DOCUMENT : L.P.

19 - Microbiologie Generală DATA : 23/05/2014

TITLU :
Fungi PAGE : 1/8

15. EXAMINAREA FUNGILOR

Micologia este știința care se ocupă cu studiul mucegaiurilor, drojdiilor și fungilor imperfecți,
ce reprezintă un grup numeros de organisme eucariote, non-fotosintetizante, care își dobândesc
nutrienții prin absorbție și care formează regnul Mycetae (regnul Fungi). Datorită unor aspecte
morfologice mai speciale, fungii filamentoși (mucegaiurile) necesită metode puțin mai speciale de
cultivare și examinare pentru a nu deterioara structurile specifice.
În continuare sunt prezentate câteva tehnici care se folosesc în mod curent în practica
microbiologică pentru examinarea fungilor.

15.1. Examinarea caracterelor de cultură

Caracterele de cultură se examinează după însămânțarea și dezvoltarea tulpinilor fungice pe
medii solide și lichide repartizate în plăci Petri, respectiv baloane Erlenmeyer. Perioada optimă de
dezvoltare a drojdiilor, la temperatura de 28°C, este de 48-72 de ore, respectiv 5-7 zile pentru
mucegaiuri, care asigură dezvoltarea completă a organelor de fructificație.
La drojdii, examenul caracterelor de cultură (Anexa 1) este asemănător cu cel de la bacterii (a
se vedea LP10 ”Examinarea caracterelor de cultură”) și presupune:
• La dezvoltarea pe medii lichide se observă și se notează: gradul de creștere după o
perioadă completă de incubare, creșterea la suprafața mediului, turbiditatea, depozitul,
culoarea și mirosul culturii, formarea bulelor de gaz;
• La dezvoltarea pe medii solide se notează: mărimea, forma, profilul, aspectul coloniilor
și gradul lor de uniformitate, aspectul marginilor și al suprafeței coloniilor, culoarea,
opacitatea și consiistența lor.

La mucegaiuri, examinarea caracterelor de cultură pe mediu lichid determină apariția a două

tipuri de culturi:
• Cultura statică (cultura de suprafață) se dezvoltă la suprafața unui mediu nutritiv aflat în
condiții statice
• Cultura submersă se dezvoltă în profunzimea unui mediu de cultură, agitat în permanență, după
însămânțarea cu materialul microbian.
Interpretarea rezultatelor
Prin cultivarea pe medii lichide se urmărește evoluția creșterii masei vegetative în raport cu
diferiți parametrii de cultivare: medii cu compoziții sau pH diferite sau la diferite temperaturi. De
asemenea, se poate determina masa miceliană prin filtrarea lichidului pe hârtie de filtru cântărită în
prealabil, urmată de uscarea la termostat la 30-35°C până când greutatea rămâne constantă. Se face
diferența între ultima greutate înregistrată și greutatea inițială a filtrului.

Interpretarea rezultatelor obținute în urma dezvoltării mucegaiurilor pe mediu solid se referă

la (Anexa 2):
• Ritmul de creștere a hifelor: rapid, lent
• Topografia generală a coloniei: netedă, neregulată, reliefată
• Aspectul coloniilor: coloniile pot fi pufoase, lânoase, catifelate, fibroase, prăfuite (Epicoccum
sp., Alternaria sp.) sau unele colonii pot avea un aspect neted (absenţa sau prezenţa unui miceliu
aerian sărac) (Cladosporium sp.).
• Coloniile de relief: coloniile pot avea un aspect plat (Cladosporium sp.) sau plisat şi
consistenţa coloniilor poate fi variabilă (moale, friabilă, elastică sau dură) (Aspergillus sp., Penicillium
sp.).

1
DOCUMENT : L.P. 19 - Microbiologie Generală DATA : 23/05/2014
TITLU :
Fungi PAGE : 2/8

• Dimensiunea coloniilor: coloniile pot fi mici de 3 – 3,5 cm (Cladosporium sp.), extinse de 4-5
cm (Aspergillus sp., Penicillium sp.) sau invazive (Botrytis sp., Fusarium sp., Trichoderma sp.).
• Culoarea coloniilor: este un element foarte important de identificare: alb, crem, galben,
portocaliu, verde, maro până la negru. Pigmenţii pot fi localizaţi în miceliu (Aspergillus sp.,
Penicillium sp.) sau difuzaţi în mediul de cultură (Fusarium sp.) (Anexele 1,2)
Examinarea fungilor se face cu ajutorul lupei de mărire și poate fi completată cu un studiu
asupra structurilor sporifere (forma, modul de formare, dispoziția și forma sporilor), pentru care este
necesară utilizarea stereomicroscopului.

15.2. Examinarea fungilor pe preparate microscopice

Examinarea microscopică a unei colonii fungice se efectuează în preparate proaspete și fixe.
• Tehnica de examinare pe preparate între lamă/lamelă: se utilizează colorantul albastru de metil
0,2% pentru drojdii și colorantul blue-cotton în lactofenol pentru mucegaiuri (folosirea coloranților
mărește contrastul celulelor/ hifelor față de fondul preparatului
• Tehnica frotiurilor: colorația Gram, în cazul drojdiilor
Interpretarea rezultatelor
De obicei, o vizualizare cu obiectivul de 40X este suficientă pentru a evidenţia cele mai
importante elemente de identificare: forma celulelor, prezenţa hifelor, prezenţa formelor de
reproducere sexuată, aspectul sporilor, prezența pseudomiceliului (Anexele 1,2, 3). Sporii pot fi
unicelulari şi mici (Penicillium sp., Aspergillus sp.) sau bicelulari (Trichothecium sp.). Pereţii pot fi
multicelulari transversali şi longitudinali (Alternaria sp.) sau înguşti, conici, curbaţi şi transversal
septaţi (Fusarium sp.).

15.3. Cultivarea pe hârtie de filtru

Pe fundul plăcilor Petri se depune un strat de vată acoperită cu hârtie de filtru. Acest ansamblu
se sterilizează în etuvă. După sterilizare, hârtia de filtru se umezește cu apă distilată sterilă, cu ajutorul
unei micropipete. Se depune câte un mic bloc de mediu solid din tulpina de mucegai de analizat și se
incubează la 25-280C, timp de 48-72 de ore.
Interpretarea rezultatelor
Se urmărește creșterea hifelor miceliene care împânzesc hârtia de filtru, apariția și aspectul
sporilor.

15.4. Examinarea fungilor folosind celula van Thiegem

Examinarea fungilor folosind celula van Thieghem este specifică pentru studiul mucegaiurilor
și permite realizarea de observații periodice asupra modului de germinare, de dezvoltare a filamentelor
și a etapelor de formare a fructificațiilor.
Celula van Thiegem (camera umedă) se pregătește prin lipirea pe o lamă de microscop, cu
ajutorul parafinei, a unui inel de sticlă sau plastic și se sterilizează în etuvă.
Tehnica de lucru:
• Toate operațiile se execută respectând regulile de manipulare aseptică
• În interiorul unei celule van Thiegem sterile se vor picura 1-2 picături de apă distilată sterilă
pentru a crea condiții de umiditate excesivă
• Pe o lamelă sterilizată se vor depune câteva picături de mediu nutritiv slab agarizat (de
exemplu, Potato Dextrose Agar)
• Mediul nutritiv este însămânțat cu sporii fungici, folosindu-se un ac de însămânțare
• Lamela se răstoarnă şi se lipeşte cu vaselină deasupra unei celule van Thiegem
• Celula van Thieghem se incubează la termostat, la 25-28°C, timp de 24-48 ore

2
DOCUMENT : L.P. 19 - Microbiologie Generală DATA : 23/05/2014
TITLU :
Fungi PAGE : 3/8

• Camera umedă se examinează periodic la microscopul optic, cu obiectivul de 10X

Interpretarea rezultatelor
Dezvoltarea mucegaiurilor poate fi urmărită, prin observaţii la microscop privind: modul de
germinare, dimensiunea, dispoziția și aspectul hifelor, viteza lor de creștere, dacă hifele sunt septate
sau nu, ce fel de fructificații se observă, etc.

Figura 15.1. Examinarea fungilor în picătură suspendată cu ajutorul celulei van Thiegem

15.5. Examinarea culturilor pe lamă de sticlă

Metoda culturilor pe lamă de sticlă este utilizată pentru examinarea mucegaiurilor care prezintă
un miceliu foarte fin și fragil.
Tehnica de lucru:
• Într-o cutie Petri se așează o baghetă de sticlă, în formă de U, care se acoperă cu o lamă de
microscop curată și degresată
• Cutia Petri astfel pregătită se împachetează în hărtie și se sterilizează la etuvă
• Toate operațiile se execută respectând regulile de manipulare aseptică
• La nevoie, restabilirea poziției ansamblului se realizează cu ajutorul unei pensete flambate
• Pentru crearea condițiilor de umiditate, pe fundul plăcii Petri se depun 5 mL apă distilată sterilă
• În centrul lamei se depune o picătuă de mediu nutritiv topit sau un mic bloc de mediu agarizat
steril decupat cu ajutorul ansei de disociere
• Suprafața mediului de pe lamă se însămânțează cu spori sau fructificații miceliene
• Se incubează 2-4 zile, la temperatura 25-280C
• Lama se scoate din cutie și se examinează cu ajutorul stereomicroscopului
• Se pot efectua preparate proaspete si fixe După expirarea perioadei de incubare lamela se ridică
cu atenție de pe blocul de agar și se plasează, cu fața în jos într-o picătură de apă distilată
sterilă, pentru a pregăti un preparat microscopic (se recomandă adăugarea unei soluții de
colorant blue-cotton în lactofenol și a unei picături de alcool 96°)
Interpretarea rezultatelor
Se urmărește: aspectul, dispoziția hifelor și a organelor de fructificare, prezența pigmentului etc.

3
DOCUMENT : L.P. 19 - Microbiologie Generală DATA : 23/05/2014
TITLU :
Fungi PAGE : 4/8

Figura 15.2 Cultivarea fungilor pe lama de sticlă

4
DOCUMENT : L.P. 19 - Microbiologie Generală DATA : 23/05/2014
TITLU :
Fungi PAGE : 5/8

Anexa 1

Figura 15.3. Observaţii macroscopice și microscopice ale speciilor de drojdii

5
DOCUMENT : L.P. 19 - Microbiologie Generală DATA : 23/05/2014
TITLU :
Fungi PAGE : 6/8

Anexa 2

Figura 15.4 Observaţii macroscopice și microscopice ale speciilor de mucegai

6
DOCUMENT : L.P. 19 - Microbiologie Generală DATA : 23/05/2014
TITLU :
Fungi PAGE : 7/8

Fig. 15.5 Genuri reprezentative de mucegaiuri

7
DOCUMENT : L.P. 19 - Microbiologie Generală DATA : 23/05/2014
TITLU :
Fungi PAGE : 8/8

Figura15.6 Stereomicroscop