ci = valena respectiv concentraia molar
a ionilor din soluie

O particul ncrcat electric, ntr-un mediu lichid tamponat, sub aciunea unui cmp electric uniform, se va
deplasa cu o vitez constant, determinat de aciunea a patru fore:
Fora de atracie electroforetic (F1) egal cu produsul dintre sarcina electric Q a particulei ( a entitii
electrocinetice) i intensitatea cmpului electric aplicat (E)

Fora de frecare Stokes (F2), egal cu produsul dintre coeficientul de vscozitate a mediului (), raza
particulei (r) i viteza electroforetic, v dup relaia:

F2= 6rv
Fora de frnare electroforetic (F3) rezultat ca urmare a atraciei exercitate de cmpul electric asupra
ionilor electrolitului (soluia tampon n care se deplaseaz particula) conform relaiei:

F3= (Q - r)E
reprezint sarcina electric a particulei;
unde Q

r
E

este constanta dielectric a mediului;

reprezint potenialul zeta;
este raza particulei;
reprezint intensitatea cmpului electric aplicat.

Fora datorat efectului de frnare (F4), for care apare din cauza redistribuirii ionilor electrolitului n
apropierea particulei, sub aciunea unui cmp electric uniform.

Imediat dup aplicarea unui cmp electric , suma vectorial a celor patru fore devine
egal cu zero, iar viteza electroforetic devine constant:

Pentru electroforeza n medii stabilizate (gel de amidon, poliacrilamid, etc.) F3 i F4 sunt practic
neglijabile, astfel nct forei de atracie electroforetice (F1) se opune fora de frecare Stokes (F2):

ceea ce nseamn c:

Din ultima relaie se calculeaz viteza electroforetic:

Ecuaia de mai sus conduce la relaia Huckel:

unde

H
r
E

reprezint potenialul zeta;

este constanta dielectric a mediului;
este gradientul de potenial, egal cu raportul dintre tensiunea
aplicat, E i distana dintre electrozi, l.
este raza particulei;
reprezint intensitatea cmpului electric aplicat.

La baza fenomenelor electrocinetice importan practic are relaia HelmholtzSmoluchovski:

Henry, plecnd de la relaiile Huckel i Helmholtz-Smoluchovski,
le generalizeaz conform teoriei stratului difuz:
unde re reprezint raza efectiv a particulei hidratate, r+, iar este
inversul grosimii stratului dublu electric, fiind cuantificat de relaia:

n care: z
e
n

reprezint valena;
este sarcina elementar;
este numrul ionilor

La
temperatura
camerei,
pentru n=c (n moli/litru)

Se poate deci evalua potenialul zeta ():

unde v reprezint viteza electroforetic.

MOBILITATEA ELECTROFORETIC

Mobilitatea electroforetic este n relaie de proporionalitate

direct cu viteza electroforetic, fiind raportul dintre viteza
electroforetic i intensitatea cmpului electric. Ea se determin
prin msurarea intervalului de timp, t, necesar unei particule sau
unei interfee solid-lichid s parcurg o anumit distan, d, sub
aciunea unei diferene de potenial exterior.
Dac l, reprezint distana dintre electrozi msurat n interiorul
soluiei, atunci mobilitatea electroforetic se poate scrie:
Cum H (gradientul de potenial), este egal cu
raportul dintre intensitatea cmpului electric
aplicat (tensiunea aplicat), E i distana dintre
electrozi, l, se poate scrie:
de unde se deduce mobilitatea efectiv (msurat n sistemul
internaional n m2V-1s-1), :

n practic se folosete mobilitatea relativ, o care

este proporional cu distana de migrare:

Mobilitatea relativ se calculeaz prin compararea mobilitilor

diferitelor particule, considerndu-se c timpul de migrare i
intensitatea cmpului electric sunt constante (adic particulele care
se compar au condiii identice de migrare electroforetic.
Pentru electroforeza n medii stabilizate, cnd
adic,

Se calculeaz viteza de migrare drept:

Coeficientul 6r este denumit coeficient de friciune (frecare)

n medii stabilizate. El depinde i de ali factori.

Substituind viteza electroforetic din relaia de mai

sus n ecuaia mobilitii relative:
atunci,
Se observ astfel faptul c mobilitatea relativ este n funcie de
sarcina particulei, Q i de raza sa, r:
unde Q reprezint sarcina particulelor, iar r este raza particulei. Se poate
spune c particulele cu un raport Q/r identic vor avea o mobilitate
identic
Cum Q este produsul dintre suprafa i densitatea
Q = 4 r2qs
de sarcin superficial, qs, pentru o particul sferic
cu raza r, sarcina particulei este:
iar mobilitatea relativ este funcie
= 4 rqs
de raportul Q/r
atunci,
ceea ce arat c dac variaiile dimensiunilor particulelor sunt compensate de
variaiile de sarcin electric superficial, particulele vor migra cu mobiliti
egale.

REZOLUIA DE SEPARARE

n electroforeza ntr-un mediu stabilizat, particulele cu

mobiliti () diferite se vor deplasa n zone discrete.
Teoretic separarea diferitelor particule sub form de zone
discrete este realizat, dac mobilitile relative sunt suficient
de diferite i dac distana migrrii este suficient de mare.
Eficiena unei separri electroforetice este exprimat printr-o
mrime denumit rezoluie de separare, Rs.
Considernd dou zone separate electroforetic, cu limea benzii egal
cu l1 i l2, iar distana dintre ele fiind egal cu d, rezoluia de separare
este egal cu:

unde d reprezint distana dintre centrele zonelor 1 i 2, iar l1 i l2 sunt limile celor
dou zone formate de dou tipuri de particule.

d = Et
Drumul parcurs (distana) n procesul
separrii electroforetice este
egal cu:
d = vt

unde v reprezint viteza electroforetic iar t

este timpul de migrare

Din relaia mobilitii, =V/E se deduce viteza electroforetic, v=E, iar drumul
parcurs de o particul n funcie de mobilitatea sa este dat de relaia:

Se poate spune c drumul parcurs de o particul este egal cu produsul dintre

mobilitatea sa, timpul de migrare i cmpul electric aplicat.
Pentru particula 1, drumul parcurs de aceasta este egal cu d1 = 1Et iar
drumul parcurs de particula 2 este egal cu d2 = 2Et.
Cum d reprezint distana dintre centrele zonelor 1 i 2 fiind egal cu diferena de
migrare ntre cele dou particule (d1-d2) se deduce rezoluia de separare:

Se consider c: (1) pentru o separare electroforetic eficient este necesar o

rezoluie de separare cuprins ntre 1 i 1,5; (2) limea zonelor de separare (l1 i l2
din figura de mai sus) are un rol hotrtor. Ea este asociat cu dispersia Gauss
datorat procesului aleatoriu de deplasare.
Dispersia total este suma a cinci termeni care acioneaz independent:
Difuziunea termic;
Microheterogenitatea;
Difuziunea turbulent;
Electrodifuziunea;
Electrosorbia.
Primii doi termeni acioneaz i sunt importani n cazul electroforezei n mediu liber;
difuziunea termic i difuziunea turbulent este important n cazul electroforezei pe
medii stabilizate.
Pe de alt parte, analiza relaiei rezoluiei de separare n contextul proceselor de
dispersie arat c pentru creterea rezoluiei dee separare este de preferat creterea
intensitii cmpului electric i nu a timpului de migrare.

FACTORII CARE INFLUENEAZ REZOLUIA DE

SEPARARE I MOBILITATEA ELECTROFORETIC

Mobilitatea particulelor care se deplaseaz ntr-un cmp electric uniform

precum i rezoluia de separare dintre particule cu mobiliti diferite sunt
influenate de urmtorii factori:
pH-ul soluiei tampon. Acesta afecteaz mobilitatea deoarece sarcina
electric este funcie de pH. Din aceast cauz, alegerea soluie cu pH
optim conduce la rezoluii superiore.
Difuziunea postelectroforetic care depinde de metoda electroforetic
utilizat.
Factori proprii particulelor: mrime, form, sarcin electric,
concentraie, gradul de hidratare i disociere.
Factori caracteristici mediului de separare: vscozitate, pH, intensitatea
cmpului electric, timpul de migrare.
Factori dependeni de metoda electroforetic utilizat: difuziunea
postelectroforetic.
Ali factori.

TRIA IONIC (FORA IONIC)

Cmpul ionic dezvoltat de un ion n soluie depinde de: (a)

concentraia sa; (b) valena (sarcina) sa; (c) prezena altor
ioni n soluie.
n soluii diluate, tria ionic este independent de natura
chimic a ionului. Pentru a ine cont de toi aceti
parametrii, s-a introdus o mrime denumit trie ionic
(for ionic).
Prin definiie, tria (fora) ionic (j) reprezint semisuma
termenilor obinui prin nmulirea concentraiilor molare
(c) a fiecrui ion n soluie cu ptratul valenei sale (z):

unde i = 1,2,....n

n calculul forei ionice a unei soluii tampon se consider c acizii slabi sunt
nedisociai, n schimb srurile lor sunt complet disociate. Astfel, pentru o soluie
tampon coninnd 8,8 g/l acid dietilbarbituric i 10,3 g/l dietilbarbiturat de sodiu,
fora ionic este dat numai din disocierea srii de sodiu i ionul de dietilbarbiturat.
Cum dietilbarbituratul are masa molecular de 206,18g, 10,3 grame reprezint 0,05
moli/l, de aici se trage concluzia c tria ionic (j) este egal cu 0,05M.
Teoretic, mobilitatea electroforetic este invers proporional cu rdcina ptrat a
forei ionice:
iar mobilitatea electroforetic este invers proporional cu rdcina ptrat a forei
ionice:

Din aceast relaie se poate observa c la micorarea

triei ionice are loc o cretere a intensitii cmpului
electric uniform aplicat. Astfel, datorit faptului c
rezoluia de separare este direct proporional cu
intensitatea cmpului electric uniform aplicat,
scderea triei ionice conduce la creterea rezoluiei
de separare.
n general se consider c: (a) soluii tampon cu fore
ionice mici permit viteze de migrare mari, deci
mobiliti mari; (b) fore ionice mai mari de 0,15M
conduc la viteze de migrare mici la timpi de migrare
mici dar cu o rezoluie bun. Trebuie totui avut n
vedere c o for ionic prea mic poate conduce la
precipitarea probelor.

EFECTUL TERMIC JOULE

n timpul unei separri electroforetice, la trecerea curentului electric prin soluie are loc
o degajare de cldur denumit cldur Joule sau efect Joule. Acest efect este deosebit
de important n condiiile n care poate afecta negativ separarea electroforetic prin
favorizarea proceselor de difuziune, a apariiei curenilor de convecie ori de denaturare
a probei (mai ales n cazul enzimelor). Din acest motiv este necesar meninerea ntre
anumite limite a acestui efect.
Efectul termic Joule poate fi controlat (a) n sisteme tampon continue prin valoarea
puterii electrice intrate (dac temperatura este constant); (b) n sisteme tampon
discontinue (multifazice) prin controlul rezistenei electrice a mediului de separare.
Rezistena electric crete odat cu avansarea frontului mobil datorit scderii
conductivitii mediului. Astfel, la o intensitate a curentului (I) constant, crete
tensiunea (U) i cldura degajat este n relaie direct cu timpul de migrare. Dac
tensiunea este constant, scderea intensitii este funcie de timpul de separare iar
cldura degajat dezvoltat prin efect Joule va fi redus ns rezoluia de separare va fi
slab.
Conform primei legi a lui Ohm, intensitatea curentului (I) este direct proporional cu
tensiunea electric (voltajul, V) i invers proporional cu rezistena (R). rezistena
sistemelor electroforetice este dat de tampoanele utilizate, de tipul de configuraii ale
gelului i de volumul total al gelurilor care se ruleaz, iar tensiunea electric este dat
de produsul dintre intensitate i rezisten dup relaia:

ELECTRO(ENDO)OSMOZA

Electro(endo)osmoza este un fenomen electrocinetic care apare n urma deplasrii fazei

lichide de dispersie printr-un capilar, sisteme capilare sau medii poroase la aplicarea
unui cmp electric exterior. Ea se caracterizeaz prin deplasarea electrolitului n cmpul
electric aplicat. Din aceeai categorie de fenomene fac parte potenialul de curgere
(fenomen opus electroendoosmozei) i potenialul de sedimentare.
n medii suport stabilizate (hrtie de filtru, dar mai ales n gelul de agaroz)
electroendoosmoza se coreleaz cu proporia de sarcini negative ale acestora, motiv
pentru care se induce un flux de lichid spre catod. Cum particulele care se separ sunt
ncrcate negativ, iar migrarea lor se realizeaz spre anod, apar fenomene de convecii
interne, deci se produc modificri ale mobilitii electroforetice i astfel ale rezoluiei de
separare.
n medii poroase saturate cu o soluie ionic se manifest o serie de sarcini electrice
fixate pe suprafaa fazei solide, distribuia spaial a anionilor i cationilor din faza
lichid are la baz teoria stratului dublu electric. Dac sarcinile fixe sunt negative, sunt
necesari cationi n exces din faza mobil pentru a asigura electro-neutralitatea. La
aplicarea unui cmp electric exterior, aceti cationi n exces exercit un moment
adiional n fluidul din por care conduce faza lichid spre catod. Aceast micare net a
fluidului fa de structura solidului ntr-un gradient electric impus este denumit
electroosmoz. n practic, viteza electroosmotic este descris la scal macroscopic
de relaia:

n concluzie, pentru ca electroforeza s fie reproductibil, este

necesar a se preciza riguros condiiile de lucru precum: calitatea
mediului de separare, proprietile sistemului tampon,
caracteristicile probei, stabilirea cmpului electric aplicat,
temperatura i timpul de lucru.

APARATURA UTILIZAT LA
SEPARRILE ELECTROFORETICE

Pentru a realiza un experiment de separare i analiz electroforetic sunt

necesare urmtoarele sisteme:
Surs de putere care genereaz un curent electric continuu, stabilizat;
Aparatul propriu-zis alctuit dup metoda electroforetic utilizat, avnd
o construcie variat dar care trebuie s prezinte compartimente pentru
electrozi (din platin, grafit, etc.) i uneori sisteme de termostatare;
Dispozitive anexe care cuprind: (a) dispozitiv de turnat plci (amidon,
poliacrilamid, etc.); (b) cuve de fixare, colorare, splare (decolorare);
(c) sistem de uscare (uneori cu aer cald); (d) sisteme de evaluare optic
(spectrofotometru cu sistem de baleiere, densitometru cu lungime de
und fixa, cu sistem de reflexie sau fluorescen, sisteme video de
preluare a imaginii i de analiz a gelurilor; (e) dispozitive specifice.

ELECTROFOREZA N MEDIU LIBER

Prin definiie, electroforeza n mediu liber se bazeaz pe deplasarea liber a
componentelor cu mobiliti diferite dintr-un amestec sub aciunea unui cmp electric
exterior. n acest context, ntre diferitele componente se formeaz suprafee de
separare (fronturi - de unde i denumirea de electroforez frontal). Aceste fronturi
pot fi observate prin modificarea brusc a indicelui de refracie (ca i n cazul
ultracentrifugrii). Prin msurarea acestui indice de refracie de-a lungul celulei
electroforetice se obin diagrame electroforetice denumite diagrame Schlieren. Din
deplasarea fronturilor se calculeaz vitezele de migrare.
Tehnica este pretabil la automatizare i computerizare, fiind de asemenea utilizat la
separarea componentelor n flux continuu (proteine, organite celulare, celule).

Aparatura utilizat n electroforeza n mediu liber are la baz aparatul Tiselius,

care are forma literei U, ns aparatele moderne au modificri la sistemul de
electrozi (reversibili), la modul de alimentare cu soluie tampon, modul de
ncrcare a probei, modul de nregistrare a vitezei de deplasare.
Prile principale ale aparatului sunt reprezentate din (a) compartimentul de
electrozi; (b) celula electroforetic; (c) sistemul de termostatare; sistemul de
nregistrare.
Celula electroforetic este alctuit din trei sectoare care se pot deplasa lateral prin
glisare. Modul de ncrcare cu prob este prezentat n figura de mai jos. Separarea
se realizeaz la temperaturi sczute (2 - 4oC) la o diferen de potenial de 4-10
V/cm timp de 6 ore.

 presupunem c avem un amestec de dou componente PA i PB (pot fi luate n

discuie dou proteine) cu mobiliti diferite (A B) care se deplaseaz n aceeai
direcie.
Dac n momentul iniial concentraia celor dou proteine este identic pe tot
parcursul tubului electroforetic, dup cum semnalul la sistemul optic este constant.
Dup introducerea n cmp electric, proteina PA, cu mobilitate mai mare va migra
mai rapid spre anod, mbogind frontul de solvent dar srcind coada tubului
(figura de mai jos)
S

Principiul de separare a dou

componente prin electroforez n
mediu liber.

Dup trecerea unui timp suficient de mare proteina PA se va concentra n fronul

de electroforez, iar proteina PB va migra dup aceasta. Dac se reprezint
grafic semnalul primit de sistemul optic se realizeaz o diagram Schlieren
(figura 2.3).

Diagrama Schlieren pentru dou componente

(PA i PB) separate prin electroforez n mediu
liber (c=concentraie, n=indice de refracie). .

Prin derivatizarea concentraiei sau a indicelui de refracie rezult o

electroforegram cu peak-uri electroforetice.

AVANTAJELE UTILIZRII ELECTROFOREZEI

FRONTALE
De la introducerea electroforezei n mediu liber (free-flow electrophoresis, FFE), n anii 1960,
aceast metod de separare i-a gsit o poziie permanent printre metodele de analiz i
preparative n biochimie precum i n chimie pentru separarea, de exemplu, a celulelor,
organitelor celulare, a peptidelor, proteinelor, a compuilor anorganici i organici. n FFE,
substane de analizat sunt separate n mod continuu ntr-un cmp electric aplicat perpendicular
peste un strat subire de tampon transportor n flux continuu dup cum se observ n figura
urmatoare.
Un amestec de prob este injectat n fluxul continuu de electrolit transportor, iar dup un timp de
migrare, componente, diferit ncrcate, se mpart pe culoarele de migrare diferite care pot fi n
continuare colectate la captul aparatului.
Sistemele FFE disponibile la scar larg n comer au fost iniial dezvoltat ca sisteme de curare
a unei probe, de exemplu, ca o treapt de Prefracionare nainte de a o electroforez
bidimensional. n continuare au fost dezvoltate mini sisteme cu dimensiuni reduse de FFE care
se pot cupla la spectrometrul de mas sau la cromatograful de lichide i care permit separarea
continu cu posibiliti de detectare a on-line. Aceast combinaie de FFE, ca metod pentru
separarea continu cu detectare on-line, permite monitorizarea n timp real a analitului, n cazul
probelor biologice ale unor pacieni, produi de reacie, etc. Sistemele rmn n continuare
complicate i sunt nc lente n funcionare, totui utilizarea lor pare a fi foarte promitoare.
Aparatele electroforetice care funcioneaz dup principiul curgerii libere (frontale) n form
miniaturizat (-FFE) i-ar putea gsi aplicaii n construcia unor aparate miniaturizate portabile
de monitorizare a unor pacieni.

O ilustrare a principiului electroforezei

libere
frontale
i
principalele
componente ale unui sistem de
separare electroforetic i microelectroforetic. Tamponul curge n flux
laminar ntr-un film continuu de 0,3 mm,
de sus n jos sub aciunea forei
gravitaionale. Proba se introduce
lateral. Sub aciunea cmpului electric,
componentele probei se deplaseaz
spre anod lateral i totodat de sus n
jos, odat cu tamponul.

Spitalul universitar din Basel

Miniaturizarea FFE implic mai multe avantaje mai ales avnd n vedere
volumul eantionului i de vitez de separare. n contrast cu volumele de
ordinul mililitrilor de prob consumate de tehnicile convenionale de
dispozitivele FFE, microsistemele FFE au nevoie doar de cteva zeci de
nanolitrii pn la cteva sute de microlitri de prob. Acest lucru este deosebit
de util n analizele clinice, n cazul n care de multe ori sunt disponibile numai
volume sczute de prob biologic. Mai mult, timpul de analiz scade de la
cteva ore-zeci de minute, la cteva secunde n cazul timpului de analiz
microdispozitive FFE

DEZAVANTAJELE ELECTROFOREZEI FRONTALE

Dintre dezavantajele electroforezei frontale se pot enumera:
Aparatura necesar;
Amestecarea zonelor datorit difuziunii, curenilor de convecie, motiv pentru care
este strict necesar existena unui sistem de termostatare;
Existena unor anomalii de interpretare. Astfel, suprafaa peak-ului nu este identic
cu concentraia de protein. Un alt tip de anomalii sunt legate de migrare. n acest
context viteza de migrare ascendent nu este identic cu viteza de migrare
descendent. Acest fenomen, n mod obinuit, se poate neglija, dar pentru o
electroforez de mare acuratee, aceast anomalie nu este de dorit.

APLICAII ALE ELECTROFOREZEI FRONTALE

Date recente arat c toate tipurile de electroforez standard
pot fi aplicate cu succes electroforezei frontale, dintre care
cele mai obinuite aplicaii sunt:
electroforeza frontal n flux continuu,
focalizarea izoelectric n flux continuu,
izotacoforeza n flux continuu i
electroforeza frontal n trepte de cmp electric

SEPARAREA POPULAIILOR DE CELULE PRIN

ELECTROFOREZ N FLUX CONTINUU

Exist mai multe dificulti implicate n separarea electroforetic de celule sau alte bioparticule.
n primul rnd, celulele care urmeaz a fi separate trebuie s fie prezente ca o suspensie
monocelular. Agregatele de celule sau ansamblurilor lor nu pot fi separate. Astfel, celule
sanguine, limfatice, sau prezente n alte fluide ale corpului pot fi destul de uor pregtite, n timp
ce celulele din esuturi trebuie s fie mai nti izolate prin dezintegrare mecanic. Multe proceduri
de izolare a celulelor conduc la o deteriorare a acestora prin disrupere i de eliberare a nucleilor
sau a ADN-ului, oferind preparate care nu pot fi utilizate la separarea electroforetic. Distrugerea
celulelor prin simpla dezintegrare mecanic poate fi redus prin tratarea esuturilor cu diferite
enzime combinat apoi cu metode mecanice blnde, cum ar fi amestecare uoar sau aspiraie
printr-o pipet gur larg. Aceast procedur este singura modalitate de a obine o suspensie
monocelular din esuturi precum cel tumoral. Enzimele care s-au dovedit a fi adecvate pentru
obinerea de suspensii monocelulare din esuturi diferite sunt tripsina, chimotripsina, colagenaza,
hialuronidaza i dispaza. Cu toate acestea, astfel de enzime, de multe ori au dezavantajul de a
cliva o serie de grupri specifice de suprafa, modificnd sarcina superficial a acestora, care
reprezint o condiie prealabil pentru separarea electroforetic. Acesta este unul dintre
principalele motive pentru care un numr relativ mic de exemple de succes de separare
electroforetic a celulelor esutului pot fi gsite n literatura de specialitate.

O abordare diferit, utilizat la pregtirea prealabil a celulelor, cum ar fi a nefronilor, care

sunt conectai ntre ei prin intermediul unor complexe juncionale Ca2+-dependente, este de a
trata esutul cu complexani slabi ai Ca2+, precum citratul, EDTA sau EGTA, n combinaie cu
o agitarea blnd. n general, orice nuclei eliberai n timpul procedurii de izolare pot fi
eliminai prin filtrarea suspensiei pe vat de sticl introdus ntr-o pipet Pasteur. ADN-ul
liber, care poate aprea n cazul n care nucleii sunt dezintegrai, trebuie s fie de asemenea,
eliminai, deoarece, n cmp electric, conduc la agregarea celular. Un tratament scurt cu DNaz ultrapur (20-30g/ml) la temperatura camerei timp de 5-10 minute este n general
suficient.
O alt problem este alegerea mediului de pregtire i de separare. Cele mai multe dintre
instrumente de electroforez n flux continuu prezint sisteme eficiente de rcire care permit a
se crete tria ionic a mediului de separare pn la 8-10 x 102 ohm/cm. Aceasta este nc o
trie apropiat condiiilor fiziologice n care se separ celule n stare viabil. n scopul de a
atenua pierderea viabilitii celulelor acestea trebuie s fie colectate n mai multe soluii
fiziologice, cum ar fi medii de cultur, dup ce acestea au fost separate prin camera
electroforetic. Compoziia cele mai potrivit a tamponului de separare trebuie s fie
identificat pentru fiecare tip de celule.

ELECTROFOREZA FRONTAL
PE COLOANA
O alt aplicaie a electroforezei n flux continuu o reprezint tehnica
denumit electroforez n flux liber pe coloan, n timp ce metoda cea mai
cunoscut fiind electroforeza preparativ ascendent.

Aparatul este alctuit dintr-o coloan cilindric parial umplut cu

tampon cu densitate specific mai mare dect cea a celulelor.
Suprafaa astfel realizat va reprezenta stratul de start pe care
celulele sunt depuse (starting cushion).). n continuare coloana se
umple cu o soluie izoton de tampon.
Densitatea specific crescut a stratului de start se realizeaz cu
Ficoll-Hypaque, sucroz ori ap grea. Electrozii se gsesc n
compartimente separate.
n condiiile aplicrii unui cmp electric, celulele vor migra
ascendent spre anod, viteza de migrare a acestora fiind n relaie
direct cu sarcina superficial de pe suprafaa lor. Separarea dureaz
circa o or, formndu-se zone distincte care se pot colecta n
fraciuni. Coloana este termostatat i prezint o capacitate de circa
2x106-2x108 celule/ciclu de separare.

Studying Materials and Processes in Microgravity:

Materials Science

The Continuous Flow

Electrophoresis
System is used to
separate and purify
biological cells and
proteins.

O importan deosebit o reprezint utilizarea electroforezei n mediu liber la

studiul analitic al macromoleculelor biologice. Tiselius, folosind un tampon cu
pH=7,6 a reuit s separeu proteinele serice n patru fraciuni: albumina, cu
mobilitatea cea mai mare i trei fraciuni globulinice (, i , cu mobiliti
descresctoare de la , la i ).). Ulterior s-a observat c la pH=8,6 (la care
toate proteinele serice sunt negative, ele migrnd spre anod), globulinele se
rezolv ca dou subfracii 1 i 2, iar la introducerea unor ioni de calciu (Ca2+
interacioneaz cu componentele serice modificnd astfel mobilitatea lor) ntr-un
tampon veronal, fracia se separ n dou componente:1 i 2.
n mod curent, electroforeza n mediu liber se utilizeaz la separarea: (a)
celulelor intacte (de exemplu a celulelor sanguine); (b) a organitelor celulare
(lizozomi, mitocondrii, aparat Golgi); sistemelor de membrane celulare.
Procedeul este utilizat la studiul adezivitii bacteriilor, la purificarea
plasminogenului tisular exprimat n drojdii, la separarea celulelor transformate i
clonate, fiind utilizat n tehnologia anticorpilor monoclonali.

Prin utilizarea unei celule electroforetice n flux liber orizontale

(figura alturat) procedeul se utilizeaz la studiul eritrocitelor
umane din snge periferic n cazuri normale i patologice (malarie),
n studiul celulelor imunocompetente T i B i a celulelor dendritice,
la diagnosticarea i clasificarea unor leucemii i monitorizarea
tratamentului aplicat precum i la urmrirea efectelor antitumorale
ale unor medicamente. S-a obinut astfel un medicament cu structur
de polizaharid extras din Coriolus versicolor (familia
Basidomicetae) denumit krestin cu efect antitumoral i reversor
(care reinstaureaz comportamentul normal al limfocitelor,
readucndu-le n limite normale funciile leucocitelor i
macrofagelor).).

Prezentarea schematic a reducerii selective i

masive a sarcinii electrice superficiale la unele
populaii celulare cu ajutorul unor anticorpi
specifici n cazul separrii celulelor cu mobiliti
electroforetice apropiate sau identice.

ELECTROFOREZA ZONAL
n momentul n care Tiselius (1937) a publicat lucrarea sa clasic
referitoare la electroforeza n mediu liber. n 1937, Konig (1937)
a indicat posibilitatea de a utiliza hrtia de filtru pentru separarea
electroforetic a amestecurilor de proteine. n deceniul al cincilea
din secolul trecut o serie de cercettori au descris variate tehnici
care au utilizat hrtia ca agent anticonvectiv pentru separarea
amestecurilor de aminoacizi, peptide, proteine i alte substane.
Utilizarea hrtiei de filtru sau a altor medii suport solide introduc de asemenea o serie de
factori care implic mobilitatea electroforetic a moleculelor ncrcate electric,
electroosmoza, curgerea hidrodinamic a lichidului, adsorbia, efecte cromatografice i
de stivuire. Din acest punct de vedere, electroforeza zonal nu poate fi utilizat pentru
determinarea precis a mobilitii electroforetice, a punctului izoelectric sau a altor
proprieti de migrare a substanelor fr o procedur de standardizare adecvat pentru
tehnicile particulare. Suportul ideal ar trebui s fie acela care nu prezint impuriti, este
chimic inactiv n ceea ce privete substanele separate, nu prezint activitate adsorbtiv
i prezint cel mai sczut efect electroosmotic. Nici o hrtie de filtru nu ndeplinete n
totalitate toate aceste condiii. Totui, noi medii suport au fost introdus care posed
proprieti mult mai favorabile, precum acetatul de celuloz, gelurile de agaroz i de
poliacrilamid

n prezent se folosesc o varietate de medii suport stabilizante care se pot mpri n:

Medii suport cu structur capilar, care
(a) prezint proprieti anticonvective - dac seciunea capilar este suficient de mic (ntr-un canal cu
seciune circular curgerea descrete cu puterea a 4-a a razei);
(b) sunt stabile fizico-chimic;
(c) prezint proprieti mecanice bune;
(d) sunt netoxice;
(e) sunt ieftine i astfel accesibile;
(f) sunt relativ inerte este cazul hrtiei de filtru, a acetatului de celuloz, a mediilor specifice
cromatografiei pe strat subire (celuloza microcristalin, silicagelul, alumina, silicagelul);
(g) au proprieti electroforetice specifice bune nu interacioneaz dect foarte slab cu compuii pe care
i separ (excepie face hrtia de filtru la care se observ o adsorbie nespecific).
n cazul acestor medii suport, proteinele serice se separ n albumin i patru sau mai multe
componente globulinice dar cu o rezoluie inegal, cu o poziie relativ a fraciunilor (zonelor)
asemntoare.
Medii suport care, datorit structurii poroase caracteristice, particip activ n separare. n acest caz
separarea electroforetic are loc att densitii sarcinilor electrice ct i a efectului de cernere
molecular. Astfel, dou particule cu aceeai sarcin electric dar cu dimensiuni diferite, vor fi separate
ca zone distincte, particulele mai mici migrnd mai uor. De exemplu, dac prin electroforez pe hrtie
proteinele serice se separ n fraciile albumin, 1-, 2-, - i -globuline, dup electroforeza pe gel de
amidon se identific circa 15 zone proteice. Din categoria acestor medii fac parte gelul de amidon, gelul
de agaroz (unde efectul de sit molecular apare la concentraii mari de gel) i gelul de poliacrilamid
(care prezint avantajul de a putea alege dimensiunea porilor).
Medii afine, pe care le vom examina ntr-un capitol special.

ELECTROFOREZA PE HRTIE

n acest caz, hrtia de filtru reprezint mediul stabilizant care posed urmtoarele caracteristici:
(a) conine minimum 96% celuloz, insolubil n NaOH concentrat;
(b) prezint o capacitate mare de imbibiie (absorbie) - mrimea acestei proprieti este dat de
firma productoare i trebuie s fie de dou ori mai mare dect greutatea sa;
(c) este lipsit de metale grele (de exemplu Pb), care modific conductibilitatea sa electric; (are
o structur uniform a fibrelor de celuloz, unidirecionate;
(d) prezint o densitate caracteristic a fibrelor - o hrtie de filtru fin sau medie prezint o
textur deas care va conduce la separri n zone bine delimitate, dar ntr-un timp mai mare, n
timp ce o hrtie de filtru grosier se mbib rapid cu cantiti mari de tampon iar separrile vor
conduce la zone neclare, ntr-un timp mai scurt;
(e) la un pH acid i la trii ionice sczute apar fenomene de adsorbie a proteinelor pe suportul de
hrtie de filtru ceea ce va conduce la formarea benzilor cu coad.
Tamponul, reprezint de asemenea o component important n sistemul electroforetic. n cazul
electroforezei pe hrtie, tamponul se afl n compartimentul electrozilor, la un nivel egal i
constant, evitndu-se fenomenul de sifonare. Meninerea evaporrii tamponului n limite
rezonabile se realizeaz prin:
(a) scderea forei ionice, legat de efectul Joule i de efectul de flux capilar;
(b) saturarea compartimentului de separare cu vapori;
(c) adugarea de propilenglicol sau glicerin (5-15%) n soluia tampon sau
(d) n cazul electroforezei de nalt tensiune, prin plasarea hrtiei de filtru n solveni hidrofobi.

Valoarea pI este specific unei proteine i ea depinde

de natura solventului i de concentraia electrolitului
(a nu se confunda pI cu punctul izotonic, definit ca
valoarea pH-ului unei soluii apoase de protein dup
ndeprtarea tuturor ionilor necoloidali din soluie).
n separarea electroforetic este necesar o conduce
cu mare atenie pH-ul i tria ionic a soluiei tampon.
De obicei tria ionic a soluiei tampon este cuprins
ntre 0,06-0,1. Soluiile tampon cu o trie ionic mai
mic de 0,06 nu tamponeaz suficient n timp ce
soluiile cu o trie ionic mai mare de 0,1 conduc la
un efect Joule, marcant, ceea ce conduce la o degajare
semnificativ de cldur.
Echipamentul utilizat n electroforeza pe hrtie
consist din dou componente principale: o camer
(tanc) electroforetic i o surs de putere electric.
Tancurile electroforetice sunt variate n construcie i
depind de aranjamentul pe orizontal sau vertical a
benzii de hrtie electroforetic precum i de
necesitile caracteristice ale unor experimente
particulare.

Dependena dintre pH-ul soluiei i

sarcina electric a dou polipeptide,
insulina uman i fragmentul
polipeptidice
des-B23-B30octapeptid insulin (DOI).).

Tancul electroforetic comun utilizat

la electroforeza pe hrtie de voltaj
sczut este de dou tipuri, dup cum
hrtia de filtru este aezat. n tipul
orizontal, hrtia de filtru este fixat
orizontal la capetele incintei. La tipul
vertical, hrtia de filtru este aezat
vertical pe o baghet. La extremiti,
banda de hrtie este imersat n vasele
de tampon la aceeai adncime n timp
ce nivelul tamponului n cele dou
compartimente trebuie s fie egal.
Unele aparate prezint un sistem
labirint prin care comunic, n condiii
speciale, cele dou rezervoare,
prevenindu-se astfel fenomenul de
sifonare prin banda de hrtie n timpul
separrii electroforetice. Aparatul este
de asemenea prevzut cu un capac,
realizat de obicei din plexiglas.
Reprezentarea schematic a tipurilor de tancuri utilizate la
electroforeza pe hrtie: (a) tip orizontal; (b) tip vertical; (c) tip cu
banda de hrtie imersat; (d) tip cu banda de hrtie nchis.

Cele mai bune rezultate sunt obinute cu electrozi obinui din platin n form de fir sau folie,
care pot fi utilizai n variai electrolii la diverse pH-uri. Pentru a se preveni contaminarea cu
produi de electroliz care se elibereaz la nivelul electrodului, banda de hrtie de filtru nu
trebuie s fie introdus direct n compartimentul electrozilor, ci ntr-un compartiment adiacent
acestora, iar contactul electric este realizat prin intermediul unor buci din hrtie de filtru sau
bumbac a unor puni din agar sau printr-un sistem special de labirint.
Volumul de electrolit-tampon n vase trebuie s fie suficient de mare pentru a preveni influena
produilor de electroliz asupra separrii electroforetice. Volumul V care transport ionii de
hidrogen n timpul unui experiment poate fi calculat astfel:

unde UH+ reprezint mobilitatea H+, I este intensitatea curentului (Amperi), t este timpul
(secunde) iar K este conductivitatea soluiei. Astfel, n cazul unor electrolii diluai i la timpi
mari de separare, tamponul trebuie s circule continuu ntre compartimentele cu electrozi.
Sursa de curent trebuie s fie capabil s ofere un curent sau un voltaj constant, preferabil
ambele. Pentru cele mai comune separri sursa de curent adecvat trebuie s aib capacitatea de a
oferi 50 mA i 500V. Intensitatea maxim a curentului care poate fi utilizat pe unitatea de arie a
benzii de hrtie de filtru supuse separrii electroforetice poate fi calculat astfel:
unde I (mA) reprezint intensitatea curentului, P (cm2) este aria benzii de hrtie
de filtru msurat ntre suprafeele de electrolit i compartimentele electrozilor
iar U (V) este potenialul electric.
n general tensiunea maxim de lucru este de 400 V, cu o cdere maxim de
15V/cm (n medie de 2-10V/cm).

Pentru determinri cantitative substanele separate pe benzile din hrtie de filtru pot fi utilizate
att metode directe ct i cele indirecte. n cazul metodelor directe, substana care trebuie s fie
msurat trebuie s absoarb radiaie UV sau s fie fluorescent ori radioactiv. n metodele
indirecte zonele separate trebuie s fie mai nti colorate iar absorbana msurat cu ajutorul unui
densitometru racordat. Au fost construite o serie de densitometre semi - sau total automatizate
care traseaz grafic intensitatea luminii transmise sau reflectate de pe o electroforegram colorat
versus distana de-a lungul benzii electroforetice n form de curbe electroforetice. Aria din
interiorul acestor curbe este determinat fie automat printr-o scalare integrat, fie cu ajutorul unui
planimetru ori prin tierea ariilor reprezentate i cntrirea lor. Sunt descrise de asemenea
scannere computerizate care permit analiza cantitativ complet a unei electroferograme n cteva
secunde. Aria din interiorul acestor curbe este determinat fie automat printr-o scalare integrat,
fie cu ajutorul unui planimetru ori prin tierea ariilor reprezentate i cntrirea lor.
Aplicarea probei se face pe banda de hrtie de filtru mbibat
cu soluie tampon, fixat n aparat, dup crearea unui mediu
saturat i stabilizat n vapori, cu ajutorul unei pipete capilare,
seringi Hamilton (1-5l), micropipete, fr a zgria hrtia. Se
folosesc dou tipuri de spotri: n pictur sau n linie.

Profilul electroforetic al proteinelor serice

separate pe hrtie, de filtru, colorate cu
amino black 10B i scannate cu un
densitometru semiautomat.

Pentru urmrirea separrii electroforetice

se apeleaz la un colorant ca substan de
referin. De obicei se utilizeaz albastru
de bromofenol, un colorant trifenilmetanic

Albastru de brom fenol

Cei mai folosii colorani utilizai n evidenierea componentelor proteice separate

prin electroforez pe hrtie sunt amino black 10B, Azocarmine B, Light Green SF i
Ponceau Red 2R.

Structura chimic a colorantului diazolic

Amido black 10B, utilizat n practica
biochimic la colorarea total a proteinelor.

Structura chimic a azo-colorantului Ponceau 2R

(Xylidine ponceau, Ponceau G, Red R, Acid Red
26, Food Red 5).

Componentele lipoproteice ale serului sanguin pot fi detectate pe banda de hrtie prin
colorare cu Sudan Black B ori Oil Red O.

Structura chimic a colorantului diazo Sudan

Black (10)B.

Structura chimic a colorantului diazo Oil Red O

(Solvent Red 27, Sudan Red 5B, C.I. 26125,
C26H24N4O).).

Prin utilizarea acestor proceduri se pot separa i detectate patru fracii lipoproteice:
chilomicroni, -lipoproteine, pre--lipoproteine and -lipoproteine. Totui, cea mai
bun rezoluie a fraciilor lipoproteice din serul sanguin se obin pe gelul de agaroz ori
pe membrane de acetat de celuloz.
Componentele glicoproteice sunt detectate pe hrtie cu ajutorul
reactivului Schiff-acid periodic, n cazul glicoproteinelor neutre,
difenilamin pentru mucoproteine i glicozaminoglicani,
albastru de toluidin i Azure A pentru glicoproteine acide,
alcian blue pentru glicozaminoglicani acizi.
Pe un ser normal se regsesc 5-6 fracii glicoproteice, a cror concentraie se
modific n timpul proceselor patologice ale ficatului, rinichilor, sistemului nervos
central i n timpul maladiilor tumorale.
Dup colorare, excesul de colorant este ndeprtat de pe banda de hrtie prin splare cu
un solvent convenabil. Pentru o decolorare mai eficient se poate aduga detergent la
soluia de solvent ori splarea se realizeaz la o temperatur de aproximativ 80C.

ELECTROFOREZA PE HRTIE LA TENSIUNE NALT

n acest caz tensiunea aplicat este de circa 50-215V/cm, iar la bornele sursei de curent
tensiunea a redresorului este de 10 kV. Se poate afirma c o cretere de la 5V la
100V/cm (adic o cretere de 20 de ori) viteza de migrare crete de asemenea de 20 de
ori dar cantitatea de cldur degajat va crete de 202, adic de 400 de ori, motiv pentru
care este absolut necesar o termostatare uniform (o termostatare neuniform conduce
la apariia zonelor de semilun-marginile hrtiei se usuc mai tare. Se mai poate nota c
la concentraii mari de prob rezoluia de separare este sczut i se vor obine zone cu
coad.
Electroforeza pe hrtie la tensiune nalt se utilizeaz la separarea aminoacizilor (se
produce n tampon acid formic-acetat de sodiu), a peptidelor (separarea se realizeaz n
tampon piridin-acid acetic (la un pH cuprins ntre 3,0 i 5,0), glucidelor sau a bazelor
azotate purinice i pirimidinice.
Sub forma bidimensional, electroforeza pe hrtie la tensiune nalt se poate combina
cu cromatografia pe hrtie.

ELECTROFOREZA PE STRAT SUBIRE

n momentul introducerii cromatografiei n strat subire i a electroforezei n strat

subire, cu ceva timp n urm, comoditatea i sensibilitatea crescut (de la 10 la 50 de
ori) n comparaie cu tehnicile pe hrtie au fost considerate metode promitoare
pentru analizele compoziiei proteinelor i a acizilor nucleici. Electroforeza n strat
subire combinat cu cromatografia n strat subire a reprezentat o metod de rutin
pentru separarea a unor mici cantiti de aminoacizi, nucleotide, ioni anorganici i a
altor substane cu mas molecular mic.
Utilizarea mediilor suport de strat subire ofer urmtoarele avantaje fa de tehnicile
care utilizeaz hrtia:
(1) necesit un echipament mult mai simplu pentru preparare;
(2) rezoluia este n general superioar;
(3) separrile se pot realiza la poteniale nalte n perioade de timp foarte scurte;
(4) sunt necesare mici cantiti de prob, putndu-se realiza mai uor separri att
cantitative ct i micro-preparative;
(5) probele nu trebuie desalinizate, ele se aplic direct pe strat. Astfel, ureea i
glucidele rmn n start, ionii migrnd rapid;
(6) se pot utiliza reactivi agresivi de spray-ere i n acest mod se coboar limita de
detecie.

Din punct de vedere al echipamentului

utilizat, se folosesc aparate convenionale
de tip orizontal, similare celora utilizate
electroforeza pe hrtie, acetat de celuloz
ori pe gel de agar. Pentru separri la
poteniale mai nalte i pentru separri
Camer pentru electroforez n strat subire. (a)
bidimensionale, s-au descris diverse
plac orizontal prevzut cu system de rcire; (b)
foie de izolare; (c) strat subire pe plac de sticl;
camere prevzute cu sisteme de rcire.
(d) bride de hrtie (Whatman 3 MM); (e) plac de
Aparatul pentru electroforez pe strat
sticl, 5 mm grosime; (f) compartimente pentru
subire este prezentat schematic n
tampon i electrozi; (w) sistem de rcire.
alturat. El posed un plan orizontal
sub care se afl un sistem de rcire cu
ap, pe care se aeaz placa (cu
dimensiuni de 10 x 10 sau 20 x 20 cm) cu
strat subire (circa 250-300 m) care este
pus n contact cu tamponul prin
intermediul unor bride din hrtie de filtru.
Aparatul este acoperit cu o plac de
sticl. Mica distan dintre placa cu strat
subire i placa care acoper aparatul Hunter Thin Layer Peptide Mapping
acioneaz ca o camer umed i previne Electrophoresis System, CE. For high
resolution two dimensional tryptic peptide
uscarea stratului subire.
mapping and phosphoamino acid (PAA)
analysis

n cazul separrilor efectuate pe ser sanguin, volumul de prob este n funcie de cantitatea de
creatinin. n general proba spotat trebuie s conin maximum 5 g de creatinin. Timpul de
separare este de aproximativ 25-30 minute la o tensiune de 30 V/cm.
Proteinele sau alte substane macromoleculare pot fi separate prin utilizarea gel filtrarea pe strat
subire-electroforeza pe strat subire. n funcie de masele moleculare ale probei, se poate utiliza
Sephadex Superfine (de la G-25 la G-200). Sephadex-ul, echilibrat cu tamponul adecvat, este
depus pe o plac de sticl. Placa cu strat subire este plasat ntr-un aparat adecvat ca cel
prezentat n figura de mai jos, fiind echilibrat cu un tampon care curge prin stratul de gel.
Stratul trebuie conectat cu un rezervor prin intermediul unei bride din hrtie de filtru Whatman
No. 1 la captul superior, iar placa se nclin ntr-un unghi de 15-20o fa de orizontal.
O bucat de hrtie de filtru Whatman 3MM este ataat
la captul inferior pentru a ndeprta fluidul filtrat. Dup
finalizarea filtrrii, placa este aranjat orizontal iar
electroforeza este realizat pe o direcie perpendicular
fa de prima dimensiune. Pentru a obine o imagine a
spoturilor proteice, placa este acoperit cu grij cu o
bucat de hrtie de filtru Whatman No. 1 i dup 5 minute
de contact, hrtia este ndeprtat de pe stratul subire,
uscat la 100C i colorat cu amino black ori un alt
colorant specific proteinelor.
Gel filtrarea pe dextran/electroforeza pe strat subire a
fost utilizat la separarea proteinelor serice, a diferii
colorani tetrazolici, a unor aminoacizi urinari i peptide
i alte substane.

Aparat pentru o separare bidimensional

utiliznd gel filtrarea i electroforeza pe
strat subire de Sephadex. (a) sistem
suport; (b) fant pentru conexiunea prin
hrtie de filtru; (c) sistem de rcire a
platformei cu ap; (d) bazin care conine
tampon ori solvent utilizat la dezvoltarea
electroforegramei; (e) sistem de schimbare
a poziiei suportului plcii; (f) orificii i (g)
uruburi de prindere.

Electroforeza pe folie de acetat de celuloza

Dac iniial membranele de acetat de celuloz au fost produse pentru filtrare, utilizarea membranelor de
acetat de celuloz ca mediu suport a fost sugerat de Kohn n 1957. Foliile de acetat de celuloz se
obin prin tratamentul celulozei cu anhidrid acetic, iar produsul, triacetat de celuloz este cel mai des
utilizat pentru electroforez.
Membrana (cu o grosime de cca. 12 m i cu un diametru al porilor de cca. 0,4 m) este un material
omogen care conine numai urme de impuriti.
Este de culoare alb opac, cu suprafa neted i uniform.
La microscop se observ o structur microporoas care mpiedic difuziunea zonelor sau a spoturilor,
din acest motiv se obine o bun separare a proteinelor plasmatice chiar la o tensiune mic.
Puritatea materialului este mare, lipsesc hemicelulozele, lignina iar metalele grele sunt prezente
numai n urme. Fa de hrtia de filtru, adsorbia proteinelor i a altor substane pe acest mediu suport
este minim, deci fenomenul de coad sau de aspect de comet fiind practic eliminat.
Timpul de separare este mai scurt iar membranele de acetat de celuloz sunt ideale pentru tehnicile de
imunodifuzie i imunoelectroforez.
Dintre dezavantajele utilizrii membranelor de acetat de celuloz enumerm preul mai mare fa de
hrtia de filtru, necesitatea de a acorda mai mult atenie pentru obinerea unor rezultate reproductibile.
n prezent s-au adus mbuntiri ale produsului iniial prin apariia acetatului de celuloz gelatinizat
(Cellogel).
Foliile (strips-urile) din acetat de celuloz sunt insolubile n ap, alcooli, eteri, acizi i baze diluate i
n majoritatea hidrocarburilor, dar sunt uor solubile n fenol, acid acetic glacial, diclorometan i
aceton, i n mod particular n cloroform:etanol 90:10 (v/v) i diclorometan:aceton 50:50 (v/v).
Strips-urile pot fi transformate n translucide (transparente) prin imersia lor n ulei din semine de
bumbac, decalin, ulei de parafin ori ulei Whitemore 120, care este important pentru scanarea optic a
benzilor colorate de pe foliile de acetat de celuloz. Ele pot fi impregnate i permanent stocate n
glicerol, care previne destrucia spoturilor colorate.

Pentru separri electroforetice de proteine i acizi nucleici s-au introdus membranele de

nitroceluloz. Aceste membrane, cu o mrime a porilor cuprins ntre 0,1-12 m, au fost
utilizate n mod constant n analizele de acizi nucleici n special a hibrizilor RNA-DNA i
DNA-DNA. Acetia prezint o adsorbtivitate selectiv fa de proteine i acizi nucleici n
condiii adecvate.
Membranele de dimensiuni dorite sunt aezate ntr-o plac Petri cu tampon i lsate s
pluteasc pn la dispariia petelor alb-opace dup care se scufund complet. Membranele
de Cellogel nu necesit aceste precauii, ele putndu-se scufunda timp de 10 minute.
Strip-urile din nitroceluloz (5 x 1 cm), cnd sunt utilizate la electroforeza proteinelor,
trebuie mai nti tratate timp de 5 minute cu o soluie de Tween 60, 2% preparat ntr-un
tampon compus din veronal, citrat i oxalat, pH=8,6. Astfel, membranele de nitroceluloz
tratate cu detergent nu adsorb proteine i pot fi utilizate pentru separri de proteine n
gradieni nali de potenial de 15-20 Vcm-1 timp de 10-15 minute.
Membranele mbibate se plaseaz imediat n sistemul reglabil i se aplic probele cu ajutorul unei
micropipete sau unui dispozitiv de aplicare simultan a probelor (10-16 probe).) Volumul aplicat de prob
este n funcie de grosimea membranei i de concentraia proteic. Nigrozina (denumit i Indian ink) este
cel mai bun colorant al proteinelor pe folii de nitroceluloz. Un alt colorant utilizat n colorarea proteinelor
este Ponceau S.
La pH neutru i alcalin, RNA migreaz rapid n folie spre anod, n timp ce DNA nativ rmne pe linia de
start. DNA monocatenar denaturat migreaz spre anod. Membranele de nitroceluloz cu dimensiuni variate
a mrimii porilor, impregnate cu detergeni ori soluii de albumin seric, pot fi utilizate la separri de
proteine, polinucleotide i nucleoproteine.

Modelul de baz a tancurilor electroforetice utilizate pentru

membranele de celuloz seamn cu cele utilizate la tehnica
electroforetic pe hrtie. O serie dintre acestea prezint
sisteme de rcire i pot fi utilizate concomitent pentru
electroforez pe membrane i pe strat subire. Ambele
separri se pot realiza att la voltaje sczute ct i la cele
nalte. Pentru a minimaliza procesul de evaporare, se poate
aduga glicerol la soluia tampon. Controlul evaporrii se
poate realiza i prin folosirea de soluii tampon cu trii ionice
mici (o concentraie mic a soluiei tampon favorizeaz
creterea vitezei de migrare n paralel cu scderea efectului
Joule.

Astfel, dac tria ionic este dat de relaia:

Dup electroforez strip-ul de acetat de celuloz este uscat la 100C

timp de aproximativ 10 minute.
Metodele de colorare i detecie utilizate sunt asemntoare cu cele
utilizate la hrtia de filtru.
Sunt de preferat ca soluiile apoase de colorant fa de soluiile
alcoolice, concentraia acestora fiind deobicei mai sczut fa de cea
aplicat pentru hrtia de filtru.
Membranele din acetatul de celuloz i nitroceluloz sunt ideale
pentru examinrile absorbiometrice i fluoro-densitometrice, precum i
de detecie a substanelor radioactive prin autoradiografie ori prin
metode de scanare direct.

MICROELECTROFOREZA PE ACETAT DE CELULOZ

Benzile (strips-urile) de membrane (acetat de celuloz sau nitroceluloz) de mici
dimensiuni (50 x 10mm) disponibile dau posibilitatea efecturii a analizei proteice
complete pe 0,25 l de ser sanguin (electroforeza microzonal, microelectroforeza pe acetat
de celuloz) n 50 minute.
Procedeul de miniaturizare prin reducerea dimensiunilor membranei, a probelor i a
timpului se bazeaz pe faptul c mobilitatea electroforetic este relaie direct cu distana de
migrare i invers proporional cu timpul i intensitatea cmpului electric aplicat dup
relaia:

Aplicaii ale electroforezei pe membrane de acetat de celuloz

Membranele de celuloz sunt utilizate n mod comun pentru separarea proteinelor
plasmatice, glico- i lipoproteinelor, hemoglobinelor, enzimelor i a altor proteine.
Ele putnd fi folosite n metodele analitice i n scopuri preparative.
Metoda electroforetic pe membrane de acetat de celuloz este nc cea mai des
utilizat n diagnosticarea unor maladii. Tabelul urmtor prezint profilul
electroforetic obinut n urma separrii pe Cellogel al unei proteinograme din ser
sanguin normal.
Fracia electroforetic analizat
Albumine
Alfa 1-globuline
Alfa 2-globuline
Beta globuline
Gama globuline

Procente Deviaie
% standard
61% 1,5
2,5% 1,5
2,0
8%
10% 2,0
16% 3,5

Analiza proteinogramei este deosebit de important n identificarea unor maladii prin analiza
concentraiei unor proteine serice. Astfel prin interpretarea unei proteinograme se pot depista:
-hipergamaglobulinemiile (creterea tuturor claselor de imunoglobuline);
-hipogamaglobulinemiile (diminuarea tuturor claselor de imunoglobuline);
-mielomul sau macroglobulinemia lui Waldenstrm (apariia unei benzi foarte omogene care
semnific prezena unei proteine monoclonale);
-sindromul nefrotic (hiperexpresia globulinelor 2 i , cu diminuarea albuminei i a
globulinelor);
-ateroscleroza (creterea globulinelor);
-poliatrita reumatoid (creteri policlonale ale globulinelor i creterea fraciei 2 globulinei.
Figura
urmtoare
prezint
profilul
unei
electroforegrame
obinute
dup
procesarea
electroforetic a unei probe de ser sanguin normal.

Tehnica electroforetic care implic membranele de acetat de celuloz

este de asemenea util n monitorizarea unui tratament aplicat. Ea este
superioar tehnicilor imunologice n determinarea izoenzimelor
enolazei (procedeul dureaz circa 10 minute iar necesarul de ser este
de circa 10l), activitatea enzimatic fiind determinat n aproximativ
5 minute prin bioluminiscen.

Electroforeza pe membrane de acetat de celuloz a fost i este utilizat la studiul comparativ

al unor proteine serice la om i la alte animale.
A fost folosit la studiul histonelor (proteine bazice ale cromatinei la eucariote), la studiul
hemoglobinelor normale i patologice cnd s-au evideniat la pH=8,4, hemoglobina A, Hb F, Hb
S, Hb S i Hb C de Hb E i Hb O.
Membranele de acetat de celuloz se utilizeaz i n tehnicile de imunoelectroforez,
colorarea efectundu-se n acest caz cu ajutorul AgNO3, iar imunodetecia realizndu-se direct,
pe membran, fr transfer pe o alt membran de nitroceluloz.
Blocurile de Cellogel (cu o grosime de circa 2,5-5 mm) s-au folosit n scop preparativ, n
acest caz utilizndu-se la separare 0,25-1 ml de ser sanguin.

Protinogramme srique normal

INTERPRETATION du protinogramme (2)

Valeurs normales

Causes derreur
srum hmolys

prsence de fibrinogenen

Inflammation AIGUE (2)

Insuffisance hpatique
(cirrhoses, hpatites fulminantes)

Syndrome NEPHROTIQUE

Hypogammaglobulinmie des
dficits immunitaires

Hypergammaglobulinmie
POLYCLONALE

Hypergammaglobulinmie
MONOCLONALE

Electroforeza pe gel de amidon

Loading samples onto a starch gel for electrophoresis

Electroforeza pe gel din amidon, prima metod de electroforez zonal care a pus n
valoare efectul de sit molecular a mediului suport a fost introdus de Smithies. Ea a
fost recunoscut drept o tehnic care furnizeaz mijloace elegante de rezolvare a ionilor
similari i cu mobiliti libere identice. Astfel, o matrice de gel - nu i n cazul mediilor
poroase de tipul hrtiei sau a granulelor de amidon - prezint o structur reticulat care
poate impune o rezisten fricional apreciabil la trecerea ionilor, accesul acestora n
structura de reea fiind dat de mrimea porilor i dimensiunea ionilor care migreaz.
Dac n cazul gelurilor de amidon, domeniul dimensiunii medii a porilor se apropie de
domeniul dimensiunilor proteinelor, fracii proteice variate vor fi ntrziate diferenial
ntr-un grad proporional cu dimensiunea lor. Ca atare, datorit reticulrii fine i avnd
un efect de sit molecular, separarea amestecurilor este realizat n astfel de geluri
matrice att prin dimensiunile, forma, ct i prin diferenele de sarcin electric.
Amidonul este un polizaharid insolubil n ap. n stare nativ, n prezena apei el se umfl.
Matricea electroforetic se obine printr-o hidroliz parial cnd amidonul se convertete ntr-o
form care se solubilizeaz la o temperatur de circa 70oC i care apoi se solidific ntr-un gel
ferm la temperatura camerei. Mrimea porilor din gelul de amidon este dat de concentraia
acestuia i de gradul de hidroliz, ea variind ntr-un domeniu redus prin faptul c nici
concentraii, nici gradul de hidroliz nu pot fi schimbate dect n anumite limite, bine definite,
fr a afecta caracteristicile mecanice ale gelului.
Dac la nceput s-a utilizat amidonul din cartof, s-a constatat c rezultate mai bune se obin cu cel
din orez.

Fa de alte medii stabilizante de separare a proteinelor, peptidelor ori a acizilor

ribonucleici, amidonul prezint o serie de avantaje comparativ cu hrtia, gelatina,
agarul, silicagelul:
(i) Adsorbia celor mai multe proteine pe amidon este neglijabil;
(ii) Eluia segmentelor de amidon dup separarea electroforetic se realizeaz mai uor
dect n cazul gelului de gelatin ori agar ceea ce reprezint un factor important n
scopurile preparative;
(iii) Amidonul formeaz mai uor o past omogen cu diverse tampoane fa de pudra
de celuloz;
(iv) Electrosmoza este mai mic dect n cazul multor altor medii suport dei acest
fenomen poate cauza o separare slab, mai ales n cazul cnd tehnica este cea de bloc
de amidon i se realizeaz n modele de aranjament orizontal.
Electroforeza pe gel de amidon este considerat dup unii autori a fi o metod blnd de
purificare a proteinelor fr anse de denaturare, putndu-se pune alturi de metoda salting-out
ori precipitarea cu acizi, alcool sau aceton. Pe de alt parte, ali autori consider c din contr, n
timpul electroforezei au loc procese ireversibile de denaturare care conduc la o pierdere
considerabil de protein. Chestiunea n cauz se ridic dac acest proces se manifest din cauza
dezvoltrii de cldur cauzat la intensiti de 17-20 mA a curentului electric cu soluii tampon cu
trie mare. Astfel, procesul de denaturare nu se observ la trii ionice sczute, rezultatele fiind
satisfctoare.

Amidonul este utilizat ca mediu suport

n trei tehnici electroforetice zonale:
Electroforeza clasic pe gel de
amidon, descris pentru prima dat de
Smithies;
Electroforeza pe coloan, dezvoltat
de ctre Carlson i independent de
Flodin i Porath;
Electroforeza pe bloc de amidon,
introdus de Kunkel i Slater.
Aparatura utilizat n electroforeza pe
gel de amidon este de dou tipuri: I)
pentru geluri orizontale; II) aparate cu
gel vertical. Ambele aparate sunt
alctuite de 2 rezervoare cu soluie
tampon, compartimentate pentru a
mpiedica produii de electroliz s
intre n contact direct cu gelul.
Contactul dintre suport i gel se
realizeaz prin intermediul unor bride
din hrtie de filtru sau tifon (bumbac)
iar legturile dintre compartimente se
formeaz n acelai mod.

Godeurile se efectueaz cu ajutorul unui pieptene din plexiglace care se plaseaz peste
stratul de amidon nainte de gelificare i se ndeprteaz dup aceasta. Dimensiunile
godeelor sunt de 15-30 mm lungime, 1 mm lime i 50 mm adncime.
n general separri bune sau foarte bune se pot obine la temperatura camerei la o
tensiune de 6V/cm timp de 6 ore sau la o temperatur de 5oC i la o tensiune de
10V/cm, n sistem de tampon continue sau discontinue.
Dup separarea electroforetic sunt recomandate diverse proceduri de colorare a
gelurilor. Astfel, gelul este extras cu grij din cuva de electroforez i tiate paralel cu
suprafaa n dou pri egale. Colorarea se realizeaz prin turnarea colorantului peste
suprafaa secionat. O serie de lucrri prezint coloraia cu soluie de Amido black 10B
n metanol:ap:acid acetic glacial (50:50:10) timp de l0-30 min.
Lipoproteinele pot fi colorate prin incubare timp de 16 ore ntr-o o soluie alctuit din: 1,2 g
Sudan black 10B, 40 ml de ap distilat, 600 ml etanol i 2 ml NaOH,. Decolorarea complet se
realizeaz dup 6-8 zile dup imersare ntr-o soluie de etanol 60%. De asemenea, pentru a
vizualiza lipoproteinele se poate utiliza o soluie saturat de Oil Red O pregtit ntr-un amestec
metanol:ap:acid acetic glacial (60:10:30).).

Proteinele care conin cupru precum hemocianina, sunt detectate prin plasarea gelului secionat
pentru 3-4 ore ntr-o soluie care conine 50 ml acetat de sodiu l0% i 3 ml de soluie ditiooximid, 0,1% preparat n alcool. Apariia unei coloraii verde-nchis este un rezultat pozitiv.
Hemoglobinele sunt detectate cu reactiv benzidin sau cea descris pentru electroforeza pe gel de
agar. Hem-proteinele pot fi de asemenea colorate cu o-tolidin.
Pentru complexul acestor proteine cu hemoglobina care prezint o activitate peroxidaz-like, odianisidina pare a fi cel mai bun reactiv ea formnd o coloraie brun.
o serie de aplicaii ale electroforezei pe gel de amidon
Material biologic
Lipoproteine serice normale i patologice

Proteine lenticulare bovine

Tuberculo-proteine
Fosfataza alcalin intestinal
Hormonul de cretere (somatotropin)

Tampon
Barbital
Fosfat
Barbital
Barbital
Barbital
Acetat

-Galactozidz
Chimotripsinogen
Tirozinaz de mamifere
Tripsin

Carbonat
Pirofosfat
Cacodilat
Barbital
Acetat

Hemocianin

Borat

Hemoglobin
Plasm uman

Borat
Borat

Trie ionic
(Molaritate)
0,1

pH

8,6

100-500

mA

Timp (ore)
25-60

0,5
0,1
0,1
0,02

8,6
8,6
8,6

400
360
200

17-20
7-9

24
24
30
12

0,017
0,1

4,00
11,2

175
175

30
30

24
72

0,025
0,1
0,1
0.1
0,02M borat +
NaOH 0,008M
0,05 M
0,025

8,5
6,6
8,5
4,00

370
3,2V/cm
300
/300

1
11
-

16
65
19
10

8,0/3

92V/cm

12

8,5
-

6V/cm
450

5
18

ELECTROFOREZA PE GEL DE AGAROZ

Agaroza este singurul hidrocoloid neadeziv care i-a gsit o multitudine de utilizri n tiinele
separatologice dup prepararea sa de ctre Araki (1937) ca un component aparent fr grupri sulfat,
din agaropectina, bogat n astfel de grupri, la rndul ei obinut din agar.
Cele dou componente se separ prin acetilare i dizolvare n cloroform cnd agaroza acetilat este
solubil. nc din secolul al XVII-lea n Japonia, agarul i o muli ali hidrocoloizi derivai dintr-o serie
de alge roii de mare din clasa Rhodophyceae (speciile Gelidium i Gracilaria) au fost utilizai la
prepararea hranei.
Agarul a fost introdus ca mediu pentru imunoelectroforez de ctre Grabar i Williams n anul 1953,
tehnica original descris de acetia fiind ocazional utilizat i astzi. Electroforeza pe agar tratat este
de altfel principala metod curent de identificare a variantelor de hemoglobin.
Agarul a fost aplicat de ctre Polson n anul 1961 pentru separri cromatografice bazate pe
proprietatea sa de sitare molecular, dup care acesta a fost nlocuit gradat cu agaroza, nceputul fiind
fcut de ctre Hjerten (1961).
Coninutul n sulfat a agarozelor de diferite grade furnizate pentru utilizare n laborator este n
general sub 0,12% comparativ cu 4% coninutul n agaropectin. Din aceast cauz agaroza poate fi
utilizat n prepararea gelurilor fr nevoia utilizrii unor aditivi sau a unor ageni de reticulare iar
ineria sa fa de interacia cu proteinele i acizii nucleici reprezint principalele raiuni ale ei n larga
utilizare ca mediu de separare. Tot ce este necesar n prepararea gelurilor este de a dizolva agaroza
pulbere prin nclzire controlat la fierbere sau aproape de temperatura de fierbere, dup care s se lase
s se rceasc. Procesul de gelificare se manifest spontan i este complet n gelurile reci. n plus fa
de simplicitatea pregtirii gelului de agaroz, alturi de ineria fa de interacii cu proteinele i acizii
nucleici i ofer acesteia o multitudine de avantaje ca mediu de separare precum recuperarea simpl a
probei, netoxicitatea i simplicitatea pregtirii gelului.
Agaroza este de asemenea unic ca aplicativitate n numeroase proceduri imunoelectroforetice.

n comparaie cu gelul de poliacrilamid, gelul de agaroz este un material foarte poros, ceea ce i
limiteaz oportunitatea folosirii sale n form nemodificat n separri de proteine bazate pe
efectul de sit molecular la cele cu mas molecular mai mic de 60 kDa. Pe de alt parte, marea
sa permeabilitate face din ea un mediu superior poliacrilamidei pentru studii imunochimice.

Proprietile gelurilor de agaroz. Din punct de

vedere chimic, agaroza este un polizaharid liniar
compus din uniti alternative de D- i Lgalactozobioz (agarobioz) legate prin legturi
1-4 (figura alturat) cu catene de o lungime dat
de cele 400 de uniti de agarobioz, legate prin
legturi 1-3 i cu o mas molecular de circa 120
kDa (figura de mai jos), cu resturi substituite
carboxilat, piruvat i/sau sulfat.

Gelificarea se manifest ca un proces de inter-legare a protofibrilelor. Astfel, n timpul acestui

proces, lanurile dublu catenate elicoidale se desfac iar legturile 3,6 din structura 3,6
anhidrogalactozei se desfac de asemenea, ceea ce conduce la fragmentarea lanului iniial n
lanuri dublu elicoidale mai scurte a cror capete se vor uni ncruciat, proces de numit
schimbarea partenerului. n continuare are loc asocierea n suprafibrile cu raza de 10-20 nm
(figura de mai jos), supranfurare care explic rezistena mai mare i porii mai mari a gelului
de agaroz comparativ cu alte geluri care nu formeaz suprafibrile (ca de exemplu gelul de
amidon, gelul de poliacrilamid cu un grad de reticulare, C% cuprins ntre 1 i 5).

Gelurile sunt translucide

deoarece fibrele nfurate
mprtie lumina dar devin
transparente prin uscare.

Abilitatea de a forma fibrile groase, puternice permit agarozei s formeze geluri chiar
la concentraii sub 0,2%. ncorporarea agarozei n suprafibre groase fac aceste geluri
nalt poroase pn la o concentraie mai mare de 6%, limita la care agaroza poate fi
dizolvat fr a apela la temperaturi de autoclavare. Concentraii pn la 16% se pot
realiza numai prin autoclavare. La gelurile cu o concentraie egal cu 2% efectul de
sit molecular nu este prezent, electroforeza fiind de tip capilar, n timp ce la gelurile
cu o concentraie cuprins ntre 3 i 10%, distanele ntre i din interiorul
suprafibrilelor devin egale i ia astfel natere un gel cu o singur dimensiune a
fibrelor. Porozitatea mare a agarozei o face superioar poliacrilamidei pentru
separarea proteinelor mari, polipeptidelor, complexelor cu un domeniu de mas
(Mr) cuprins ntre 100 kDa i mai muli megadaltoni. Prin utilizarea agarozei se
pot separa fragmente de ADN din domeniul 1000 la 23000 perechi de baze (bp).
n cazul agarozei hidroxietilate numrul de lanuri din constituia suprafibrilelor este
mai mic dect n cazul agarozei nesubstituite i din aceast cauz porii gelului sunt
mai mici fiind similari cu cei ai gelului de poliacrilamid, avnd o mare capacitate de
sitare molecular similar gelului de poliacrilamid ns rezistena mecanic este mai
mic dect a agarozei nemodificate. Recent, au fost obinute noi formule de derivai de
agaroz care au proprieti mecanice mbuntite.

n funcie de gradul de substituie cu sarcini negative i de modificrile chimice survenite, se

disting trei categorii de agaroz caracterizate prin:
a)coninutul n resturi sulfat (exprimat n %);
b)electroosmoz;
c)temperatura de gelificare;
d)temperatura de topire.
Electroendoosmoza preparatelor de agaroz este dat de parial de coninutul n resturi sulfat i
piruvat. Ea poate fi msurat convenional fie
cu ajutorul ciancobalaminei (vitamina B12), colorat n rou,
fie cu Dextran-500, care poate fi detectat n urma precipitrii cu etanol,
fie urmrind migrarea albuminei serice bovine (BSA).
De obicei se utilizeaz deplasarea BSA la pH=8,6 iar n urma acestei analize se determin
factorul mr, dup care se clasific agarozele n agaroze cu electroosmoz mare, medie
(standard) i mic. Gruprile sulfat prezente n cele mai multe preparate induc o mic
electroendosmoz (EEO) n timpul electroforezei. Electroendosmoza se manifest ca o curgere
de tampon prin gel. Efectul este datorat faptului c sarcinile negative ale gruprilor sulfat din
matricea de gel nu se pot mica spre anod motiv pentru care apare ca rezultat o pompare
compensatoare de tampon spre catod. Efectul asupra mobilitii proteinelor este n general mic,
totui devine pronunat n sisteme de tampon discontinue utilizate pentru ngustarea benzilor din
proba aplicat. EEO poate astfel induce colapsarea gelurilor n sisteme tampon discontinue
datorit electroendosmozei inegale prin frontul de tampon. Astfel, o serie de sisteme de
tamponare descrise pentru gelurile de poliacrilamid nu funcioneaz la fel de bine pentru
gelurile de agaroz.

Agarozele cu electroosmoz diferit se utilizeaz n tehnici specifice precum:

Agarozele cu electroosmoz mare (-mr=0,25) se utilizeaz n tehnicile de
contraimunoelectroforez;
Agarozele cu electroosmoz standard i mic (-mr =0,13-0,07) se utilizeaz pentru
electroforez i imunoelectroforez. Ele sunt folosite la separarea acizilor nucleici
(agarozele standard), dedetectnd DN-azele, RNA-azele, proteazele, inhibitorii
endonucleazelor, enzimele de restricie i modificare, ligazele, polimerazele.
Agarozele cu electroosmoz egal cu zero sunt utilizate pentru focusare (focalizare)
izoelectric. Ele se obin prin adugarea unor aditivi sau printr-un procedeu chimic
(reacie de substituie) n scopul blocrii (contrabalansrii) sarcinilor electrice negative
cu grupri electropozitive. Aditivii dintr-o serie de zero-EEO agaroze contribuie la
formarea unui background n timpul colorrii.
Agarozele hidroxietilate (numrul de grupri hidroxietil fiind de circa 15%) formeaz
geluri cu concentraie de 2-10% cu dimensiunile porilor aproximativ egale cu cea a
proteinelor. Ele au o temperatur de gelificare n jurul a 25oC iar temperatura de
solidificare de aproximativ 45oC (25/45). Astfel, o agaroz hidroxietilat 15/45
formeaz geluri de concentraie 2-10%, asemntoare gelurilor de poliacrilamid.
Agarozele cu un procent de 5% hidroxietil formeaz geluri cu o temperatur de topire
de 60-65oC

Echipamente i sisteme tampon.

Gelurile de agaroz sunt n mod curent utilizate pentru electroforez plan, orizontal pe care
gelurile sunt plasate ntre electrodul anodic i catodic aflai n camere umplute cu tampon i
conectate prin puni umede. Cu excepia unor cerine uzuale la platforma pe care se aeaz
gelul se poate adapta uor un sistem de rcire prin recircularea apei. Gelurile sunt turnate n
casete deschise ori prevzute cu dou spaiatoare. Se are n vedere c utilizarea punilor din
hrtie sau bumbac conduce la o pierdere de voltaj prin ele ceea ce conduce la o creterea a
efectului de nclzire i apariia fenomenului de condensare n camera de separare
electroforetic. Pierderea de voltaj de-a lungul gelului trebuie s fie controlat direct de la
nivelul gelului i nu din sursa de curent. n plus hrtia de filtru nu este totdeauna
recomandat deoarece prin utilizarea sa drept brid de contact, datorit procesului de
electroosmoz, puntea dinspre anod se poate usca mpreun cu extremitatea respectiv a
gelului n timp ce la extremitatea catodic se adun lichid n exces, deoarece hrtia de filtru
nu poate prelua i transfera cantiti mari de lichid. Condensarea vaporilor pe gel este uor
de prevenit printr-o simpl barier de vapori care se aeaz pe gel. Pentru electroforeza
acizilor nucleici utilizarea punilor (bridelor) de legtur a fost eliminat prin aplicarea tehnici
cunoscute drept submers n care gelul este aezat pe o platform ncrcat cu tampon
conectat la camerele electrozilor. Modul de electroforez submarin nu este n mod curent
aplicabil n electroforeza proteinelor deoarece acestea au tendina de a difuza n tamponul
nconjurtor, n timp ce acizii nucleici posed constante de difuziune foarte mici, motiv pentru
care migreaz aproape n ntregime prin gel la aplicare unui cmp electric, cu o doar mic
difuziune. Gelurile de migrare din agaroz n format vertical cu camere de electrozi sunt
rareori utilizai deoarece agaroza are tendina de a se dilata i astfel de a prsi caseta.

Iniial, aplicarea probei n gelul de agaroz s-a realizat

prin tierea unei fante n gel. Aceast tehnic este n
continuare utilizat la electroforeza acizilor nucleici,
care formeaz benzi nguste cnd migreaz nerestinctiv
din soluia de prob n gelul de migrare restrictiv,
comparativ cu proteinele la care se manifest foarte
mic ngustare a benzii care permeaz gelul uor. n
plus, godeurile induc distorsiuni ale benzilor proteice
datorit: (i) procesului de permeaie parial n
marginile godeului nainte de nceperea de facto a
separrii electroforetice; i (ii) datorit tensiunii
electrice inegale care se manifest le-a lungul godeului
n momentul aplicrii unui cmp electric. Datorit
uurinei cu care soluiile pot fi mbibate n agaroz
urmat de compresia temporar cu hrtie de transfer,
probele pot fi depuse pe gel n benzi demarcate prin
intermediul aa-numitei tehnici folie de aplicare a
probei, un plastic subire ntins peste gel care are
prevzute nite fante prin care probele sunt depuse pe
gel. Acest sistem de aplicare a probei a fost sugerat de
Cawley simplificnd procedura comparativ cu cea de
formare de godeuri.

Din punct de vedere electric, n cele mai multe aparate se utilizeaz un gradient de
potenial de 15-20 V/cm. Acesta corespunde unei puteri totale a cmpului electric de
250-300 V i o intensitate de curent de 100-140 mA, depinznd de mrimea electrozilor.
n cazul gelurilor subiri de 3 mm grosime, tensiunea aplicat este de 6 V/cm.
Fixarea fraciilor proteice se realizeaz: a) fie prin imersarea gelului n soluie de acid
acetic 20% timp de o or, dup care gelul se usuc timp de 16 ore la 37oC; b) fie prin
imersarea sa ntr-un amestec de acid picric (soluie saturat):acid acetic (20%) ntr-un
raport 3/1 timp de 15 minute, dup care gelul se usuc.

Toate metodele comune de colorare utilizate

(bazate pe Coomassie Brillant Blue,
fluorescen, chimiluminescen, i de tip
coloidal) funcioneaz bine cu agaroza,
metoda cu Coomassie coloidal fiind una
dintre cele mai rapide. Amido Black 10B
(soluie 1% preparat ntr-o soluie de acid
acetic 7% sau preparat ntr-un amestec
metanol:acid acetic:ap, n raport de 5:1:5)
este utilizat deoarece produce zone distincte
i faciliteaz vizualizarea - i lipoproteinelor.

Structura chimic a Coomassie

Brillant Blue G-250 (sinonime: Serva
blue G sau C.I. acid blue 90), un
colorant trifenilmetanic.

O adaptare a electroforezei pe agaroz o reprezint electroforeza de nalt

rezoluie. Ea este utilizat n clinic n laboratorul de analize medicale. Prin
utilizarea ei, se evideniaz schimbri calitative i cantitative ale proteinelor
serice, semnificative din punct de vedere clinic care nu pot fi decelate prin
electroforez convenional sau pe acetat de celuloz. Practic se lucreaz
pe gel de agaroz de 1 mm grosime, turnate pe folii de film flexibil de
poliester, Gelbond care sunt pstrate n soluie tampon i n ambalaje
ermetice, care faciliteaz mnuirea i stocarea gelului prelucrat. Volumul de
prob este de 2-4 L, putndu-se aplica simultan 6 ori 12 probe. Timpul de
separare este de aproximativ 45 de minute la o tensiune de 20V/cm

INTERPRETAREA ELECTROFOREGRAMELOR N TERMEN DE

VARIAIE A PROTEINELOR INDIVIDUALE
Abilitatea gelului de agaroz de a
revela proteine diferite variaz n
funcie de concentraia de protein,
capacitatea de legare a colorantului i
de
gradul
de
omogenitate
electroforetic. n general, capacitatea
de legare a colorantului scade odat cu
creterea coninutului n oligozaharide
i lipide. Figura de mai jos d o
prezentare schematic a concentraiei
relative
i
eterogenitatea
electroforetic
a
proteinelor
plasmatice majore, ntr-un subiect
sntos, avnd cel mai frecvent
fenotip
Distribuia electroforetic i concentraiile relative ale proteinelor majore plasmatice
comparativ cu fraciile obinute prin electroforez clasic. Abreviaii: Alb, Albumin;
Lp, Lipoproteine; Om, Orosomucoid; 1-At, 1-antitripsin; 2-M, 2macroglobulin; GC, componente specifice de grup; Hp, haptoglobine; CIG,
globulin insolubil la rece; Hz, hemopexin, Tf, transferin; C3, complement C3;
Fg, fibrinogen; Ig, imunoglobuin; i CRP, protein C-reactiv

Tabelul de mai jos prezint proteinele individuale care pot fi prezente n concentraii
care pot influena profilul electroforetic. Datele din paranteze sunt prezente la aa
concentraii nct nu pot influena semnificativ profilul electroforetic.
Proteina int
Prealbumina
Albumina
-Lipoproteine
(-Fetoproteina)a
(Orosomucoid)
1-Antitripsina
Globuline specifice de grup
(Inhibitorii inter-1-tripsin)
(Ceruloplasmina)
2-Macroglobulinele
Haptoglobinele (1-1, 2-2, 2-1)
Globulinele insolubile la rece
Transferina
-Lipoproteinele
Al treilea component al sistemului complement, C3
IgA
Fibrinogenul
(IgM)
IgG
(Catenele de imunoglobulin uoar)
(Proteina C-reactiv)

Domeniul normal (g/L)

0,15-0,36
39-51
(3-7)
<1-1 -5
0,40-1,05
0,8-1,9
0,2-0,55
0,2-0,7
0,22-0,46
1,2-2,4
0,40-2,9
0,1-0,3
1,7-2,7
2,2-7,4
0,6-2,2
1,0-3,0
2,2-4,4
0,6-2,2
6,5-15,5
<0,001
<0,02

Analiza profilului electroforetic

Zone electroforetice Observaie
Zona prealbuminei

Sczut

Sczut
Zona albuminei

Front anodal rapid

Intensitate sczut
Interzona albumin1
Intensitate crescut
1- Lipoproteine
Polimorfism
Zona 1
1-Antitripsina

Crescut
Relativ sczut

Zona 2
2-Macroglobulina
Haptoglobina

Imunoglobuline

Crescut
Crescut
Relativ sczut
Benzi nguste
Difuzie crescut
Apariie n benzi

Cauze posibile
Mas celular hepatic sczut,
Rspuns inflamator
Malnutriie
Rspuns inflamator,
Malnutriie,
Pierderi n greutate,
Maladii maligne,
Un volum extracelular crescut.
Medicamente (penicilin)
Icter
Leziuni ale celulei hepatice
Malnutriie
Abuz de alcool
Nivel estrogenic crescut postmenstrual
Variante genetice.
Rspuns inflamator,
Alterarea celulei hepatice
Deficien genetic,
Scderi n greutate.
Dependent de vrst la copii,
Persoane n vrst (>70),
Proteinurie selectiv
Rspuns inflamator,
Hemoliz in vivo
Componenta M
Cretere policlonal
Cretere oligoclonal, infecie viral, malignitate

Un profil policlonal semnificativ al electroforezei proteinelor serice

pe gel de agaroz (anodul fiind n stnga). Banda prevzut cu
asterisc este lrgit i se ntinde pe toat aria de mobilitate gama
(Panelul B). Trasarea densitometric a acestei observaii vizuale
relev un peak difuz de mobilitate gama. Acest profil este cel mai
adesea dat de prezena unui proces inflamator ori reactiv, precum i
n bolile cronice ale ficatului, n bolile esutului conectiv, n infecii
cronice, ori ntr-o maladie limfoproliferativ (Panel A).

Polimorfism
Zona 1
Transferina

Crete
Scade

Poziie crescut
Lipoproteine
Zona 2
IgA

Cretere selectiv
Polimorfism
Poziie

C3

Zona
Fibrinogen

Crete
Scade
Crete

Variante genetice (proteina Bence

Jones, componenta M, hemoglobin)
Deficien de fier, estrogeni
Malnutriie, scderi n greutate rspuns
inflamator
Hipercolesterolemie
O mobilitate sczut cu creterea
intensitii sugereaz o obstrucie
biliar
Malignitate, infecii ale mucoasei,
artrit, abuz de alcool
Variante genetice,
Conversia in vivo/invitro a C3 la C3c
Rspuns cronic inflamator,
Obstrucie biliar
Activarea complementului
Rspuns inflamator

PROFILUL ELECTROFORETIC AL PROTEINELOR DIN PLASM COMPARATIV

CU CELE DIN FLUIDUL CEREBROSPINAL
n mod normal, aproximativ 80% din proteinele fluidului cerebrospinal fluid (CSF) au
originea n plasm iar restul sunt sintetizate local. Timpul de njumtire pentru
proteinele plasmatice care intr n spaiul subarahnoid este de aproximativ o
sptmn, i din acest motiv compoziia n proteine a CSF o urmeaz pe cea din
plasm, cu o oarecare ntrziere. Rezistena de transfer a proteinelor plasmatice crete
rapid odat cu masa molecular i din acest motiv raportul dintre proteinele mari
(IgM, -lipoproteine i 2-macroglobuline) i albumin, este n mod normal mai
sczut n CSF dect n plasm. Aceast discriminare pe baza masei moleculare se
micoreaz cnd concentraia proteic a CSF este crescut.

PROFILUL ELECTROFORETIC AL PROTEINELOR

DIN URIN COMPARATIV CU CELE DIN PLASM
Un determinat primar pentru profilul proteinelor urinare este compoziia i cantitatea de
proteine care permeaz filtrarea glomerular n relaie cu capacitatea resorbtiv tubular.
n mod normal, aceasta este limitat la aproximativ 200 mg/zi. Asupra pierderii urinare
intense de cantiti de protein, analizele comparative electroforetice disting trei
posibiliti majore:
(a) proteinuria glomerular neselectiv,
(b) proteinuria glomerular selectiv, i
(c) proteinuria Bence Jones.

PROTEINURIA BENCE JONES

Excreia urinar a catenelor uoare de imunoglobuline ori , cu origine monoclonal
(proteinuria Bence Jones) conduce la apariia unei singure (ori uzual dubl) bande, mai mult ori
mai puin nchis la culoare, undeva n zona 1 spre zona cu mobilitate mic . Natura ei poate fi
demonstrat prin imunoelectroforez, dar este de preferat o evideniere prin imunofixare dup o
electroforez pe gel de agaroz n prezena antiserurilor anti i anti . Rezultatul unor analize
imunoelectroforetice convenionale este mai dificil de interpretat dect rezultatul obinut prin
imunofixare dac concentraia de caten uoar monoclonal este sczut, deoarece catenele
policlonale uoare apar n urin.
Electroforeza proteinelor urinare pe gel de agaroz n
prezen de dodecil sulfat de sodiu
S-a introdus pentru analiza calitativ a proteinelor urinare electroforeza pe gel de poliacrilamid n prezena
dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE). SDS-PAGE separ proteinele n funcie de mrimea lor molecular, iar
monomerii catenelor uoare libere (policlonale sau monoclonale) sunt vizualizate ca o band cu mas
molecular (Mr) de 25.000 Da, care sunt deosebite cu uurin de imunoglobulinele intacte (cu mas
molecular de 150.000 Da). SDS-PAGE difereniaz, de asemenea, proteinuriea cu origine glomerular
(proteine, cu mas molecular de 66.000 Da), de cea cu origine tubular (proteine cu mas molecular de
66.000 Da), sau cu origine mixt. Aceast metod este, aadar, un potenial instrument clinic pentru evaluarea
funciei renale, un important factor de prognostic n MM. Cu toate acestea SDS-PAGE, nu este utilizat pe
scar larg n laboratoarele clinice, pentru c este exigent din punct de vedere tehnic, un timp mai
mare, i este mai costisitoare.

Le Bricon i colaboratorii (1998; 2000) propun pentru prima dat o tehnic de

analiz a proteinelor urinare prin electroforez pe gel de agaroz n prezen de
dodecil sulfat de sodiu (SDS-AGE) la pacieni suferinzi de Mielom multiplu. Astfel,
urina, fr o concentrare prealabil, se analizeaz prin SDS-AGE pe suport
Hydragel, mediu electroforetic utilizat n mod comun la analiza proteinuriei.
Profilul electroforetic a cinci probe diferite obinut
dup SDS-AGE. De la stnga spre dreapta: 1,
proteinurie glomerular selectiv: transferin i
albumin; 2, BJP prerenal pur: dimeri ai
catenelor uoare i monomer, nainte de
tratamentul cu mercaptoetanol; 3, proteinurie
mixt: immunoglobuline, transferin, albumin,
1- microglobulin (Alfa-1 ), monomeri ai
catenelor uoare (policlonali), proteina de legare
a retinolului (RBP) i 2-microglobulin (Beta-2
); 4, BJP prerenal pur: monomeri ai
catenelor uoare; 5, proteinurie tubular: mici
cantiti de albumin, monomeri ai catenelor
uoare (policlonale) i RBP. Caracterul
monoclonal al catenelor uoare detectate sunt
confirmate prin imunofixare.

Trebuie ns accentuate o serie de limitri ale tehnicii SDS-AGE. Cea mai

important este faptul c SDS-AGE nu poate s realizeze o distincie
definitiv ntre proteinele monoclonale i cele policlonale. n absena unor
leziuni tubulare (n cazul BJP pur sau n proteinuria glomerular), se
evideniaz ntotdeauna banda electroforetic corespunztoare
Mr=25.000 Da caracteristic BJP.
n concluzie, SDS-AGE
pare a fi un instrument de laborator clinic pentru urmrire a pacienilor diagnosticai cu
MM.
SDS-AGE are o nalt rezoluie, sensibilitate, i reproductibilitate.
ntr-un laborator specializat, metoda este util n monitorizarea progresiei maladiei la
pacieni prin intermediul determinrii semicantitative a BJP.
Comparativ cu electroforez pe gel de agaroz de rutin, SDS-AGE combin simplitatea
(nu este nevoie de o concentrare prealabil a urinei) cu o sensibilitate crescut pentru
detectarea BJP.
Profilurile electroforetice glomerulare, tubulare ori mixte se identific uor pe gelul de
agaroz. Interpretarea profilurilor benzilor proteice dup SDS-AGE cere, totui,
contientizarea unor capcane, n special n ceea ce privete polimerizarea catenelor uoare i
prezena unor catene uoare mono-i/sau policlonale n specimenele de urin a pacienilor
diagnosticai cu mielom multiplu.
n unele cazuri, SDS-AGE poate fi uor mai sensibil dect imunofixarea n detecia
proteinelor Bence Jones la concentraii sczute.

ELECTROFOREZA FRAGMENTELOR DE ADN PE GEL DE AGAROZ

Acizii nucleici sunt polimeri compui din uniti nucleotidice individuale, unitile fiind conectate prin
intermediul legturilor diester fosfat la scheletul zaharidic. Efectul net al acestor legturi este cel de a oferi
polimerilor o sarcin net negativ.
nc de la nceputul tehnicilor electroforetice s-a axiomat faptul c moleculele care transport o sarcin
electric vor migra ntr-un cmp electric ntr-un mod previzibil. Atunci cnd este supus unui cmp electric, o
molecul care transport o sarcin net negativ va migra spre polul pozitiv, n timp ce o molecul ncrcat
cu o sarcin net negativ va migra spre polul negativ.

Atunci cnd macromolecule de acizi nucleici ncrcate electric sunt plasate n matricea
semi-solid a unui gel, ele vor migra spre polul pozitiv ntr-un mod previzibil i
reproductibil, procesul putnd fi descris ca o funcie exponenial negativ a lungimii
acestora. Altfel spus, moleculele mai scurte vor migra mai repede n timp ce moleculele
mai mari (mai lungi) vor migra mai lent. ntr-adevr, n cazul unui acid nucleic, aflat
ntr-un cmp electric uniform, orice alt element al expresiei migrrii sale este o
constant, iar mobilitatea sa este complet determinat de mrimea moleculei (masa
molecular a unui acid nucleic se exprim n daltoni sau n perechi de baze, base pair,
bp, de fapt nucleotide; o pereche de baze este aproximativ egal cu 660 daltoni).
Metoda este deosebit de simpl, rapid i sensibil pentru separarea, identificarea i
purificarea fragmentelor de ADN.

Din punct de vedere practic, intr-un gel de

agaroz, este dificil s se rezolve cu
precizie acizi nucleici dubli catenari mai
mici de aproximativ 100 de baze, deoarece
proprietile de cernere molecular a
agarozei nu sunt suficient de pregnante. Pe
de alt parte, macromoleculele mai mari
de aproximativ 25.000 bp dar mai mici de
aproximativ 2.000.000 bp vor migra n gel
cu viteze diferite, datorit limitrii de
mobilitate. Macromoleculele de acizi
nucleici mai mari de 2.000.000 bp nu vor
putea penetra un gel convenional de
agaroz. Astfel, domeniul efectiv de
mrime pentru electroforeza acizilor
nucleici dublu catenari pe un gel
convenional de agaroz este ntre 100 bp
i 25.000 de bp. n acest interval
comportamentul macromoleculei este
precis i previzibil. Acest comportament
este prezentat n figura alturat.

Mobilitatea electroforetic a fragmentelor de

restricie a ADN ntr-un gel de agaroz. DNA provine
din bacteriofagul lambda n urma digestiei cu enzima
de restricie Hind III. Graficul arat c distana de
migrare n centimetri n funcie de mrimea n
perechi de baze a fragmentului separat

n anii 80, a fost prezentat o teorie prin care se consider c

acizi nucleici migreaz prin gel asemntor micrii
ondulatorii a unui arpe. Astfel macromolecula se mic din
fa i trage restul de macromolecul dup ea. n acest model,
cu ct molecula este mai mare, cu att ea interacioneaz mai
puternic cu matricea de gel i astfel ntmpin o rezisten mai
mare din partea acesteia
n aa fel nct timpul su de
.
staionare ntr-o zon este mai mare. Aa cum a fost artat mai
sus, creterea rezistenei gelului este neliniar. Acest model,
numit biased reptation, este suficient pentru a explica tot
comportamentul unui acid nucleic ntr-o matrice de semisolid.
n anul 1989 un grup de cercettori de la Universitatea din
Washington, au testat aceast teorie, filmnd macromoleculele
de ADN care se deplaseaz printr-un gel de agaroz. Filmul a
artat att micarea ondulatorie, sigmoidal, ct i
interaciunile dintre acid nucleic i matricea gelului de
agaroz.

Separarea fragmentelor de ADN de dimensiuni

diferite prin electroforez pe gel vertical. Gelul este
preparat prin turnarea agarozei topite sau a
acrilamidei nepolimerizate ntre dou geamuri de
sticl aflate la o distan de civa milimetrii. Dup
solidificarea agarozei ori polimerizarea acrilamidei se
formeaz o matrice de gel, a crei pori depinde de
concentraia de gel sau de acrilamid utilizat.
Deoarece porii sunt mai mari n gelurile de agaroz
dect n cele de poliacrilamid, cel din nainte este
utilizat la separarea fragmentelor mari de ADN (ntre
500 i 20 kb) n timp ce al doilea se utilizeaz la
separarea fragmentelor mici (de la o nucleotid, pn
la 2 kb). Amestecul de fragmente de ADN care
urmeaz a fi separat este depus ntr-un godeu din
partea superioar dup care se aplic un cmp
electric prin gel. Fragmentele de ADN se mic spre
polul pozitiv cu o vitez invers proporional cu
logaritmul lungimii lor formnd benzi care pot fi
vizualizate prin autoradiografie (dac fragmentele
sunt radiomarcate) ori prin adugare de colorant
fluorescent de tipul bromurii de etidiu; n acest ultim
caz, agaroza lichefiat este lsat s se solidifice pe
un suport de sticl sau plastic orizontal

Cum matricea de gel restricioneaz difuzia ntmpltoare a moleculelor,

moleculele cu lungimi diferite se separ n zone discrete (benzi) a
cror lime este egal cu limea godeului unde s-a plasat amestecul
original de ADN

Analiza unor fragmente de ADN dup

separare electroforetic pe gel de agaroz.
Prima linie conine fragmente cu mas
molecular cunoscut de ADN obinute n
urma digestiei cu o enzim de restricie a
unui ADN cunoscut. Celelalte patru linii
arat diverse fragmente cu mrimi diferite
prezente n probe.

Se poate spune astfel c mobilitatea ADN este funcie de masa molecular,

cmpul electric aplicat, compoziia nucleotidic, temperatura de lucru i
soluia de tampon utilizat la separare. Deplasarea moleculelor liniare de
ADN se realizeaz cu o vitez invers proporional cu logaritmul masei lor
moleculare.
Dup cum se cunoate, conformaia ADN explic mobilitile diferite la
mase moleculare egale. Astfel, ADN o serie de conformaii: circular nchis
(covalentry closed circle) supranfurat (supercoiled), circular deschis
(open circular), liniar. Moblitatea electroforetic a celor trei forme de
ADN este n funcie de condiiile de lucru.
Pentru vizualizate postelectroforetic a
fragmentelor de ADN se utilizeaz tehnici
autoradiografice (dac fragmentele sunt
radiomarcate) ori prin adugare de colorant
fluorescent de tipul bromurii de etidiu
(figura alturat).
Bromura de etidiu, o molecul planar, se
intercaleaz n structura ADN ntre bazele
azotate iar buclele supranfurate ncrcate
cu sarcin negativ ale conformaiei
circular nchise se desfac i n aceste
condiii mobilitatea electroforetic se
reduce.

Legarea bromurii de etidiu la ADN crete de asemenea

fluorescena intrinsec. Ca rezultat, n condiiile iluminrii unui
gel cu lumin ultraviolet, regiunile de gel care conin ADN,
vor fi mai strlucitoare fa de regiunile gelului fr ADN.

La concentraii de 0,1-0,5 g/ml de bromur de etidiu, toate buclele

nfurate sau supranfurate sunt desfcute. De asemenea, bromura de
etidiu reduce i mobilitatea conformaiilor circular nchise i liniare. ADN
marcat radioactiv poate fi vizualizat i prin autoradiografia gelului. n acest
caz, gelul este depus n contact cu un film fotografic, la ntuneric; filmul
astfel expus va indica poziiile ADN prezent marcat. Dac filmul se
developeaz, se obine imaginea fotografic a ADN. Benzile de ADN
radiomarcat pot fi detectate prin analiza particulelor eliberate de
moleculele marcate din gel. Datele rezultate se pot stoca n computer i pot
fi convertite ntr-o imagine asemntoare unei autoradiograme

Compoziia nucleotidic nu influeneaz n mod semnificativ mobilitatea electroforetic, n

schimb, concentraia de agaroz este esenial: cu ct concentraia de gel este mai mare, cu
att mobilitatea fragmentelor de ADN este mai mic. Prin folosirea gelurilor n gradient de
concentraie este posibil separarea ADN de diferite mrimi.
Pentru a obine o rezoluie bun, cderea de tensiune ntre bornele aparatului de electroforez
trebuie s fie de 5V/cm. n general, la diferene mici de potenial, mobilitatea fragmentelor
lineare de ADN este proporional cu intensitatea cmpului electric.
n general se lucreaz la temperatura camerei. Pentru geluri care conin mai puin de 0,5%
agaroz, se recomand migrarea la o temperatur de 4oC. Majoritatea protocoalelor de lucru
recomand tamponul Tris, 50mM, pH=7,5-7,8 drept optim n ceea ce privete tria ionic i
capacitatea de tamponare.
Aparatura utilizat este de obicei orizontal, asemntoare celei utilizate la electroforeza
proteinelor. Este de asemenea necesar un redresor de curent cu o intensitate maxim de 100 mA
i o tensiune maxim de 100V, iar pentru evideniere postelectroforetic a fragmentelor de ADN
dup colorare cu bromur de etidiu, de o lamp UV prevzut cu un filtru de 300 nm.
Tehnica de lucru pentru electroforeza submers a fragmentelor de ADN. De obicei se utilizeaz
o agaroz cu o electroosmoz standard (-mr = 0,13) sau mai mic (-mr = 0,07). Gelurile se prepar
asemntor celor de amidon, iar dup solidificare se plaseaz pe platforma cuvei unde se acoper
cu tampon, stratul de deasupra fiind de circa 1 mm. La trecerea unui curent electric, rezistena
electric a stratului de soluie tampon este aproape egal cu cea a gelului i astfel, cea mai
important parte a curentului aplicat va trece prin gel. Aceast tehnic este numit electroforez
cu gel scufundat (submers) i este cea mai utilizat tehnic de analiz electroforetic a
fragmentelor de ADN.

Electroforeza fragmentelor de ADN n cmp electric

pulsator
Dac prin metoda clasic, convenional se pot separa fragmente de ADN de pn la 20 kbp cu
rezoluie bun, cele pn la 40 kbp cu rezoluie satisfctoare, pentru separarea fragmentelor
pn la 500 kbp se rezolv cu rezoluie slab, ntr-un gel de agaroz foarte fragil cu o
concentraie de 0,1%. La mijlocul anilor `80 s-au dezvoltat o serie de metode de analiz
electroforetic a moleculelor de acizi nucleici n domeniul de mrime care limiteaz mobilitatea.
Soluia a implicat introducerea mobilitii dependente de mrime a moleculelor de acizi nucleici
prin alterarea cmpului electric. Primul tip de alterare implic simpla schimbare de polaritate a
cmpului electric ntr-o manier regulat. S-a artat c o schimbare periodic a polaritii va
induce moleculelor o micare de ntoarcere n forma literei U, n matricea de gel. Chiar pentru
cele mai mari molecule, aceast ntoarcere permite separarea moleculelor. Dac lungimea
timpului de reversare a moleculelor este de aproximativ o treime din timpul de micare spre
nainte, ele se vor putea separa n cteva ore pe agaroz standard. Prima demonstraie practic a
acestei metode, denumit electroforez n cmp inversat (Field Inversion Gel ElectrophoresisFIGE), a rezolvat complet printr-o migrare de o secund nainte urmat de o secund napoi
molecule mari de 2.000.000 bp precum cromozomii intaci din drojdie. De atunci s-au dezvoltat o
varietate de metode, n mod comun denumite electroforez n cmp pulsator. Prin aceste
tehnici cele mai mari molecule de ADN cu o lungime cuprins ntre 2104 la 107 bp (20 kb la 10
megabp, Mb), se pot separa n funcie de masa lor molecular. Separarea prin electroforez n
cmp pulsator depinde de comportamentul singular al moleculelor mari de DNA ntr-un cmp
electric care este pornit i oprit (pulsat) la intervale mici de timp.

n condiiile n care se aplic un cmp electric unor

molecule mari de ADN aflate ntr-un gel, molecule
migreaz n direcia cmpului electric i de asemenea se
ntind pe toat lungimea lor. Dac curentul este stopat,
moleculele ncep s se relaxeze prin nfurri
ntmpltoare. Timpul necesar pentru relaxare este
direct proporional cu lungimea moleculei. Cmpul
electric este apoi reaplicat ntr-un unghi de 90 ori 180
fa de prima direcie. Moleculele mai mari se
relaxeaz mai puin dect moleculele mai scurte n
momentul n care curentul este oprit. Cum moleculele
trebuie s se relaxeze prin nfurri ntmpltoare
naintea miscrii lor ntr-o nou direcie, moleculele
mai mari ncep se mite n direcia nou impus mai
lent dect cele mai scurte. Alternarea repetat a
direciei cmpului electric foreaz moleculele mari de
ADN de diferite mrimi s se ndeprteze mai mult i
mai multe ntre ele.
Electroforeza n cmp pulsator este foarte important n purificarea moleculelor mari de
ADN, pn la 107 bp n lungime. Tehnica este necesar pentru analiza cromozomilor
celulari de la 5105 bp (cel mai mic fiind cromozomul de la drojdie) pn la aproximativ 23108 bp (cromozomii animali i de plante). Cromozomii cei mai mari trebuie n prealabil
s fie digerai n fragmente de 107 bp ori mai mici nainte de analiz. Astfel de fragmente
de restricie pot fi generate cu ajutorul enzimelor de restricie care taie la situsuri de
restricie gsite la situsuri de restricie de 8 bp

Se poate spune c principiul (caracteristica metodei) o reprezint faptul c

fragmentele de ADN sunt obligate s-i schimbe periodic direcia de deplasare ca
urmare a schimbrii direciei cmpului electric. Intervalul de timp pentru migrare
ntr-o direcie sau alta determin limita superioar a dimensiunii fragmentelor de
ADN care se vor separa distinct. Dependena de timp este aproape liniar: la
frecvene de timp de 0,1 secunde, se separ fragmente mai mari de 10 Kbp, n timp
ce la intervale de timp de o or, se vor separa fragmente de circa 1 Mbp. Timpul
necesar separrii prin electroforez n cmp pulsator este cuprins ntre 20 i 80 de
ore, n condiiile n care gelul de agaroz are o concentraie de 0,5-1%
Temperatura de lucru este de 14-15oC, la o cdere de tensiune de 2,5-10V/cm.
Calculul voltajului se realizeaz prin asumarea faptului c n sistemele
electroforetice submarine, numai aproximativ 80% din curent trece prin gel,
cderea de tensiune (V/cm) poate fi estimat prin relaia:

Schemele unei serii diverse de tipuri de aparate

utilizate n electroforeza acizilor nucleici n cmp
pulsator.

Mobilitatea moleculelor de ADN este n funcie de tensiunea (diferena de potenial) aplicat,

temperatura de lucru, frecvena schimbrii direciei cmpului electric i de soluia de tampon
folosit, din care cauz trebuie identificat combinaia optim tensiune/temperatur (rezoluia
de separare scznd odat cu creterea temperaturii i a tensiunii, dei viteza de migrare
electroforetic crete). Din acest motiv se recomand schimbarea frecvenei ciclurilor de dou
sau mai multe ori n timpul separrii. Prin aceast tehnic, este oarecum dificil a se determina
mas molecular cu toate c se pot utiliza markeri de mas. Asemntor vizualizrii
fragmentelor mici de ADN, i n acest caz gelul poate fi colorat cu bromur de etidiu (1 g/ml),
cnd fluorescena intens orange a colorantului intercalat n molecula de ADN dublu helical
conduce la cuantificarea a minimum 50ng de ADN.

Dintre aplicaiile electroforezei n cmp pulsator se pot enumera

obinerea hrilor genetice, (a librriilor metagenomice), a cariotipului
electroforetic la drojdii (Sacharomices cerevisiae, Candida albicans) la
protozoare (Giardia intestinalis). Ea s-a utilizat n studiul genomului
uman, de analiz a unor regiuni implicate n maladii cunoscute precum
complexul major de histocompatibilitate, de analiz a genei distrofiei
musculare Duchenne, unde s-a pus la punct un test molecular de
diagnostic n cazul femeilor vector purttoare a genei defecte i astfel
de diagnostic prenatal n familii cu risc crescut. Se poate spune c
apariia electroforezei n cmp pulsator a contribuit semnificativ la
dezvoltarea biologiei moleculare.
Dintre dezavantaje se pot enumera timpul mare de izolare i restricie a
ADN care preced electroforeza, acesta fiind dezavantajul major a
analizelor de macrorestricie prin intermediul electroforezei n cmp
pulsator. Astfel, un protocol standard dureaz cinci-ase zile pn la
evaluarea rezultatelor

ELECTROFOREZA PROTEINELOR
PE GELURI DE POLIACRILAMID

Sursele comerciale furnizeaz acrilamid i N,N'-metilen bisacrilamid

cu o puritate suficient care permite utilizarea lor fr o aciune de
pregtire. O serie de reactivi pot fi obinui n form pre-mixat
(amestecai) gata pentru reacia de polimerizare. Exist disponibile
comercial componente nalt purificate care permit formarea gelurilor
transparente la lungimi de und cuprinse n domeniul ultraviolet (260
i 280 nm), care permit scanarea direct pentru identificarea acizilor
nucleici ori a proteinelor.
Dintre dezavantaje se pot enumera: neurotoxicitatea, cancerogenitatea
acrilamidei iar la contactul cu pielea, componentele amestecului de
polimerizare pot cauza iritaii. n plus, reproductibilitatea depinde de
puritatea reactivilor i a condiiilor de lucru. Ca regul, componentele
trebuie s fie stocate n vase nchise la culoare, la frigider. Odat ce
monomerii au fost dizolvai durata de via a soluiei este de
aproximativ 3 luni. Este recomandat ca pH-ul soluiei s fie msurat
periodic deoarece odat cu mbtrnirea soluiei, pH-ul va crete.
Astfel, aceast soluie va necesita un timp mai ndelung de
polimerizare, fenomen care servete de asemenea drept indicaie c
monomerii se deterioreaz.

Acrilamida (amida acidului acrilic, 2-propen amida) este o pulbere

alb, uor solubil n ap, solubil n solveni polari (etanol, aceton,
cloroform) i insolubil n solveni nepolari (tetraclorur de carbon, nheptan) Ea i pstreaz proprietie chimice timp ndelungat dac este
pstrat corespunztor. Dac este expus la lumin, polimerizeaz slab
i formeaz mici cantiti de poliacrilamid. Amida acidului acrilic se
prepar fie prin sintez chimic, prin hidroliza acrilonitrilului, fie prin
biosintez, cnd utiliznd o tulpin de Cornynebacterium se obine cu
un randament de aproximativ 100% acrilamid.
Acrilamida se purific prin recristalizare la o temperatur de 60oC din
cloroform sau soluii alcoolice cu un randament de circa 60%.
Acrilamida astfel obinut este apt pentru focusare izoelecric i alte
tehnici unde sunt necesare geluri foarte subiri.

N,NCistaminbisacrilamida este utilizat la gelurile de acrilamid

solubilizabile, nlocuind echimolecular bisacrilamida. Gelurile se
solubilizeaz utiliznd ageni reductori ai legturii disulfurice (-S-S-), 2
mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritriol.
Diacrilpiperazina (N-Bis-acrililpiperazin, BAP) se sintetizeaz relative uor
i este foarte solubil n ap. Ea formeaz geluri cu conductibilitate mai
mare dect cele obinute prin copolimerizarea acrilamidei cu bisacrilamid.
Aceste geluri nu se umfl prea tare cu ap iar n prezena dodecilsulfatului
de sodiu porii gelului scad aparent. Prin utilizarea gelurilor cu
diacrilpiperazin drept agent de reticulare separarea i detecia proteinelor
este mbuntit, iar transferul proteinelor pe membrane de nitroceluloz
este mai eficient.
N,N Dialiltartratdiamina formeaz geluri care i mresc volumul cu
aproximativ 30% n ap. Ele sunt solubile n acid periodic sau periodat de
potasiu. Gelurile formate de N,Ndialiltartratdiamin au o stabilitate
mecanic mai bun, sunt mai aderente pe sticl i sunt perfect transparente,
comparabil cu cea a gelurilor de poliacrilamid-bisacrilamid.

Structura chimic a unor monomeri

acrilamido N-substituii utilizai la
prepararea gelurilor de poliacrilamid

Ali ageni de reticulare.

Versatilitatea gelurilor poliacrilamide este, de asemenea demonstrat de numrul mare de ageni de

reticulare, pe langa Bis, care pot fi folosii pentru a turna geluri cu proprieti specifice n scopul
unei fracionri diferite. Acestea sunt enumerate n tabelul de mai sus. N,N'-(1,2-Dihidroxietilen)
bisacrilamida (DHEBA) poate fi folosit pentru turnarea geluri reversibile, deoarece structura de
1,2-diol face DHEBA un conpus sensibil la clivaj prin oxidare cu acid periodic. Acelai principiu se
aplic, de asemenea, pentru gelurile pe baz de N,N'-(1,2-Dihidroxietilen) bisacrilamid (DATD)
Alternativ, geluri pe baz de etilen diacrilat (EDA) pot fi utilizate, deoarece acest agenytul de
reticulare conine legturi ester care pot clivate prin hidroliz. Agenii de reticulare poli(etilen glicol
diacrilat) fac parte din aceeai serie de derivai esterici. Aa cum s-a descris anterior, gelurile pe
baz de N,N-bisacrililcistamin (BAC) conin puni disulfurice uor clivabile.

n general sistemele catalitice se pot mpri n:

Sisteme catalitice n care radicalii liberi sunt generai prin reacii redox;
Sisteme catalitice n care radicalii liberi sunt generai prin fotocataliz.
n afara celor dou mari categorii exist de asemenea sisteme combinate.
Sisteme catalitice redox constau de obicei din:
Iniiator al reaciei de polimerizare vinilic (acesta este o substan care
introdus n sistemul chimic n concentraie mic poate declana procesul
chimic respectiv. Iniiatorul se descompune cu uurin n radicali liberi). Cel
mai utilizat iniiator al reaciei de polimerizare este persulfatul, S2O82-.
Catalizator (accelerator) al reaciei de polimerizare (acesta este o substan
care modific viteza de reacie, cataliznd formarea de radicali liberi, n acest
caz). O condiie necesar pentru a funciona drept catalizator este de a
poseda dou grupri amino separate prin doi atomi de carbon sau o grupare
amino teriar.

Schema reaciei de descompunere a persulfatului i de generare a radicalilor liberi

Cel mai utilizat accelerator n polimerizarea vinilic a

acrilamidei este tetrametiletilen diamina, TEMED. n
acest sistem, TEMED accelereaz descompunerea
moleculelor de persulfat n doi radicali sulfat iar
acetia iniiaz reacia de polimerizare

Trebuie ns avut n vedere necesitatea prezenei TEMED

pentru aceast reacie. Eficiena polimerizrii n acest sistem
scade rapid la valori ale pH-ului mai mici de 6,0
1.4. piperazin dimetil (1. 4 dimetilpiperazina, DMPIP)
reprezint un alt catalizator utilizat n polimerizarea
vinilic. Acesta este ns un catalizator mai slab dect
TEMED, dar este mai bun pentru colorarea gelurilor cu
argint amoniacal (n acest caz se adaug la sistemul
catalitic tiosulfat de sodiu alturi de persulfat).

Un alt sistem catalitic utilizat la prepararea gelurilor de poliacrilamid este format din
riboflavin i TEMED. Astfel, riboflavina, sub aciunea radiaie UV genereaz radicali
liberi care iniiaz reacia de polimerizare. Sistemul conine i TEMED pentru a mri
viteza de reacie. Polimerizarea dureaz circa o or iar n absena TEMED reacia
decurge n aproximativ 8 ore, dup circa o or, doar 60% din monomeri fiind
polimerizai, obinndu-se astfel geluri nereproductibile, monomerii neintrai n reacie
putnd interaciona cu resturile de aminoacizi din constituia proteinelor supuse separrii
electroforetice, putnd chiar interaciona cu diverse componente ale sistemului tampon.
De obicei fotopolimerizarea cu riboflavin drept accelerator, este utilizat pentru gelurile cu
pH sczut .

Un sistem diferit de fotopolimerizare

cuprinde un colorant cationic (albastru
de metilen) i un cuplu redox alctuit din
sodiu toluen sulfinat, un reductor i
clorur de difeniliodoniu, un oxidant
mediu
Catalizatori ai reaciei de fotopolimerizare: A. clorur de difeniliodoniu
(DPIC); B. toluen sulfinat de sodiu (STS), C. albastru de metilen (MB).
Ultimul, poate fi utilizat i n combinaie cu riboflavin-5'-fosfatul

FACTORII DE CARE DEPINDE VITEZA REACIEI DE

POLIMERIZARE

Viteza reaciei de polimerizare depinde de:

(1) Concentraia net de monomeri i de radicalilor liberi ( de obicei se utilizeaz TEMED
n concentraie de 10 mM i persulfat);
(2) Temperatura la care are loc reacia de polimerizare. n acest context se cunoate c
reacia de polimerizare este exoterm i din aceast cauz temperatura trebuie s fie
controlat cu atenie. Ea se desfoar mai uor la temperatura camerei, cu toate c exist
matrice termostatate. n general la gelurile plate, disiparea cldurii este mai eficient cu ct
grosimea gelului este mai mic;
(3) Puritatea reactivilor;
(4) Concentraia de inhibitori. Prin inhibitor trebui neles orice compus care distruge
radicalii liberi. Astfel, orice compus care poate aciona ca o trap pentru radicalii liberi va
aciona ca un inhibitor de polimerizare. Oxigenul atmosferic este cel mai important inhibitor
i din acest motiv este necesar o degazare corespunztoare a amestecului de polimerizare
pentru a elimina oxigenul dizolvat n soluiile de acrilamid. Prezena oxigenului este critic
pentru o reproductibilitate absolut a electroforezei. Cu toate acestea, pot fi acceptabile i
geluri obinute fr o degazare complet. Ali inhibitori ai reaciei de polimerizare sunt (a)
aminele alifatice, (b) compuii aromatici precum piridina, (c) protonii (existeni n mediul
acid).
Pentru ca gelurile s fie reproductibile, toi aceti parametrii trebuie s fie controlai cu
atenie.

PROPRIETILE GELULUI DE POLIACRILAMID

Prin polimerizarea acrilamidei cu bisacrilamida, se formeaz o reea tridimensional n condiiile n care
agentul de reticulare bifuncional se leag de lanurile liniare de poliacrilamid adiacente formnd un mediu
poros n care dimensiunile porilor sunt n funcie de concentraiile iniiale ale monomerilor (acrilamid i
bisacrilamid) i de condiiile de realizare a reaciei de polimerizare (sistem catalitic, temperatur, etc.).

Prin convenie, gelurile de poliacrilamid sunt caracterizate printr-o pereche de valori, T% i

C%, n cazul n care T% reprezint procentul de greutate al cantitii totale de monomeri,
inclusiv a agentului de reticulare (n g/100 ml),

adic:

unde a reprezint cantitatea de acrilamid iar b este cantitatea de

bisacrilamid n timp ce V este volumul total de soluie.

C(%) reprezint procentul (proporia) de agent de reticulare ca procent din totalul de

monomeri, adic din cantitatea total de monomeri.
C(%) se calculeaz dup relaia:

Dup cum se observ, C(%) este practic gradul de reticulare.

S-au observat o serie de anomalii n condiiile n care se utilizeaz doi ageni de
reticulare cu mase molecular diferit. Acetia nu vor avea aceeai frecven.
agentul de reticulare mai mic va avea o frecven mai mare. Astfel, uneori se
utilizeaz fracia molar, X care poate fi definit ca:

Efectul de cernere molecular

Termenul de por nu definete un element geometric dect n sens orientativ i comparativ.
Mrimea porilor semnific rezistena opus de reeaua tridimensional a gelului la
deplasarea macromoleculelor (n spe a proteinelor). Cu ajutorul gelului de poliacrilamid
se pot separa molecule de la cteva sute la cteva milioane de daltoni. Mrimea efectiv a
porilor este n funcie de concentraia total a monomerilor, T (%) i de proprietile
agentului de reticulare, C (%).

Dependena de concentraia de monomeri, T(%) i C(%)

O macromolecul cu sarcin electric dat n funcie de dimensiunile sale i de
dimensiunile porilor va fi mai mult sau mai puin frnat n deplasarea sa n cmp, fiind
caracterizat printre altele, prin mobilitatea electroforetic. n practic se folosete
mobilitatea relativ electroforetic care este proporional cu distana de migrare. Ea se
calculeaz prin compararea mobilitilor diferitelor macromolecule considernd timpul
de separare i intensitatea curentului electric, constante.

Mobilitatea relativ se noteaz cu Rf i definete ca raportul

dintre mobilitatea unei macromolecule oarecare i mobilitatea
unei macromolecule standard sau a unui colorant care migreaz
cu frontul. Rf poate fi definit i ca raportul ntre mobilitile
unei macromolecule n mediu restrictiv i mobilitatea sa ntrun mediu liber, nerestriciv, o dup relaia:

Rf este o constant fizic care caracterizeaz o macromolecul dat ntr-un gel cu

o anumit compoziie, n condiii definite

Pentru a obine date despre: (a) dimensiunile i sarcina net a unei macromolecule, (b) omogenitatea,
(c) concentraia optim a unui gel care poate rezolva sau diferenia dou specii moleculare, se folosesc
reprezentrile Ferguson (figura alturat).
KR (msura frnrii deplasrii macromoleculei n gel) i y0 (msur a mobilitii macromoleculei n
mediu liber, nerestrictiv la T (%)=0) sunt parametrii caracteristici ale macromoleculei luate n studiu.
n plus, y0 poate fi corelat cu sarcina electric net.
n lumina acestei reprezentri gelurile pot fi:
Zerodimensionale, cnd fibrele de polimer au o lungime aproximativ egal cu 0, polimerul fiind liniar
i supranfurat formnd suprafibre cu pori mari cu raza de 20-40 nm.
Unidimensionale, cnd fibrele de polimer au o lungime infinit iar numrul de capete este
neglijabil. Este cazul poliacrilamidei convenional reticulate cu C(%)=2-5% care pare a avea
predominant caracter de gel unidimensional cu fibre cu raz de 1-2 nm.

Reprezentarea Ferguson. Din panta

dreptei () se calculeaz coeficientul KR iar
din intersecia cu axa oy se obine yo
valoare dat pentru T(%)=0.

Configuraiile geometrice probabile ale diferitelor tipuri structurale de geluri de poliacrilamid

Tipuri structurale de geluri de poliacrilamid. A. Poliacrilamid

nereticular cu C(%)=0%. Este un gel unidimensional iar consistena
polimerului este lichid-vscoas. B. Un gel de poliacrilamid cu C(%)
de valoare medie. C. Un gel de poliacrilamid cu C(%) de valoare mare.
D. Un gel de poliacrilamid reticulat pur, zerodimensional
(C(%)=T(%)).

La valori ale C% situate n domeniul 5-50%, fibrele de poliacrilamid sunt

zerodimensionale, supranfurate, diametrul porilor crete, iar practic moleculele
nu mai sunt frnate n migrarea lor n cmp electric. Figura de mai jos prezint
dependena factorului de frnare n funcie de concentraia total de polimeri, T%.

Dependena mrimii porilor de gradul de reticulare, C(%).

n ceea ce privete dependena mrimii porilor de parametrul

T(%), se poate spune c la o valoare constant a gradului de
reticulare (C%=2-5%), mrimea porilor scade pe msur ce
valoarea parametrului T% crete dup relaia:

Astfel, mrimea efectiv a porilor a unui gel de

poliacrilamid este o funcie invers a concentraiei totale
de monomeri (T%). Pentru orice concentraie total de
monomer dat, dimensiunea porilor efectiv, variaz de
asemenea, n funcie de proporia de agent de reticulare din
amestecul de reacie (C%). Odat cu creterea T(%), la o
concentraie sczut de agent de reticulare, numrul de
catene liniare crete, iar mrimea porilor scade. Cnd T%
este crescut la o concentraia fix, dar sczut de agent de
reticulare, numrul de catene crete iar dimensiunea
porilor se reduce. Pe de alt parte, dimensiunea porilor este
o funcie bifazic dependent de C (%). n condiiile n care
se variaz C (%), la un T% constant, scade dimensiunea
porilor, nivelul minim fiind atins la aproximativ C=5%

Pe lng aplicaiile evidente de analiz a puritii unor probe proteice, disc-electroforeza

este utilizat la determinri fizico-chimice. Dac proteina supus analizei ntr-o serie de
geluri cu concentraii (T%) i se msoar mobilitatea ei electroforetic relativ, Rm (Rm, Rf
este definit ca raportul dintre distana migrat de proteina dat i distana migrat de
colorantul trasor, de obicei albastrul de bromfenol) n fiecare gel se poate construi o
diagram liniar, log Rm versus T% (diagrama Ferguson). Aceast reprezentare poate da o
important informaie: panta acestei drepte este o msur a mrimii moleculare i este
denumit coeficient de retardare (retardation coefficient, KR). Prelungirea acestei drepte care
intersecteaz axa 0y (Y=Rm cnd T=0) este o msur a mobilitii electroforetice n condiii
libere (cnd gelul nu este prezent) i aadar este o msur a sarcinii electrice nete.

Reprezentarea grafic a
logaritmului
mobilitii
electroforetice
a
BSA
versus
concentraia
(densitatea) gelului (T%) la
un grad de reticulare (C%)
constant de 2%.

n cazul electroforezei bidimensionale, prima dimensiune se realizeaz n cele

mai bune condiii n geluri cilindrice.
Dac gelurile plac pot fi n egal msur omogene sau n gradient, gelurile
cilindrice sunt de obicei omogene.

Creterea ulterioar a C% cauzeaz formarea de legturi mai scurte i mai

groase de lanuri de polimer. Utilizarea unor reactivi de nalt calitate este o
condiie prealabil pentru obinerea unor geluri reproductibile i de nalt
rezoluie. Acest lucru este valabil mai ales pentru acrilamid, care constituie
componenta cea mai abundent n amestecul de monomeri. Reziduurile de
acid acrilic, poliacrilamid liniar i a impuritilor ionice sunt contaminani
majori care scad calitatea preparatelor de acrilamid.
1. Acid acrilic va copolimeriza cu acrilamida i bisacrilamida, ceea ce pentru
gelul rezultant confer proprieti de schimbtor de ioni.
2. Poliacrilamida linear, prin furnizarea unui nucleu de polimerizare
necontrolat, poate conduce la geluri nereproductibile.
3. Contaminanii ionici pot s includ att inhibitori ct i acceleratoriai
reaciei de polimerizare. n special, metale precum cuprul poate inhiba
polimerizarea gelului.
Componentele tampon trebuie s fie de grad de reactiv i numai apa
deionizat trebuie s fie utilizat pentru toate fazele electroforezei pe gel de
poliacrilamid.

STRATEGIA DE SEPARARE A
PROTEINELOR PE GELURI DIN
POLIACRILAMID
n funcie de proprietile proteinei (proteinelor) luate n
studiu i n funcie de scopul urmrit, trebuie avut n
vedere:
- compoziia chimic, concentraia i structura gelului
de poliacrilamid (gel omogen, gel n gradient, etc.);
- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau plat);
- condiiile de separare (denaturante, nedenaturante,
disociative, nedisociative);
- sistemul tampon (continuu sau discontinuu)
- fora ionic i pH-ul sistemului tampon.

Compoziia chimic, concentraia i structura gelului de poliacrilamid

Din punct de vedere al compoziiei chimice, acrilamida poate fi polimerizat cu bisacrilamida

(cel mai adesea folosit), bisacrilcistamina (BAC), dialiltartatdiamina (DATD),
dihidroxietilenbisacrilamida (DHEBA), etc. Ultimii trei ageni de reticulare se utilizeaz la
prepararea gelurilor solubilizabile, n tehnici la scal micropreparativ, deoarece aceti
ageni permit solubilizarea gelului n condiiile cele mai avantajoase pentru conservarea
integritii structurale i funcionale a proteinelor luate n analiz.
Dac gelul este format din dou zone, gelul de concentrare (T%=4%) este plasat deasupra
gelului restrictiv de rezolvare, ultimul avnd o concentraie de monomeri cuprins ntre 5 i
30%. Gelul de concentrare (de stivuire) conine tampon Tris-HCl 0,125 M, pH=6,8, iar gelul de
separare conine tampon Tris-HCl 0,375 M, pH=8,8. Discontinuitatea de pH dintre cele dou
geluri suprapuse este desemnat pentru a regla mobilitatea efectiv ale ionilor de glicinat
din compartimentul catodic. Concentraiile de tampon Tris-HCl din cele dou geluri deriv
din consideraii electrochimice. Porozitatea gelului de concentrare este att de mare pentru
a nu mpiedic micarea proteinelor i funcioneaz n general ca un mediu suport cu
proprieti anticonvective n timpul formrii zonei nguste de start. Separarea proteinelor se
realizeaz mai jos, n gelul de rezolvare. Porozitatea acestui din urm gel este determinat
empiric fiind potrivit mobilitii proteinelor din prob. Nu exist o regul clar pentru a
prediciona concentraia corect a concentraiei de gel pentru un amestec de proteine
necunoscute neanalizate electroforetic. Alegerea este fcut astfel ca proteinele de interes
s se separe n gel. n mod obinuit se ncepe cu un gel cu 7,5%T pentru electroforeza
iniial a probei cu mobiliti necunoscute.

Concentraia gelului se refer la concentraia total a monomerilor (parametrul

T%) i a gradului de reticulare (parametrul C%) Pentru proteine bine caracterizate,
alegerea concentraiei gelului nu reprezint o problem. n general, pentru
proteine cu mas molecular cuprins ntre 20.000 i 150.000 daltoni, se
recomand geluri cu T%=5-12%. n cazul proteinelor cu mas molecular cuprins
ntre 10.000 i 80.000 daltoni se recomand geluri cu T%<10-12% iar n cazul
proteinelor mas molecular mai mic de 15.000 daltoni se utilizeaz geluri cu
T%>15%.
Structura gelurilor este strns legat de parametrii T(%) i C(%) Astfel, un gel
omogen se caracterizeaz printr-o singur valoare a concentraiei totale de
monomeri, T(%), n timp ce un gel cu gradient este caracterizat printr-un gradient
de concentraie, deobicei cuprins ntre 5 i 20%. Gelurile n gradient sunt mai
avantajoase deoarece ofer mai multe date despre proteinele supuse
electroforezei. Gradientul poate fi liniar sau exponenial, putnd astfel vorbi
despre gradient de pori. Gelurile omogene au pori de aceeai mrime.
Pentru obinerea unei rezoluii optime de separare a dou proteine, se folosete
un gel omogen de concentraie potrivit. Concentraia gelului este n funcie de
mrimea i sarcina electric a proteinei luate n studiu, putnd s fie stabilit
(determinat) prin msurarea mobilitii fiecrei proteine ntr-o serie de geluri de
concentraii (T%) diferite.

Se disting patru categorii de probleme (situaii) de separare:

Cele dou proteine au densiti de sarcin electric identice, deci mobiliti identice
ntr-un mediu nerestrictiv (panelul A).

Proteina cu mobilitate mai mare (densitate de sarcin electric mai mare) este mai mic n
dimensiuni. n acest caz separarea se realizeaz pe baza mobilitii i a masei moleculare.
Se consider c cele dou proteine sunt sinergice iar prin creterea concentraiei de gel
crete i rezoluia de separare (panelul B).
Una dintre proteine are dimensiuni mai mari i mobilitate electroforetic mai mare. n acest
caz separarea se realizeaz n funcie de dimensiune i sarcin electric, cele dou proteine
fiind antagoniste. Cazul este caracteristic sistemelor nedisociative (panelul C).
Dou proteine au aceleai dimensiuni dar au mobiliti electroforetice diferite (este cazul
izoenzimelor, hemoglobinelor, etc.). n acest caz concentraia monomerilor nu are efect
asupra separrii relative a celor dou proteine. Situaia corespunde separrilor prin focusare
izoelectric sau prin izotacoforez (panelul D).

Soluiile de monomeri se prepar uzual ca soluii stoc, concentrate. Pentru gelurile utilizate n
separarea de proteine este preferat o soluie stoc de monomeri cu T%=30% i C%=2,7% care se
prepar prin dizolvarea a 29,2g de acrilamid i 0,8g de bisacrilamid n 70 ml de ap complet
deionizat (volumul final fiind de 100 ml iar densitatea specific de 1,025). Soluia de monomeri
trebuie filtrat i stocat la rece, preferabil ntr-un vas de sticl. Pentru gelurile utilizate n
separarea de acizi nucleici se folosete un amestec alctuit din acrilamid:bisacrilamid cu
T%=30% i C%=3,3% preparat din 29g de acrilamid i 1g de bisacrilamid.
Concentraiile de iniiator sunt determinate empiric prin urmrirea polimerizrii n timp de 1520 minute dup adugare. n aceste condiii, gelificarea se realizeaz complet n 90 de minute.
Dac se utilizeaz geluri de concentrare, este necesar ca acestea s aib structuri poroase mari.
Pentru o polimerizare rapid (n circa 8-10 minute) se adaug persulfat de amoniu, la o
concentraie final de 0,05% respectiv TEMED, 0,1%.
Soluiile stoc de monomer i de tampon se combin pn la concentraia dorit i apoi se
deaereaz sub un vid modest timp de aproximativ 15 minute. Iniiatorul i catalizatorul sunt apoi
adugate iar amestecul se toarn n aparatul montat. Dac se utilizeaz gel de concentrare, se
prepar i se toarn mai nti gelul se rezolvare (separare). El este apoi acoperit cu o soluie de
izobutanol saturat n ap pentru a exclude aerul din vecintatea superioar a gelului i pentru a
forma o legtur puternic ntre cele dou geluri. Dup aproximativ o or, stratul de alcool este
ndeprtat i gelul format n partea superioar se spal cu ap pn la dispariia mirosului
caracteristic de butanol, dup care se toarn amestecul de gel de concentrare peste gelul de
separare i se introduce un pieptene formator de godeuri pentru a forma spaii n care se aplic
proba. Dup finalizarea polimerizrii i ndeprtarea pieptenului, gelul este gata de utilizare.

Gelurile de poliacrilamid sunt inerent instabile n afara domeniului de

pH cuprins ntre 4 i 6. Dup un stocaj de aproape 4 luni la o temperatur
de 4oC, n tampoanele uzual utilizate n electroforez, uneori are loc o
scdere notabil a profilului benzilor separate electroforetic. Astfel,
pentru a obine o rezoluie maxim, este necesar s se utilizeze numai
geluri proaspt preparate. Alterarea structurii poliacrilamidei este un
proces lent de hidroliz a gruprilor carbox-amididice (-CO-NH2) ale
monomerilor de acrilamid i care se manifest n tampoane bazice.
Hidroliza conduce la formarea unor grupri carboxil (-COO-), ionizabile.
Gelurile vechi umflate au o structur a porilor este schimbat ele lund
caracteristici de schimbtori de ioni datorit hidrolizei. mbtrnirea
gelurilor de poliacrilamid are o semnificaie comercial deoarece
limiteaz perioada de utilizare a gelurilor preturnate.

Forma gelului
Primele electroforeze care au folosit poliacrilamida drept mediu suport s-au efectuat pe
geluri plate, orizontale i apoi pe geluri cilindrice (unde amestecul de polimerizare se toarn
n tuburi de sticl sau plexiglace). n prezent ns, n majoritatea cazurilor se apeleaz la
separarea pe vertical n geluri plate (geluri plac), cu o grosime a gelului cuprins ntre 50
m i 3 mm.

Gelurile plac orizontal (sau vertical) sunt simplu de preparat , ntr-un timp scurt. Pe
un astfel de gel se aplic mai multe probe, inclusiv proteine standard cu mas
molecular cunoscut, separndu-se n condiii identice. Numrul de probe aplicate este
n funcie de necesiti iar analiza calitativ i estimrile cantitative se efectueaz cu mai
mult uurin i precizie n cazul gelurilor cilindrice. Se elimin astfel artefactele optice,
ceea ce face posibil fotografierea corect. n plus, n cazul gelurilor plac, cldura
produs prin efect Joule este mai repede disipat comparativ cu gelurile cilindrice iar
uscarea gelurilor este relativ simpl.
Gelurile cilindrice sunt
de nenlocuit la separarea proteinelor marcate cu radioizotopi cnd se urmrete
determinarea cantitativ a radioactivitii.
Ele sunt de preferat atunci cnd trebuie determinat activitatea enzimatic a
fraciunilor separate deoarece cantitatea aplicat este mult mai mare (fr a afecta
calitatea separrii).
Gelurile cilindrice sunt preferate la testarea pH-ului optim de lucru i a concentraiei
optime a gelului de poliacrilamid

CONDIII DE SEPARARE
Condiiile de separare trebuie s asigure o solubilizare complet a probelor
proteice, alegerea acestora realizndu-se sistematic n funcie de proprietile
hidrofile/hidrofobe ale proteinelor.
Pentru testarea solubilitii numai prin disocierea legturilor hidrofile, proba este
incubat n soluii tampon alcaline, neutre i acide, n prezena/absena clorurii de
potasiu (0,1-0,5 M), la o temperatur de 4oC, pentru a nu afecta activitatea
biologic.

Dac proba nu se solubilizeaz, se repet testarea n

prezen de EDTA (etilendiaminotetraacetat), 0,1 M. EDTA
complexeaz ionii metalici divaleni i astfel se desfac
legturile n care acetia sunt implicai.
Urea este deseori utilizat ca agent de disociere n electroforeza pe gel. Urea, care disrupe
legturile de hidrogen i legturile hidrofobe poate cauza agregri nedorite ori formarea
unor structuri secundare care afecteaz mobilitile proteinelor. Ea este deseori utilizat n
denaturarea acizilor nucleici. Urea este un component esenial al gelurilor la care este
necesar meninerea configuraiilor unicatenare a ADN sau ARN, pentru a se determina cu
acuratee masele moleculare. Disocierea legturilor de hidrogen necesit uree n
concentraii mari (7-8 M).
Poliolii (de exempul glicerina, trixidroxipropan, propantriolul) este folosit frecvent pentru
solubilizarea proteinelor n condiiile meninerii activitii biologice.

Dac proba continu s rmn insolubil se recurge la detergeni,

compui care modific hidrofobicitatea relativ a proteinelor i care astfel
mbuntesc separarea electroforetic. ntr-o mic msur acelai efect
se obine prin folosirea tampoanelor relativ hidrofobe pe baz de Netilmorfolin sau hidroxietilmorfolin

N CH2

CH3

N CH2

CH2

OH

Structura chimic a N-etilmorfolinei (A) i a hidroxietilmorfolinei (B)

Electroforeza n condiii denaturante

Cea mai mare parte a studiilor de electroforez n gel de poliacrilamid folosete condiii
denaturante, disociative. n aceste condiii, proteinele oligomere disociaz n lanuri
polipeptidice, componente. Astfel, proteinele i pierd activitatea biologic. Detergenii se
utilizeaz n electroforez cnd este necesar disruperea interaciilor protein-lipid i
protein-protein. n acest scop au fost utilizai o serie de detergeni. Cel mai cunoscut
agent de disociere este dodecilul sulfat de sodiu (lauril sulfatul de sodiu, SDS). SDS este un
detergent ionic care are formula CH3-(CH2)10-CH2-SO3-Na+.

Structura
chimic
a
dodecilsulfatului de sodiu, SDS.
Se observ braul nepolar i
regiunea polar care posed o
sarcin negativ

 Cele mai multe proteine sunt uor solubile n SDS, fcnd electroforeza n prezen
de SDS (SDS-PAGE) o metod general aplicabil.
Puritatea (calitatea) detergentului este o condiie important n SDS-PAGE.
Efectele impuritilor prezente n preparatele de SDS sunt impredictibile.
Dintre contaminani, cele mai nedorite efecte le au probabil alchil sulfaii,
alii dect dodecil sulfatul (C12); n special decil sulfatul (C10), tetradecil
sulfatul (C14) i hexadecil sulfatul (C16) Acetia se leag la proteine cu
afiniti diferite i n consecin afecteaz mobilitile.
Contaminanii lipofilici prezeni n preparatele de SDS, printre care
dodecanolul, pot fi inclui n complexele SDS-protein i n micelele de
SDS conducnd la scderea rezoluiei. Numai SDS purificat (care se
realizeaz prin recristalizare n n heptan) trebuie utilizat pentru
electroforez, dar chiar cu SDS pur, diferite glicoproteine, lipoproteine i
nucleoproteine au tendina de a se lega la detergent neregulat, rezultanta
fiind o migrare anormal a complexelor SDS-polipeptide n ceea ce
privete masele lor moleculare. n plus, prezena unor sruri anorganice n
preparatul de SDS conduce la modificarea proprietilor tensioactive ale
acestuia. Dintre proprietile fizice ale SDS se pot aminti:
SDS are o solubilitate n ap de 3% (mas/volum);
SDS precipit la temperaturi cuprinse ntre 0-10oC.

Dodecil sulfatul de litiu (lithium dodecyl sulfate, LDS) a fost uneori

substituit SDS n analizele efectuate pe geluri de poliacrilamid dup cum
bromura de cetiltrimetilamoniu (cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)
a fost de asemenea utilizat n electroforeza proteinelor.
LDS este mai solubil dect SDS i nu precipit la temperaturi sczute (la
4oC se leag afin la poliacrilamid, dei la 25oC nu prezint o astfel de
proprietate), ceea ce permite migrarea gelurilor la temperaturi sczute. Sa constatat c dac ntr-un sistem tampon continuu, SDS este nlocuit cu
LDS, separarea moleculelor cu mas molecular mic este accelerat
datorit deficitului de LDS n regiunea frontal a gelului. Dac gelul este
saturat n LDS, rezoluia separrii la 4oC pe acest gel este mai bun dect
cea obinut dup electroforez un gel de poliacrilamid n prezen de
SDS efectuat la 25oC.
CTAB este un denaturant mai slab dect SDS, prezervnd anumite
activiti biologice care sunt distruse de ctre SDS.

Majoritatea proteinelor leag SDS ntr-un raport constant de 1,4g SDS/gram protein. n
aceste condiii, sarcinile intrinseci (proprii) ale polipeptidelor sunt nesemnificative
comparativ cu sarcinile electrice negative rezultate dup legarea SDS. Densitile de
sarcin electric superficial ale complexelor SDS-polipeptide sunt n principiu
identice, ceea ce permite separarea (ntr-un gel cu porozitate controlat) strict n funcie
de dimensiunile polipeptidelor. n acest fel, pe lng compoziia (coninutul)
polipeptidelor din prob, se determin i masele moleculare ale polipeptidelor, dac
sunt separate n acelai timp cu un set de proteine cu mas molecular cunoscut, prin
raportare la acestea. Tehnica de lucru este simpl iar cantitatea de prob este de
ordinul a micro sau a nanogramelor.
Cea mai mare parte dintre proteine se solubilizeaz n SDS, indiferent de surs, ns
exist i excepii: astfel, glicoproteinele i lipoproteinele nu pot fi saturate n SDS,
deoarece, n primul caz, partea neproteic a unitilor hidrofile oligozaharidice previn
legarea micelelor de SDS partea proteic numai interacionnd cu acesta. Proteinele
puternic bazice (de exemplu, histonele) interacioneaz prin legare electrostatic a
micelelor de SDS prin intermediul gruprilor sulfat.
n cazul glicoproteinelor, impedimentul poate fi relativ ndeprtat prin
utilizarea tampoanelor Tris-borat n condiii alcaline, astfel crescndu-se sarcina net
negativ a glicoproteinelor ceea ce conduce la viteze de migrare bine corelate cu masa
molecular.
Migrarea histonelor poate fi mbuntit prin utilizarea gelurilor n gradient de
pori care permit catenelor polipeptidice s accead la limita lor de pori.

Pe de alt parte, proteinele pure, au tendina ca la temperaturi

ridicate s formeze agregate i s precipite. Este cazul
hemaglutininei bacteriene care disociaz complet dup 30 de
minute de fierbere la 100oC n prezen de SDS. Competiia
agregare/dezagregare se poate rezolva prin scderea
concentraiei proteinei din prob. Practic, testarea celui mai bun
amestec de disociere se face prin pstrarea constant a
concentraiei proteice, a concentraiei de agent reductor (de
obicei -mercaptoetanol), i a concentraiei de detergent cu
varierea timpului de incubare. Dac rezultatul este
nesatisfctor, se trece la varierea unui alt parametru dintre cei
artai mai sus.

S-a studiat interaciunea diferiilor detergeni anionici cu albumina seric bovin

(BSA). n stare nativ, BSA conine 10-11 situsuri cu constante mari de legare a ionilor
de detergent. Legarea ionilor de detergent de proteina nativ nedenaturat se
realizeaz secvenial (unul dup altul), n timp ce legarea detergentului la proteina
denaturat este puternic cooperativ. Existena complexelor discrete protein-detergent
sugereaz c asocierea ionilor de detergent este, de asemenea important, atunci cnd
afinitatea detergentului pentru protein este mai mic. Un raport de legare mai mare
dect cel normal pentru un singur situs de legare se explic numai prin formarea de
micele de detergent n acel loc, adic ionii de detergent se leag att la protein ct i la
ionii de detergent deja legai. acest fenomen este numit amplificarea legrii, iar acest tip
de legare poart numele legare micelar i s-a demonstrat c este reversibil. La
atingerea concentraiei micelare critice acest mecanism nceteaz.
Saturarea cu SDS a unei proteine depinde de asemenea n punctul izoelectric
al acesteia, indirect influennd comportamentul electroforetic. De asemenea, saturarea
cu SDS este posibil la temperatura camerei i se aplic la electroforeza
bidimensional, gelurilor folosite la separarea proteinelor prin focusare izoelectric fiind
pregtite pentru a doua dimensiune, electroforeza pe gel de poliacrilamid n prezen
de SDS (SDS-PAGE). n acest caz, incubarea la fierbere este nlocuit printr-o incubare
la temperatura camerei ntr-un amestec format din uree, 9M i Triton X-100, 20%.

Un alt agent de disociere foarte aplicat n disocierea probelor pregtite pentru

electroforez este ureea.
Denaturarea produs de uree este dependent de temperatur, pH i trie
ionic. Pentru o denaturare complet, se utilizeaz uree cu o concentraie mai
mare sau egal cu 8M, alturi de agenii reductori ai punilor disulfurice. Totui
exist proteine care nu se pot denatura.
Avantajul utilizrii ureei drept agent de denaturare const n faptul c n
unele separri electroforetice ea nu afecteaz sarcina electric intrinsec a
proteinei permind astfel o separare att n funcie de masa molecular ct i n
funcie de sarcina electric. Efectul denaturant al ureei datorat ruperii legturilor
de hidrogen inter i intramoleculare poate fi reversat prin ndeprtarea ei prin
dializ.
Dezavantajele utilizrii sale constau n faptul c nu se poate determina cu
precizie masa molecular, nu este la fel de eficient ca SDS n disocierea
proteinelor. De exemplu, ureea disociaz n proporie de 50% un lizat celular brut
(la electroforez, 50% din lizat este agregat nefiind apt s penetrteze gelul) n timp
ce SDS disociaz acelai preparat n proporie de 90%.
Unele proteine, pentru a fi disociate complet necesit prezena simultan
a SDS i a ureei.

Clorura de guanidin (guanidina hidrocloric) este, de asemenea, un

agent de disociere utilizat n disocierea probelor pregtite pentru
electroforez. n concentraii de 4-6M, ea realizeaz ruperea legturilor
necovalente provocnd desfacerea structurii cuaternare i distrugerea
structurilor secundare i teriare datorit capacitii superioare de a
participa la stabilirea legturilor de hidrogen. Majoritatea proteinelor n
guanidin hidrocloric au o conformaie total dezordonat i din aceast
cauz este rareori folosit n separrile electroforetice.

Disocierea complet a celor mai multe proteine se realizeaz prin

incubarea probei diluate n tamponul de migrare la 95-100oC (pe baie de
ap) timp de 2-5 minute n prezena att a SDS n exces ct i a mercaptoetanolului, ditioeritrolului sau ditiotreitolului (ageni utilizai la
reducerea punilor disulfurice)
Mecanismul
reducerii
punilor disulfurice de
ctre
tiocompui.
Coloana din stnga:
reducerea cu monotioli
(de
tipul
mercaptoetanolului).
Coloana din dreapta:
reducerea
cu
ditioli
ciclizabili (cum ar fi
ditiotreitolul,
DTT).
Sferele
ntunecate
reprezint
suprafaa
proteinei.

n procedura Laemmli (1970) probele pregtite pentru electroforez pe gel de

poliacrilamid n prezen de SDS (SDS-PAGE) se prepar n tampon Tris-HCl, 0,0625
M, pH 6.8, SDS, 2%, -mercaptoetanol, 5%, glicerol, 10%, i aproximativ 0,025%
(greutate/volum) colorant de monitorizare a migrrii, albastru de bromfenol.
Este de preferat a se prepara un stoc de tampon pentru prob care s conin toate
componentele cu excepia -mercaptoetanolului, acesta adugndu-se chiar nainte de
utilizare. Glicerolul ofer probei o densitate care i permite depunerea sa n godeul
gelului de separare aflat sub tamponul de migrare.
Colorantul de migrare permite att aplicarea probei ct i monitorizarea migrrii
electroforetice (el migreaz odat cu ionul frontal, adic odat cu frontul).
Cantitatea de detergent prezent n tamponul probei este suficient pentru a asigura
saturarea amestecului de proteine. n cazuri rare, cnd proba are o trie ionic foarte
crescut (> 0,2 M), ea poate fi dizolvat n tamponul stoc al probei (tamponul de
ncrcare) ntr-un raport de 1:1 (v/v), fiind totui, mai indicat o diluie ntr-un raport de
cel puin 1:4 (v/v).
Cantitatea de protein din proba care se ncarc pe un gel depinde de metoda de
detectare utilizat. Proteinele de interes care se ncarc pe gel trebuie s fie ntr-o
cantitate suficient pentru a fi ulterior localizate. Detectarea n geluri impune o cantitate
de protein/band de circa 1 g pentru a avea o vizibilitate uoar a benzilor proteice
colorate cu coloranii anionici, de tipul Coomassie Brilliant Blue R-250 sau de 0.1 g de
proteine/band n cazul colorrii cu argint.

Electroforeza n condiii nedenaturante

n acest tip de electroforez se pstreaz conformaia nativ a proteinelor,
interaciile dintre subuniti i activitatea biologic, separarea realizndu-se pe
baza dimensiunii i sarcinii nete a proteinelor. n acest caz, se utilizeaz
detergeni neionici, n general nedenaturani, folosii la solubilizarea proteinelor
de membran sau a altor proteine cnd se urmrete pstrarea activitii
biologice.
Cel mai cunoscut detergent neionic utilizat n electroforez este Triton X-100,
care din punct de vedere structural este o polioxietilen, cu structura chimic
prezentat alturat (unde n=10). n scopul desluirii mecanismului molecular de
legare, s-a studiat interacia detergent-protein. Astfel, Triton X-100
interacioneaz hidrofob cu unele proteine precum albumina seric bovin
(BSA), albumina seric uman, -lactoglobulina, n timp ce alte proteine nu
leag acest detergent (mioglobina, imunoglobulina G uman, etc.). S-a constatat
c BSA are 4 situsuri de legare a Triton X-100, nefiind ns o legare cooperativ
(prezent la legarea cu SDS), probabil, datorit concentraiei micelare critice
relativ mici. Avantajul utilizrii Triton X-100 deriv din capacitatea de solubilizare
a proteinelor de membran, iar n general, sunt preferai detergeni cu o
concentraie micelar critic mai mic de 1 mM.

SISTEME TAMPON
Dei cunotinele cu privire la proprietile geluri sunt relativ modeste, se
cunoate destul de mult despre comportamentul ionilor din tampoane n
condiiile aplicrii unui cmp electric. Astfel, au fost concepute o serie de
sisteme tampon interesante si utile, astfel nct exist o mare flexibilitate n
alegerea sistemului de tampon

Tampon de electrolit, evident, are un efect profund asupra migrrii electroforetice. Tipul de tampon utilizat
conduce la stabilirea condiiilor intensitii cmpului electric aplicat i afecteaz separarea i de aici
rezoluia. Proteinele difer foarte mult n sensibilitatea lor la trii ionice, specii ionice, pH, i necesitile
lor n cofactori. Astfel, sistemul de tampon utilizat este n funcie de proba care urmeaz a fi separat
electroforetic. Tamponul ales pentru separarea proteinelor prin electroforez nativ (nedenaturant) de
multe ori depinde mai mult de tipul proteinelor luate n studiu dect de cerinele electroforetice.

Sistemele electroforetice n care ionii unei singure soluii tampon sunt

prezeni n prob, gel i compartimentul electrozilor (concentraia lor putnd
fi diferit) la un pH constant se numesc sisteme tampon continue. Un sistem
continuu de tampon se poate utiliza pentru separarea acizilor nucleici i a
proteinelor n concentraii de aproximativ 1 mg/ml sau mai mare. n acest caz, n
tancul electroforetic se folosete acelai tampon, la un pH constant, ca i la
prepararea gelului. De asemenea, proba este ncrcat direct pe gelul unde se va
produce separarea electroforetic. Dup cum moleculele vor migra prin porii de
gel, acestea sunt fracionate n funcie de mobilitatea lor. Limea benzilor este
determinat n principal de volumul probei aplicate, acest parametru limitnd
rezoluia n sistemele continue de electroforez.
Probe diluate necesit volume mari pentru a furniza cantiti detectabile de
material, obinndu-se benzi relativ largi. Utilizarea gelurilor de dimensiunea
porilor constant, limiteaz sistemele continue la probe cu o concentraie mare de
proteine care conduc astfel la cele mai bune rezultate. De obicei gelul are porii
suficient de mici pentru a permite separarea n funcie de dimensiunile
macromoleculelor proteice.

Unele proteine plasmatice i celulare se pot separa mai bine n geluri de

poliacrilamid cu gradient de concentraie n sistem continuu, viteza de deplasare
a proteinelor descrescnd n timp i ajungnd zero, odat cu atingerea limitei lor de
por. n acest fel, crete rezoluia de separare, electroforeza cu limit de pori fiind foarte
valoroas pentru separri de proteine pe baza masei lor moleculare.
Se poate spune c ntr-un gel omogen separarea macromoleculelor se
realizeaz n funcie de sarcin electric i mas molecular, n timp ce ntr-un gel cu
gradient de concentraie, separarea macromoleculelor se realizeaz n funcie de
mas molecular.
De exemplu, ntr-un gel omogen cu T%=7,5 1-antitripsina are o mobilitate
mai mic dect albumina, migrnd dup aceasta, ntr-un gel n gradient de
concentraie, 1-antitripsina (MM=54.000 Da) va migra n faa albuminei
(MM=68.000Da).
Folosind geluri de poliacrilamid cu gradient liniar de concentraie (gradient
de pori) %T=3-30, %C=3,8, n sistem de tampon continuu, se constat c distana de
migrare (D) este proporional cu logaritmul timpului de migrare dup relaia:

unde a reprezint panta dreptei iar b este intersecia cu abcisa

Dreapta de regresie utilizat la calculul

masei moleculare a unei macromolecule
dup electroforez pe geluri cu gradient
de concentraie a porilor.

Exist o relaie liniar ntre logaritmul masei moleculare i logaritmul pantei

dreptei de regresie, dat de relaia:

Aceast formul este utilizat la calculul masei

moleculare a unei proteine studiate.

mbuntirea puterii de rezoluie s-a realizat odat cu introducerea sistemelor de tampon

discontinue. Altfel spus, aceste sisteme sunt concepute pentru a accentua zonele probei pentru
separri de nalt rezoluie. Sistemele de tampon discontinue (sau multifazice) utilizeaz ioni
de tamponare diferii n gel i n soluiile de electrozi. n electroforeza zonal multifazic,
discontinu, probele sunt aplicate pe un gel cu porozitate mare, gelul de concentrare
(stivuire), care servete ca i un mediu anticonvectiv. Toate speciile ionice, inclusiv
moleculele din prob, formeaz fronturi n micare.
Ionii din tamponul de gel, formeaz un front de ioni care se mic naintea moleculelor
de prob.
Ionii din tamponul de electrozi formeaz un front care se mic n spatele probei.
Ionii din prob (macromoleculele cu sarcin electric) dintre fronturile de tampon se
concentreaz (se stivuiesc) n zone extrem de ngust aranjate n ordinea descreterii mobilitii
lor. Moleculele din prob se concentreaz (se stivuiesc) rapid, n regiuni foarte nguste, nu mai
mari de cteva sute de microni, cu coninut proteic ridicat, de circa 100 mg/ml protein.
Probele (macromoleculele) stivuite se vor deplasa prin pori mari ai gelului de stivuire
ca zone individuale foarte nguste, indiferent de volumul de prob iniial, i intr n gelul
restrictiv de rezolvare (sau de separare), gel cu o dimensiune mic a porilor, n serii foarte
nguste aflate la distane mici, unele de celelalte. Odat ajunse n gelul de rezolvare, cernerea
devine predominant i macromoleculele de prob "se destivuiesc" i se separ, n funcie de
mrimea i sarcina lor electric.

Sisteme de tampon discontinue

Ornstein (1964) i Davis (1964) au dezvoltat pentru prima dat sisteme electroforetice pe gel de
poliacrilamid (PAGE) de nalt rezoluie pentru separarea proteinelor native. Sistemul propus de
ei a fost att de popular, nct este nc utilizat pe scar larg. Acesta a fost conceput pentru
analiza de proteine serice, dar funcioneaz bine pentru o gam larg de tipuri de proteine.
Sistemul de tampon Ornstein-Davis este prima tehnic de ncercat atunci cnd se lucreaz cu o
prob nou de proteine native. Ornstein a recunoscut c o nalt rezoluie este atins atunci cnd
zona de start a proteinelor din prob este ct mai ngust posibil. Astfel, el a conceput o metod
electroforetic care comprim zonele de protein cu mult dincolo de limitele atinse prin mijloace
mecanice. Formularea lui se bazeaz pe ecuaiile care descriu fluxul de curent n soluii ionice i
proprietile tampoanelor.
Ideea lui Ornstein a fost cea de includere a proteinele din prob ntr-un tip de sandwich intim
mrginit de dou fronturi de ioni de electrolii care se deplaseaz n cmp electric. Sub influena
cmpului electric, proteinele din prob devin comprimate ntre frontul de ioni conductor i cel
de extremitate final i segreg n zone nvecinate, n ordinea de mobiliti lor relative. Acest
proces are loc n regiune gelului cu pori mari, de concentrare. Proteinele din prob ajung la gelul
de rezolvare ntr-o band de start foarte subire. Odat ce proteine trec n gelul de rezolvare,
predomin efectul de separare prin cernere molecular. Sistemul Ornstein-Davis, folosete ioni de
clorur drept ioni conductori, dup cum ionii glicinat sunt ioni finali, n timp ce ionul Tris este
un ion comun. Dintre componentele posibile disponibile n momentul n care sistemul
electroforetic a fost dezvoltat, proprietile acestor tampoane au fost cele mai potrivite pentru
cerinele procesului de electroforez. n timp, prin analize electrochimice s-au descris o serie de
sisteme tampon care se preteaz separrii electroforetice.

Electroforeza pe geluri de poliacrilamid n condiii discontinue i nedenaturante

dup Ornstein-Davis. Este instructiv de a considera evenimentele ionice care au loc n
timpul electroforez discontinue, mai ales avnd n vedere popularitatea acestuia. Alte
sisteme discontinue funcioneaz prin mecanisme similare.
Sistemul Ornstein-Davis, folosete la separarea proteinelor, dou tampoane diferite care
conin anioni diferii i un cation comun. Ionul clorur, prezent n gel de cnd acesta este
turnat, devine ion frontal iar ionii glicinat care provin din tamponul de migrare (tamponul
de electrozi) devine ion terminal. Ionul Tris, comun, susine electroneutralitatea. Cele
mai multe proteine serice transport sarcini negative nete n acest sistem i migreaz
spre anod.
Sistemul Ornstein-Davis const din patru pri interdependente: (1) un gel de stivuire
(concentrare), (2) un gel de separare, (3) un tampon de electrod (de migrare), i (4)
prob. Etapele succesive dintr-o separare electroforetic n sistemul de tampon descris
de Ornstein-Davis sunt prezentate n figura urmtoare.
Gelul este format din dou seciuni (panel A), o poriune cu porozitate mare (gelul de
concentrare) cu T%=4 este turnat peste gelul restricitiv de rezolvare (T%=5-30). Gelul
de concentrare conine tampon Tris-Cl, 0,125 M, pH=6,8, n timp ce gelul de separare
conine tampon Tris-Cl, 0,375 M, pH=8,8. Discontinuitatea de pH dintre cele dou zone
de gel este desemnat pentru a regla mobilitatea efectiv a ionului glicinat.
ei.

Etapele succesive dintr-o separare electroforetic n sistemul de tampon descris de Ornstein-Davis

Etapele separrii unui amestec de proteine n sistem discontinuu tampon Ornstein-Davis. (A) gelul este format din dou
seciuni. Un gel de concentrare cu pori mari aflat n parte superioar este turnat peste un gel restrictiv de rezolvare
(separare). Fiecare seciune de gel conine tampon Tris-HCl, dar concentraiile i pH-urile celor dou tampoane
corespunztoare celor dou seciuni sunt diferite. Gelul de concentraie este indicat printr-o nuan de gri deschis n timp
ce gelul de separare este de culoare gri-nchis. Proba proteic dizolvat n tamponul gelului de concentrare diluat este
plasat n godeurile gelului de concentrare (linii orizontale ntunecate). Tamponul Tris- glicin de electrozi (culoarea
fondului figurii) este n contact cu partea de sus a gelului, partea de sus a probei, precum i partea de jos a gelului. Anodul
este situat n partea inferioar a gelului iar catodul se afl n zona superioar, nefiind prezentate. n acest sistem proteinele
serice de exemplu, au sarcini nete negative i se mic n jos spre anod. Ionii de Tris sunt distribuii n ntregul sistem i
servesc la meninerea electroneutralitii. Intensitatea cmpului electric, E, la scurt timp dup aplicarea unei tensiuni
electrice, este reprezentat n graficul din partea dreapt a imaginii de gel. Cmpul electric din gel, E este relativ sczut, ca
o consecin a conductivitate relativ ridicat datorat ionilor de clorur, mobili. (B). n momentul aplicrii unei tensiuni,
constituenii anionici ai sistemului se vor alinia n ordinea de mobiliti lor electroforetice. Magnitudinea mobilitii ioni
clorur (Cl-), n zona tamponului de gel este mai mare dect mobilitatea ionului glicinat (Gly), provenit din zona tamponului
de electrozi. Proteinele din prob, cu mobiliti intermediare, sunt introduse ntr-un sandwich (n ordinea de mobilitatea lor)
ntre frontul clorur i frontul de ioni glicinat. Astfel, proteinele din prob devin "stivuite" n regiunea foarte ngust dintre
cele cele dou fronturi de ioni de tampon n micare i formeaz, spaial, o zon foarte ngust de start. Intensitatea
cmpului electric este influenat de distribuie local a purttorilor de sarcin, care sunt proteinele din zona de prob.
Intensitatea, E, a cmpului n zone diferite care conin ioni este ajustat, astfel nct toate fronturile ionice migreaz cu
aceeai vitez. (C). La scurt timp dup ce procesul de concentrare este finalizat, proteinele din prob trec n gelul de
rezolvare care este prevzut cu pori mai mici pori unde micarea este ncetinit datorit procesului de cernere molecular.
n gelul de rezolvare, ionii de glicinat depesc proteinele din prob i vor migra chiar n spatele ionilor clorur. n timpul
etapei de rezolvare, proteinele vor rspunde la cmpul electric relativ ridicat determinat de ionii glicinat din gel.
Electroforeza continu cu proteinele din prob n tampon Tris- glicin, pn cnd aparatul este nchis.

Stivuirea. Cnd este aplicat o tensiune de curent, ionii clorur din seciunile de gel, proteinele
anionice din prob, precum i ionii de glicinat din zona tamponului de electrod ncep s se
deplaseze spre anod (panel B). Tris-ul (o baz), precum i orice alt protein cationic din prob
migreaz spre catod. Aa cum ioni de clorur prsesc proba, n spatele lor se creeaz o regiune
localizat, de conductivitate sczut i cmp nalt. Cmpul crescut din spatele frontului de ion
clorur accelereaz proteinele din prob i ionii de glicinat de la tampon electrodului la aceeai
vitez ca i a ionilor clorur (E=constant). Gradul de ionizare a glicinei, la pH-ul tamponului de
electrozi (pH=8,3) este de aa natur c mobilitatea efectiv a ionilor glicinat este mai mic dect
ca a ionului clorur i a proteinelor din prob. (Mobilitatea efectiv a unei electrolit slab este
mobilitatea medie a formei ionizate; ef=x, unde x este fraciunea de molecule ionizate la un pH
specific iar este mobilitatea acestuia. Fiecare molecul poate fi gndit ca fiind ionizat x% din
timp i neionizat restul timpului. pKa a glicinei este pH=9,8 iar la pH=8,3, moleculele de glicin
sunt disociate n proporie de 1/30 n ioni glicinat). O regiune a frontului mobil se formeaz rapid
cu ioni de clorur, frontali i ionii de glicinat n spate, iar proteinele din prob sunt comprimate
ntre ele. Proteinele formeaz, zone individuale subiri, aezate precum fiicul de monede, n
ordinea descresctoare a mobilitii, ntre ionul conductor, clorur i ionul de sfrit, glicinat. n
acest timp, pH-ul gelului de concentrare devine 8,3 deoarece ionii de glicin se deplaseaz prin
acest gel. n stiva creat, fiecare zon proteic se afl ntr-un cmp electric sczut care se mic
n fa i un cmp electric ridicat aflat n spatele ei. Orice molecul de protein avanseaz n zona
din faa sa unde ntlnete un cmp electric cu intensitate sczut, fiind ncetinit pn cnd zona
sa l va prelua. Invers, o molecul proteic care provine spatele acestei zone este accelerat de
cmpul electric crescut de acolo. n starea de echilibru, fiecare dintre proteine este concentrat
ntr-o zona ngust, de nalt densitate, determinat exclusiv de mobilitatea sa, n condiii
electroforetice.

Separarea. n cazul n care regiunile mobile se deplaseaz n ajung la

interfaa dintre gelul de concentrare (stivuire) i gelul de rezolvare, proteinele
vor fi ncetinite accentuat datorit existenei porilor restrictivi ai gelului de
separare. n acelai timp, pH-ul este brusc crescut la o valoare de 8,8 i
crete rapid la un pH de 9,5 deoarece tris-Cl se nlocuiete cu tris-glicinat.
Mobilitatea efectiv a ionilor de glicinat la pH 9,5 este destul de mare i ca
atare depete proteinele din prob care sunt ncetinite n micare de ctre
porii gelului de rezolvare, migrnd chiar n spatele frontului de clorur
(x=1/3) n aceste condiii zonele de proteine devin necomprimate i ncepe
s se separe n benzi macroscopice prin cernere molecular (panel C). In
gelul de rezolvare, proteine se mic la pH 9,5. pH-ul de operare a gelului
de separare, egal cu 9,5 a fost introdus n sistemul Ornstein-Davis pentru a
asigura o mobilitate eficient a glicinatului, mai mare dect cea a celei mai
rapide proteine serice (prealbumina) n geluri cu %T=7,5. Dup cum are loc
progresul migrrii, benzile proteice, iniial foarte subiri se lesc ntr-un ordin
de milimetrii, drept consecin a difuziei i diluiei.

Principiul electroforezei pe gel de poliacrilamid n sistem

discontinuu.

Electroforeza pe geluri de poliacrilamid n condiii discontinue i denaturante

dup protocolul descris de Laemmli.
Laemmli (1970) a modificat sistemul Ornstein-Davis, pentru a permite
determinri ale greutate molecular. Sistemul Laemmli conine SDS 0,1% n
tampoanele Ornstein-Davis i utilizeaz o etap de denaturare prin tratament termic
a probei. Tratamentul este conceput pentru a denatura complet proteinele de prob
n componentele lor polipeptidice constitutive nainte de electroforez.
n momentul n care un amestec de proteine se incubeaz ntr-un tampon
care conine SDS (2%) i un agent tiol reductor, cum ar fi 2-mercaptoetanolul
(5%) la temperatur, proteinele sunt complet denaturate iar polipeptidele rezultate,
datorit SDS-ului, se ncarc cu o sarcin negativ uniform, n raport cu masa lor.
Agentul de reducere rupe legturile disulfurice ntre segmentele proteinelor native,
n timp ce SDS, un denaturant bine-cunoscut, mbrac polipeptidele uniform, cu 1,4
g de SDS pe gram de polipeptid. Proprietile detergentului ecraneaz proprietile
polipeptidelor. Toate filmele SDS-polipeptide iau o form similar prelungit,
asemntoare unei vergea, cu dimensiuni proporionale cu greutatea lor molecular.
n plus, densitatea de sarcin a complexelor SDS-polipeptid este independent de
pH n intervalul 7-10 i astfel fracionarea n gel este guvernat strict de procesul
de cernere molecular, astfel nct prin utilizarea acestui sistem se poate la estima
greutile moleculare ale polipeptidelor separate.

O serie de tipuri de proteine nu se comport ntr-un mod ateptat n cursul SDSPAGE. Proteinele incomplet reduse, cu unele puni intra- sau intermoleculare disulfurice
intacte, nu sunt saturate cu SDS, deoarece o parte din domeniile lor de legare a SDS nu sunt
disponibile la detergent. Glicoproteinele i lipoproteinele nu sunt, de asemenea, saturate cu
SDS, deoarece componentele lor neproteice nu interacioneaz cu detergent. Proteine care
conin secvene neuzuale de aminoacizi, n special cele cu un coninut crescut n resturi de
lizin sau cele cu un coninut crescut n resturi de prolin, proteinele foarte bazice i cele foarte
acide se comport anomal n SDS-PAGE, probabil pentru c raportul sarcin electric/mas a
complexelor SDS-polipeptid sunt diferite de cele care ar fi de ateptat, dat pentru
dimensiunea lor. n mod similar, complexele foarte mari SDS-protein, cu mase moleculare de
sute de kilodaltoni, ar putea avea conformaii anormale.
Polipeptidele mai mici de aproximativ 12.000 Da nu sunt rezolvate bine n cele mai
multe sisteme SDS-PAGE. Complexe SDS-polipeptid mici, fie au aceleai conformaie
aproximativ sferic, fie nu pot fi separate de zona de micele de SDS pur care se formeaz n
spatele frontului de ioni conductori.
Sistemele electroforetice descrise de Laemmli i Ornstein-Davis pot fi utilizate la
separarea att a proteinelor ct i a acizilor nucleici. n cazul separrii acizilor nucleic, este
totui preferat sistemul Laemmli deoarece n cazul acestei tehnici, prezena SDS conduce la
denaturarea nucleazelor contaminante.

ESTIMAREA MASEI MOLECULARE PRIN SDS-PAGE

n procedura descris de Laemmli, tratamentul probei anterior SDS-PAGE conduce la
desfacerea proteinelor n subunitile lor componente i las subunitile acoperite cu detergent
anionic. Mobilitile electroforetice ale tuturor complexelor polipeptid-SDS rezultate i asum
aceeai relaie funcional n referitoare la masa lor molecular. ntr-o prim aproximare, vitezele
de migrare a derivailor SDS sunt invers proporionale cu logaritmii maselor lor moleculare. SDSpolipeptidele, astfel, se vor deplasa prin geluri ntr-un mod previzibil, complexele cu mas
molecular mic vor migra mai repede dect cele mari. Aceasta nseamn c masa molecular a
unei proteine poate fi estimat din mobilitile relative ale subunitilor sale n SDS-PAGE, calibrat.
Estimrile de mas molecular sunt printre aplicaiile cele mai des folosite de electroforeza pe gel
i reprezint o parte a popularitii SDS-PAGE prin metoda Laemmli.
Masele moleculare sunt determinate n SDS-PAGE prin compararea mobilitii proteinei de
testare cu mobilitile unor proteine marker cunoscute. Parametrul relevant este
mobilitatea relativ, Rf, definit ca mobilitatea a unei proteine raportat la mobilitatea
frontului de ioni. Acest parametru permite normalizarea mobilitilor la o mrime
msurabil semnificativ i caracteristic. Mai degrab dect a determina mobiliti, este
suficient s se calculeze Rf ca raportul dintre distanta parcursa de o proteina din partea de
sus a gelului de rezolvare mprit la distan de migrare a frontului de ioni. Deoarece
frontul de ioni este dificil de a localiza, n practic, mobilitile sunt normalizate la colorant
de urmrire care migreaz doar puin n spatele frontului de ioni:

Graficul log M vs Rf construit

din distanele de migrare a
standardelor
conduc
la
calibrarea
curbei
gelului.
Valorile Rf ale proteinelor de
testat sunt apoi comparate cu
cele
ale
standardelor.
Interpolarea valorilor Rf ale
proteinei de testat pe curba
standard ofer masa ei
molecular aproximativ
Curb de calibrare, logMr vs. Rf plotat cu o serie de markeri
de mas molecular cuprins n domeniul 10.000-200.000Da,
separai pe un gel omogen (T%=10% i C%=2,75%) de
poliacrilamid n prezen de SDS. Se poate observa deviaia
de la linearitate. Proteinele marker sunt (masa molecular,
Mr fiind dat n kDa): miozin (194); RNA polimeraz
(subunitatea ) (160); galactozidaz (116); fosforilaz B
(94); RNA polimeraz (subunitea ) (95); albumin seric
bovin (68); ovalbumin (43); RNA polimeraz (subunitea
) (38,4); anhidraz carbonic (30); tripsinogen (24.5); 1actoglobulin (17,5); lizozim (14,5).

Curbele standard sunt de fapt n form sigmoidal. Liniaritatea aparent a

curbei standard nu poate acoperi ns, ntreaga gam de mase moleculare
pentru un amestec de proteine separate ntr-un gel particular. Cu toate
acestea, log M este suficient de aplatizat, ntr-un sens matematic, pentru a
permite estimri n mas molecular destul de exacte care urmeaz s fie
fcute prin interpolare, i chiar i prin extrapolare, peste domenii relativ
mari. Intervalele aproximative utile a gelurilor dup SDS-PAGE pentru
estimri de mas molecular sunt dup cum urmeaz: pentru mase
moleculare din domeniul 40.000 la 200.000 Da, geluri cu T%=7,5%; pentru
mase moleculare din domeniul 30.000 la 100.000, geluri cu T%=10%;
pentru mase moleculare din domeniul 15000 la 90000 Da, geluri cu
T%=12%; pentru mase moleculare din domeniul 10.000 la 70.000 Da,
geluri cu T%=15%.
Amestecuri de proteine standard cu mas molecular cunoscut sunt
disponibile n comer pentru calibrarea geluri n vederea electroforezei
proteinelor.

Markeri de mas molecular utilizai n SDS-PAGE

Este important a avea la ndemn o gama larg de markeri de

mas molecular, astfel nct s se exploreze orice dimensiune a
unui polipeptid. Acetia ar trebui s suficieni pentru cele mai multe
scopuri, deoarece se ntind pe un interval de aproximativ 1000 de
ori a masei moleculare (dei markeri cu mas mai mic de 10 kDa
sunt rar folosii).
Kiturile acoper intervale de mas molecular limitate sunt, n
general, disponibile din mai multe surse comerciale De exemplu, se
ofer trei seturi de markeri denumii markeri pe un domeniu sczut,
pe un domeniu mare i markeri pe o gam larg, pentru a fi utilizate
ca standarde pentru separaii de proteine n intervale cuprinse ntre
14.000-90.000 Da, 45.000-200.000 Da, respectiv 6.500-200.000
Da. Dac acetia nu sunt de ajuns, se poate pregti o serie proprie
prin reticularea catenelor polipeptidice ale unor proteine mici (de
exemplu, lizozim, hemoglobin, albumin seric bovin).

ELECTROFOREZA PE GELURI DE POLIACRILAMID N GRADIENT DE

POROZITATE
Migrarea macromoleculelor ntr-o matrice de gel cu o concentraie continuu variabil
(ceea ce semnific un gradient de porozitate), are ca efect compactarea zonelor de
proteine de-a lungul direciei de migrare, astfel c banda proteic, traverseaz
concentraii din ce n ce mai mari de gel, iar viteza sa de migrare scade continuu. Acest
proces conduce la o ngustare progresiv a benzii proteice. Exist i alte motive pentru a
recurge la geluri de porozitate gradat.
Principiul tehnicii este prezentat n figura alturat, cnd,
dup o separare electroforetic n timp suficient (de cel
puin 10 kVh) pentru ca mobilitatea proteinelor s fie
constant i n cele din urm s nceteze pentru c fiecare
element constitutiv al probei s ajung ntr-o regiune a
gelului cu o densitate la care dimensiunea medie a porilor
se apropie de diametrul proteinelor (limita de pori). Astfel,
raportul dintre distanele de migrare a unei proteine cu cea
a oricrui alteia devine o constant, dup ce au intrat toate
ntr-o regiune a gelului n care acestea sunt supuse unor
condiii de cernere drastic. Din aceast cauz profilul
electroforetic devine constant dup o migrare prelungit
ntr-un gel cu gradient de concentraie. Concentraia de
gel, la care rata de migrare pentru o protein dat devine
constant se numete limit de pori: dac acest porozitate
marcat n mod corespunztor cu ajutorul unui set adecvat
de proteine marker, atunci este posibil s se coreleze
distana de migrare a oricrui element constitutiv n
amestec cu masa sa molecular.

Metoda descris pentru determinarea masei

moleculare dup SDS-PAGE, folosind un gradient
linear de pori. Curba arat o relaie liniar ntre
logaritmul masei moleculare i D (D1/2) pentru o
serie de 34 de proteine standard care acoper
domeniul de masele moleculare cuprinse ntre
13.000 i 95.000 Da, separate pe un gel n
gradient T%=3-30% (la un C% constant de 8,4%).

Schema unui sistem pentru turnarea gelurilor de

poliacrilamid n gradient linear: A, dispozitiv bicameral de
formare a gradientului; B, rezervor; C, camer de
amestecare; D, supap; E, bar magnetic de agitare; F,
agitator magnetic; G, robinet; H, pomp peristaltic; I,
tubulatur; J, caset de turnare a gelului plac vertical.

Calitatea gradientului generat poate fi verificat prin adugarea

unui colorant, cum ar fi p-nitrofenolul sau albastru de bromofenol
ntr-unul dintre rezervoare i apoi de scanarea gelului cu un
densitometru.

n cazul n care se are n vedere

turnarea simultan a unui numr de
geluri plac verticale
Reprezentarea schematic a unui
aparat pentru prepararea unui numr
de geluri de poliacrilamid cu gradient
liniar de pori: A, sistem de producere a
gradientului; B, rezervor (concentraie
mare de monomeri, T% mare); C,
camer de amestecare (concentraie
mic mare de monomeri, T% mic); D,
valv; E, bar magnetic; F, agitator
magnetic; G, robinet de nchidere; H,
pomp peristaltic; I, caset de
turnare a mai multor copii de geluri
verticale.

Limitele concentraiei aleas pentru gradient depinde de compoziia probei ce

urmeaz a fi separat. Gradieni de tipul 4-24, 4-26, 4-30, 2-30% etc., sunt considerai
n general mai potrivii a se utiliza pentru cele mai multe probe proteice (de exemplu
proteine serice, proteine urinare, etc.), dei, dac electroforeza este prelungit este
posibil ca proteinele cu Mr n jur de 30,000 Da s migreze n afara gelului.
.

Aplicaii ale electroforezei pe geluri de poliacrilamid n gradient de

porozitate

Electroforeza n gradient de pori n prezena SDS poate rezolva, o gam larg de proteine
ntr-un domeniu mare de mas molecular. Prin urmare, asocierea dintre focalizare
izoelectric i electroforeza n gradient de pori n prezen de SDS maximizeaz numrul de
proteine identificate ntr-un gel dup o singur separare bidimensional. Pentru a obine pI-ul
i masa proteinelor native, se utilizeaz n prima dimensiune focalizarea izoelectric n
absena ureei urmat de electroforeza n gradient de pori n condiii nedenaturante
n cazul unei proteine multimerice, parial purificate, numrul de subuniti i masa
molecular a subunitilor sunt analizate simultan prin electroforez 2-D cu electroforeza n
gradient de pori pentru prima dimensiune i SDS-PAGE pentru a doua dimensiune. Dup o
prim electroforez n gradient de pori n condiii nedenaturante, poziia proteinelor
multimerice n gel este determinat prin teste specifice acestei proteine pentru estimarea
masei sale moleculare native, dup care proteina multimeric este disociat n subunitile
sale prin tratament cu SDS. Masa molecular a fiecrei subuniti este determinat prin
electroforez pe gel de poliacrilamid n prezen de SDS iar numrul de subuniti dintr-o
protein nativ complex se calculeaz din aceste valori.

Au fost descrise alte aplicaii ale electroforezei n analiza lipoproteinelor, inclusiv lipoproteinelor cu
densitate mare (HDL) precum i a lipoproteinelor cu densitate mic (LDL). n cele mai multe laboratoare de
analiz specializat, metodele uzuale de separare i analiz a lipoproteinelor din ser sunt cele de
ultracentrifugare n gradient de densitate. Un dezavantaj al acestei metode const din necesarul unui
echipament scump i personal cu experien, n timp ce separarea i analiza acestora prin electroforez n
gradient de pori este o metod relativ simpl, necostisitoare, i sensibil pentru detectarea subfraciilor
lipoproteice dintr-un volum mic de ser. n plus, electroforeza n gradient de pori n condiii nedenaturante
separ lipoproteinele, pe baza diferenelor de dimensiune a particulelor i astfel poate oferi n mod direct
dimensiunea particulelor, n timp ce separarea ultracentrifugarea n gradient de densitate se bazeaz pe
diferena de densitate, parametru indirect, dependent de dimensiunea particulelor. Dac, nainte de
electroforez, n cazul n care lipoproteinele din prob sunt precolorate printr-o tehnic de colorare a lipidelor
(colorare cu negru de Sudan B, de exemplu) migrarea lor poate fi monitorizat n timp real. De exemplu,
HDL poate fi fracionat n 14 subclase prin electroforez n gradient de pori n condiii nedenaturante.
n plus fa de interaciunea funcional a proteinelor sau a subunitilor acestora, reaciile antigen-anticorp
sunt analizate dup separarea prin electroforez n gradient de pori n condiii nedenaturante. Mobilitatea
unui complex de antigen-anticorp este mai lent dect cea a unei molecule singulare de antigen. Mai mult
dect att, un complex al unei molecule de antigen i doi anticorpi monoclonali care recunosc doi epitopi
distinci migreaz mai lent dect un complex format dintr-un antigen i un anticorp monoclonal. Prin urmare,
prin electroforez n gradient de pori n condiii nedenaturante se poate determina dac dou anticorpi
monoclonali mpotriva acelai antigen recunosc epitopi diferii sau identici, i astfel este posibil realizarea
unui studiu de cartografiere a epitopilor prin electroforez pe gel.
se poate realiza de asemenea, studiul complexelor ADN-proteine. n analiza de modificare a mobilitii
electroforetice (electrophoretic mobility shift assay, EMSA), EMSA cu electroforeza n gradient de pori n
condiii nedenaturante are o capacitate de rezoluie nalt i este util pentru analiza complexele ADNproteine care conin proteine diferite ori pentru detectarea unor proteine de legare a de ADN mutani.

ELECTROFOREZA PE GELURI DE
POLIACRILAMID N PREZENA
BROMURII DE CETIL-TRIMETIL-AMONIU
n cazul n care, n loc de ncrcarea negativ cu SDS, se utilizeaz o
ncrcare pozitiv a proteinelor cu detergeni de tipul bromurii de
cetiltrimetilamoniu (CTAB), sarcina negativ a glucidelor se neutralizeaz
prin legarea suplimentar a unor molecule de detergent. Acest lucru
conduce la obinerea unor benzi mai clare. CTAB este cunoscut c
solubilizeaz proteinele foarte eficient i a fost folosit pentru izolarea unor
proteine "dificile"
n CTAB-PAGE proteinele se deplaseaz spre polul negativ, mai degrab
dect spre electrodul pozitiv i ca atare trebuie utilizat un sistem diferit de
tamponare.

Electroforeza nativ pe gel de poliacrilamid n prezen de Coomasie Brillant Blue

n ultimii ani, separarea de complexe proteice prin electroforez nativ pe gel de poliacrilamid n prezen de
CBB (Blue native PAGE, BN-PAGE) s-a dovedit a fi o metod dominant n identificarea unor tulburri
funcionale prin analiz din omogenate totale, esuturi, celule ori fraciuni celulare. Metoda a fost utilizat la
determinarea greutii moleculare a complexelor proteice din intervalul cuprins ntre 10 i 10.000 kDa. Au fost
analizate cu succes mai ales complexele membranare intrinseci de transfer a electronilor/protonilor din
mitocondrii i cloroplastele. Metoda a fost combinat cu alte tehnici pentru a determina starea oligomeric,
stochiometria, activitatea enzimatic i structura molecular a complexelor multiproteice. Aa cum multe probe
pot fi separate n paralel, ntr-o singur migrare electroforetic, printr-o comparaie direct a complexelor proteice
se permite uor identificarea unor tulburri, ceea ce permite direcionarea spre analize funcionale suplimentare. n
proteomic, separarea de nalt rezoluie de proteine este, n general realizat prin separri bidimensionale (2-D),
n conformitate cu punctul izoelectric al proteinelor (IEF-PAGE) i masa lor molecular (SDS-PAGE). Aceasta
ultim tehnic de denaturare separ sute de mii de proteine din probe complexe. Cu toate acestea, proteinele
hidrofobe de membran sunt greu detectabile, dup 2-D IEF/SDS-PAGE.
BN-PAGE reprezint o strategie alternativ de separarea cu rezoluie nalt a proteinelor de membran i de
meninere a funciei lor enzimatice. Metoda se numete nativ, deoarece cele mai complexe de proteine separate
i pstreaz funciile enzimatice i blue native, deoarece separarea electroforetic se bazeaz pe proprietatea
colorantului Coomassie blue G250 (CBB) de a se lega la proteine. BN-PAGE a fost descris pentru prima data n
1991 n cazul separrii complexelor de proteine membranare din lanul respirator al mitocondriei umane. Astzi,
BN-PAGE reprezint o alegere n cazul n care este necesar o analiz a interaciunilor proteinelor native de
membran, la o rezoluie nalt i cu randament sporit.
Importana biologic a interaciunilor dintre proteine este dat de faptul c proteinele se exprima n funcie de gene
n toate organismele vii. Proteinele sunt molecule funcionale care opereaz pe ci metabolice, de dezvoltare i de
reglare, dintr-o celul, esut sau dintr-un organism. Proteinele multiple sunt complexe integrate, n scopul
organizrii lor n mai multe funcii enzimatice. Complexe de proteine, prin urmare, reflect organizarea
macromolecular a strii celulare, care reprezint fundamentul n nelegerea funciilor celulare. n practica
proteomic, obiectivul central l reprezint identificarea tuturor proteinelor prezente ntr-o stare definit de
dezvoltare a unui organism, esut, celule sau subfracie celular i de a caracteriza modificrile lor calitative i
cantitative, ca rspuns la schimbrile de mediu.

Pregtirea probei n vederea BN-PAGE. Blue native PAGE separ complexe ale proteinelor de
membran n stare nativ. Pentru a obine rezultate optime, pregtirea probelor reprezint pasul
cel mai critic, din acest motiv toate treptele de prelucare se efectueaz pe ghea. Pentru a mri
ansele de solubilizare a complexelor proteice i de cretere a stabilitii lor, se are n vedere c
solubilitatea proteinelor depinde att de natura probei, precum i pe tipul de detergent i de
concentraia acestuia, aceste variabile trebuind testate pentru oricare prob de interes.
Solubilizarea complexelor proteice. Membranele biologice sunt ansambluri complexe de lipide i
proteine. Un compus lipidic este de obicei compus din dou cozi hidrofobe de hidrocarbur
conectate la un cap polar. Lipidele sunt cel mai adesea aranjate ntr-o structur bistratificat cu
cozile hidrofobe alturate iar capetele hidrofile ale acestora sunt ndreptate spre exterior.
Proteinele de membran sunt ncorporate n zonele hidrofobe ale bistratului membranar prin
interaciunea lor cu faza hidrofob lipidic. Proteine se adun n complexe multisubunitare pentru
a ndeplini funciile celulare n cadrul fazei de membran.

Evoluia unui proces de migrare electroforetic prin BN-PAGE. Imaginile reprezint trei puncte
caracteristice din perioada de timp de electroforez prin BN-PAGE. Aparatul electroforetic const din
anod (partea de jos) i tancul rezervor de tampon catodic (sus, umplute cu tampon catodic, care conine
CBB, albastru), gelul se afl situat ntre dou plci de sticl (ca un sandwich) iar meninerea temperaturii
(la 4oC) se realizeaz printr-un sistem de rcire prin intermediul tamponului anodal n tot timpul
electroforezei. Tamponul din zona anodal este agitat pentru a menine o temperatur constant. nainte
de nceperea electroforezei, tamponul catodal care conine CBB este completat n rezervorul cu tampon i
probele sunt depuse n godeuri (sgeata de culoare alb, godeul probei, panelul 1, nainte de nceperea
migrrii). n timpul electroforezei, probele ncrcate electric intr n gelul de concentrare (stivuire) i dup
un timp, colorantul Coomassie care se deplaseaz cu frontul ajunge la jumtatea gelului de separare. n
acest moment, complexele proteice ncep s devin vizibile n gelul de separare. n acest moment,
tamponul cu Coomassie catodic se schimb cu un tampon catodal incolor (sgeile de culoare alb,
panelul 2, n timpul migrrii). BN-PAGE poate fi oprit atunci cnd tampon colorat cu CBB ptat a ajuns
la sfritul gelului de separare i separarea de complexe este finalizat (sgeile de culoare alb, panelul
3, sfritul migrrii)

BN-PAGE a complexelor de proteine membranare tilacoide.

Markerul de mas molecular (MP) conine urmtoarele
proteine standard separate: tireoglobulin 696, feritin 440,
catalaz 232, lactat dehidrogenaz 140, i albumin 67, kDa.
Din 1108 cloroplastele de orz corespunznd la 400 g de
protein, au fost izolate plastide care au fost n continuare
lizate, iar membranele tilacoide au fost colectate prin
centrifugare. Proteinele membranare au fost solubilizate cu
dodecilmaltozid i separate pe un gel de poliacrilamid cu
gradient liniar de pori (6-12%), prin blue native PAGE (TM).
Linia a doua de gel a fost colorat cu CBB (CS). Pentru a se
determina
activitatea
diaforazei
NAD(P)H:plastoquinon:oxidoreductazei (asterisc pe partea
dreapt a gelului), gelul din prima dimensiune, a fost incubat n
50 mM tampon fosfat pH=8,0/EDTA, 1mM. Reacia de culoare
a fost iniiat prin adugarea a 0,2 mM NADH i 0,5 mg/ml
nitro blue tetrazoliu. Gelul s-a incubat n continuare timp de 12
ore. Se evideniaz (prin sgei) dou complexe proteice care
conin clorofil (AS) la o mas molecular de 550 kDa
(semnalul de sus, echivalent complexului PS I, LHC I) i un
altul, la o mas molecular de 120 kDa (semnalul mai mic,
echivalent complexului LHC II).

Electroforeza nativ pe geluri de

poliacrilamid incolore

nu este nimic altceva, dect un sistem de gel folosit n BN-PAGE, fr a utiliza

colorantul CBB
Pentru a evita o potenial agregare a proteinelor de membran din extractele de
detergent n timpul migrrii electroforetice, se adaug detergeni blnzi la gelurile
native incolore, de exemplu
Detergentul utilizat
-D-dodecilmaltozid
-D-decilmaltozid
-D-octilglucozid
Triton X-100
Nonidet P-40
Lubrol
Digitonin

Proba biologic
Mitocondrie la mamifere
Mitocondria la drojdii
Cloroplaste la plante (tilacoide)
Mitocondrie la mamifere
Mitocondrie la drojdii
Mitocondrie la drojdii
Mitocondrie la drojdii
Mitocondrie la drojdii
Mitocondria la drojdii

SEPARAREA PROTEINELOR PE GELURI DE POLIACRILAMID

PRIN FOCALIZARE (FOCUSARE) IZOELECTRIC
IEF este o tehnic electroforetic pentru fracionarea compuilor amfoterici n funcie de pI-ul lor
de-a lungul unui gradient continuu de pH. Contrar electroforezei zonale, unde mediul de separare
posed un pH constant (tamponat) care stabilete o sarcin electric constant pe suprafaa
moleculei i care conduce, n absena procesului de stivuire (cernere molecular) la o mobilitate
constant, sarcina electric de suprafa ale unui compus amfoter n IEF este ntr-o continu
schimbare, i scdere, n funcie de curba sa de titrare, n timp ce trece de-a lungul unui gradient
de pH pn cnd ajunge la o poziie de echilibru, adic n regiunea n care pH-ul se potrivete cu
pI-ul su. Acolo, mobilitatea acestei molecule este egal cu zero iar molecula se oprete.
Gradientul este creat i meninut, prin trecerea unui curent electric printr-o soluie de compui
amfoterici, care au valori ale pI-urilor apropiate pe o distan care cuprinde un domeniu dat de pH.
Transportul electroforetic cauzeaz acestor amfolii transportori (CA) stivuirea n funcie de pI-lor,
astfel nct se realizeaz un gradient de pH care crete de la anod la catod, i care este stabilizat.
La nceputul unei migrrii, mediul de separare are un pH uniform, este egal cu pl-ul mediu al
amfoliilor transportori. Astfel, cei mai muli amfolii au o sarcin net i o mobilitate net. Amfolitul
cel mai acid migreaz n apropierea anodului i se concentreaz ntr-o zon la care valoarea pHului su este egal cu pI, n timp ce cel mai bazic amfolit se deplaseaz adiacent i n apropierea
catodului. Un amfolit mai puin acid migreaz adiacent i uor catodal ntr-o zon stablit de pH-ul
su i astfel toi componenii sistemului ating o stare de echilibru. Dup finalizarea acestui proces
de aranjare (stivuire), unii amfolii transportori tind s se deplaseze n zone cu pH mai mare sau
mai mic prin procese de difuziune n cazul n care sistemul nu se afl ntr-un echilibru izoelectric.
Dar, aa cum imediat ce acetia intr n aceste zone, amfoliii transportori devin ncrcai electric iar
tensiunea electric aplicat i foreaz s se ntoarc napoi n poziia lor de echilibru.

Principiul focalizrii izoelectrice. nainte de ncrcarea probei, se stabilete un

gradient de pH. (A) Se ncarc proba i se aplic pe gel. Proteinele vor migra n
funcie de pH-ul lor izoelectric, localizare la care sarcina lor net este nul; (B)
Proteinele formeaz benzi electroforetice care pot fi excizate sau utilizate n
experimente ulterioare.
Din punct de vedere chimic, amfoliii transportori sunt acizi oligo-amino, acizi oligo-carboxilici,
disponibili comercial sub denumiri diferite. Exist trei abordri de baz n sinteza amfoliilor
transportori:
abordarea Vesterberg, care implic o reacie dintre oligo-amine diferite (tetra-, penta-i hexaamine) cu acid acrilic;
procesul de sintez chimic propus de Soderberg i colab. care implic co-polimerizarea de
amine, aminoacizii i dipeptide cu epiclorhidrin;
abordarea Pogacar-Grubhofer, care a utilizeaz etilenimina i propilendiamina pentru reacii
ulterioare cu propansulfona, vinil sulfonatul de sodiu i clormetil fosfonatul de sodiu.

Focalizarea izoelectric cu gradieni de pH imobilizai (CA-IEF).

Se realizeaz cu tampoane, un set de ase acizi slabi i baze neamfotere, avnd o
compoziie chimic general, CH2=CH-CO-NH-R, unde R reprezint fie dou gruprii
carboxil diferite slab acide, cu pK-uri de 3,6 respectiv 4,6, sau patru grupri teriare
amino, cu pK-uri de 6,2, 7,0, 8,5, i 9,3 (disponibile sub denumirea comercial de
Immobiline, figura alturat).

STRATEGIA DE SEPARARE A PROTEINELOR PE GELURI DIN POLIACRILAMID

PRIN FOCALIZARE IZOELECTRIC
Proteinele, ca molecule amfotere, posed sarcini nete pozitive, negative, sau neutre n
funcie de pH-ul de mediului n care se afl dizolvate. Sarcina per ansamblu a unei proteine
particulare este determinat de resturile de aminoacizi acizi sau bazici ionizabili de pe
catenele polipeptidice i de gruprile protetice. Gruprile carboxilice acide (-COOH), din
proteine sunt neionizate n soluii acide i disociaz n form anionic (-COO-), la valorile ale
pH-ului mai mari, de mai sus de pH=3,0. Gruprile amino (-NH2) i ali compui de baz din
proteine, cum ar fi guanidinele, sunt nencrcate electric la un pH alcalin, dar devin cationi la
un pH mai n jur de 10,0 (de exemplu,-NH3+). pH-ul la care o caten polipeptidic disociaz
este afectat de compoziia total a proteinei i de proprietile mediului n care se afl
dizolvat. Ca urmare, fiecare grupare individual ionizabil dintr-o protein are un punct
aproape unic de disociere.
Sarcina net a unei proteine este suma algebric a tuturor sarcinilor sale, pozitive i
negative. Dup cum s-a mai amintit n acest capitol, exist un pH specific pentru fiecare
protein la care sarcina net care o posed este egal cu zero. Aceast valoare este
denumit pH izoelectric (pI) este o proprietate caracteristic fizico-chimic specific fiecrei
proteine. n cazul n care numrul de grupri acide dintr-o protein depete numrul de
grupri bazice, pI-ul proteinei va avea o valoare sczut a pH-ului. Pe de alt parte, n cazul
n care numrul gruprilor bazice sunt mai numeroase dect cele acide, pl-ul va fi nalt.
Proteinele arat variaii considerabile ale punctelor izoelectrice, dar valorile pl-urilor se
ncadreaz de obicei, n intervalul de pH cuprins ntre 3 i 10.

n general, IEF se efectueaz n condiii nedenaturante, fiind o tehnic de nalt

rezoluie. Deseori, rezoluia a dou proteine diferite se realizeaz la valori ale
pI-ului lor de doar 0,02 uniti de pH, sau mai puin. Din cauza acestei naltei
rezoluii, probe de proteine care par a fi omogene atunci cnd sunt testate prin
alte mijloace poate fi adesea separate n mai multe componente prin IEF. Astfel,
microheterogenitatea poate fi un indiciu dat de diferene n structura primar,
existena unor izomeri conformaionali, a unor diferenele de tipuri i de numr
de grupri prostetice, sau de denaturare a proteinei.
n funcie de proprietile proteinei (proteinelor) luate n studiu i n funcie de
scopul urmrit, trebuie avut n vedere:
- compoziia chimic, concentraia i structura gelului (de poliacrilamid ori
agaroz);
- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau plat);
- condiiile de separare (IEF, CA-IEF).

REZOLUIA DE SEPARARE N FOCALIZAREA IZOELECTRIC

Conform teoriei focalizrii izoelectrice i rezultatelor experimentale, diferena

de pI (pI) ntre dou benzi de proteine adiacente rezolvate prin aceast tehnic
este direct proporional cu rdcina ptrat a gradientului de pH i invers
proporional cu rdcina ptrat a gradientului de tensiune (intensitatea
cmpului electric aplicat) conform relaiei:

pI = (gradient de pH / gradient de voltaj)1/2

Astfel, n focalizarea izoelectric, un domeniu ngust de pH i o tensiune nalt, aplicat, conduce
la o rezoluie nalt (un pI mic). n plus fa de aceti doi factori, o rezoluie bun este favorizat
de substane cu coeficieni de difuzie sczui. De asemenea, vitezele ridicate de schimbare a
mobilitii, cu un pH apropiat de punctele lor izoelectrice conduc la o rezoluie nalt. Cele mai
multe dintre proteine ndeplinesc ultimele dou criterii, dar aceti factori nu sunt, desigur, sub
controlul experimentatorului. Schimbarea distanei dintre electrozi pentru o tensiune dat i
alegerea unui domeniu de pH, va schimba n aceeai msur att pH-ul ct i gradienii de
tensiune, astfel nct, cu excepia cazului n care intervalul amfoliilor transportori sau tensiunea
electric aplicat sunt de asemenea, modificai nu au drept consecin o modificare n rezoluie.

APARATURA UTILIZAT N FOCALIZAREA IZOELECTRIC

SEPARAREA PROTEINELOR PRIN ELECTROFOREZA BIDIMENSIONAL PE GEL DE

POLIACRILAMID
Prima dimensiune a 2D PAGE implic separarea proteinelor prin focalizare izoelectric care se realizeaz pe geluri
cilindrice (T=3-5%), turnate n tuburi de sticl capilare (cu diametrul intern de 1-1,5 mm) sau pe stripuri. n mod
uzual, gelurile conin uree 8 M i un detergent neionic sau zwitterionic. Detergentul inclus are de obicei o
concentraie de 2% (mas/volum), aceasta putnd fi adesea redus pn la 0,5% fr a afecta modul de separare.
Gelurile conin de asemenea amfolii sintetici transportori care genereaz gradientul de pH-ul necesar procesului de
separare ntr-o concentraie de 2% (mas/volum). Din acest punct de vedere, sunt disponibili o varietate de amfolii
sintetici, majoritatea acestora fiind potrivii n 2D PAGE.
Adesea este folosit o gam ampl de amfolii (pH 3-10), cu toate c, un amestec de amfolii dintr-un domeniu de
pH=4-8 poate oferi, de multe ori, rezultate excelente dup cum n gelurile cilindrice utilizate n IEF, gradientul final
de pH rareori se poate extinde peste 7,5.
A doua dimensiune poate fi realizat fie pe sisteme orizontale, fie pe sisteme verticale. Pentru set-up-urile orizontale,
de laborator se pot utiliza geluri gata de utilizare ori geluri de poliacrilamid cu SDS (cu o grosime de 0,5 mm
aezate pe un film GelBond PAG) care sunt plasate pe placa de separare cu sistem de rcire a unitii de electroforez
orizontal.
Gelurile de poliacrilamid supuse anterior separrii prin focalizare izoelectric echilibrate, sunt plasate de-a lungul
gelului care va fi utilizat n a doua dimensiune. Scopul echilibrrii gelurilor separate n prim dimensiune prin
focusare izoelectric este cel de a pregti proteinele focalizate pentru transferul lor n a doua dimensiune a gelului de
SDS-PAGE. Aceast operaiune implic incubarea timp de aproximativ 30 minute a gelului folosit la focusare ntr-o
soluie tamponat care conine SDS, uree i glicerol. Aceast operaiune este necesar deoarece proteinele care au
fost iniial separate pe baza sarcinii lor electrice intrinsece trebuie s fie echilibrate cu un detergent anionic care ofer
sarcina electric obligatorii separrii n cea de a doua dimensiune (proteinele focalizate la valorile lor de pI sunt
nencrcate electric) i pentru a asigura ca masa polipeptidic reprezint caracteristica primar a separrii n cea de a
doua dimensiune. Surfactantul anionic SDS este ales n acest scop. SDS formeaz complexe cu proteinele ntr-un
raport de aproximativ 1,4 g SDS/g protein, care supra-acoper sarcina intrinsec a proteinei, acordnd o sarcin
electric net negativ complexelor SDS-protein i dnd astfel polipeptidelor aproximativ aceeai form
hidrodinamic .

Echilibrarea gelurilor supuse focalizrii

izoelectrice n detergent (SDS)

Transferul gelurilor de poliacrilamid

supuse anterior separrii prin focalizare
izoelectric pe suprafaa gelurilor ncrcate
cu SDS n sistem orizontal

Transferul gelurilor de poliacrilamid

supuse anterior separrii prin focalizare
izoelectric pe suprafaa gelurilor ncrcate
cu SDS n sistem orizontal

IZOTACOFOREZA
Izotacoforeza sau electroforeza de dizlocuire, dup cum a fost denumit la un moment dat, este o
dezvoltare mai recent a principiului descris n 1920, fiind o metod de separare n funcie de
sarcina electric. Ea se utilizeaz pentru separarea particulelor care se deosebesc n special prin
ncrctura electric net i nu prin dimensiuni fizice, vitezele de separare ale fraciunilor din
prob, dup ce separarea este complet, cnd s-a atins o stare de echilibru, sunt egale, de unde i
denumirea acestei metode. n aceast tehnic electrolitul dintre cei doi electrozi nu este o singur
soluie uniform, ci este format dintr-o secven discontinu de soluii diferite (figura de mai
jos), n care ionii acestora migreaz cu aceeai vitez (iso = egal, tachos = vitez, phoresis =
migrare).

Izotacoforeza este similar stivuirii, concentrrii n faza staionar sau

electroforezei zonale n sisteme multifazice. n practic, totui se face distincie
ntre aceste metode. Concentrarea n faza staionar se realizeaz n dou moduri:
Concentrarea selectiv (selective stacking) prin care componentul/componentele
de interes sunt incluse n fronul mobil, iar celelalte componente rmn n afara
acestuia (unstacked). Este de altfel cazul izotacoforezei;
Excluderea selectiv (selective unstacking) prin care componentul/componentele
de interes sunt excluse selectiv din frontal mobil, iar celelalte componente sunt
incluse n acesta.

Separarea componentelor printr-un model de tren ionic

Deoarece toi ionii sunt forai s migreze cu aceeai vitez, tria
cmpului electric este mai mare n aria ionilor cu mobilitate mai mic
i este mai redus n domeniul ionilor mai mobili. n timpul acestei
migraii se formeaz zone pure alturate ale probei alctuite din
analii individuali. La echilibru, ionul cu cea mai mare mobilitate
migreaz n front, ceilali migrnd n spatele lui n ordinea scderii
mobilitii:
mL->mA->mB->mTunde m reprezint mobilitatea, L-, simbolizeaz ionul frontal, T-, ionul
terminal, A- i B- fiind ioni din cadrul probei. Zona cu cea mai mare
mobilitate posed cea mai mic trie a cmpului electric, iar zona cu
cea mai mic mobilitate prezint cea mai nalt trie ionic a
cmpului. Produsul triei ionice i a mobilitii fiecrei zone este
astfel constant

ELECTROFOREZA DE AFINITATE

Electroforeza de afinitate, n sens larg, include toate metodele utilizate n biochimie i

biotehnologie n care un anumit tip de interaciune specific are loc ntre un component
din proba supus electroforezei i un alt component prezent n constituia mediului
suport, denumit ligand specific. Cu ceste metode, unele nrudite cu imunoelectroforeza,
altele, cu cromatografia de afinitate, se detecteaz componentele dintr-o prob care
prezint afinitate pentru un ligand, se determin omogenitatea sau heterogenitatea
legrii componentului/componentelor de ligand, modificrile induse de diverse
tratamente i uneori cantitatea de component/componente care leag specific ligandul,
sau se elfectueaz studii cantitative privind formarea complexelor component-ligand (n
spe, protein-ligand).
Ligandul poate fi liber sau imobilizat n mediul suport. Dac masa sa molecular este
foarte mic n raport cu masa molecular a proteinelor int, modificrile electroforetice
vor fi relativ mici sau chiar neglijabile, n special dac i sarcina ligandului este mic
sau zero (de exemplu substratele cu mas molecular mic i inhibitorii enzimatici).
Efectele asupra mobilitii electroforetice vor fi mai evidente dac ligandul i proteinele
int sunt cu mase moleculare relativ apropiate, sau dac ligandul are fie o sarcin
electric mare, fie o structur ramificat, care s permit interaciunea simultan cu mai
multe molecule int de proteine. n aceste cazuri interaciunea se va concretiza printr-o
scdere sau cretere semnificativ a mobilitii electroforetice a proteinelor sau prin
apariia unui precipitat.

Toate aceste posibiliti stau la baza diferitelor metode aparinnd de

electroforeza de afinitate. Cele mai cunoscute metode sunt :
Imunoelectroforeza ncruciat;
Imunoelectroforeza tip rachet;
Imunoelectroforeza zonal;
Electroforeza ncruciat;
Imunoafinoelectroforeza ncruciat;
Afinoelectroforeza bidimensional;
Afinoforeza;
Electroforeza de afinitate propriu-zis (care este asemntoare ca
principiu cromatografiei de afinitate).

Imunoelectroforeza ncruciat. Tehnica a fost pus la punct de ctre Bog-Hansen, n

perioada 1973-1980 i este utilizat la separarea, identificarea i caracterizarea
glicoproteinelor cu ajutorul lectinelor i a anticorpilor specifici.
Metoda are aplicabilitate n cercetare (de exemplu la studiul interaciilor anticorpilor
monoclonali) ori n clinic (n laboratorul de diagnostic al maladiilor n care sunt implicate
glicoproteine anormale).
Afinoelectroforeza bidimensional. Tehnica are la baz acelai principiu ca i
imunoelectroforeza ncruciat, dar spre deosebire de aceasta anticorpii specifici se gsesc
ntr-o membran de nitroceluloz. Metoda se caracterizeaz printr-o rezoluie foarte bun i
este o metod de perspectiv.
Afinoforeza. A fost pus la punct de ctre Shimura i Kasai. Tehnica are la baz
interaciunea dintre un ligand macromelecular solubil cu sarcin electric mare (afinofor) i o
protein. Complexul protein-afinofor se remarc printr-o mobilitate electroforetic
substanial mai mare dect al proteinei libere.
Electroforeza de afinitate propriu-zis. Este analog cromatografiei de afinitate. n aceast
tehnic, ligandul este imobilizat ntr-un gel astfel c proteina int, n cursul electroforezei,
este mpiedicat i astfel ntrziat datorit interaciunii specifice.
Se poate remarca faptul c nu exist o delimitare net ntre variantele asemntoare
imunoelectroforezei i variantele asemntoare cromatografiei de afinitate, deoarece
imobilizarea ligandului, n cazul variantelor cromatografice nu este necesar s fie complet,
mai ales pentru liganzii mari.

ELECTROFOREZA CAPILAR

Electroforeza capilar (capillary electrophoresis, CE), s-a dezvoltat ca tehnic la

sfritul anilor 1980 i a crescut constant n popularitate de atunci. n forma sa cea
mai simpl i mai frecvent utilizat, CE reprezint o ntoarcere la metoda original
descris de Tiselius, dar popularitatea sa nu se bazeaz numai pe aceast
simplitate inerent, ci i cu privire la avantajele suplimentare date de vitez,
versatilitate i costuri reduse. Fiind n esen o metod analitic, ea i-a gsit
aplicabilitatea n separarea biopolimerilor, cum ar fi peptide, proteine,
oligonucleotide, ioni de metale i ioni anorganici, precum i n analiza de
produse farmaceutice ori n monitorizarea calitii apei. Dei metodologia de
baz presupune separarea moleculelor pe baza raportului sarcin electric/mas
molecular, exist simple modificri la procedur, mprumutate de la tehnicile
existente, bine stabilite, care permit separri pe baza dimensiunii sau a punctului
izoelectric, sau care s permit separarea unor molecule fr sarcin electric, n
timp ce gradul de rezoluie poate s conduc la separri de izomeri optici.

Aparatura

Dup cum sugereaz i numele, trstura distinctiv a acestei metode o

reprezint separrile efectuate ntr-un tub capilar (figura de mai jos), a
crei seciune transversal (de obicei de 50 m), are ca scop controlul uor
a temperaturii. Lungimea capilarei difer n fincie de aplicaii diferite, dar
este n mod normal n domeniul de 20-50 cm. Capilarul este umplut cu un
tampon de migrare iar proba este introdus prin injectare la un capt al
coloanei, dup care se aplic un cmp electric (injecie electro-cinetic)
ori se aplicare o presiune de gaz (injecie de presiune). Migrarea prin
capilar este realizat, n mod direct sau indirect, prin aplicarea unui cmp
electric, iar analiii sunt detectai n momentul n care se deplaseaz prin
dreptul unei ferestre situate n captul opus al capilarului.

Schem de principiu a unui aparat de electroforez capilar. Sunt

prezentate prile principale ale instalaiei. Liniile continue indic
condiiile de separare, n timp ce liniile discontinue indic condiiile de
injecie electrocinetice.

METODE DE DETECIE A PROTEINELOR DUP ELECTROFOREZ BIDIMENSIONAL

PE GELURI DE POLIACRILAMID

Cutarea unor metode de a vizualiza proteinele rezolvate prin electroforeza pe

oricare suport, de la benzi de acetat de celuloz la geluri de poliacrilamid
dateaz de la originile electroforezei n sine. Odat cu introducerea discelectroforezei, la nceputul anilor 1960, cea mai frecvent utilizat coloraie a
proteinelor s-a realizat cu amido black. Cum nevoia de metode de colorare cu
sensibilitate nalt i colorare uniform a crescut pentru a satisface cerinele de
cuantificare proteine n geluri, coloraia cu amido negru a devenit improprie.
Colorantul amido black nu are sensibilitate necesar, calitatea variaz de la lot
la lot iar de multe ori proteinele se coloreaz multicromatic
pentru vizualizarea proteinelor separate prin electroforeza pe benzi de acetat de
celuloz, Fazekas St Groth i colaboratorii (1963) au testat sistematic un numar mare de
tehnici standard de colorare utilizate n industria textil convenabili ca poteniali colorani
ai proteinelor dup electroforez. n 1963 ei au introdus n practica electroforetic un
colorant acid, Coomassie Brilliant Blue 250, tradiional utilizat pentru colorarea lnei,
colorant convenabil din punct de vedere al gradului crescut de sensibilitate, a marii
intensiti a culorii i a absorbanei peakului. n anul 1965, Meyer i Lambert au aplicat
cu succes metoda de colorare cu Coomassie Blue descris de St. Groth la detectarea
unor proteine din saliv, separate prin electroforeza pe benzi de gel din acrilamid.
Succesul experimentului de colorare i-a condus pe cercettori n a conchide c
"Commasie Brillant Blue i-ar putea gsi o aplicare n cadrul investigaiilor altor fluide
biologice prin electroforez n gel de poliacrilamid".

Coomassie Brilliant Blue, un colorant anionic trifenilmetanic este utilizat n dou forme:
Coomassie R-250 (de culoare roie) i Coomassie G-250 (de culoare verde), ultimul
avnd dou grupri metil adiionale

n prezena unui mediu acid, aceti colorani se leag de gruprile amino a

proteinelor prin interacii electrostatice i hidrofobe. n protocoalele originale
gelurile sunt plasate pentru o perioad de timp ntr-o soluie de colorare de 0,1%
colorant Coomassie dizolvat ntr-un amestec de metanol, 45% (v/v), ap, 45%
(v/v) i acid acetic 10%; background-ul se decoloreaz ntr-un amestec alctuit din
metanol, 25% (v/v), ap, 65% (v/v) i acid acetic 10%.

ALI COLORANI ORGANICI UTILIZAI N EVIDENIEREA

POSTELECTROFORETIC

Fast Green FCF (food green 3), uor de

utilizat n densitometria cantitativ.

colorarea proteinelor n geluri de

SDS-PAGE
comparabil
ca
sensibilitate cu coloraia CBB:
utilizarea acidului 1-(2-hidroxi-4sulfo-1-naftilazo)-2-hidroxi-3naftoic (acidul calconcarboxilic,
NN).

COLORAIA CU CUPRU
Coloraia reversibil cu cupru este o metod realizat ntr-o singur etap pentru
detectarea rapid a proteinelor fracionate prin SDS-PAGE. n aceast tehnic nu
este necesar o etap de decolorare. Colorarea se bazeaz pe interaciunea ionilor
de cupru cu poliacrilamida i cu proteinele separate. Tehnica de colorare implic
precipitarea ionului de cupru n gel care astfel devine verde opac, n timp ce SDS
previne legarea ionului de cupru la proteine, rezultnd astfel o imagine negativ. n
final se evideniaz benzi clare de proteine pe un fundal semiopac albastru-verzui de
poliacrilamid. Benzile proteice sunt vizualizate n mai putin de 5 minute.
Sensibilitatea coloraiei reversibile este cuprins ntre 0,5ng i 12ng/band proteic.
Colorarea nu interfer cu tehnicile ulterioare de electroeluie a proteinelor i nu
modific proprietile biologice ale acestora. Gelurile colorate reversibil cu ioni de
cupru pot fi decolorate n 20-25 de minute, nainte de transferul sau electroeluia
proteinelor din gel. Un dezavantaj major totui, este c aceast coloraioe nu este
compatibil cu gelurile native
n cazul BSA sensibilitatea metodei ajunge la 0,5-10 ng protein/band, fraciile proteice fiind
vizibile dup o separare pe un gel de poliacrilamid cu T=12%. n cazul gelurilor cu o concentraie
mai mic de 12% sensibilitatea scade din cauza creterii dimensiunilor porilor, cu consecin n
creterea procesului de difuziune a benzilor de proteine.

COLORAIA NEGATIV IMIDAZOL-SDS-ZINC

Un complex al srii de zinc, al SDS i imidazolului precipit n gelul de

poliacrilamid i formeaz un background alb opac, dar care rmne
solubil n prezena spotului proteic. Zonele proteice devin vizibile ca un
background nchis la culoare. Sensibilitatea deteciei (care este de ordinul
a ctorva nanograme) este cuprins ntre cea a CBB i coloraia cu argint.

Evidenierea fosvitinei dup colorare reversibil

cu imidazol-zinc

COLORAIA CU ARGINT
Detecia proteinelor prin coloraie cu argint este larg utilizat deoarece
sensibilitatea ei este de aproximativ 1 ng per spot, costurile pentru reactivi
sunt relativ sczute, i-dei presupune o procedur multistadial-rezultatele
sunt disponibile relativ repede. Ideal spoturile sunt brun-nchise spre negru pe
un background uor bej.

Principiul protocolului de colorare cu azotat de argint este urmtorul: n prima etap

proteinele sunt fixate; SDS-ul i componentele tamponului sunt ndeprtate prin
splare cu o soluie de etanol, 40% i acid acetic, 10%. Urmtoarea treapt combin
legarea ncruciat a proteinelor din matricea de gel cu ajutorul glutardialdehidei i de
sensibilizare cu tiosulfat de sodiu n prezen de acetat de sodiu. Dup un numr de
splri cu ap distilat la intervale exacte de timp, gelul se plaseaz ntr-o soluie
care conine azotat de argint 0,25% i o cantitate mic de formaldehid. Dezvoltarea
se realizeaz cu formaldehid la o valoare bazic de pH, care se realizeaz cu
ajutorul carbonatului de sodiu. Reacia este stopat prin plasarea gelului ntr-o soluie
de acid acetic, 5% ori ntr-o soluie de EDTA 1,5%.

Coloratia argentica (silver staining)

De 100 X mai sensibila decat coloratia cu
coloranti organici
Metoda simpla, ieftina
Reducerea fotochimica
Argint amoniacal

Metoda ce adimite supracolorarea gelurilor

colorate initial cu CBB

Fosfoproteinele
Colorare in rosu a proteinelor sub actiunea bromurii de
1 etil 2,3 (1 eilnafto-(1,2d) tiazolin-2-iliden)2-metilpropenil-nafto-(1,2d)-tiazol denumit colorant total
Fosfoproteinele se coloreaza in albastru

Lipoproteinele
Precolorare cu Sudan Black

Glicoproteinele
Colorare cu sulfit de fucsina (reactiv Shiff) in conditii oxidante realizate cu
acid periodic;
Colorare argentica
Colorare cu Alcian blue (glicoproteinele acide)
Colorare cu izocianat de fluoresceina (FTIC)- lectinebenzi fluorescente

COLORAIA FLUORESCENT

Coloranii fluoresceni prezint un mare domeniu de linearitate

dinamic, de peste 4 ori magnitudine fa de coloraiile clasice, cu
rezultate nalt reproductibile deoarece coloraia fluorescent este o
metod de tip endpoint. De la introducerea colorrii cu Nile Red n
ultimii ani, au fost dezvoltai o varietate de colorani cu diverse i
marcante sensibiliti i proprieti, precum familia coloranilor
Sypro (Orange, Red, Tangerine i Ruby)

Structura chimic a colorantului hidrofob

Nile red.

PREMARCAREA PROTEINELOR CU FLUOROFORI

Electrotrensferul proteinelor pe
membrana (western blotting)evidentierea specifica

Hrtia diazobenziloximetilat s

ce luloz
O
CH2

+
N N]

Nitrocellulose

PVDF (polyvinylidene difluoride)

Tipuri de membrane utilizate n

transferul de proteine

Protein transfer systems

 Proteins migrate to the membrane

following a current (I) that is generated by
applying a voltage (V) across the
electrodes, following Ohms law:
V=IxR
where R is the resistance generated by
the materials placed between the
electrodes (that is, the transfer buffer, gel,
membrane, and filter papers)

METODE DE DETECIE A PROTEINELOR PE MEMBRAN DUP TRANSFER

ELECTROFORETIC
Transferul proteinelor pe membran (denumit western blotting) reprezint o tehnic de rutin,
deosebit de utilizat n detectarea i caracterizarea proteinelor. Metoda prezint avantajul
specificitii anticorpilor care conduc la identificarea fr dubii a proteinelor dup separarea lor
prin electroforez pe gel de poliacrilamid i transferate pe o membran. Western blotting-ul
implic recunoaterea secvenial dintre trei componente: proteina int, anticorpul primar
care recunoate proteina int i un anticorp secundar care recunoate anticorpul primar i
genereaz un semnal detectabil. Dup legarea proteinelor la o membran, situsurile nelegate
sunt inactivate (membrana este blocat), incubat cu un anticorp primar, apoi cu un anticorp
secundar i n final, splat. Anticorpul primar se leag la proteina de interes n timp ce anticorpul
secundar este pregtit pentru detecie.
Anticorpul secundar poate fi marcat cu un radioizotop, un fluorofor, sau cu o enzim, n marea
majoritate peroxidaza din hrean (horseradish peroxidase- HRP) sau fosfataza alcalin (AP)
O lung perioad de timp, radioizotopii au reprezentat singura cale de marcare a probelor de
anticorpi secundari i astfel utilizai n aplicaiile de transfer ale proteinelor. Ultimii ani au
dezvluit noi metode mai puim periculoase i mai fezabile dect cele radioactive, care conduc la
rezultate comparabile n ceea ce privete sensibilitatea lor. Tehnicile curente de detecie dup
transfer pe membran includ metode bazate pe detecia emisiei de lumin (chemiluminiscen,
bioluminescen, chemifluorescen i fluorescen), detecie prin autoradiografie, ori
colorimetrie.

Detecia prin chemoluminiscen

Chemiluminescena reprezint producerea unei cuante de
lumin detectabil rezultat n urma unei reacii chimice. n
detecia pe membrane de transfer, reaciile sunt catalizate de
ctre o enzim precum fosfataza alcalin ori peroxidaza
conjugat cu un anticorp. Semnalul luminos poate fi
capturat prim impresionarea unui film de tipul celor
utilizate la captura radiaiilor X sau de ctre sisteme video
de captare a imaginilor. Beneficiile detectrii semnalelor
chemiluminescente de ctre un sistem de preluare a
imaginilor sunt numeroase. Astfel, domeniul de linearitate
dinamic a sistemelor video este de 2 pn la 5 ori
magnitudine mai sensibile comparativ cu sistemele de
impresionare a filmului fotografic. Aceste sisteme video
digitale de preluare a imaginii ofer pe lng o sensibilitate
crescut i o economicitate n sensul eliminrii
achiziionrii continue de film ori consumabile de
prelucrare al acestuia. Tehnica chemiluminescent este uor
de adaptat la procedurile de western blotting existente
deoarece utilizeaz anticorpi conjugai cu enzim, pentru a
genera semnalul luminos. Treptele de blocare i splare sunt
comune celor utilizate n n tehnicile de western blotting.
Cele mai multe metode chemiluminescente necesit puine
componente necesare n generarea semnalului luminos. n
cazul chemiluminescenei luminolului, substratul este
oxidat chimic de ctre HRP cu producia unui compus aflat
n stare excitat.

n cele mai multe metode bazate pe oxidarea luminolului, semnalul luminos se produce n
momentul n care produsul excitat se ntoarce la starea sa de baz. Semnalul este vizualizat prin
expunerea membranei pe un film foto sau prin utilizarea sistemelor de achiziie a imaginii. Pe
lng luminol sunt, disponibile comercial i alte substrate chemiluminescent precum substratele
bazate pe acridan (este cazul Lumigen PS-3 (care utilizeaz AP sau HRP ca enzim reporter) ori
substraturi pe baz de 1-2-dioxetan (care utilizeaz AP ca enzim reporter) Emisia de lumin
poate fi crescut de pn la 1000 de ori prin adugarea unor amplificatori cu structur fenolic.
Amplificatorul difer de tipul de kit utilizat. Detecia chemiluminescent prezint ca avantaje,
viteza i sensibilitatea. Timpul mediu de expunere de 30 secunde pn la 15 minute. Timpul scurt
este principala mbuntire fa de metoda bazat pe detecia cu 125I, care necesit pn la 48 de
ore de expunere pe film foto. Prin aceast metod se pot detecta cantiti de ordinul picogramelor
de protein mai sensibile dect majoritatea metodelor colorimetrice i sunt aproximativ egale cu
cele radioizotopice. Este important a se nota c sensibilitatea deteciei este oarecun dependent de
afinitatea antigenului i a anticorpilor primar i secundar care poate varia considerabil de la o
prob proteic la alta. Detecia chemiluminescent nu prezint n plus dezavantajul celei
radioizotopice n ceea ce prezint riscul de expunere la iradiere, costul crescut n ceeea ce
privete msurile de protecie fa de reziduurile radioactive n ceea ce privete contaminarea
mediului. Nu n ultimul rnd, membranele utilizate n cazul metodelor chemiluminescente pot fi
utilizate de mai multe ori prin splare i rebandarea proteinelor, proces care nu este posibil n
cazul tehnicilor de detecie colorimetrice.

Detecia prin bioluminescen

Bioluminescena este un fenomen de emisie de lumin de ctre multe organisme. Sistemele

bioluminescente difer n structura i funcia enzimelor i cofactorilor implicai n proces
alturi de mecanismul reaciilor de generare a luminii. Bioluminescena poate fi exploatat ca
metod de detecie pe membrane. Detecia prin bioluminescen implic incubarea membranei
care conine un antigen legat/complex anticorp-enzim n prezena unui substrat
bioluminogenic, cu msurarea simultan a luminii emise. Substratul n acest sistem de detecie
este un derivat al luciferinei. Detecia luminii este realizat ntr-o camer fotoevideniere iar
proteinele sunt vizualizate ca spoturi luminoase. Din punct de vedere al sensibilitii i a
vitezei de realizare, tehnica este similar celei de chemiluminescen dar nu este generalizat
datorit numrului mic de substrate bioluminogenice comercializate. Membrana PVDF este
preferabil n detecia bioluminescent deoarece membrana de nitroceluloz poate conine
substane ce inhib activitatea luciferazic i astfel sunt posibile interferene n analiz.

Detecia chemifluorescent

Chemifluorescena reprezint a conversie enzimatic a unui substrat

ntr-un produs fluorescent. Compuii fluorogenici (substane
nonfluorescente sau slab fluorescente care pot fi convertite n produi
fluoresceni) sunt utilizai cu o mare varietate de enzime, inclusiv cu
AP ori HRP. Enzima cliveaz o grupare fosfat a unui substrat
fluorogenic cu producerea unui compus nalt fluorescent. Fluorescena
poate fi detectat prin utilizarea unui sistem de preluare a imaginii
astfel, cuantificat de ctre un program. Chemifluorescena poate
conduce la produi de reacie fluoresceni stabili, astfel membranele pot
fi analizate n condiiiile de timp convenabile. Metoda este compatibil
pentru recolorri i splri.

Detecia prin fluorescen

n cazul deteciei fluorescente, anticorpul secundar este marcat cu un fluorofor

precum fluorescein (FITC), Texas Red, rhodamine (TRITC), ori R-phycoerythrin.
Principalul avantaj n detecia fluorescenei este faptul c domeniul dinamic linear
este de circa 10 ori mai mare dect n detecia prin chemiluminescen cu o
reducere a sensibilitii de numai 24 ori. Detecia fluorescent a proteinelor
legate de membrane poate conduce uneori la o mai bun linearitate i la
cuantificri mai bune n limitele de detecie. Detecia fluorescent poate fi
deasemenea multiplex. Legarea mai multor fluorofori colorai la diveri antigeni
conduce la detecia simultan a mai multor proteine int pe aceeai membran.

Autoradiografia

Pentru multe aplicaii radioizotopii pot fi utilizai pentru a marca probele

(n cazul membranelor rezultate din transfer este vorba de anticorpul
secundar) Radioizotopii cei mai utilizai n tiinele biologice sunt 35S,
32P, 33P, 14C, i 125I. Pentru a detecta radioactivitea, metoda cea mai
utilizat este autoradiografia pe filme de radiaii X. Autoradiografia
conduce la o relaie bun ntre sensibilitate i rezoluie fr o investiie
mare. Pentru intensificarea semnalului autoradiografic se utilizeaz
scintilatori. Exist sisteme de analiz a fosforului care ofer o alternativ
la metodele de detecie pe film. Marele avantaj al metodei const ntr-o
relaie linear ntre intensitatea semnalului i cantitatea de protein.

Detecia colorimetric

O serie de substrate sunt convertite la un precipitat colorat de ctre o

serie de enzime precum HRP ori AP, enzime uzual conjugate la
anticorpul secondar. Cele mai comune sisteme utilizeaz substraturi
precum 5-bromo-4- chloro-3-indolil fosfat/Nitroblue Tetrazoliu
(BCIP/NBT) pentru AP ori diaminobenzidina (DAB) sau 4-cloro-1naftol (4CN) pentru HRP. n momentul acumulrii de precipitat pe
band, se dezvolt un semnal colorat pe membran. Reacia enzimatic
poate fi monitorizat i stopat n condiiile n care semnalul are o
intensitate dorit pentru a preveni zgomotele de fond. Metoda este cea
mai simpl dintre toate tehnicile de evideniere, semnalul detectabil fiind
rodul legrii anticorpului secundar la un anticorp specific proteinei de
interes

Metode de detecie a proteinelor

dup transferul pe membran
Comparaie ntre metodele de detecie a proteinelor dup transfer pe membran

DETECTAREA ENZIMELOR N GELURI

Detectarea activitilor enzimatice dup electroforez n gel i stabilirea exact a benzilor
individuale proteice produse astfel datorit activitii catalitice specifice rmne o int
fascinant. Acest lucru a fost bine evideniat de numrul mare de studii focusate n acest scop. Cu
o vedere spre trecut este interesant de observat legturile intime dintre metodele de evideniere
postelectroforetice de cele histochimice din care, majoritatea metodelor de evideniere au
provenit. n acelai timp, noi enzime continu s fie descoperite, de unde noi probleme n
evidenierea lor postelectroforetic.
Singurele probleme sunt ntmpinate din cauza faptului c activitatea enzimatic trebuie
demonstrat dup rezolvarea gelului. Separarea proteinelor native care i menin activitatea
nativ n timpul procesului electroforetic este una din metodele posibile. Alternativ, separarea
poate fi realizat n condiii denaturante de exemplu n prezena dodecilsulfat de sodiu (SDS),
urmat de renaturarea n scopul recuperrii activitii enzimatice maxime. n orice instan,
activitatea poate fi determinat direct pe gel ori dup transfer pe un suport potrivit. Alegerea
tehnicii electroforetice specifice va depinde de proprietile individuale ale enzimelor, de ali
componeni ale probei ori de rezoluia maxim atins n condiii native deoarece proteinele native
nu pot fi la fel de bine rezolvate precum cele denaturate.
Astzi, detecia activitilor enzimatice sunt n mod uzual realizate pe geluri plate verticale, mai
mult dect pe geluri cilindrice. Compararea proprietilor de migrare este mai uor realizat i
este de preferat n condiii identice, fa de cele realizate n condiiile gelurilor cilindrice. Pe de
alt parte, acoperirea cu tampon-substrat care conine enzime auxiliare, substrat, coenzime, ori
ali cofactori necesari poate fi produs maxim numai n cazul gelurilor plate, factori de asemenea
importani n detectarea activitii. Alternativ, transferul pe alte membrane poate reprezenta o alt
alternativ n evidenierea postelectroforetic a activitilor enzimatice.

Separarea electroforetic a protein-enzimelor poate fi nsoit de dou trsturi diferite.

Este vorba de sarcina intrinsec a proteinei, proprietate ce poate fi utiliza n procesul de
migrare electroforetic, sau de sarcina extrinsec, care poate fi indus.
Separarea pe baza sarcinii intrinseci, n electrolii cu o singur valoare a pH-ului ori
prin focusare izoelectric reprezint alegeri atractive din cauza faptului c astfel se menine
proteina n starea ei nativ, cu pstrarea activitii, ce poate n acest mod determinat direct.
Electrofocusarea este n particular utilizat deoarece prin ea se rezolv izoforme apropiate.
Separarea bazat pe sarcinile extrinseci are la baz denaturarea i legarea SDS la
situsurile hidrofobe ale proteinei. Pornind de la aceasta, treapta de maturare este necesar dup
electroforez.
Electroforeza n prezen de SDS reprezint una dintre cele mai comune forme de electroforez
n gel. Ea se bazeaz pe separarea n funcie de mrimea proteinei la care domeniile hidrofobe
ale fiecrei molecule proteice interacioneaz cu catena alifatic a SDS, care sunt repartizate ca
sarcini extrinseci pe ntreaga suprafa a proteinei. Din nefericire, cele mai multe enzime sunt
inactivate de ctre SDS, numai un numr restrns reinnd activitatea chiar n prezena
detergentului.

PREPARAREA PROBEI I ELECTROFOREZA EI

naintea oricrei separri i localizri este necesar a cunoate proprietile enzimei luate n studiu,
precum pH-ul optim, necesitile n cofactori, inclusiv a cationilor i a cosubstratelor. Detergenii,
agenii de oxidare sau ali factori detrimentali care pot influena activitatea enzimatic precum
pH-ul i mediul ionic trebuie monitorizai cu strictee, att n timpul preparrii probei ct i n
timpul procesului electroforetic. Ieste bine de notat c prezena coloranilor de evideniere a
migrrii pot ei nsui s denatureze ireversibil o serie de enzime. naintea electroforezei este
esenial a se determina concentraia proteic i a se efectua un test convenabil al activitii
enzimatice. O cantitate de 1 pn la 10 g de protein pur reprezint optimul n timp ce
amestecurile de proteine pot conine pn la 100 g. Este important a alege o cantitate optim de
soluie proteic care s prezinte o activitate bine-decelat n urma procesului de evideniere
postelectroforetic, o cantitate prea mic fcnd dificil identificarea enzimei n timp ce o
ncrcare mare va conduce la suprapunerea benzilor i la o distorsiune a lor. Electrofocusarea este
pe departe mult mai sensibil la suprancrcare, dup cum proteina va distorsiona n gradientul de
pH.

n condiiile n care toate informaiile pertinente sunt obinute, este necesar un

experiment pilot n determinarea activitii enzimatice. n acest scop, este preparat un
gel care conine toate componentele necesare n timpul procesului de separare
electroforetic. Proba este plasat ntr-un godeu i lsat s difuzeze n matricea
gelului, fr migrare electroforetic. Metoda de detecie este astfel testat fr separare
electroforetic, n scopul stabilirii prezenei sau absenei agenilor denaturani ori a
inhibitorilor n gel. Dac testele preliminarii relev o inactivare a enzimei, trebuie
aleas i testat o alt strategie de evideniere n scopul meninerii activitii
enzimatice n timpul procesului electroforetic.
Cele mai comune i nedorite componente inhibitorii ale gelului de poliacrilamid sunt
iniiatorii reaciei de polimerizare, persulfatul i riboflavina, monomerul de acrilamid
nepolimerizat i acidul acrilic, deseori prezent n amestecul de polimerizare. Exist o
serie de ci n limitarea a efectului acestor componente. De exemplu, pre-electroforeza
gelului de separare, singur, naintea polimerizrii gelului de concentrare va elimina
iniiatorii reaciei de polimerizare care au capacitatea de a oxida gruprile tiol deseori
implicate n actul catalitic. O alt tehnic este aceea de a aduga acid cisteic la
tamponul de migrare, care va "cura" gelul de peroxizi datorit faptului c acest acid
va migra alturi de ionul lider, conductor. Alternativ, gelurile subiri (de 1 mm sau
mai mici) pot fi imersate i umectate ntr-un tampon care conine ditiotreitol n scopul
ndeprtrii oxidanilor. Eliminarea acidului acrilic poate fi realizat prin
recristalizarea monomerului de acrilamid chiar naintea polimerizrii.

PRINCIPIILE LOCALIZRII IN SITUA

ENZIMELOR

Captura simultan a produsului reaciei enzimatice. Produsul reaciei este cuplat cu un

reactiv care conduce la obinerea unui produs colorat. Aceast tehnic este utilizat n toate
cazurile n care enzima rmne activ n prezena reactivilor de colorare. Marele ei avantaj este
reprezentat de faptul c procedura este realizat ntr-o singur treapt, fr o difuzie
substanial a enzimei n gel.
Postincubarea cuplat a substratului. Aceast tehnic necesit o metodologie n dou trepte.
Incubarea enzimei prezente n gel cu substratul este urmat de incubarea cu un reactiv ce
permite formarea unui produs secundar colorat i insolubil. n cazul acesta, difuziunea se
manifest n timpul perioadei iniiale de incubare a gelului cu substratul.
Metode autocromice. Evoluia activitii enzimatice poate fi urmrit n mod direct prin
observarea modificrilor proprietilor optice precum absorbia luminii sau fluorescena, produs
de substrat sau de ctre produsul de reacie. O serie de substrate sau coenzime i modific
proprietile optice n lumin vizibil sau ultra violet n timpul reaciei enzimatice. Schimbarea
fluorescenei servete de asemenea ca indicator n cazul metodelor autocrome.
Analiza indicator-matrice. Enzimele de cuplare auxiliare i substratele cu mas molecular
mare necesit o incubare a gelului cu un strat care conine o matrice indicatoare, un gel
suplimentar, indicator. Incubarea de tip sandwich a gelului de separare i indicator conduce la
localizarea activitii enzimatice. O variant a acestei tehnici o reprezint incubarea dup
separare cu o matri pe care proteina a fost transferat i imobilizat. Astfel, dup separare,
proteina este transferat din gel pe membran prin tehnicile descrise ca Western blotting.
Copolimerizarea substratului n gelul de separare. Substraturile cu mas molecular mare
precum polimerii carbohidrai, proteinele sau acizii nucleici pot fi copolimerizai n gelul de
separare. Acest procedeu poate totui influena separarea enzimei. n timpul electroforezei,
activitatea enzimatic poate fi stopat prevenindu-se astfel aciunea ei asupra substratului, de
exemplu prin utilizarea unor inhibitori reversibili precum SDS. Dup separare, gelul este splat n
tampon fr detergent, ceea ce conduce la renaturarea sa. O alt cale de prevenire a activrii
enzimei n timpul procesului de electroforez este reprezentat de incubarea cu diveri ageni
chelatori care leag ionii metalici eseniali. Dup finalizarea procesului de separare gelul este
incubat n tampon care conine cationul esenial ntr-o concentraie mai mare dect cea a
agentului chelator, i prin aceasta se restabilete activitatea.

Oxidoreductaze- Detecia direct a enzimelor

NAD- i NADP-dependente prin conversia
coloranilor tetrazolici la formazani
Aplicarea cu succes a acestei metode necesit ca sensul reaciei enzimatice s
conduc la oxidarea substratului cu reducerea concomitent a coenzimei
(formarea de NADH ori NADPH) Echivalenii de reducere sunt apoi transferai
spre colorantul tetrazolic, reacie de cele mai multe ori mediat de fenazin
metosulfat; astfel prin reducerea srii de tetrazoliu rezult formazan, colorat i
insolubil. Stoichiometria transferului necesit un echivalent de reducere la o
pereche de electroni transferai pentru formarea unui formazan din srurile
monotetrazolice i doi echivaleni pentru srurile ditetrazolice. Astfel, srurile
monotetrazolice precum MTT (bromur de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazoliu, tiazolil blue) sunt mult mai sensibile dect srurile de srurile
de ditetrazoliu. De exemplu, NBT (clorura de 2,2'-di -p-nitrofenil-5,5'-difenil-3,3'(3,3'-dimetoxi-4,4'-difenilen) tetrazoliu, n condiiile reducerii incomplete,
conduce la un formazan de culoare roie, n timp ce forma total redus este
albastr.

N
N+
CH3

CH3OSO3

Structura fenazin metosulfatului (N-Metilfenazin metilsulfat).

Compusul are rolul de a cupla transferul de electroni dinspre
NAD(P)H spre srurile de tetrazoliu, fcnd astfel posibil
urmrirea reducerii NAD(P)+.
Exemplu: -Glicerofosfat Dehidrogenaza
Amestecul de reacie, 50 ml, este astfel preparat s conin 25 mg de NAD+, 15 mg de
clorur de nitroblue tetrazoliu (NBT), 1 mg de fenazin metosulfat (PMS), 5 ml de glicerofosfat sare de sodiu, 1 M, pH 7,0 i 10 ml de tampon Tris-HCI 0,2 M, pH 8,0. Gelul,
care conine enzima, se incubeaz la 37C pn cnd apar benzile albastre. Gelul se cltete
cu ap, apoi se fixeaz ntr-un amestec etanol/acid acetic/glicerol/ap (5:2:1:4).
Este necesar a se utiliza un control pentru a arta dependena culorii de substrat i nu ca
efect al reducerii datorate luminii ori a oxidrii produse de oxigen.

Formulele generale ale srurilor de mono- (A) i di-tetrazoliu (B)

Evidenierea alcool
dehidrogenazei, EC 1.1.1.1
un alcool + NAD+ <=>
o aldehid sau o
ceton + NADH+H+
NAD+, 1 mg/ml,
PMS, 0,02 mg/ml,
Nitro blue tetrazoliu,
0.2 mg/ml,
Etanol, 0.1 M

Detecia enzimelor NAD- i NADP-dependente prin iluminare UV

Piridin nucleotidele sub form redus sunt vizibile direct n lumin UV ca i

fluorescen galben n timp ce formele lor oxidate apar ca benzi negre. Fa de
metodologia descris mai sus, aceast tehnic poate fi aplicat la identificarea
att a formelor reduse ct i a formelor oxidate de substrat. O alt nsuire
utilizabil a metodei const n capacitatea ca de a detecta benzile fr
dehidrogenaze, adic a formrii de NADH n absena substratului, astfel
eliminndu-se coloraiile fals-pozitive. Un dezavantaj al acestei tehnici este
reprezentat de difuzia continu a substratului n timpul perioadei de incubare i
de necesitatea fotografierii n timpul evoluiei reaciei.

Oxidoreductazele piridin nucleotid-independente

Tirozinaza prezent n celulele mamiferelor , o enzim care
reine activitatea chiar i n prezen de SDS, poate fi dat ca
exemplu. Chiar dac procedeul prezentat include ca treapt n
de
evideniere
ndeprtarea
SDS
dup
separarea
electroforetic, ea nu este neaprat necesar n cazul unei
probe care conine o activitate foarte activ. Enzima
catalizeaz oxidarea L-tirozinei la L-Dopa (3,4-dihiroxi
fenilalanin) i n continuare la dopaquinon. Dopaquinona se
convertete spontan n dopacrom, un produs maro-nchis. Cum
prima treapt de oxidare este foarte lent, metoda descris
utilizeaz Dopa ca substrat

Transferazele
Reaciile de transfer ale gruprilor metil, glicozil, ori fosfat de la un donor spre un acceptor sunt
catalizate de ctre transferaze. Denumirea generic a acestor enzime este de "donor:acceptor grup
transferaze." Sunt unele cazuri unde donorii sunt ATP ori CoA, care conin grupri (fosfat
respectiv acil) ce pot fi transferate. n mod curent, detecia transferazelor implic participarea
unor enzime auxiliare. De exemplu, pentru identificarea hexokinazei (ATP:glucozo
fosfotransferaza) enzima este incubat la nceput cu glucoz, ATP, i Mg2+ pentru a produce
glucoz-6-fosfat. Formarea glucozo-6-fosfatului este cuplat cu glucozo-6-fosfat dehidrogenaza,
o enzim NADP-dependent. Astfel, formarea de NADPH este detectat printr-o metod descris
n cazul oxidoreductazelor precum transferul de echivaleni dinspre NADPH spre PMS i n final
spre sarea de tetrazoliu cu producerea unui formazan. Utilizarea enzimelor auxiliare se realizeaz
n mod curent i prin tehnica de acoperire a gelului cu o hrtie sau agar, ntr-o incubare de tip
sandwich. Alternativ, transferul produilor de electroforez pe un alt suport precum membranele
de nitroceluloz este urmat de detectarea activitii enzimatice pe membrane. Trebuie avut ns
n vedere c enzimele auxiliare necesit condiii specifice care trebuiesc asigurate pentru a avea
activitate catalitic.
L-Alanina + -cetoglutarat
L-glutamat + APAD+
PMS
APADH + MTT

piruvat + L-glutamat
-cetoglutarat + APADH + NH3

APAD+ + MTT-formazan

APAD-Un analog al NAD, 3-acetilpiridin

adenin dinucleotid
Tehnicile cu gel indicator i de transfer pe membrane

Hidrolazele

n general, hidrolazele sunt cele mai stabile enzime dintre toate clasele sus
menionate. Substraturile cromogene pentru multe dintre ele sunt
disponibile comercial, evoluia reacieie putnd fi monitorizat direct, n
lumin vizibil, ori n UV. Substraturile sau produii care-i schimb
proprietile fluorescente sunt deasemenea larg utilizai datorit tehnicilor
de mare sensibilitate. Hidrolazele pot fi deasemenea localizate prim
metode de cuplare cu derivai azoici, n care substratul hidrolizat
reacioneaz cu sruri de diazoniu, precum Fast Red TR ori Fast Blue
RR.

CENTRIFUGAREA

Separarea amestecurilor eterogene sub influena forei centrifuge care apare

cnd n amestec se realizeaz viteze de rotaie mari, poart denumirea de
separare centrifugal sau centrifugare.
Centrifugarea este o metod foarte rspndit n aproape toate
subramurile industriei alimentare. Utilajele utilizate pentru separarea sub efectul
forei centrifuge poart denumirea de centrifuge, acestea fiind caracterizate prin
elemente n micare la turaie mare.
Materialele din care se construiesc centrifugele trebuie s satisfac
cerinele impuse de evitarea coroziunii, de pstrare a calitilor lichidului i de
rezisten admisibil. Sub aspectul separrii eterogene, efectele forei centrifuge
i a celei gravitaionale sunt aceleai, deosebirea const n faptul c, intensitatea
cmpului centrifugal poate fi modificat prin modificarea turaiei i a distanei fa
de axul de rotaie.

Separarea amestecurilor eterogene

sub influena forei centrifuge
Separarea amestecurilor eterogene sub influena forei centrifuge, se realizeaz pe
dou principii:
1) Sedimentare, cnd separarea sub influena forei centrifuge se realizeaz pe baz
de diferen de sedimentare, prin stratificarea componenilor. Se aplic amestecurilor
eterogene lichid-lichid, solid-lichid, solid-solid, solid-gaz. Separarea centrifugal pe
principiul sedimentrii, poart uneori denumiri speciale: limpezire) eliminarea
impuritilor solide dintr-un lichid), concentrare (concentrarea particulelor solide dintrun amestec solid-lichid ), etc.
Sedimentarea sub influena forei centrifuge se realizeaz n dou faze:
depunerea fazei cu viteza de sedimentare sau cu densitatea mai mare, care se
supune legilor hidrodinamicii n cazul sedimentelor solide;
tasarea sedimentului, care se supune legilor mecanicii solului.
Sedimentarea
sub influena forei centrifuge se deosebete de sedimentarea sub influena forei
gravitaionale prin faptul c se realizeaz sub influena acceleraiei centrifugale.
Centrifugarea se folosete pentru accelerarea sedimentrii, pentru amplificarea vitezei
de filtrare i eliminarea fazei lichide dintr-un solid n stare de granule. Se pot realiza
umiditi minime de 3-10%.

Viteza de sedimentare n cmpul gravitaional este dat de legea lui Stokes:

1
g d 1 2
2 1 2
wg d

18
2

18 2
2

unde:
wg- viteza de sedimentare n cmp gravitaional;
d diametrul particulelor care sedimenteaz;
1- densitatea particulelor;
2- densitatea lichidului;
g acceleraia gravitaional
- vscozitatea cinematic a lichidului

Viteza de sedimentare n cmpul gravitaional depinde de mrimea

particulelor care sedimenteaz i de constantele fizice (1,2, ) ale sistemului
dispers. Rezult c viteza de sedimentare nu poate fi schimbat dect prin
schimbarea proprietilor sistemului, de exemplu prin mrirea particulelor
(coagulare) sau prin micorarea vscozitii (nclzire). O alt posibilitate de
mrire a vitezei de sedimentare este de a lucra ntr-un cmp de fore
caracterizat printr-o acceleraie mai mare dect cea gravitaional, ceea ce se
poate realiza prin centrifugare.
ntr-o centrifug viteza de sedimentare nu este constant din cauza cmpului
neomogen a crui intensitate crete cu distana de la centru.
Durata de sedimentare, adic timpul necesar ca particula cu diametrul d s
parcurg un strat de lichid egal cu ( R2-R1) se deduce cu ajutorul vitezei medii:

w0,c

1 2 1 2 w R
w R
d

w0, g
w0, g z
18
2

g
2

Efectele sedimentrii ntr-un cmp de fore centrifuge sunt:

viteze mari de sedimentare;
sedimentarea particulelor mai fine, adic o separare mai
naintat a celor dou faze din care este format sistemul dispers;
separarea sistemelor disperse cu diferen mic ntre densitile
1 i 2 ale celor dou faze.

Ultracentrifugarea zonala
Svedberg- separarea particulelor in cmp
centrifugal
Intensit cp. Centrifugal
a = x2 x=pozitia radiala
=viteza unghiulara
= 2
a = x (2)2
a = x2 / g

F = mex2
me= m-ms
Fef = mx2 - msx2
Vp=volum particula de masa m
p= densitatea particulei
l = densitatea lichidului

ms=Vp p
Fef = mx2 - m(l / p) x2
s = v / a = dx/dt/x2
Unitate svedberd 1s = 10-13sec
s = so / (1 + kc)
so = val. Coef. la conc. = 0

sRT
M=
l
D(1- )
p

Factorii care influenteaza

sedimentarea particulelor
Raza particulei
Vscozitatea
Densitatea mediului