Curs I : Introducere in studiul microbiologiei medicale

Thursday, October 04, 2012

12:26 PM

Este stiinta care se ocupa cu studiul bacteriilor si microorganismelor.

Microbiologia :
Bacteriologia
Virusologia
Parazitologia

Rolul pozitiv al microorganismelor

Productia de oxgen
Circulatia biologica a materiei in natura
In medicina in inginerie genetica :
Hormoni de crestere
Insulina
Interferon

Rolul negativ al microorganismelor

Microflora indigena :
Neoplazii
Imunosupresiile

Microbiologia medicala

Morfologia agentilor microbieni infectiosi

Relatia cu organismul uman

Microorganismele reprezinta primele forme de viata si sunt organisme unicelulare.

Curs Page 1
Curs II: Morfologie bacteriana
Friday, October 12, 2012
2:16 PM

Forma si imensiunile celulelor bacteriene

Curs Page 2
Curs III: Fiziologia celulei bacteriene
Friday, October 19, 2012
2:02 PM

A. Compozitia chimica a bacteriilor

Cuprinde in jur de 20 de elemente ale sistemului periodic :

Elemente de baza : H, C, O, P, S - cu rol primordial structural si energetic pentru orice celula vie
Elemente sub forma ionizanta ( <1%) : K, Mg, Na, Cl, Ca
-cu rol functional in procesele de activare enzimatica, permeabilizarea membranei , etc...
Oligoelementele : Mn, Fe, Co, Cu, aflate in cantitati foarte reduse - intra in structura unor
coenzime , necesare desfasirarii metabolisului
Continutul in apa : 85% din masa celulara, ce transporta, solubilizeaza electrolitii , eprezinta
mediul in care au loc reactiile metabolice.

1. Apa : 75-85% din greutatea umeda (40% la spori )

i. Apa libera
ii. Apa egata fizico-chmic de alte elemente

2. Substante minerale
i. 2-30% din greutatea uscata a bacteriei
ii. p, K, na, S, Cl, Fe, oligoelemente, Cu, Mg, Zn
iii. Proportia lor variaza cu:
Specia
Varsta culturii
Compozitia chimica a mediului

Roluri

Intra in compozitia diferitelor strucuri si enzime, rol important in viata celulei

3. Elementele chimice constructive ale celulei bacteriene
Regleaza presiunea osmotica
Favorizeaza schimburile cu mediul
Reglarea pH
Potential redox
Pot stimula cresterea si metabolismul bacterian ( ex. Fierul simuleaza producerea
toxinei difterice )
4. Substantele organice : glucide, proteine, lipide, pigmenti , enzime , substante antibiotice,
vitamine
i. Glucidele
10-25% din greutatea uscata a bacteriei
Variaza cu:
Specia
Varsta
Conditiile de dezvoltare
Glucide simple ( mono si dizaharidele)
Au rol in metabolism
Polizaharidele.
Simple -- intra in metabolismul intermediar
Complexe- structura peretelui celular sau a capsulei bacteriene
Importanta in diagnostic:
Teste care pot stabili capacitatea unei bacterii de a metaboliza un anumit
zaharid - valoare taxonomica

Curs Page 3
 zaharid - valoare taxonomica

ii. Proteinele
40-80% din greutatea uscata a bacteriei
Rol:
Jumatate dintre ele functioneaza ca enzime
Restul au rol structural
Pot fi :
Simple ( albumine globuline, etc..)
Complexe ( heteroproteine )
Simple- intra in metabolismul intermediar
Complexe, cu functii specializate :
Mucoproteinele - mucopolizaharizi de grup la Str.pneumoniae
Cromoproteine - catalaze, peroxidaze, citocromi ( intra in lantul
respirator la nivelul membranei celulare )
Nuceloproteinele - acizi nucleici ( ADN, ARN )

iii. Lipidele
1-10% din greutatea uscata abacteriei
-exceptie - Mycobacteriile ( 20-40%)
Variaza cu:
Specia
Varsta culturii
Compozitia mediului
Pot fi :
Libere (in vacole )
Combinate ( facand parte din iferite complexe )

iv. Pigmentii
Numai la bacteriile dromogene
Localizare pigment - clasificare a bacteriilor in :
Cromofore ( in citoplasma )
Paracromofore ( in perete sau un strat mucos : La Staphylococus aureus )
Cromopare ( difuzabil : Pseudomonas aeruginosa - criteriu de identificare )
Rol:
Protectie Uv ( pigmenti carotenoizi )
Antibiotic ( ex: piocianina la Ps. Aeruginosa )
Enzimatic ( proteine transportoare )

v. Enzimele bacteriene
Elaborate sub control genetic
Clasificare:
- dupa locul de actiune :
Intrcelulare - raman in celula
Ectocelulare - in membrana citoplasmatica
Regleaza permeabilitatea selectiva
Extracelulare ( exoenzime ) -eliberate in mediu
-In raport cu reactia catalizata :
Hidrolaze , transferaze , oxido-reductaze , izomeraze
-dupa modul de aparitie:
Constitutive - exista intotdeauna in celula
Adaptative- sintetizate ca raspuns la anumiti compusi

vi. Antibiotice

Curs Page 4
 vi. Antibiotice
Bacterocine - plasmide col ( colicine )
Bacitracina ( B.licheniformis )
Gramicidina (B.brevis)
Polymixina (B.polymixa)

Sintetizate pentru a inhiba alte microorganisme.

Utilizare terapeutica si taxonomica - in identificarea bacteriilor.

Bacterocine
Cu efect asupra altor bacterii receptive inrudite
Colicinele -elaborate de E.coli
Antibiotice polipeptidice
Produse de unele specii de Bacillus
Poimixina - produsa de B.polymyxa
Bactracina - produsa de B.licheniformis

vii. Vitaminele bacteriene

Secretate de unele specii :
Tiamina ( vitamina B1)
E.coli, B.subtilis
Biotina
E.coli, B.anthracis
Vitaminele de grup B, K

viii. Factori de crestere

Metaboliti esentiali , pe care bacteria nu ii poate sintetiza. Necesari in cantitati
mici dezvoltarii bacterii.
Nu au rol plastic sau energetic
Sunt biocatalizatori

Ex:Vitaminele B1,B2,B6
Factorul X, V
Acid folic

B. Nutritia bacteriilor

Totalitatea proceselor metabolice ce presupune participarea de substante energetice, necesare

sintezei celulare.
Bacteriile folosesc functii nutritive diverse :
Azot molecular
Dioxid de carbon
Sulf
Etc...

In functie de tipul de nutritie bacteriile pot fi :

Autotrofe
Heterotrofe
In raport de sursa de energie utilizata , bacteriile autotrofe sunt :
Fototrofe -utilizeaza energia radianta luminoasa
Chimiotrofe - utilizeaza energia rezultata din reactiile de oxidoreducere
Bacteriile patogene sunt heterotrofe , deoarece datorita parazitismului si-au pierdut capacitatea
de a-si sintetiza elemntele de care au nevoi.

Curs Page 5
de a-si sintetiza elemntele de care au nevoi.
Pentru cultivarea pe medii artificiale este necesara introducerea unor factori de crestere:
Vitamine B1, B2, B6, PP , aminoacizi, etc...

Sursa de energie :
Fotosintetizante - energia luminoasa
Chimiosintetizante- reactii de oxido-reducere
Lihotrofe - oxideaza substantele anorganice
Chemoorganotrofe- oxideaza substante organice
Sursa de carbon
Autotrofe
Mixotrofe
Heterotrofe

Sursa de azot
Aminoacizii, saruri de amoniu ( E.coli)

Curs Page 6
LP I : Laboratorul de bacteriologie , functii , structura , dotari ,
masurile de protectie in loboratorul de bacteriologie
Thursday, October 04, 2012
12:26 PM

Functii

1. Identificarea agentilor patogeni din diferite prelevate clinice

2. Depistarea purtatorilor de germeni
3. Stabilirea sensibilitatii la antibiotice si monitoriarea tratamentului cu aceste antibiotice
4. Controlul operatiunilor de sterilizare a diferitelor instrumente
5. Rol in cercetarea stiintifica

Structura laboratorului

1. O locatie compartimentata :
a. O camera de recoltare si primire a prbelor
b. Camere de lucru propriuzis prevazute cu boxe ( anexa inchisa cu geam )
c. O camera de pregatire a mediilor de cultura
d. Camera de depozitare a probelor lucrate
e. Camera pentru efectuarea sterilizarii
f. Camera pentru subiecte de test
g. Biblioteca ( arhiva documentara )
2. Camerele de laborator trebuie sa fie spatioase
3. Peretii incaperilor trebuie sa fie acoperiti cu faianta
4. Pardoseala din ciment / mozaic / mai rar linoleum
5. Instalatii de apa curenta / aprovizionare cu gaz / energie electrica

Aparatura minima

1. Microscop
2. Termostat ( incubator ) - un apart in interiorul caruia se mentine o temperatura constanta
necesara dezvoltarii microorganismelor ( deobicei , bacteriile se dezvolta la 37 0C )
3. Un dispozitiv electric ajuta la mentinerea temperaturii cat si la reglarea ei .
4. Centrifuga - aparat prin care se separa rapid anumite particule aflate in suspensie in medii lichide .
( ex: hematiile , celulele microbiene ). Asigura de la 3k rpm pana la 15k rpm
5. Se poate ajunge pana la 100k rpm
6. Autoclav ( realizeaza sterilizarea prin caldura umeda )
7. Un frigider
8. Un congelator ( pentru conservarea prelevatelor clinice )

Aparatura necesara

1. Ansele bacteriologice ( fire de platina su nichelina atasate unor baghete de sticla sau metal cu
ajutorul carora se realizeaza :
a. Insamantarea probelor pe medii de cultura
b. Efectuarea de frotiuri
2. Cutii de infecte
3. Bec de gaz

Laborator Page 7
 3. Bec de gaz
4. Diferite ustensile ( foarfeci , bisturie si pense )
5. Cilindrii gradati
6. Placi Petri
7. Lame si lamele pentru microscopie optica

Pericole

1. Pericol de infestare
2. Alergia

Caile de infectare in laborator

Poate fi foarte grava datorita unei doze mult crescute , fata de infectiile capatate in mediul inconjurator
cat si a unor posibilitati / cai mult mai diversificata

1. Cale respiratorie / inhalatorie ( ex: Micobacterium tuberculosis - bacil Coh )

2. Cale orala ( ex : sarmonela )
3. Prin intepare ( leziuni ale pielii ) ( ex: stafilococi )
4. Prin cale conjuctivala ( ex : Virus hepatic B, C )

Principiul protectiei in laboratorul de bacteriologie

Principiul de eliminare sau minimalizare a riscului infectios consta in blocarea cailor de infectare prin
bariere in jurul :
1. Microorganismelor
2. Lucratorului in laborator
a. Purtarea echipamentului de protectie
b. Igiena personala
c. Sa se imunizeze ( vaccinuri )
3. In jurul laboratorului
a. Curatenie
b. Sa nu se permita accesul persoanelor straine in laborator

Masuri de precautie in laborator

Eliminarea posibilitatii de nhalare a microorganismelor

Aerosoli : sunt particule fine in suspensie in aer ce se pot forma in momentul in care se lucreaza cu
lichide :
Picaturile mici se vor evapora rapid Iar microorganismele continute in ele vor patrunde in
organism putand ajunge in cazul in care , daca u dimensiunea mai mica de 0,5 pana in plamani si
prodce boli grave
Ansele bacteriologice sa nu fie mai mari de 3mm, va trebui manuita ansa cu mare grija ,
deasemenea , ansa va trebui flambata de la baza spre varf .
Purtarea mastii prin laborator

Eliminarea posibilitatilor de ingerare

1. Nu se introduc in gura obiecte de laborator aflate pe mesele de lucru

Laborator Page 8
 1. Nu se introduc in gura obiecte de laborator aflate pe mesele de lucru
2. Nu se mananca , nu se bea si nu se fumeaza in laborator
3. Nu se depoziteaza mancae in laborator
4. Spalarea mainilor

Eliminarea posibilitarilor infecatii pe cale cutanata

1. Se curata locul i se panseaza

2. Purtarea manusilor
3. Nu se racapisoneaza acele dupa utilizare
4. Se inlocuiesc eprubetele si pipetele de sticla cu cele de plastic

Eliminarea posibilitatilor de infectare pe cale conjuctivala

1. Purtarea ochelarilor de protectie

2. Nu se va duce mana infectata la ochi

Masuri generale de protectie

1. La boratorul sa fie usor de curatat

2. Accesul persoanelor straie strict interzis
3. Dezinfectantii sa fie la indemana
4. Purtarea echipamentului de protectie complet , mereu
5. Manipularea corecta a materialelor infecte
6. Controlul zilnic al instalatiei de apa , gaz si electricitate
7. Asigurarea lunar a procedurilor de tip DDD ( Dezinfectie , Deratizare, Dezinsectie )

Masuri de protectie in cazul transportarii probelor cu caracter infectios

1. Materialele se vor transporta intr-un recipient inchis ermetic , introdus intr-un al doilea recipient
deasemenea inchis ermetic astfel incat sa nu permia scurgerea materialului infectat
2. Transportul se va face de catre personal instruit special
3. Pentru transportul in exteriorul unitatii sanitare se va eticheta containerul respectiv cu insemnul
de biohazard

Norme de siguranta privind neutralizarea materialului infect

1. Materialelel taietoare se vor arunca in recipiente speciale

2. Nu se racapisoneaza acul
3. Deseurile de tip biohazard ( cu potential infectios crescut ) se vor transporta si neutraliza prin
autoclavare dupa care vor fi transportate la incinerator pentru a fi incinerate .

Laborator Page 9
Masurile enumerate urmaresc :
1. Protectia personalului din laborator
2. Eliminarea transmiterii unei infectii de laborator in exteriorul acestuia existand posibilitatea
raspandirii in populatie
3. Evitarea contaminarii secundare a probelor / prelevatelor clinice su efect asupra rezultatelor
analizelor, rezultate care vor fi eronate.

Laborator Page 10
LP II : Sterilizarea si metode de control al sterilizarii
Thursday, October 11, 2012
10:15 AM

Sterilizarea ca operatiune se foloseste in practica medicala , chirurgicala , stomatologica , in saloanele de

infrumusetare dar si in alte ramuri.
Un obiect ese consderat steril cand nu mai contine nici un fel de microorganisme vii capabile de a se
dezvolta si multiplica in conditii corespunzatoare dezvoltarii si multiplicarii acelor microorganisme.

Ca oeratiune , sterilzarea modalitate prin care sunt distrusi sau indepartati microbii vii ( atat forme
vegetative cat si forme sporulate ) de pe obiecte , materiale , lichide.

Exista diferite metode si tehnici de realizare a operatiunii de sterilizare in functie de :

a. Tipul microorganismului
b. Felul obiectului sterilizat
c. Natura agentului folosit
Sterlizarea prin caldura :
Aducerea la incadescenta
Sterilizarea prin caldura uscata
Sterilizarea prin caldura umeda
Prin radiatii ( , , UV )
Prin folosirea substantelor chimice si biologice
Prin flitrare ( procedeu aplicat lichidelor )

Sterilizarea prin caldura

Aducerea la incandescenta

Este foarte rar folosit , fiind folosit inspecial in bacteriologie prin aducerea la incandecent a a anselor
bacteriologice si spatulelor .
Reprezinta incalzirea pana la inrosire , bacteriile fiind morate sau distruse prin carbonizare.

Sterilizarea prin caldura uscata

Pentru realizarea acestei operatiuni se folosesc o serie de aparate numite etuve / Poupinel .
Steriliabile prin acesta metoda sunt : sticlarie , portelan , ceramica , instrumente metalice neascutite .
Materiale care nu se pot steriliza astfel : obiecte metalice asutite , lichide , materiale plastice , obiecte
din cauciuc .

Controlul operatiunilor de sterilizare se realizeaza prin doua metode :

1. Verificarea unor parametrii ( timpul si temperatura ) - pentru o realizare corecta a unei sterilizari
prin caldura uscata trebuie sa se mentina o temperatura de 180oC timp de 60 min
2. Prin introucerea in mediul de sterilizare a unei hartii de filtru sau a unei bucati de vata, care isi va
modifica culoarea ( se va ingalbenii ) in cazul unei sterilizari corecte.

Sterilizarea prin caldura umeda

Este cel mai folosit procedeu pentru realizarea sterilizarilor si se bazeaza pe principiul ca se formeaza
vapori de apa prin fierberea unei cantitati de apa , vapori a caror tempertura creste cu presiunea astfel

Laborator Page 11
vapori de apa prin fierberea unei cantitati de apa , vapori a caror tempertura creste cu presiunea astfel
acestia avand urmatoarele propietati :
1. Au o mare putere de penetrabilitate in materialele care trebuie sterilizate
2. Determina o coagulare ireversibila ( distrugere ) a proteinelor din celulele bacteriene si sprorii
bacterieni .

Treebuie sa se atinga o temperatura de 120oC timp de 30 min.

Pentru caldura umeda se folosesc niste aparate numite autoclave. ( Este ca un dulap , prevazut cu niste
pereti foarte grosi , o incinta de introducere a obiectelor, capacul inchinzandu-se ermetic. La baza
prezinta o sursa de caldura , prezinta o cuva cu apa )

Modalitati de control :
1. Prin verificarea periodica a parametrilor temperatura, timp dar si presiune.
2. Prin introducerea in autoclav a unor martori chimici ( o serie de substante puse in fiole , substante
ale caror puncte de topire sau solidificare sunt cunoscute , ex: acidul benzoic si benzonaftolul ).
3. Prin folosirea unor stripuri ( benzi de hartie ) impregnate cu o specie bacteriana numite Bacillus
stearotermofilus . Pot fi folosite si fiole in care exista aceasta bacterie. In urma unei sterilizari
corecte stripurile impregnate isi vor schimba culoarea la fel si fiolele cu bacteria respectiva.

Metoda de sterilizare se face in functie de :

Caracterele fizico-chimice ale solutiilor , obiectelor sau materialelor de sterilizare, cerinta
principala este ca in urma procesului de sterilizare caracterele fizico-chimice sa nu se modifice.
Sa fie daca se poate cea mai inexpensiva,cea mai simpla si cea mai adecvata scopului propus.

Alte metode de realizare a sterilizarii prin caldura uscata

Flambare - trecerea intermitenta prin foc a unor instrumente metalice sau din sticla ( pipete ,
eprubete )

Alte modalitati de sterilizare prin caldura umeda

Prin fierbere - 30 min se distrug bacterii virusuri fungi dar nu sunt distrusi sporii.
Tindalizare - reprezinta o sterilizare fractionata prin mentinerea unei temperaturi de 100oC , timp
de 60 min pe parcursul a 3 - 8 zile. In pauzele dintre incalziri se va mentine o temperatura
ambientala.
Pasteurizarea - procedeu in industria limentara . Prin acest procedeu sunt distrusi bacteriile ,
fungii , dar nu sunt distrusi virusii si sporii.

Sterilizarea prin radiatii

Radiatiile folosite sunt de doua feluri :

Ionizante
, , - ele produc distrugerea bacteriana ( sunt bactericide ) prin formarea de radicali liberi
de O2
Neionizante
UV - actioneaza prin distrugerea celulelor bacteriene prin absorbtia lor de catre acizii si
proteinele bacteriene. Lampile cu UV sunt mentinute in Sali de operatii , cabinete medicale ,
laboratoare de microbiologie , timp de 1-3h deoarece bacteriile , virusurile si fungii sunt
distrusi de aceste radiatii UV in cateva minute. Sporii bacterieni sunt distrusi in cateva ore.

Sterilizarea prin substante chimice si biologice

Laborator Page 12
Sterilizarea prin substante chimice si biologice

Substantele chimice si biologice folosite se impart in doua categorii :

Dupa tipul substantelor folosite ( structura chimica )
Dupa modul de actiune

Din punct de vedere chimic :

1. Substante elementare : O, H, Cl , metale ( Hg , Cu )
2. Compusi organici : alcooli , fenoli , acizi , baze si saruri

Dupa dodul de actiune :

1. Actiune asupra membranei bacteriene
Alcoolul , fenolii , crezolii , clorhexidina
2. Distrugerea proteinelor bacteriene ( pe care le denatureaza )
Acizii , bazele , sarurile
3. Inactivarea enzimelor bacteriene
Aldehidele ( formaldehida - formol ) , iod ( betadina ) , apa oxigenata, glutaraldehidele ,
metalele , colorantii ( rivanol , albastru de metil , violet de gentiana )

Sterilizarea prin filtrare

Nu sunt indepartate bacteriile ci doar indepartate . Exista mia multe tipuri de filtre folosite :
1. Filtre de sticla
2. Filtre de portelan
3. Filtre de pamant de sulf
4. Discuri filtrante
5. Membrane filtrante ( Milipore )

Laborator Page 13
LP III: Mediile de cultura in bacteriologie
Thursday, October 18, 2012
10:08 AM

Mediu de cultura
Mediile de cultura sunt solutii sau substrate solide care asigua nutrientii si conditiile fizico-chimice
necesare cultivarii bacteriilor . Aceste medii de cultura po fi utilizate pentru :
Cultivarea bacteriilor
Efectuarea antibiogramelor ( modalitate de studiu a sensibilittii unor specii bactriene la diferite
antibiotice )
Pentru stocarea bacteriana
Pentru transportul bacteriilor

Cultuvarea bacteriana reprezinta dezvoltarea unor specii bacteriene pe anumite medii de cultura in
condtitii " in vitro"

Cerinte ale mediilor de cultura

1. Asigurarea nutrinetilor si condtiile fizico-chimice propice dezvoltarii bacteriene

2. Sa aibe un pH optim ( 7,2-7,4 )
3. Sa aibe o umiditate optima
4. Sa ie izoton ( un continut de maxim 0,5% NaCl )
5. Sa fie steril

Clasificarea mediilor de cultura

A. Dupa provenienta:
1. Medii naturale ( sa aibe in componenta produse de origine animla sau vegetala - ex: carne ,
ou , cord , sange m etc,,,, )
2. Sintetice ( componente chimice )
3. Semisintetice
B. Dupa consistenta:
1. Medii lichide
2. Medii solide ( acestea au in continutul lor un procent de 3-5% de Agar-Agar - un polizaharid
extras din niste alge marine )
3. Medii semisolide ( au in ontinutul lor o concentratie de doar 0,2-0,5% Agar-Agar )
C. Dupa compozitia chmica :
A. Medii uzuale sau simple :
1. "Bulion simplu" - NaCl 0,5% si macerat de carne
2. "Geloza simpla " - bulion simplu dar cu continut de Agar-Agar
B. Medii cmpuse :
1. Medii complexe ( medii ce cultura formate dintr-un mediu simplu cu adaos de
substnte organice- nutritive )- Geloza ser, Geloza sange , Bulion sange , Bulion ser.
2. Medii selective ( medii solide cu adaos de componente care asigura si stimuleaza unor
anumite specii bacteriene inhiband totodata dezvoltarea altor specii bacteriene ) -
Hektoen, mediu selectiv pentru salmonela , shigella.
3. Medii de imbogatire ( medii selective dar lichide care au aceleasi proprietati cu cele
selective ) - pe de alta parte ele si imbogatesc cultura bacteriana existenta . - Mediul
Pike - mediu de imbogatire pentru streptococi , Mediul Hiperclorurat ( Geloza Salina ) -
mediu de imbogatire pentru stafilococi.

Laborator Page 14
 mediu de imbogatire pentru stafilococi.
4. Medii speciale ( medii care au o compozitie speciala propice dezvoltarii unei singure
specii bacteriene ) - Mediul Lowenstein - mediu special pentru bacilul Koch
( micobacterium tuberculosis - M.TBC) , Mediul Sabouraud - mediu special pentru
dezvoltarea fungilor ( Candida Albicas )
5. Medii selectiv diferentiale ( medii selective dar care au in componenta zaharuri
/polialcooli , si un indicatori de pH ), Mediul SS - Salmonela -Shigella , Mediul
Chapman - mediu selectiv diferential pentru stafilococi, Mediul Cled - mediu pentru
bacterii ale tractului urinar.
6. Medii diferentiale simple ( medii care permit evaluarea caracterelor biochimice si a
mobilitatii bacteriene ) - T.S.I - Triple Shugar Iron ( aceste medii studiaza :
1. Fermentarea zaharozei ,
lactozei glucozei si
producerea de hidrogen
sulfurat .
M.I.U-Mobility Indol Uree ( studiaza mobilitatea degajarea de indol si producerea de
ureeaza, Mediul cu citrat ( Simmons ) - folosirea citratului sau nefolosirea citratului ca
unica sursa de carbon.
7. Medii de transport :
i) Mediul Carry-Blair ( folosit pentru transportul enterobaceelor )
ii) Mediul Stwart ( folosit pentru transportul neisseiriilor- gonococul )

Modalitati de insamatare a mediilor de cultura

Insamantarea unui mediu de cultura reprezinta punerea in contact a unor bacterii cu medii de cultura

In functie de caracteristicile mediului avem :

1. Pe medii solide :
a. Insamantarea prin epuizare ( prin dispersie ) - in urma acestui procedeu se obtin colonii
izolate ( coloni bacteriana reprezinta o aglomerare de bacterii vizibila cu ochiul liber
provenia din multipliarea unei singura celule bacteriene pe un mediu de cultura )
Metoda de lucru

1. Se incarca ansa bacteriologica cu produs bacteriologic

2. Se descarca ansa pe mediul de cultura intr-un sector
3. Din primul sector insamantat se traseaza cateva striuri paralele
4. Rotind placa 30o vom trasa alte cateva striuri paralale care le intersecteaza pe
precedentele
5. Insmantarea se termina printr-u striu in zigzag care intersecteaza precedentele striuri
paalele
Obs: Dupa fiecare etapa se sterilizeaza ansa bacteriologica

b. Insamantarea in sector ( prin aceasta procedua se obtin colonii confluente )

Metoda de lucru

1. Se incarca ansa bacteriologica cu produs bacteriologic

2. Se descrca ansa pe un sector de cerc
Obs: Aceasta procedura este folosita in urmatoarele cazuri :
Avem mai multe
prelevate de la un pacient
Avem mai multi pacienti

Laborator Page 15
 Avem mai multi pacienti

c. Insamantarea prin intepare

Metoda de lucru

1. Cu ansa bacteriologica incarcata cu produs patologic se inteapa mediul de cultura

dispus in eprubeta pe o distanta de 3/4 din inaltimea mediului

d. Insamantarea unui mediu solid turnat in coloana inclinata

Metoda de lucru

1. Se incarca ansa bacteriologica su produs bacteriologic

2. Se traseaza un striu pe portiunea inclinata a mediului de cultura

2. Pe medii lichide :
a. Omogenizarea culturii bacteriene in mediul lichid

Caracteristici ale bacteriilor pe mediile de cultura

Pe medii lichide avem :

1. Tulburarea uniforma a mediului de cultura - Stafilococul
2. Formarea unei membrane groase la suprafata mediului - M.TBC
3. Formarea unui inel la suprafata mediului - Corinebacterium difetrie ( C.Dift )
4. Formarea unui inel aderent de peretii eprubetei - E.Coli ( Esherihia COli )
5. Formarea unui pigment la fundul eprubetei - Pseudomonas

Pe medii solide avem :

1. Marimea coloniilor :
a. Colonii mici ( intre 0,1-1mm )- streptococi
b. Colonii medii ( intre 1-2mm ) - stafilococi
c. Colonii mari ( intre 2-5mm ) - C.Dift
2. Dupa forma :
a. Colonii rotunde - Staf.
b. Colonii stelate - M.TBC
3. Dupa aspectul marginilor coloniilor :
a. Margini regulate - Stafilococul
b. Margini neregulate - M.TBC
4. Dupa culoare:
a. Colonii galbene - stafilococul aura
b. Colonii albe - stafilococul alb
c. Colonii portocalii - nocardia
d. Colonii negre - C.Dift
5. Dupa miros:
a. Miros de putrefactie - Proteus
b. Miros de flori de tei - Pseudomonas

Tipuri generale de colonii

Laborator Page 16
Tipuri generale de colonii

1. Colonii de tip S
Colonii bombate netede opace mari si sunt caracteristice spectiilor patogene
2. Colonii de tip R
Colonii zbarcite , uscate plate , cu margini neregulate , sunt caracteristice speciilor
nepatogene cu 3 exceptii : M.TBC , C.Dift, Bacillus Antracis .
3. Colonii intermediare de tip S-R sau R-S
Aceste tipuri de colonii apar in timp dupa mai multe insamantari
4. Colonii de tip M
Colonii foarte mari , bombate, lucioase, margini regulate si cu tendinta de curgere pe
mediile solide. Sunt caracteristice bacteriilor ce poseda capsula- cea mai mare capsula o are
Klebsiella .
5. Colonii pufoase
Colonii caracteristice mucegaiului.
6. Un fenomen care apartine unei singure specii - fenomenul de invazie a placii
Este caracteristic unei specii bacteriene numite Proteus

Laborator Page 17
LP IV:
Thursday, November 01, 2012
10:21 AM

Laborator Page 18
LP V: Prelevate
Thursday, November 01, 2012
10:21 AM

In caz de suspiciune de septicemie o sa se recoltez 2-3 seturi din locuri separate in decurs de 10 min. dar
numai in stare febrila - hemocultura - .

RCR

Se va folosi pentru recoltare , un recipient steril prevazut cu capac. Recoltarea RCR-ului se va recolta don
spatiul intravertebral L4-L5 , ajunge pana la L5-S1. Transportul in maxim 15 min la temperatura camerei.
Pastrare maxim 24h la temperatura camerei. Numar de prelevate , unu pe zi.

Prelevate de la nivelul urechii

Prelevate din urechea externa

1. Se indeparteaza debriurile ( acumularie ) din canalul auditiv si pavilionul urechii cu ajutorul unui
tampon umed sau umectat in ser fiziologic.
2. Un alt tampon se recolteaza prin rotirea lui in canalul auditiv.
3. Maxim 2h transporul
4. Pastrare maxim 24hla temperatura camerei
5. Numar de prelevate 1 pe zi

Obs: nu se va efectua recoltarea energica pentru a nu produce leziuni.

Prelevate din urechea interna

1. REcoltare cu precautie
2. In cazul in care timpanul este intact , se va curata locul si apa si sapun; dupa cre se sterge locul cu
ajutorul uni pansament steril si apoi se aspira lichidul existent in zona cu o seringa .
3. Daca timpanul este perforat , se curata locul cu apa si sapun , dar recoltarea se va face su ajutorul
uni tampon umectat , subtire , flexibil folosindu-se totodata un instrument numit speculum
auricular.
4. Transporul 2h si pastrare 24h la temperatura camerei.
5. Numar de prelevate unu pe zi.

Prelevate oculare

Secretia conjuctivala

1. Se recolteaza de la ambii ochi , cu ajutorul unor tampoane sterile rotind tamponul pe conjuctiva.
2. Se insamanteaza tampoanele imediat dupa recoltare
3. Daca nu se poate face acest lucru se vor imersa tampoanele in medii de conservare si de
transport.
4. Se vor efectua doua frotiuri .
5. Recoltarea se face de la ambii ochi , ochiul neafcetat servind ca si martor.
6. Transportul in 2h cu pastrare 24h la temperatura camerei .

Laborator Page 19
 6. Transportul in 2h cu pastrare 24h la temperatura camerei .
7. Un prelevat pe zi.

Prelevatele tractului genital

Masculin

1. Secretie uretrala, recoltare cu precautie. Se insera tamponul urogenital aproximativ 2-4 cm in

lumen. Se roteste tamponul pentru a se impregan si apoi se imerseaza in mediul de transport.
Transport mexim 2h , pastrare 24h la temperatura camerei , un prelevat pe zi.
2. Secretie de la nivelul prostatei, recoltare cu precauie mare. Se face toaleta zonala a pacientului cu
apa si sapun. Se maseaza prostata rectal, apoi se recolteaza secretia rezultate intr-un tub steril .
Transpor mxim 2h cu pastrare maxim 24h la temperatura camerei. Un singur prelevat pe zi.

Feminin

1. Secretie uretrala, recoltare cu precautie. Se recolteaza secretia la o ora dupa mictiune. Se

indeparteaza exudatul din orificiu. Se recolteaza cu un tampon prin rotirea lui timp de cateva
secunde. Se va imersa tamponul in mediul de conservare si transport . Transporul maxim 2 h cu
pastrare maxim 24h la temperatura camerei . Un singur prelevat pe zi.
2. Secretie vaginala, recoltare cu precautie. Se indeparteaza secretia sau scurgerea in excess din
zona. Se recolteaza folosind doua tampoane sterile. Unul folosit pentru efectuarea de frotiuri iar
al doilea pentru insamantare pe mediul de cultura. Transport maxim 2h cu pastrare 24h la
temperatura camerei. Un singur prelevat pe zi.

Prelevate de la nivelul pielii si tesuturilor subdiaccente

Abcesele deschise

Recoltarea cu precautie. Se sterge exudatul de la suprafata su ser fiziologic, apoi se recolteaza

introducand un tampon profund in abcess ( leziune ) , sau se poate folosi o seringa cu cre aspiram.
Transport 2h, pastrare 24h la temperatura camerei , un singur prelevat pe zi.
Se recolteaza doua tampoane , unul pentru efectuarea frotiurilor si al doilea pentru insamantare pe
mediul de cultura.

Abcesee inchise.

Recoltare cu precautie. Se foloseste o seringa cu ajutorul caruia aspiram din abcess ( dupa dezinfectare
cu alcool / beadina ). Se va folosi un mediu de transport mentru anaerobi.Transport maxim 2h pastrare
24h la temperatura camerei, un prelevat pe zi.

Ulcerele

Se curata suprafate ulcerului cu ser fiziologic si apoi recoltam de la baza leziunii cu ajutorul unui tampon
steril. Transport 2h , pastrare 24h la temperatura camerei cu un prelevat pe zi.

Obs: Pentru gangrena, fistule , etc.. La fel ca la ulcere.

Laborator Page 20
Pelevate de la nivelul tractului urinar

Recoltare cu precautie, se spala zona ( igiena locala ) cu apa si sapun , dupa care se va sterge locul apoi
cu un tifon steril .

La femei
Se departeaza labiile

La barbati
Se retracteaza preputul.

Recoltarea se face din jetul mijlociu , intr-un recipient steril ( urocultor ) . Transporul maxim 2h , pastrare
24h la 40C , numar de prelevate 1-2 pe zi.

Laborator Page 21
LP VI:
Thursday, November 15, 2012
10:23 AM

Laborator Page 22
LP VII:
Thursday, November 15, 2012
10:23 AM

Metoda difuzimetrica

Principiul metodei

Aceasta metoda este standardizata pentru bacteriile cu crestere rapida .

O cantitate de substanta antimicrobiana ( antibiotic sau antifungic ), este dispusa pe suprafata unui
mediu de cultura preinsamantat cu o specie bacteriana de testat. Doua fenomene se vor produce
simultan :
a. Dezvoltarea si multiplicarea bacteriei de testat
b. Difuzia in mediul de cultura a antibioticului / antifungicului .

Rezultatul metodei

In zonele in care concentratia de substnata antimicrobiana depaseste asa numitul ( C.M.I. ) , bacteria nu
se va dezvolta.

C.M.I. reprezinta concentratia minima de antibiotic care inhiba dezvoltarea bacteriei de testat.

Materiale necesare

Mediul M.H ( Muler - Hinton ) dispus in placa Petri.

Cultura bacteriana de testat
Discuri ( microcomprimate ) de antibiotice
Anse bacteriologice
Pipete
Eprubete
Un aparat numit densimat
Un alt aparat numit dispenser
O penseta.
Un frigider
Un termostat
O rigla gradata

Etapele antibiogramei difuzimetrice

I. Recipientele cu discuri cu antibiotice sunt scoase de la frigider si sunt mentinute timp de 1-2 h la
temperatura camerei pentru echilibrare termica. ( Pentru a se evita condensarea vaporilor de apa
pe suprafata microcomprimatelor ).
II. Se usuca suprafata mediului Muler-Hinton , mentinand placa Petri cu capacul intredeschis timp de
20-30 min la 370C.
III. Se prepara o suspensie a tulpinii bacteriene de testat in serfiziologic suspensia aducandu-se la o
turbiditate nefelometrica de 0,5 unitati McFarland cu ajutorul densimatului.
IV. Cu ajutorul unui tampon de vata introdus in suspensia bacteriana se efectueaza insamantarea
mediului MH prin descarcare in striuri paralele rotind placa de fiecare data cu cate 600.
V. Se lasa placa insamantata timp de 3-5 min ( niciodata mai mult de 15min. Pentru absorbtia
inoculului bacterian.

Laborator Page 23
 inoculului bacterian.
VI. Se dispun discurile cu antibiotic pe suprafata mediului MH insamantat folosind o pensa sau
dispenserul.
VII. Se introduce placa Petri la termostat timp de 16-18h la 370C .
VIII. Se scoate placa de la termostat si se vor citi diametrele ( ala halourilor produse in jurul
antibioticelor ) folosind rigla gradata.
IX. Diametrele zonelor de inhibitie determibate de antibioticele folosite se vor raporta la un tabel
interpretativ numit CLSI . ( Clinical laboratory standard institute )

Erorile in efectuarea antibiogramelor

Se pot datora urmatoarelor cauze :

1. Mediul sa nu fie steril.
2. Neuscarea suprafetei discului antibiotic
3. Suspensie bacteriana efectuata incorect
4. Masurarea incorecta a diametrelor zonelor de inhibitie
5. Incubarea incorecta la termostat ( atat ca timp cat si ca temperatura )

Rezultatele antibiogramei difuzimetrice

In urma efectuarii antibiogramei difuzimetrice se vor identifica trei categorii :

1. Categoria "sensibil" - bacteria este inhibata de antibioticul dat , antibioticul va actiona asupra
speciei bacteriene de testat inhiband-o daca acel antibiotic va fi administrat respectand prospectul
lui.
2. Categoria "intermediar" - specia bacteriana de testat va raspunde doar la administrarea unor
cantitati crescute fata de dozele utilizate in mod obisnuit pentru tratarea respectivei infectii .
3. Categoria "rezistent" - antibioticul nu isi va face efectul asupra bacrteriei de testat ( dozele
terapeutice nu au aplicabilitate clinica )

Metoda E-test

Principiul metodei

Aceasta metoda este o combinatie intre metoda difuzimetrica si metoda dilutiilor .

E-testul este un strip ( o bucata de plastic de 5mm latime si 60mm lungime care pe o parte este notata
cu o scala a CMI-ului si cu denumirea antibioticului , iar pe cealalta fata este o cantitate deantibiotic in
stare uscata ). In momentul aplicarii stripului pe suprafata mediului MH preinsamantat cu bacterie de
testat se elibereaza antibioticul si se va obtine un gradient eponential al cocentratiei de antibiotic , astfel
dupa 24h la 370C va aparea in jurul stripului E-test o zona elipsoidala care intersecteaza stripul. Locul in
care elipsoida intersecteaza stripul reprezinta CMI-ul a ubstantei antimicrobiene respective fata de
bacteria testata.

Materiale necesare

Idem ca la antibiograma difuzimetrica cu doua exceptii :

Se foloseste congelator in loc de frigider
Se folosesc stripuri E-test in loc de discurile cu antibiotic ( microcomprimate )

Etapele E-testului

I. Primele V etape idem ca la antibiograma difuzimetrica

Laborator Page 24
 I. Primele V etape idem ca la antibiograma difuzimetrica
II. Se depun stripurile E-test ( 2 pe o placa ) cu ajutorul unei pense.
III. VII-VIII idem ca la antibiograma difuzimetrica
IV. Ultima etapa difera , citindu-se locul in care elipsoida intalneste ( intersecteaza ) stripul si se
citeste pe scala valoarea CMI-ului, care va fi raportata la tabelul interpretativ CLSI .

Metoda dilutiilor

Este in principal o metoda cantitativa.

Principiul metodei

Intr-un sir de eprubete , in care avem 1ml de ser fiziologic se efecteaza dilutii ale unui antibiotic, apoi in
toate eprubetele ( cu exceptia ultimei care se va numi martor ) se adauga cultura bacteriana etalonata
McFelometric.
Cea mai mica doza de antibiotic care inhiba cresterea bacteriana ( va aparea mediul clar ) constituie
CMI-ul respectivului antibioticului respectiv fata de bacteruia de testat . CMB ( concentratia minima
bactericida ) reprezinta cantitatea minima de antibiotic care omoara 99,99% din bacterii dupa 18 ore de
incubare la 370C .

Determinarea CMB-ului

Din ultimele eprubete fara crestere bacteriana se repica 0,1 ml pe o paca Petri cu geloza simpla. Dupa
24h la termostat la 370C se compara numarul celulelor care au supravietuit si se va raporta la numerul
initial de celule bacteriene .

Laborator Page 25