CAPITOLUL II

BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE

2.1. Importanţa transferului de embrioni

Importanţa transferului de embrioni poate fi zooeconomică şi ştiinţifică.

Importanţa zooeconomică. Lucrările de selecţie şi ameliorare a

efectivelor de animale sunt limitate de numărul redus de produşi care se obţin de
la o femelă în cursul vieţii sexuale şi de intervalul dintre generaţii. Transferul de
embrioni dă posibilitatea folosirii cu eficienţă crescută a rezervelor de ovocite de
la animalele de înaltă valoare zootehnică numite donatoare, prin provocarea
maturării şi eliberării mai multor gameţi femeli (poliovulaţie) cu obţinerea unui
număr mai mare de produşi de la aceeaşi femelă prin transferul embrionilor în
uterul femelelor receptoare. Astfel, în decursul vieţii sexuale este valorificată doar
o infimă parte din rezerva de ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexuală.
De exemplu, vaca începe perioada genitală cu o rezervă de circa 150000 de
ovocite ( în ambele ovare), rezervă care diminuă la circa 21000 la vârsta de 2-3
ani şi la circa 2500 la 12-14 ani. Numărul de ovocite eliberate în întreaga viaţă
sexuală nu depăşeşte 50, din care în condiţii normale rezultă maxim 10-12 viţei.
Prin asigurarea numărului corespunzător de animale primitoare, de la vacile
donatoare se pot obţine, în medie 3-4 viţei pe an, fiind cunoscute cazuri când în
condiţii de supraovulaţie, de la o vacă donatoare s-au obţinut 30-35 viţei.
Transferul de embrioni se practică şi pentru scurtarea intervalului dintre
generaţii. Prin instalarea gestaţiei, femela intră în repaus productiv (sub raportul
procreerii) pe întreaga durată a gestaţiei. În cazul practicării transferului de
embrioni, produşii de concepţie sunt transferaţi în alte organisme, ceea ce dă
posibilitatea obţinerii de noi produşi de la aceeaşi femelă în intervalul de timp în
care în mod normal, ar fi trebuit să fie gestantă.
Mai mult, în prezent se pot obţine gameţi şi de la tineretul femel prepuber
prin provocarea prin mijloace hormonale a maturării şi expulzării ovocitelor, care
vor fi apoi transferate în uterul femelelor receptoare. Scurtându-se mult intervalul
dintre generaţii, se accelerează ameliorarea efectivelor de animale.
Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport, carantină
şi eventualele restricţii sanitar-veterinare în comerţul cu animale, prin conservarea
prin congelare a embrionilor. Totodată, prin practicarea transferului de embrioni,
se pot obţine produşi de la femelele valoroase dar cu diverse afecţiuni genitale
incompatibile cu menţinerea gestaţiei sau cu parturiţia.
De asemenea, prin transferul de embrioni se reduce intervalul de timp
necesar creării de noi rase de animale cu însuşiri morfo-productive performante
care pot forma linii de femele consangvine în vederea folosirii lor la încrucişări
industriale.
În sinteză, în practica de producţie, transferul de embrioni se aplică pentru
rezolvarea următoarelor probleme:
- reproducerea accelerată a animalelor de prăsilă, de calitate superioară, a raselor
rare, a animalelor din rezerva genetică a purtătoarelor unor însuşiri valoroase

66
(producţii ridicate, capacitate de utilizare intensă a furajelor, prolificitate mare,
longevitate productivă, rezistenţă la anumiţi factori nefavorabili etc.);
- obţinerea unui număr mare de descendenţi de la femelele cu producţii ridicate şi
cu durată prelungită de exploatare, în vederea creării de familii cu aceste însuşiri;
- raţionalizarea importului şi exportului animalelor valoroase, ca urmare a
transportului embrionilor congelaţi, înlăturându-se astfel barierele sanitar-
veterinare şi înlesnirea aclimatizării materialului importat, dezvoltarea lui
embrionară având loc în organismul primitoarelor;
- obţinerea de embrioni liberi de leucoză cu posibilitatea transferului acestora
femelelor leuco-negative;
- crearea unor bănci de embrioni în vederea păstrării raţionale a rezervelor
genetice, ceea ce este mai economic decât întreţinerea unor efective numeroase
din rezerva genetică.

Importanţa ştiinţifică
Transferul de embrioni reprezintă o biotehnologie prin intermediul căreia se
poate efectua, în condiţii optime, un aprofundat studiu ştiinţific al proceselor
intime legate de fecundaţie şi de influenţele maternă şi paternă asupra produsului
de concepţie. Totodată, poate fi studiată dezvoltarea embrionară la animale,
diversele abateri de la dezvoltarea normală, cauzele şi factorii care generează
mortalitatea embrionară.
Produşii obţinuţi prin transferul de embrioni permit studierea influenţelor
factorilor genetici şi ai mediului extern asupra dezvoltării embrionilor, ereditatea
grupelor sanguine, obţinerea de animale „mozaic de gene“, a concentrării mai
multor caractere pe acelaşi individ, a instituirii unei profilaxii şi terapeutici
genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceeaşi linie, transferul de embrioni
reprezintă baza unei noi generaţii de biotehnici care derivă din aceasta sau îi sunt
asociate: bisecţia embrionilor, sexajul, fecundaţia „in vitro“ clonarea, transferul de
gene, iar ingineria genetică foloseşte ca verigă importantă, în metodologie, această
biotehnologie.
Micromanipularea şi microchirurgia ovocitelor şi a embrionilor permit
desfăşurarea unei cercetări ştiinţifice interesante, şi obţinerea din punct de vedere
practic a unor înalte performanţe în reuşita transferului de embrioni, prin
transferul jumătăţilor de embrioni.
Sexul embrionului poate fi precizat cu multă acurateţe, baza investigaţiei
fiind dată de transferul embrionilor.
Reproducerea, fără contribuţia genetică a partenerului, se poate realiza prin
ginogeneză, fiind deja obţinuţi primii şoareci homozigoţi, (Groza I., 1996).
Aspecte similare ridică androgeneza în care se poate induce bispermia, adică
pătrunderea în ovul a doi spermatozoizi, cu retragerea ulterioară a pronucleului
femel şi în consecinţă diviziunea va continua numai în zona masculină (Groza I.,
1996).

2.2. Biotehnologia transferului de embrioni la vacă

La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproducţie

larg răspândită în lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine stăpânite, astfel încât
această modernă biotehnologie poate fi extinsă la aproape toate fermele de
creşterea vacilor din lume. Astfel, în Europa se obţin anual circa 100000 de
produşi prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial circa 300000 de produşi,
extinderea biotehnologiei fiind limitată de costurile destul de ridicate.
67
 Transferul de embrioni constituie, totodată, baza unei noi generaţii de
biotehnici, care derivă din aceasta sau îi sunt asociate, cum ar fi: bisecţia
embrionilor, sexajul, fecundaţia ,,in vitro“, clonarea, transferul de gene.
Transferul de embrioni presupune parcurgerea următoarelor etape (fig. 10):
selecţia şi pregătirea vacilor donatoare; selecţia şi pregătirea vacilor primitoare
(receptoare); sincronizarea estrului şi ovulaţiei la vacile donatoare şi primitoare;
inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială a vacilor donatoare; recoltarea
embrionilor; conservarea embrionilor; transferul embrionilor.

SELECŢIA DONATOARELOR SELECŢIA RECEPTOARELOR

TRATAMENTUL DE
SUPEROVULARE

PMSG
- tipul
FSH-p
- doza
- schema de administrare SINCRONIZAREA
CICLULUI SEXUAL CU AL
DONATOARELOR

I.A. A DONATOARELOR

RECOLTAREA EMBRIONILOR

CONSERVAREA EMBRIONILOR TRANSFERUL

EMBRIONILOR

Fig. 10 Schema transferului de embrioni la animale

2.2.1. Selecţia şi pregătirea vacilor donatoare

Vacile donatoare de embrioni trebuie să întrunească la cel mai înalt nivel

caracterele zootehnice care interesează. De aceea, când se face selecţia
donatoarelor, se are în vedere evaluarea următoarelor criterii: performanţa
reproductivă, superioritatea genetică şi valoarea produsului obţinut prin transfer
embrionar.
Vaca donatoare va fi mai performantă reproductiv atunci când vârsta se
situează între 3 şi 10 ani, a născut anual câte un viţel, a rămas gestantă în maxim
două cicluri sexuale, ciclurile de călduri au o succesiune fiziologică şi nu a avut
antecedente ginecologice (distocii, retenţii placentare, infecţii genitale etc.).
Practic, criteriile care se au în vedere sunt: o stare ginecologică perfectă, intervalul
dintre parturiţie şi primul estru să fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiţie-
însămânţarea fecundă să fie mai redus de 80 zile iar indicele de gestaţie să fie mai
mic de 1,5.

68
 Superioritatea genetică constă într-un ritm superior de creştere, înainte şi
după înţărcare şi un randament ridicat la sacrificare. În cazul vacilor de lapte,
însuşirile cu heritabilitate ridicată se referă la producţia de lapte, procentul de
grăsime din lapte şi conformaţia corporală.
Vacile donatoare trebuie să fie sănătoase, ele suportând mai multe
intervenţii de supraovulare şi recoltare de embrioni. O atenţie deosebită trebuie să
se acorde alimentaţiei raţionale a acestei categorii de vaci.

2.2.2. Selecţia şi pregătirea vacilor primitoare (receptoare)

Vacile receptoare de embrioni trebuie să fie sănătoase, fără afecţiuni

ginecologice, să aibă aceeaşi talie cu donatoarele, să fie apte să nască descendenţi
cu aceeaşi greutate la naştere ca donatoarele, avându-se în vedere că gestaţia
constituie un fenomen morfo-fiziologic complex ce presupune eforturi
suplimentare deosebite din partea organismului matern.
Cele mai bune rezultate se obţin atunci când transferul de embrioni se face
la tineretul femel în vârstă de 18-20 de luni.

2.2.3. Sincronizarea estrului şi ovulaţiei la vacile donatoare şi

primitoare

Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare şi receptoare de embrioni

se poate realiza pe cale naturală sau medicamentoasă.
În cazul sincronizării femelelor prin mijloace naturale se urmăresc, în
lotul receptoarelor femelele care în mod spontan manifestă estrul în acelaşi timp
cu donatoarele. Principalul dezavantaj constă în fapul că sunt necesare multe
animale receptoare în aşteptare. Această modalitate de sincronizare s-a practicat în
perioada de început a transferului de embrioni, când s-au folosit pentru transfer
embrionii proaspăt recoltaţi. În această situaţie, în aceeaşi unitate trebuia să fie şi
vaci donatoare şi receptoare, iar transferul embrionilor trebuia să se realizeze într-
un timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare).
Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazează pe faptul
că se urmăresc succesiv două-trei cicluri de călduri la vacile donatoare şi se
stabileşte durata ciclului. În acest fel se poate calcula data apariţiei ciclului care
interesează în transferul de embrioni. În funcţie de data previzibilă, se acţionează
prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele primitoare în vederea
inducerii căldurilor, sincronizate cu căldurile naturale ale donatoarei. În acest caz
se acţionează asupra donatoarei numai în ceea ce priveşte inducerea poliovulaţiei.
Sincronizarea medicamentoasă a ciclului estral al femelelor donatoare şi
receptoare de embrioni se realizează pe două căi: blocarea eliberării hormonilor
gonadotropi sau prin inducerea luteolizei.
Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor
sintetice care prin retroacţiune îşi exercită efectul negativ asupra hipotalamusului,
diminuând nivelul hormonilor gonadotropi. (Vezi capitolul „Sincronizarea
estrului“).

2.2.4 Inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială

a vacilor donatoare

69
 Provocarea eliberării concomitente la aceeaşi perioadă de călduri a unui
număr sporit de ovocite decât cel caracteristic speciei se numeşte poliovulaţie
(supraovulaţie, superovulaţie) si este asigurata prin multiple scheme de tratament.
Tratamentele actuale aplicabile in „vitro“ se sprijină pe cunoaşterea
mecanismelor foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH,
LH) care intervin îndeosebi în ultima fază a creşterii şi maturării foliculare.
Potenţialul ovarian de foliculi terţiari (cu antrum) rămâne relativ constant (însă
variabil cu individul) de la vârsta de două luni până la 12 ani (Nibart M., 1991).
Fiziologic, la vacă, un singur folicul ajunge la maturitate în preajma ovulaţiei, în
timp ce, în timpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenerează. Injecţia unui
hormon cu activitate de FSH împiedică atrezia unor foliculi şi stimulează
dezvoltarea şi maturarea simultană a mai multor foliculi terţiari, în cursul aceluiaşi
ciclu estral.
În prezent, două scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate,
ambele bazate pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul
gonadotrop de iapă gestantă, liofilizat şi standardizat - PMSG (Pregnant Mare
Serum Gonadotropin) denumit şi Ecvin Chorionic Gonadotropin (ECG), produs
de celulele corionice ale iepei gestante si hormonul de stimulare foliculară (FSH)
extras din hipofiza anterioară.
PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante şi are o dublă
activitate: de tip FSH şi LH, raportul FSH/LH variază de la 1/1 la 1/5 (Saumande
J., 1987). Perioada de înjumătăţire destul de lungă - 120 ore - a acestui hormon
determină o uşurinţă în folosire, o singură injecţie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind
eficientă în provocarea poliovulaţiei. La două-trei zile de la injectarea PMSG se
administrează i.m. o doză de 500-750 g prostaglandină F2, căldurile apărând la
circa 48-60 de ore de la injectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG antrenează şi
unele efecte negative traduse prin creşterea foliculară şi secreţia ridicată de
estradiol şi după descărcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate fi
contracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima
sau cea de a doua însămânţare artificială (de ex. Neutra -PMSG intervet).
Fecundarea ovocitelor se face, de regulă, prin însămânţarea artificială a
vacilor la un interval de 12 ore de la începutul estrului cu repetare la 8-12 ore
interval.
FSH – se prepară din extractele purificate parţial, provenite din hipofiza
mamiferelor - în principal de suine - care conţine FSH şi LH. Conţinutul în cei doi
hormoni şi raportul dintre aceştia variază cu lotul. Perioada de înjumătăţire foarte
scurtă (circa 70 minute a acestui hormon necesită injectarea lui bicotidian timp de
4 zile, în vederea menţinerii unui nivel sanguin suficient de ridicat. Funcţie de
preparatul comercial, raportul dintre FSH şi LH, de regulă variază de la 1 la 0,5.
Dozele totale care se administrează, în vederea producerii poliovulaţiei, variază de
la 28 mg la viţelele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injecţiile făcându-se în ritm
descrescător, intramuscular sau subcutanat.
Preparatele care conţin aceşti hormoni au denumiri care diferă cu unitatea
producătoare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc.
Ca şi cealaltă schemă de tratament, injectarea prostaglandinei F2, în doză
de 500-750 g se face la 48-72 de ore de la începerea tratamentului, estrul
apărând la circa 50-60 ore de la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor
se face prin însămânţarea artificială a femelelor supraovulate de două ori, la 12 şi
24 ore de la apariţia estrului.

Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaţiei

70
 Preparatele medicamentoase care conţin hormoni gonadotropi sunt
injectate în faza luteală a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent între ziua a
9-a şi a 13-a. Două zile după injecţia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injecţie
de FSH, se injectează un analog de PGF2 (de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are
efect luteolitic permiţând ovulaţiile (fig. 11 şi 12).

POLIOVULA}IE
FSH p

ANTILUTEOTROP

2
IMPLANT
NORGESTOMET
9 zile

POLIOVULA}IE
PMSG
ANTI-PMSG

ANTILUTEOTROP

4 IMPLANT
NORGESTOMET
9 zile

Fig. 11 Scheme de inducere a poliovulaţiei la vacile donatoare de

embrioni (după M. Thibier şi M. Nibart, 1991)

O altă schemă de tratament constă în utilizarea progestinelor pe cale orală,

parenterală, intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12 zile. Progestinele
blochează axul hipotalamo-hipofizo-ovarian, prin neeliberarea de FSH dar mai
ales de LH. Cât timp receptorii axului hipotalamo-hipofizar se găsesc sub acţiunea
temporară a progestinelor, femela nu va manifesta estru şi nici nu va ovula. După
suprimarea terapiei cu progestine, se produce o descărcare rapidă, compensatoare
de Gn-RH, ceea ce va determina, în decurs de 5-7 zile, intrarea în călduri
ovulatorii a femelelor tratate. În cursul unui astfel de tratament de blocare a
ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, în ritm
descrescător începând cu a 6-a zi de la blocarea ciclului, concomitent cu o injecţie
intramusculară de PGF2.

71
 PMSG
PGF2

PMSG
PGF2
Gn-RH

PMSG
PGF2
HCG

FSH
PGF2

Fig. 12 Scheme de inducere a poliovulaţiei la vacile donatoare de embrioni

(după I.C.P.C.B. Baloteşti)

În cazul întrebuinţării preparatelor hormonale pe bază de PMSG, acestea

se injectează, împreună cu o doză de prostaglandină F2, în a 6-a - a 7-a zi de la
introducerea implantelor, pesariilor etc., urmată de injectarea unei doze de anti
PMSG concomitent cu a 2-a însămânţare artificială (fig. 11 şi fig. 12).
O schemă mai simplă de provocare a poliovulaţiei constă în începerea
tratamentului cu hormoni gonadotropi în a 15-a, a 16-a zi a ciclului estral la viţele
şi în a 16-a, a 17-a zi a ciclului sexual la vaci, însă numărul de embrioni obţinuţi
este mult mai redus.
Rezultate bune în provocarea poliovulaţiei s-au obţinut prin injectarea unei
doze de Gn-RH la vacile poliovulate înainte de prima însămânţare artificială sau
concomitent cu aceasta, în vederea grupării ovulaţiilor.
Prin provocarea poliovulaţiei se pot obţine de circa 8-10 ori mai mulţi
embrioni, decât în cazul recuperării unui singur ou de la femelele nesupuse
tratamentului poliovulator (foto 18).

72
 Există o variaţie
mare în ceea ce priveşte
răspunsul la tratamentul
poliovulator, din partea
vacilor. Această variaţie
pronunţată se datorează
hormonului utilizat,
purităţii acestuia şi de
specificul individual al
femelelor. Cercetările au
relevat faptul că circa 10-
20% dintre vaci nu
răspund la tratamentul
poliovulator, alte 20-25%
răspund slab la un astfelde
Foto 18 Ovare superovulate
Tratament (1-3 embrioni transferabili pe vacă tratată) şi doar 30-40% dintre vaci
au un răspuns ideal la tratamentul de superovulaţie furnizând 7-12
embrioni/vacă/tratament iar 5-10% dintre femelele tratate furnizează mai mult de
20 de embrioni. În prezent, stimularea ovariană pare a fi atins un anumit plafon
întrucât, se colectează, în medie 9-10 embrioni (limite între 0-50), iar cel al
embrionilor viabili este de 5-6 (limite între 0-30), din care 3 congelabili (Nibart,
Thibier, Chouke 1988).
În ceea ce priveşte repetarea tratamentelor de superovulaţie la aceeaşi
donatoare, s-a constatat că tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor
luni sau a mai multor ani. Producţia totală de embrioni de la aceeaşi donatoare
depinde de aceasta şi de ritmul de colectare .
Este necesar un interval de cel puţin 60 de zile după fătare în vederea
începerii tratamentului poliovulator. Unii cercetători constată o reducere a
numărului de embrioni transferabili o dată cu repetarea tratamentului cu PMSG,
fapt ce se explică prin formarea în organismul femelei tratate a anticorpilor anti-
PMSG şi reducerea categoriilor de foliculi sensibili la stimulare. Pentru a se evita
acest efect negativ, repetarea tratamentului trebuie să se facă la un interval de 54-
60 de zile şi să se intercaleze tratamentele pe bază de PMSG şi FSH-p.
Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influenţate de vârsta
femelelor, rasă, mascul, sezon, nivelul producţiei de lapte, starea generală, etc. De
regulă, viţelele produc un embrion viabil mai puţin decât vacile adulte.

2.2.5. Fecundarea ovocitelor

Ovocitele sunt fecundate în urma însămânţării naturale sau artificiale. De

regulă, se efectuează două însămânţări artificiale la interval de 12-24 de ore de la
începutul căldurilor observate clinic sau, sistematic, după 56 şi 72 de ore de la
injecţia cu PGF2, sau după 36 şi 48 de ore de la retragerea implantelor sau
pesariilor.

2.2.6. Recoltarea embrionilor

Embrionii sunt colectaţi atunci când se găsesc în cornul uterin, după

ieşirea lor din oviduct (între zilele 4-5). Din motive sanitare şi de congelare se

73
preferă colectarea embrionilor încă incluşi în zona lor pelucidă (ies în a 9-a zi).
Cel mai frecvent, colectarea se realizează între zilele 6-8 după fecundaţie, de
regulă în ziua a 7-a.
Recoltarea embrionilor se face chirurgical şi nechirurgical. Mult timp,
metoda chirurgicală a fost singura utilizată. Tehnica operatorie presupunea
parcurgerea a două etape: laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital în
plagă şi recoltarea propriu-zisă a embrionilor prin spălarea cu un lichid cu o
compoziţie specială, a oviductelor (după un interval de timp mai mic de 3 zile
după însămânţare) sau a coarnelor uterine (după un interval de timp mai mare de 4
zile de la însămânţare). În prezent, metoda chirurgicală de recuperare a
embrionilor la vacă este abandonată, datorită inconvenientelor pe care le prezintă.
Astăzi, este generalizată metoda nechirurgicală de prelevare a embrionilor, a cărei
principiu constă în spălarea coarnelor uterine cu un mediu special preparat,
spălare care se realizează în condiţii de asepsie în a 7-a zi de la însămânţare.
Tehnica nechirurgicală de colectare a embrionilor s-a perfecţionat continuu, firme
specializate produc pe scară industrială mediul de recoltare, congelare,
decongelare şi întreaga aparatură necesară recoltării şi transferului embrionilor.
Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multe
operaţii: contenţia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei şi a regiunii
perivulvare, identificarea prezenţei corpilor galbeni pe ovar, introducerea
lichidului de spălare în lumenul coarnelor uterine, spălarea acestora, recuperarea
lichidului împreună cu embrionii, identificarea şi recuperarea embrionilor din
lichidul recuperat şi supus decantării şi aprecierea morfologică a acestora.
În condiţii de fermă, recoltarea embrionilor se face la locul unde se găseşte
femela donatoare,dupa contentia adecvata. Pentru a suprima durerea, se practică
anestezia epidurală cu 4-6 ml procaină 2% sau cu 10 ml ludocaină 1%, care
blochează nervii coccidieni şi ultimele perechi de nervi sacrali (S 3, S4, S5). Acul se
introduce între prima şi a doua vertebră coccigiană sau între ultima vertebră
sacrală şi prima vertebră coccigiană, anestezia instalându-se după circa 10-15
minute şi durează în jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada,
anusul, rectul, vulva, vaginul şi uterul.
Se introduce, cu precauţiile de rigoare, mâna în rect, acesta se videază de
conţinut, apoi se apreciază răspunsul femelei la tratamentul poliovulator,
palpându-se cu atenţie ambele ovare şi numărâdu-se corpii galbeni (foto 19). În
cazul în care răspunsul la tratamentul de superovulare este pozitiv, se procedează
cu precauţie la introducerea cateterului de tip Folley cu două sau trei căi, prin
conductul cervical până în cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se
introduce pe lumenul acestuia un mandren (tijă metalică), care se menţine până se
ajunge în lumenul cornului uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8
cm de la bifurcaţia coarnelor uterine, pe unul dintre acestea, apoi se introduce de
la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer în scopul fixării cateterului şi pentru a
împiedica refularea din cervix a lichidului de spălare. Vasul din sticlă, ce conţine
lichidul de spălare se suspendă la 1,5 m de la sol şi, prin cădere, acesta ajunge prin
calea de admisie a cateterului în coarnele uterine. Irigarea acestora se face
continuu, calea de evacuare a lichidului este conectată, printr-un tub de plastic, la
vasul de colectare a mediului recuperat (de spălare).
Recuperarea lichidului de spălare se face prin calea de admisie (în cazul
cateterului cu două căi la care s-a adaptat o piesă în forma literei y) prevăzut cu
canal de admisie şi evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind
conectată la un filtru de colectare a cărui orificii au un diametru de 75 m, care
are rolul de reţinere a embrionilor, lichidul ce traversează filtrul fiind colectat într-
un recipient situat sub filtru.

74
Mediul folosit la spălarea unui corn
uterin se foloseşte la spălarea, în
acelaşi mod, a celui de-al doilea corn
uterin. Cantitatea de mediu care se
foloseşte pentru spălarea unui corn
uterin este de 300-500 ml, efectuându-
se irigări repetate şi un masaj
transrectal permanent al cornului
uterin perfuzat. Există diverse sonde
de recuperare a embrionilor, imaginate
de diverşi cercetători, care se bazează
pe acelaşi principiu constructiv .
Între momentul recuperării
embrionilor şi cel al inoculări lor în
uterul receptoarelor, zigoţii trebuie să
fie menţinuţi în viaţă în condiţii
speciale şi să fie manipulaţi în cele
mai bune condiţii tehnice şi igienice.
În ultimii ani s-a generalizat folosirea
unei soluţii tampon fosfat - PBS –
(Fosfat bufferet salin) pentru spălarea
coarnelor uterine şi pentru păstrarea
embrionilor recuperaţi. Foto 19 Recoltarea embrionilor prin
metoda nechirurgicală

Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotică de 290 miliosmoli şi

conţine multe săruri minerale, glucoză şi proteină (albumină bovină serică, 2-4 g/l,
sau ser de viţel fetal decomplementat 10%.
Toate mediile, soluţiile, serurile, enzimele şi substanţele crioprotectoare
care vin în contact cu embrionii trebuie să fie sterile. Tot materialul care nu se
aruncă (sonde colectoare, filtre, recipienţi din sticlă, sonde de transfer, etc.) care
necesită a fi sterilizate, se spală cu o soluţie de detergent netoxic, se clăteşte în apă
distilată, se usucă şi se înveleşte în hârtie în vederea sterilizării. Alegerea metodei
de sterilizare depinde de natura materialului (căldură uscată, căldură umedă,
substanţe antiseptice, vapori de formol etc.). Rezultatele recuperării embrionilor
depind în cea mai mare măsură de abilitatea şi antrenamentul operatorului.
Proporţia embrionilor recuperaţi, oscilează în medie, între 60-70% comparativ cu
numărul de corpi galbeni identificaţi pe ambele ovare. După colectarea
embrionilor se injectează donatoarei o doză de PGF 2, care are rolul de a liza
corpii galbeni, evitându-se astfel gestaţia multiplă.

2.2.7. Căutarea şi aprecierea calităţii embrionilor

După prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este

lăsat timp de 20-30 minute pentru decantare. Se îndepărtează supernatantul iar
stratul inferior în care se regăsesc şi embrionii recoltaţi, se transferă într-o placă
Petri cadrilată cu diametrul de 10 cm, (foto 20) sau se agită în mediu din filtrul
colector şi se toarnă în placa Petri. Recipientele de recoltare a mediului ca şi filtrul
folosit la recuperarea embrionilor se clătesc de două trei ori.

75
 Examenul embrionilor în lichidul recoltat trebuie să se facă în cele mai
bune condiţii de asepsie, curăţenie şi la o temperatură constantă a laboratorului
(20o-25o). Embrionii bovinelor au un diametru de 150-190 microni, zona pelucidă
având o grosime de 12-15 µm. Pentru identificarea embrionilor, se examinează la
o stereolupă (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare pătrat de la nivelul plăcii
Petri. (foto 21).

Foto 20 Placa PETRI cadrilată Foto 21 Căutarea embrionilor în lichidul

folosită la căutarea embrionilor de spălare cu ajutorul stereolupelor
O dată identificaţi, embrionii sunt transferaţi cu ajutorul unei seringi de
aspirare, la care s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipetă, în plăci Petri
mai mici, cu diametrul de 5 cm în care se găseşte mediul de spălare la care s-a
adăugat 20% albumină serică bovină (BSA). Operaţiunea se repetă de 3-5 ori,
embrionii fiind transferaţi dintr-o plăcuţă în alta, schimbându-se de fiecare dată
pipeta de aspirare. În cazul în care embrionii sunt destinaţi exportului, aceştia sunt
trecuţi prin zece astfel de băi de spălare. Amestecul crioprotectorului cu mediul de
conservare (PBS 40% BSA sau 10-20% ser de viţel fetal) provoacă o creştere a
presiunii osmotice. Pentru a reduce şocul osmotic, embrionii sunt trecuţi succesiv
şi pe câte o durată de 5 - 10 minute în două-trei băi cu mediu de conservare cu o
concentraţie crescândă în crioprotector: glicerol 0,7 M şi apoi 1,4 M, DMSO sau
etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Această trecere a embrionilor în mediul de
conservare cu adaos de crioprotector se face la o temperatură cuprinsă între+20 oC
şi +30oC.
După ultima baie, adică în momentul în care este atinsă concentraţia finală
în crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condiţionaţi
pentru congelare, fie în fiole de sticlă de 1,2 ml, fie în paiete de polipropilen de
0,25 ml (de tip paiete fine folosite la conservarea spermei). Paietele sunt
identificate individual. Există bancuri de identificare ce permit pe de o parte
închiderea ermetică a paietei şi care poartă (sunt inscripţionate) toate informaţiile
necesare.
Pentru fiecare paietă trebuie să se menţioneze: identificarea donatoarei,
rasa, data colectării, numărul de embrioni, centrul de producţie.
Procedura de umplere a paietelor comportă trei compartimente lichide
separate de bulele de aer. Aceasta limitează orice risc de pierdere a embrionilor în
momentul manipulărilor efectuate cu umplerea sau evacuarea conţinutului
paietelor.
Embrionii sunt încadraţi în mai multe categorii calitative: excelent, bun,
acceptabil, inferior, degenerat, ovocit nefecundat.
În cursul examenului sub stereolupă la un grosisment mai mic de 80,
embrionul este întors cu ajutorul unei micropipete de sticlă în vederea aprecierii
morfologiei sale din toate unghiurile, unele imperfecţiuni putând scăpa observaţiei
în anumite poziţii ale embrionului.
Zona pelucidă garantează protecţia embrionului, motiv pentru care ea
trebuie să fie perfect integră, fără fisuri şi perfect sferică. Gradul de dezvoltare

76
embrionară în raport cu ziua colectării este principalul factor luat în considerare.
Embrionii care prezintă o întârziere în dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt
eliminaţi. Embrionii colectaţi în a şaptea zi de la debutul estrului trebuie să se
găsească în stadiul de morulă compactă/blastocist. Embrionii care conţin 16 celule
sau mai puţin, nu se reţin pentru transfer sau congelare, fiind într-o întârziere mare
a dezvoltării.
În stadiul de morulă compactă, limitele celulare sunt mai puţin distincte
întrucât blastomerele sunt strâns legate între ele şi dau un aspect de mure.
Prezenţa câtorva celule detaşate, în spaţiul perivitelin nu constituie un motiv de
eliminare întrucât majoritatea blastomerelor formează o masă sferică fără
opacitate marcantă.
În stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar,
trofoblastul) trebuie să fie vizibile şi să prezinte contururi bine delimitate.
Prezenţa blastomerelor în spaţiul perivitelin şi a unor granulaţii la
suprafaţa celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei întârzieri în
dezvoltare, absenţei contururilor celulare sau unei opacităţi marcante ale
blastomerelor constituie criteriu de eliminare a embrionilor. Embrionii a căror
aspect este îndoielnic sunt conservaţi una-două ore apoi vor fi examinaţi din nou.
Excelent este considerat
embrionul perfect ca aspect
morfologic şi corespunzător vârstei
(foto 22). Embrionul bun calitativ
prezintă unele imperfecţiuni: zona
pelucidă ovală, dimensiuni mai
mici ale embrionului, întârziere în
dezvoltare cu o zi, puţine celule
extrudate, mici. Embrionul
acceptabil este cel care este bine
conturat, însă prezintă unele
anormalităţi: un număr moderat de Foto 22 Embrioni buni pentru
celule excluse, dimensiuni congelare
mai mici, unele degenerări şi întârzierea cu o zi. Embrionul inferior prezintă
diverse degradări considerabile: celule veziculate, variabilitate mare în ceea ce
priveşte dimensiunile celulelor, întârzierea în dezvoltare cu două zile, absenţa
compactării. Embrionul degenerat prezintă degenerări evidente, iar ovocitele
nefecundate sunt cele care prezintă structură simplă a gametului femel, fără
celulele rezultate din segmentare (Seidel F.G. şi colab.,1991).

2.2.8. Conservarea şi deconservarea embrionilor

Embrionii pot fi conservaţi câteva ore „in vitro“ la 20oC într-un mediu de
conservare: PBS adiţionat cu 4 g/l albumină serică bovină, sau cu 10% ser de viţel
fetal decomplementat. În acest mediu, embrionii sunt menţinuţi până când sunt
transferaţi la receptoare. În cazul în care transferul nu se realizează în 6-8 ore de la
recoltare, se recomandă congelarea prin refrigerare a embrionilor, la o
temperatură de 0o-4oC într-un mediu de conservare identic. În acest fel embrionii
pot fi conservaţi una-două zile fără ca viabilitatea să fie afectată.
Conservarea de lungă durată a embrionilor – congelarea - rămâne cea mai
avantajoasă metodă de menţinere pentru un interval de timp practic nelimitat a
viabilităţii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii, trebuie să fie menţinuţi în stare
solidă, în azot lichid, la temperatura de circa -196 oC. La temperaturi mai scăzute
de -100oC, metabolismul celular este complet blocat, singura problemă mai

77
dificilă constând în atingerea acestor temperaturi fără a omorî embrionii. În timpul
congelării, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea gheţii intracelulare
şi concentraţia salină ridicată. Pentru a preîntâmpina efectul negativ al acestor doi
factori, metoda de răcire constă în deshidratarea parţială a celulelor şi evitarea
şocului produs de concentraţiile ridicate în săruri prin utilizarea unui

Crioprotector, în general glicerol

cu o concentraţie de 1,5 M (sau
10% în volum) în mediul de
congelare. Ca agenţi criopro-
tectori se mai pot folosi:
dimetilsulfoxid (DMSO), etilen-
glicol, glicerol, propilen-glicol. În
prezent sunt numeroase aparate
programabile (freezere) care
permit realizarea unei curbe
optimale de răcire (foto 23).
Substanţele crioprotectoare (în
general polialcooli) sunt capabile
să pătrundă uşor în celule printr-o
simplă difuziune (osmoză),
întârziind formarea Foto 23 Model de freezer
cristalelor de gheaţă prin coborârea punctului de îngheţ. Totodată, substanţele
crioprotectoare limitează efectele negative ale concentraţiei saline ridicate,
înlocuind o parte din apa intracelulară atrasă prin creşterea presiunii osmotice
extracelulare. Alţi compuşi pot avea un rol protector faţă de membranele celulare
(hidraţi de carbon, polivinilpirolidon), (Baril şi colab., 1993).
Viteza de coborâre a temperaturii are importanţă mare în protejarea
viabilităţii embrionilor. Mediul care conţine embrionii (extracelular) este mai
bogat în apă decât mediul celular. Prin coborârea temperaturii, primele cristale de
gheaţă se produc mai întâi în mediul extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a
concentraţiei în soluţie a fracţiunii necristalizate. Această concentraţie salină
ridicată va provoca ieşirea unei părţi din apa celulară, reducând în acest fel
formarea gheţii intracelulare. Dacă ritmul de răcire este prea rapid, apa
intracelulară nu poate ieşi în cantitate suficientă, cristalele de gheaţă se formează
în cantitate mare în interiorul celulelor şi aceste cristale îşi măresc talia lor în
timpul congelării şi decongelării distrugând structurile celulare. În cazul în care
ritmul de răcire este lent, deshidratarea progresivă a celulelor antrenează o
creştere importantă a concentraţiei în electroliţi, în mediul celular, modificând
proprietăţile fizico-chimice (efectul soluţiei), consecinţa fiind totdeauna pierderea
viabilităţii celulelor.
Astfel, integritatea celulelor vii după congelare este strâns legată de
dinamica apei intracelulare în timpul răcirii şi deci de viteza de congelare. În cazul
embrionilor, ritmul de răcire trebuie să corespundă pentru toate tipurile de celule
care-l compun. Rezultatele cercetărilor întreprinse pentru clarificarea aspectelor
referitoare la ritmul de congelare confirmă faptul că acesta trebuie să se
desfăşoare în două etape diferite: o congelare lentă, în două trepte: la început
4oC/min până la –6 –7oC şi 0,3-0,6oC/min între –7oC şi –30 –35oC, apoi o
congelare rapidă (bruscă) de la -35oC până la temperatura de păstrare -196oC.
Timpul de aşteptare al embrionilor din momentul recoltării şi până la
începerea congelării, nu trebuie să depăşească două-trei ore.
Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede următoarele:

78
 - alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun;
- timp de la recoltare până la începerea congelării: două-trei ore;
- introducerea embrionilor în mediul de congelare la temperatura
laboratorului (20oC);
- introducerea embrionilor în paiete identificate (mediu, bulă de aer,
embrioni +mediu, bulă de aer, mediu);
- răcirea până la -6oC sau -7oC cu o viteză de 4oC/minut;
- inducerea cristalizării (palier 5-10 minute);
- răcirea până la –30oC sau –35oC cu o viteză de 0,3 - 0,6oC/minut;
- introducerea paietelor ce conţin embrionii, direct în azot lichid şi
stocarea lor (-196oC).
Paietele se vor păstra în permanenţă în azot lichid până în momentul
transferului la femelele receptoare. Durata stocării embrionilor în azot lichid nu
influenţează supravieţuirea ulterioară a acestora.

Decongelarea embrionilor şi înlăturarea crioprotectorului

Embrionii congelaţi la -35oC nu sunt decât parţial deshidrataţi, o anumită
cantitate de gheaţă se formează inevitabil în celule, în momentul imersiei în azot
lichid (-196oC). Pentru a se evita ca prin decongelare să se producă o creştere a
acestor mici cristale de gheaţă care să distrugă celulele, decongelarea trebuie să se
facă în timp, cât mai repede posibil (circa 2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele
se scot repede din containerul cu azot lichid şi se introduc direct într-o baie de apă
la 37oC, unde se menţin circa 30 de secunde. Imediat după decongelare,
înlăturarea rapidă a crioprotectorului este indispensabilă supravieţuirii
embrionilor. Totuşi, celulele care conţin o concentraţie ridicată de crioprotector nu
trebuie să fie introduse direct într-un mediu izotonic, întrucât diferenţa mare de
presiune osmotică va provoca pătrunderea prea rapidă a apei în celulă, ceea ce va
risca să explodeze. De aceea, este necesară o îndepărtare progresivă a
crioprotectorului astfel încât ieşirea acestuia şi pătrunderea apei în celulă să fie
compatibile cu permeabilitatea membranei celulare.
Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizează o rehidratare lentă a
celulelor embrionare.

Diluţia crioprotectorului pe etape constă în trecerea succesivă a

embrionilor prin băi cu concentraţii descrescânde în crioprotector (de ex: etilen
glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M şi 0 M). Menţinerea embrionilor în fiecare baie
este de 5-10 minute. În acest caz concentraţia mediului în crioprotector este
inversă celei din perioada congelării. După înlăturarea lichidului de răcire,
calitatea embrionilor poate fi apreciată printr-un examen morfologic efectuat cu
ajutorul unei stereolupe (grosisment x80). În urma examenului morfologic, de
regulă sunt eliminaţi ca necorespunzători calitativ, 10-30% dintre embrionii
decongelaţi.
Diluţia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care conţine sucroză are
la bază accelerarea ieşirii acestuia din celule. Molecula de sucroză având o
greutate moleculară mare (344) nu pătrunde în celule prin simplă difuziune;
prezenţa sa în mediu crează o mărire a presiunii osmotice din mediul extracelular,
ceea ce va determina o difuziune accelerată a crioprotectorului din celule. Pentru
aceasta, embrionii decongelaţi sunt introduşi direct într-o soluţie de PBS care
conţine 0,25-0,5 M sucroză, apoi în două-trei băi succesive de PBS înainte de
examinare şi transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin
intermediul sucrozei, direct în interiorul paietei. Pentru aceasta, în momentul
introducerii embrionilor în paiete pentru congelare, alternanţa diverselor medii din

79
paietă este: la mijloc embrionul în mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, înconjurat de
bule de aer şi apoi la exterior PBS+sucroză 0,25 M. După decongelare paieta se
scutură în vederea amestecării mediilor pe bază de etilen glicol şi cele pe bază de
manoză, ceea ce va permite difuzia crioprotectorului în afara celulei în câteva
minute. Embrionii sunt transferaţi fără selecţie prealabilă, împreună cu conţinutul
paietei direct în uterul femelelor receptoare. Această metodă mai necesită unele
verificări.
Nivelul supravieţuirii embrionilor după decongelare este condiţionat de mai mulţi
factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor înainte de
congelare, femela donatoare etc.
Embrionii transferaţi în stadiul de morulă realizează o proporţie de
supravieţuire „in vitro“ mai redusă (64%), comparativ cu cei transferaţi în stadiul
de blastocist (81%), (Martinez şi colab., 1985).
Congelarea nu trebuie aplicată decât embrionilor de bună calitate, caz în
care procentul de supravieţuire după transfer fiind uşor inferior (10%) faţă de
nivelul supravieţuirii obţinut după transfer direct, fără congelare.
Originea genetică a donatoarei pare a avea un rol însemnat asupra
aptitudinii embrionului de a fi congelat. Acelaşi efect denumit şi „efectul
donatoarei“ a fost demonstrat prin faptul că procentul de supravieţuire a
embrionilor congelaţi în aceleaşi condiţii poate varia de la 0 la 78% în raport cu
donatoarea.

2.2.9. Transferul embrionilor

O atenţie deosebită va fi acordată selecţiei femelelor receptoare, întrucât
condiţionează în mare parte rezultatele după transfer. Aşa cum s-a menţionat în
capitolul anterior, receptoarele trebuie să aibă o activitate sexuală ciclică, să fie
bine dezvoltate corporal, fără afecţiuni ale tractusului genital. Alegerea
receptoarelor poate porni de la viţele în vârstă de 18 luni cu condiţia atingerii a cel
puţin 2/3 din greutatea corporală a adultului. Transferul embrionilor se face cu
foarte bune rezultate şi la vaci adulte în vârstă de 3-6 ani dacă funcţia de
reproducţie s-a desfăşurat normal.
Examenul femelelor receptoare se completează cu aprecierea ultimului
estru, care trebuie să aibă loc între parametrii fiziologici (comportament sexual,
calitatea mucusului cervical, starea de sănătate a conductului vestibulo-vaginal şi
al orificiului vaginal al cervixului).
Pregătirea receptoarelor constă într-o sincronizare cât mai perfectă a
ciclului sexual cu cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie în
călduri naturale fie în călduri induse printr-un tratament de control al ciclurilor
sexuale (vezi cele menţionate anterior). O atenţie specială se va acorda depistării
ciclurilor (dimineaţa, prânz, seara) apoi se determină momentul exact al
începutului estrului. Înaintea transferului propriu-zis se face un examen transrectal
al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul
embrionului se va face în vârful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafaţa
căruia este prezent corpul galben. Rezultate bune s-au obţinut şi prin depunerea
embrionului la circa 10 cm de la bifurcaţia coarnelor uterine în lumenul cornului
uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. Înainte şi imediat după transfer se va
evita orice stres: vaccinări, tratamente antiparazitare, ecornări, lotizări,
tuberculinări, recoltări de sânge etc. Se va evita schimbarea bruscă a regimului
alimentar: de exemplu introducerea masei verzi primăvara 4 săptămâni după
transfer. Variaţiile climatice determină o creştere a mortalităţii embrionilor după
transfer. În cazul folosirii embrionilor proaspeţi, receptoarele se ţin într-un grajd
curat şi cât mai aproape de donatoare.

80
 Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare se realizează
prin două metode: chirurgical şi nechirurgical.
Transferul chirurgical s-a aplicat în perioada de început şi a constat în
deschiderea cavităţii abdominale (pe linia albă sau în flanc), exteriorizarea
cornului uterin şi depunerea embrionului pe cornul uterin corespunzător ovarului
cu corp galben prin puncţionarea peretelui acestuia. Este o metodă laborioasă,
costisitoare, traumatizantă pentru femele, ceea ce a condus la abandonarea ei.
Metoda actuală care dă cele mai concludente rezultate este cea
nechirurgicală. Această metodă foloseşte calea vagin-cervix, asemănător
însămânţării artificiale. Pentru transfer se foloseşte un pistolet tip Cassou în care
se introduce paieta cu embrionul deconservat sau proaspăt recoltat. Pentru a se
evita contaminarea învelişului din material plastic al pistoletului Cassou pe timpul
traversării conductului vestibulo-vaginal, se fixează un al doilea înveliş din
material plastic care este secţionat pe toată lungimea sa. După ce pistoletul ajunge
în lumenul cervical, acest înveliş protector se retrage. Pentru a învinge rezisteanţa
cervixului (în această fază cervixul fiind închis) se folosesc uneori dilatatoare. La
circa 10 cm de bifurcaţie, pe cornul uterin corespunzător ovarului ce conţine
corpul galben, se depune embrionul, asemănător însămânţării artificiale. Această
metodă este exclusiv folosită în present. Traversarea cervixului trebuie să se
realizeze cu mare precauţie în vederea evitării lezionării mucoasei acestuia. În
vederea relaxării cervixului, a evitării contracţiilor organelor genitale se
efectuează anestezia epidurală cu 4-6 ml procaină 2%, sau alte preparate
medicamentoase cu efect similar.

2.3. Biotehnologia transferului de embrioni

la rumegătoarele mici

Ca şi la rumegătoarele mari, folosirea transferului de embrioni la

rumegătoarele mici se practică cu scopul multiplicării descendenţei femelelor cu
înalt potenţial genetic, introducerii de noi genotipuri prin importul de embrioni
congelaţi şi asigurării bazei morfo-fiziologice ale unui model modern de cercetări
fundamentale în reproducţia animalelor şi biologia celulară.
Reglarea şi controlul funcţiei de reproducţie la rumegătoarele mici sunt
influenţate considerabil de factorii de mediu. La latitudini mai mari de 35 o,
rumegătoarele mici au un sezon de reproducere limitat, care începe către sfârşitul
verii şi se încheie către finele sezonului de toamnă. În decursul unui an, funcţia
sexuală la oaie se caracterizează prin alternarea a două perioade:o perioadă de
anestru fiziologic, cuprinsă între sfârşitul iernii şi începutul verii;o perioadă de
activitate sexuală, cu derularea mai multor cicluri sexuale, cuprinsă între sfârşitul
verii şi începutul iernii (10-14 săptămâni după cea mai lungă zi).
Anestrul fiziologic se datorează atât factorilor materni (anestru de lactaţie),
cât şi factorilor climatici (anestru sezonier), efectul acestor factori suprapunându-
se.
Periodicitatea sexuală sezonieră este atribuită influenţei modulatoare a
fotoperiodismului, temperaturii, umidităţii şi alimentaţiei asupra unui ritm ciclic
anual de bază, condiţionat genetic.
Factorul principal în stimularea funcţiei sexuale la oi este reprezentat de
reducerea progresivă a numărului de ore lumină, iar cel subordonat este scăderea
temperaturii şi schimbarea alimentaţiei.
Din punct de vedere reproductiv oile sunt considerate ca „animalele zilelor
scurte“. Fotoperiodismul reglează funcţia de reproducţie la oi prin intermediul
melatoninei, hormon secretat de glanda epifiză. Epifiza controlează momentul
apariţiei maturităţii sexuale şi sezonul de reproducţie. Melatonina reglează funcţia

81
de reproducţie prin schimbarea secreţiei hormonilor gonadotropi. O dată cu
micşorarea zilei lumină, secreţia melatoninei creşte şi activează funcţia sexuală.
Factorii de mediu trebuie să aibă un anumit nivel pentru a influenţa pozitiv
funcţia de reproducţie: temperatura aerului 8-18oC, umiditatea relativă 65-85%,
durata zilei lumină - 4-7 ore. Alţi factori ai mediului ambiant (relaţiile dintre
indivizi, masculi/femele, femele/miei, nivelul alimentar) au un rol modulator în
blocarea sau declanşarea activităţii reproductive. Utilizarea acestor factori (de ex.
efectul „mascul“) permite să se controleze mai bine perioadele de reproducţie.
Gradul de ovulaţie variază în timpul sezonului de reproducţie. Nivelul
acestui indice este maxim la mijlocul perioadei sexuale. Oile ţinute la temperaturi
scăzute, în timpul verii, încep sezonul de reproducţie mai devreme decât cele care
în sezonul estival, au fost ţinute la temperaturi obişnuite acestui anotimp.
Oile expuse stresului termic în orele de dinainte sau de după estru, prezintă
tulburări de fecunditate. Variaţiile raţiei de hrană (date de variaţiile
disponibilităţilor alimentare) determină oscilaţii ale nivelului de fertilitate.
La latitudini medii, variaţiile fotoperioadei rămân factorul principal care
declanşează activitatea reproducţiei la oi (Thimonier J. şi colab., 1986).

2.3.1. Alegerea donatoarelor şi receptoarelor

Femelele care intră într-un protocol al transferului de embrioni trebuie să

fie selecţionate înaintea începerii operaţiilor propriu-zise.
Prima selecţie a donatoarelor se face după valoarea lor genetică pa baza
unor criterii apropiate aptitudinilor zootehnice cercetate la rasa respectivă. În
general, în alegerea donatoarelor se are în vedere ca acestea să se fi născut în
sezonul de reproducţie precedent, fără tulburări ginecologice, să nu fie gestante,
cu ovare normale, capabile să răspundă la tratamentul superovulator (examen
făcut prin ecografie sau endoscopie) (laparoscopie).
În cazul repetării tratamentelor de superovulare, se investighează, prin
probe de laborator, prezenţa sau absenţa anticorpilor contra hormonilor folosiţi la
tratamentul de superovulare. Femelele tratate de mai multe ori se pot imuniza
contra gonadotropinelor heterospecifice şi nu mai răspund la administrarea
preparatelor hormonale de acest tip.
În cazul folosirii nuliparelor, acestea trebuie să aibă o greutate corporală de
cel puţin 60% din greutatea femelei adulte şi să fie în vârstă de cel puţin 8-10 luni.
Înaintea lotizării, donatoarele (ca şi receptoarele) se supun mai multor teste
serologice pentru depistarea maladiilor contagioase, susceptibile a le afecta
(bruceloza, febra Q, clamidioza etc.). Acest criteriu este impus şi de legislaţia
sanitar-veterinară din mai multe ţări, care prevede pentru femelele donatoare să fie
indemne de boli contagioase. Lotizarea femelelor donatoare şi receptoare se va
face cu cel puţin două luni înaintea tratamentului, pentru a se evita efectele
negative ale stresului de adaptare la un nou mediu şi pentru a se instala o nouă
ierarhie în interiorul lotului reconstituit.
Donatoarele şi receptoarele trebuie să fie supuse unui tratament
antiparazitar cu spectru larg cu cel puţin o lună înaintea începerii tratamentului. În
cazul examenului coprologic pozitiv, tratamentul va fi în special dirijat contra
infestaţiei constatate.
Alimentaţia donatoarelor şi receptoarelor se va face după norme ştiinţifice.
Creşterea nivelului energetic alimentar pe durata a trei săptămâni care
precede folosirea la reproducţie (flushing) provoacă, la ovine, o creştere a

82
nivelului ovulaţiei pentru femelele supuse tratamentului de inducere a ovulaţiei şi
o diminuare a luteolizei premature pentru oile supuse superovulării. Practica
„flushing“-ului este recomandabilă atât pentru donatoare cât şi pentru receptoare
şi în special când alimentaţia nu acoperă în totalitate nevoile energetice.
La receptoare, nevoile nutriţionale suplimentare datorate gestaţiei, nu sunt
diferite de cele legate de o gestaţie naturală, dar ele trebuie luate în consideraţie
pentru a se evita avortul consecutiv subalimentaţiei.
În preajma fătării, o supraveghere atentă a femelelor previne mortalitatea
perinatală şi erorile de descendenţă (filiaţie).
Alegerea donatoarelor se face pe baza performanţelor genetice, starea
fiziologică şi sanitară. Donatoarele, în general, trebuie să fie de vârstă medie, să
aibă o carieră de reproducţie fără tulburări notabile, să fie sănătoase în urma
examenului clinic general şi ginecologic, făcut la trei luni înaintea transferului de
embrioni. Se respectă un interval de cel puţin 5 luni între ultima fătare şi începutul
tratamentului.
Alegerea receptoarelor se face, în general, după aceleaşi criterii ca
donatoarele, valoarea genetică nefiind luată în consideraţie. Nuliparele sunt cele
mai recomandate. În momentul transferului, receptoarele trebuie să fie în vârstă de
8-10 luni şi cu o greutate de cel puţin 60% din greutatea medie a femelei adulte
din rasa respectivă (30-35 Kg). În cazul în care receptoarele sunt achiziţionate,
acestea se integrează crescătoriei cu cel puţin trei luni înaintea începerii
tratamentului, pentru a se adapta la noile condiţii, după ce au fost alese pe baza
unor criterii stricte, întrucât femelele destinate reformei prezintă adeseori
probleme de reproducţie şi sanitare.
Cu trei luni înaintea transferului embrionar şi până la fătare se evită orice
tip de stres: alimentar, traumatic, profilactic, sanitar, social etc.

2.3.2. Sincronizarea estrului şi ovulaţiei la femelele donatoare

şi receptoare

Tratamentele hormonale specifice donatoarelor şi receptoarelor se fac

pentru a induce estrul şi superovularea (donatoarelor) sau ovulaţia (receptoarelor)
la un moment predeterminat. Aceste tratamente urmăresc de fapt un control
temporar al activităţii ovariene, prin mimarea, mai mult sau mai puţin, a
mecanismelor endocrine care controlează ciclul sexual.
Donatoarele şi receptoarele sunt supuse unei serii de intervenţii,
cronologic precise. Înainte de provocarea hormonală a superovulaţiei se impune
stabilirea cu exactitate a momentului apariţiei ciclului estral. Depistarea
manifestării căldurilor se face de două ori pe zi (dimineaţa şi seara) prin folosirea
berbecilor încercători de calitate. Pentru provocarea superovulaţiei, se folosesc oi
cu ciclu natural sau sincronizat.
Pentru standardizarea stării fiziologice a donatoarelor la începutul
stimulării şi mai ales sincronizarea intrării în estru la terminarea tratamentului
stimulativ, acestea sunt supuse unui tratament progestativ. La sfârşitul
tratamentului progestativ, stimularea creşterii foliculare se face prin administrarea
hormonilor gonadotropi cu scopul creşterii numărului de ovulaţii/femelă
(superovulaţie). Atât pentru sincronizare (tratamente progestative) cât şi pentru
stimularea ovarină (tratament gonadotrop) se folosesc mai multe variante.

83
 2.3.2.1. Tratamente progestative de sincronizare

Diferă prin substanţele progestagene folosite şi prin calea de administrare:

a) injecţii zilnice a câte 12 mg de progesteron intramuscular timp de 17-21
de zile la capră sau 12-14 zile la oaie;
b) implante vaginale, reprezentate de bureţi de poliuretan impregnaţi cu 60
mg acetat de medroxiprogesteron (MAP) sau 30-40 mg acetat de fluorogeston
(FGA) sunt în prezent cele mai folosite;
c) implante cu synchro-mat B (norgestomet-6 mg) care sunt inserate sub
pielea de la nivelul suprafeţei externe a urechii. Eficacitatea acestei căi de
administrare a progesteronului este asemănătoare celei a pesariilor vaginale.
Cel mai folosit tratament de sincronizare este cel care apelează la pesariile
vaginale impregnate cu FGA.
Durata tratamentului diferă în raport cu specia şi cu sezonul.
La ovine, oricare ar fi sistemul de impregnare folosit, durata recomandată
a tratamentului variază în funcţie de perioada anului: 14 zile în timpul sezonului
sexual şi 12 zile înafara sezonului sexual.
La caprine, durata tratamentului trebuie să fie de 17-21 zile (tratament
lung), fie 10-12 zile (tratament scurt) în asociere cu prostaglandinele.
În cazul tratamentului scurt, la caprele donatoare, durata acestuia este mai
scurtă decât cea a unui corp galben ciclic, de aceeea se intervine cu o injecţie de
PGF2 (50 µg Cloprostenol, Estrumate, Flavoliz etc), 48 ore înaintea tratamentului
progestativ pentru a liza corpii galbeni ce pot fi încă activi în momentul retragerii
suportului de progestagen.
d) sincronizarea estrului poate fi făcută fără a se realiza impregnarea
printr-un progestagen. Se poate induce luteoliza sincronă prin două injecţii, la
interval de 10-14 zile, de prostaglandină F2, (50-100 µg de Cloprostenol etc).
Această metodă nu dă rezultate la femelele neciclice (în afara sezonului sexual),
iar pe de altă parte, procentul ouălor divizate este mai slab la femelele donatoare
decât în cazul unui tratament progestativ.

2.3.2.2. Tratamentele de stimulare ovariană

Stimularea creşterii foliculare pentru inducerea superovulaţiei donatoarelor

sau ovulaţiei receptoarelor survine cel mai adesea la sfârşitul tratamentului
progestativ, şi este realizată prin injecţii intramusculare de gonadotropine
hipofizare sau extrahipofizare.
Tratamentul gonadotrop pentru inducerea superovulaţiei poate fi efectuat
în cursul unui ciclu natural, prin începerea stimulării cu 48 de ore înaintea
momentului prezumat al luteolizei spontane, însă această metodă este ineficace în
perioada anovulatorie şi dificil de aplicat în cazul tratamentului mai multor femele
nesincronizate în prealabil.
Administrarea gonadotropinelor are loc, în general, la finele tratamentului
progestativ (ceea ce corespunde fazei foliculare a ciclului sexual), care va
determina o creştere a numărului de foliculi preovulatori şi la ovulaţia mai multor
foliculi.
Stimularea cu ajutorul PMSG constă într-o injecţie de 750-1500 U.I.
PMSG efectuată 48 de ore înaintea terminării tratamentului progestativ. Durata
relativ lungă a activităţii biologice (circa 4-5 zile), nivelul ridicat de PMSG încă în
circulaţie în preajma estrului provoacă o activitate foliculară anormală în acest

84
stadiu care perturbă mediul hormonal în timpul fecundaţiei şi a primelor faze ale
dezvoltării ouălor. Aceste efecte au drept consecinţă generală o slabă producţie de
embrioni de bună calitate şi ca urmare, acest hormon este din ce în ce mai puţin
folosit pentru inducerea poliovulaţiei. Repetarea tratamentului superovulator cu
PMSG determină o reducere accentuată a răspunsului ovulator.
Stimularea cu ajutorul FSH-ului este cea mai frecventă metodă folosită
pentru provocarea superovulaţiei la rumegătoarele mici.
Cantităţile de FSH care se administrează pentru a obţine superovularea sunt
adesea exprimate în mg standard Armour (1 mg Armour este o unitate a activităţii
unui test biologic ce corespunde a circa 10-14 µg de hormon FSH pur).
Administrarea FSH-p se face în zilele 2, 3 sau 4 după tratamentul
progestativ, în doză de 12-24 mg/femelă. Perioada scurtă de înjumătăţire (3-4 ore),
face ca doza să fie repartizată în mai multe injecţii pentru a determina
superovularea. În intervalul de două-patru zile de la încheierea tratamentului
progestativ se injectează FSH-p, 4-8 injecţii, de două ori/zi, la interval de 10-12
ore, în doze descrescânde (trei zile de tratament).
Tratamentul de superovulare se poate face şi cu extracte hipofizare de
cabaline - HAP (horse anterior pituitary) - sau HMG (human menupausal
gonadotropin) care determină un răspuns ovulator şi o producţie de embrioni
similare celor observate după tratamentul cu FSH-p la caprine şi ovine, însă aceste
preparate sunt puţin disponibile.
Pentru provocarea superovulaţiei se poate asocia tratamentul pe bază de
PMSG cu cel pe bază de FSH-p. Pentru aceasta, se asociază 48 de ore înaintea
retragerii spongiilor vaginale cu o injecţie de 12-18 mg de FSH-p ce se
administrează în 6 injecţii sau într-o singură injecţie concomitent cu administrarea
de PMSG.
Răspunsul superovulator este condiţionat de mai mulţi fatori, între care
menţionăm: rasa, individul, apariţia anticorpilor în cazul repetării tratamentului,
tipul de hormon folosit etc.

2.3.2.3. Inducerea estrului şi ovulaţiei la receptoare

Programarea estrului la femelele receptoare se face printr-un tratament

progestativ identic celui folosit la donatoare. Atunci când transferul se face fără
interval (imediat), tratamentul progestativ al donatoarelor şi receptoarelor începe
în acelaşi moment, astfel încât să se găsească în acelaşi stadiu fiziologic în
momentul transferului embrionar.
O injecţie de PMSG se face către sfârşitul tratamentului progestativ:
injecţia cu PMSG se face cu 48 ore înaintea retragerii spongiilor vaginale la capră
şi în momentul retragerii acestora la oaie. Pentru caprele receptoare, injecţia se
face cu 48 ore înaintea retragerii bureţilor vaginali impregnaţi cu progestagene, iar
ovulaţia se produce cu circa 12 ore mai târziu decât la donatoarele supuse
aceluiaşi tratament asociat cu FSH-p. În acest caz, pentru receptoare se întârzie
terminarea tratamentului progestativ cu circa 12 ore în raport cu donatoarele care
au fost tratate cu progesteron asociat cu FSH-p.
La oile receptoare, injecţia de PMSG se face în momentul retragerii
spongiilor vaginale. Oile intră în călduri după circa 36 de ore, cu o întârziere de 12
ore, în raport cu donatoarele tratate cu FSH-p.
Costul total al tratamentului este de circa 150-225 ff.
Dozele de PMSG variază cu sezonul, vârsta şi nivelul producţiei de lapte
(caprine).

85
 La donatoare, variabilitatea momentului ovulaţiei este un factor limitant al
nivelului de fecunditate, mai ales critic în cazul folosirii spermei congelate.
Principalul criteriu folosit pentru depistarea începutului estrului este
manifestarea reflexului de acceptare a saltului masculului. Pentru a determina
practic debutul estrului, se foloseşte un mascul vasectomizat sau prevăzut cu şorţ,
care este pus în prezenţa femelei la interval de 4-6 ore, între 20 şi 60 de ore după
terminarea tratamentului progestativ. Insuficienţa libidoului la mascul poate fi un
factor limitant al eficacităţii detecţiei estrului.

2.3.3. Însămânţarea femelelor donatoare

Fecundarea donatoarelor poate fi făcută fie pe cale naturală, practicându-se

monta liberă sau dirijată, fie prin însămânţare artificială, când se poate întrebuinţa
sperma proaspătă sau congelată care poate fi depusă fie pe cale cervicală sau
direct în uter sub controlul endoscopic.
În toate cazurile este important să folosim masculii cu o fertilitate ridicată.
Monta a fost cea mai întrebuinţată metodă de însămânţare a femelelor
donatoare în cursul sezonului sexual atât la ovine cât şi la caprine, însă nu permite
folosirea raţională a masculilor valoroşi, repartiţia geografică a acestora fiind
neuniformă, aceştia fiind concentraţi în centrele în care se practică însămânţarea
artificială (depozite ORSA), când se practică monta liberă, masculii şi femelele
sunt lăsaţi împreună pe perioada estimată a căldurilor, pentru fiecare mascul
repartizându-se 3-4 femele. În cazul practicării montei dirijate, fiecare femelă
descoperită în călduri trebuie să fie dată la montă de cel puţin două ori la interval
de 10-12 ore. Momentul însămânţării artificiale cea mai eficace este între 12 şi 24
de ore de la începutul estrului.
Când se practică monta în contrasezon, absenţa sau slaba manifestare a
libidoului masculilor sunt cauzele nerealizării procentului de fecunditate normal la
femelele donatoare, la care se adaugă şi puterea fecundantă foarte scăzută a
spermei în această perioadă.
Însămânţarea artificială permite valorificarea spermei masculilor a căror
valoare genetică este cunoscută. Cercetările au demonstrat faptul că transportul şi
supravieţuirea spermatozoizilor în căile genitale femele sunt perturbate după
tratamentul progestativ şi/sau cu prostaglandine asociate şi a inducţiei ovulaţiei
(Evans şi colab., 1984).
Eficacitatea însămânţării artificiale endo- sau exocervicale la
rumegătoarele mici superovulate este sensibil redusă comparativ cu animalele
martor nesuperovulate. Nivelul ouălor divizate obţinute prin această metodă este
adeseori insuficient şi inferior celui obţinut după montă.
Mai mult, nivelul fecundaţiilor este strâns dependent de nivelul răspunsului
ovulator la tratamentul de stimulare.
La ovine, se foloseşte pentru însămânţare numai sperma proaspătă.
Conservarea spermei de berbec reduce sub 40% procentul de fecunditate a oilor
însămânţate pe cale cervicală. Doza de spermă este de 2x400x106 spermatozoizi
total în sperma proaspătă, sperma depunându-se la intrarea în cervix. Anatomia
cervixului nu permite trecerea instrumentelor clasice de însămânţare.
La caprine, conservarea spermei prin congelare este o practică curentă.
Sperma se depune pe canalul cervical la 48 şi 54 de ore (două însămânţări
artificiale) sau la 30, 48 şi 54 de ore (trei însămânţări artificiale) după sfârşitul
tratamentului progestativ. Totuşi, procentul ouălor fertilizate este scăzut, datorită

86
faptului că nivelul ridicat de estrogeni după un răspuns bun la tratamentul
progestativ, inhibă transportul spermatozoizilor pe căile genitale femele.
Însămânţarea artificială intrauterină, sub controlul endoscopic, este destul
de răspândită la rumegătoarele mici. Această tehnică permite folosirea spermei
congelate şi obţinerea unui procent de fecunditate ridicat pentru ovocite. Numărul
de spermatozoizi mobili/doză prin practicarea acestei tehnici poate fi redus la
circa 80-100 milioane şi se face o singură însămânţare artificială.
Însămânţarea artificială intrauterină se face la 48-60 de ore după sfârşitul
tratamentului progestativ sau la 20-24 de ore după începutul estrului la capre sau
la 32 de ore după începutul căldurilor la oi (87% embrioni viabili).

2.3.4. Recoltarea embrionilor

Operaţiile de colectare şi transfer a embrionilor sunt eficiente sub

anestezie generală, femelele fiind supuse, în prealabil, unei diete alimentare şi
hidrice în cursul a 24 de ore care premerg intervenţia chirurgicală.
Embrionii sunt recoltaţi prin „spălări succesive“ a celor două coarne
uterine în a 6-a sau a 7-a zi după începutul estrului.
Acest interval de timp relativ scurt în care embrionii pot fi recoltaţi, este
condiţionat de mai mulţi factori:
- trecerea embrionilor din lumenul oviductului în cel al coarnelor uterine
se produce începând cu a 4-a zi;
- pentru raţiuni sanitare, legislaţia prevede ca embrionul să fie transferat
înainte de a ieşi din zona pelucidă, care poate surveni începând cu a 8-a
zi;
- congelarea embrionilor se poate face cel mai bine când aceştia se
găsesc în stadiile de morulă compactă şi blastocist (a 6-a sau a 7-a zi de
la începutul estrului).
Mediul de colectare este PBS (phosphate buffered saline) cu adaos de 2%
albumină serică bovină sau de 10% ser de viţel fetal menţinut la 37oC.
Embrionii sunt recoltaţi aproape în exclusivitate, fie prin laparotomie
abdominală (metoda chirurgicală), fie sub control endoscopic (colectare prin
endoscopie sau laparoscopie).
S-a încercat colectarea embrionilor şi prin mijloace nechirurgicale, pe cale
cervicală, asemănător ca la rumegătoarele mari sau la cabaline, însă rezultatele
sunt foarte slabe, datorită traversării dificile a conductului cervical şi a
imposibilităţii manipulării coarnelor uterine prin palpare rectală.
Recoltarea prin metoda chirurgicală se face pe femela sub anestezie
generală, contenţionată pe o masă în decubit dorsal, cu o înclinare antero
posterioară de 35-45o.
Se face o incizie lungă de 8-10 cm pe linia albă înaintea ataşării mamelei.
Se exteriorizează coarnele uterine, se numără corpii galbeni de pe ambele ovare,
pentru a se aprecia răspunsul la tratamentul de superovulare (foto 29). În cazul în
care recoltarea se face după două-patru zile de la debutul estrului, majoritatea
embrionilor se regăsesc în lumenul oviductului. Un cateter cu un diametru de 1
mm se introduce circa 2 cm pe lumenul oviductului prin pavilion, apoi 4 ml de
PBS sunt injectaţi cu scopul de a-i antrena în coarnele uterine. Apoi se spală
coarnele uterine sau se recuperează la nivelul pavilionului oviduc-tului perfuzatul
injectat la baza coarnelor uterine .
În cazul în care recoltarea embrionilor se face în zilele 6-7, se spală fiecare
corn uterin cu ajutorul lichidului special introdus la acest nivel. Se face o puncţie
la baza coarnelor uterine, la nivelul ligamentului intercornual. Pe la nivelul

87
puncţiei se introduce o sondă Folley. Lumenul uterin la baza coarnelor uterine este
obturat, prin umflarea balonaşului situat la extremitatea sondei. Printr-un cateter
introdus la nivelul joncţiunii utero-tubare se injectează 40-50 ml de PBS,
recuperarea lichidului care antrenează şi embrionii făcându-se prin sonda Folley.
Mediul de spălare poate fi injectat la nivelul sondei Folley şi recuperat prin
cateterul introdus anterior (perfuzie anterogradă ) legat cu un tub steril plasat într-
o baie marină la 37oC. Se procedează la spălarea succesivă şi separată a celor două
coarne uterine apoi se introduce un antibiotic în cavitatea abdominală şi se închide
plaga de la nivelul coarnelor uterine şi al peretelui abdominal.
Această metodă este cea mai răspândită la rumegătoarele mici. Nivelul de
recuperare a embrionilor oscilează între 70 şi 90%, însă diminuă mult atunci când
se fac recoltări repetate de la acelaşi animal (52-24%) la ovine şi 65-42% la
caprine în cazul colectărilor 2 şi 3.
Recoltarea prin endoscopie (laparoscopie). Femela anesteziată se
contenţionează pe o masă de operaţie, în decubit dorsal, cu o înclinare antero-
posterioară de 30-45oC. O primă puncţie se face la 4-5 cm înaintea glandei
mamare şi la 10-15 cm la stânga liniei albe. Se introduce o canulă cu un diametru
de 7 mm, care poartă endoscopul. Se insuflă aer filtrat în cavitatea abdominală
pentru a separa viscerele de organele genitale. A doua canulă, cu un diametru de 5
mm, se introduce în partea opusă primei, în raport cu linia albă şi prin care se
introduce o pensă atraumatică pentru a manipula tractusul genital. Cu ajutorul
pensei, corpii galbeni de pe fiecare ovar pot fi număraţi. Un corn uterin se prinde
la nivelul ligamentului intercornual şi se puncţionează cu un ac având diametru de
2,5 mm.
A treia canulă, cu diametru de 5 mm, se plasează pe linia albă, la 15 cm de
prinderea glandei mamare. Prin această canulă se introduce o sondă cu trei căi
până în lumenul uterului. Balonaşul fixat la sondă este umflat cu aer prin
intermediul unei seringi cu scopul de a obstrua lumenul uterin la baza coarnelor
uterine. Extremitatea cateterului este deplasată cât mai aproape posibil de
joncţiunea utero-tubară. Pensa se fixează la nivelul istmului pentru a se evita
refularea mediului de colectare în oviduct.
Mediul de colectare se injectează prin corpul sondei (40-50 ml pentru
fiecare corn). Presiunea creată de lichidul introdus permite returul acestuia prin
cateter. Se poate folosi şi o sondă cu două căi. În acest caz, a doua puncţie se face
la vârful cornului uterin pe unde se inseră un cateter de injecţie, fixat la pensa
atraumatică. Mediul de colectare injectat prin cateter este recuperat prin sonda
plasată la baza coarnelor uterine. Proporţia de embrioni recuperaţi prin endoscopie
este inferioară cu 10-15% celei obţinute prin chirurgie, însă repetarea colectărilor
de la aceeaşi femelă prin endoscopie nu provoacă reducerea proporţiei de
embrioni colectaţi.

2.3.5. Examenul şi aprecierea embrionilor

Mediul de colectare recuperat după clătirea coarnelor uterine este turnat

într-o placă Petri cu fundul cadrilat care să uşureze cercetarea embrionilor la o
lupă binoculară. Embrionii depistaţi sunt aspiraţi cu ajutorul unei pipete fine sau a
unei seringi racordată la un tub transparent din plastic şi introduşi într-o cutie Petri
mai mică ce conţine PBS filtrat şi suplimentat cu 4% albumină serică bovină sau
10% ser de oaie sau de capră. Se apreciază calitatea embrionilor recuperaţi.
Mediul de colectare şi examen a embrionilor este menţinut la o
temperatură de +25+27oC, clasificarea embrionilor făcându-se în următoarele

88
categorii: nefecundaţi, degeneraţi, retardaţi sau morulă compactă, blastocişti
tineri, blastocişti extinşi sau blastocişti ieşiţi din zona pelucidă. Viabili se
consideră embrionii care au o formă regulată, sferică, cu citoplasma omogenă,
înveliă transparent, blastomere de dimensiuni identice distribuite uniform. Foarte
importantă este şi stabilirea nivelului de segmentare, dat fiind că încetinirea
ritmului de diviziune constituie, în majoritatea cazurilor, dovada unui început de
degenerare a embrionilor.
Embrionii sunt clasaţi în excelenţi, buni, de calitate medie sau
necorespunzători. Numărul de embrioni degeneraţi creşte considerabil cu vârsta
acestora, începând cu a 5-a zi de la însămânţarea artificială. Abaterile de la
morfologia normală survin la animalele donatoare sub acţiunea nefavorabilă a
unor concentraţii ridicate de steroizi ovarieni. Majoritatea embrionilor
degenerează în stadiul de morulă până în ziua a 8-a. În practică se poate asigura
un procent ridicat de fătări alegându-se embrioni după atingerea stadiului de
blastocist.
În momentul colectării - în ziua a 7-a - unii embrioni de oaie şi capră pot
prezenta o uşoară întârziere în dezvoltare (morulă compactă) pe când alţii sunt
într-un stadiu de dezvoltare mai avansat (blastocist ieşit din zona pelucidă). La
capre, dezvoltarea embrionară precoce apare cu o întârziere de 12-24 de ore în
raport cu cea observată la oi. În ziua a 7-a după debutul estrului, proporţia
embrionilor în stadiul de blastocist ieşit din zona pelucidă este mai ridicat la oi
decât la capre (oaie: 95%; capră: 63%) (Meineche-Tillman, 1990 citat de G. Baril
şi colab., 1993).
Embrionii care au o întârziere în dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt
eliminaţi.
În stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, trofoblast, buton
embrionar) trebuie să fie vizibile şi să prezinte un contur bine delimitat. Prezenţa
blastomerelor în spaţiul perivitelin, a granulaţiilor la suprafaţa celulelor, absenţa
contururilor celulare vizibile sau prezenţa unei opacităţi evidente a blastomerelor,
constituie criterii de eliminare a embrionilor.
După aprecierea calităţii embrionilor, embrionii transferabili sunt trecuţi
prin 10 băi succesive de PBS în vederea înlăturării eventualelor bacterii sau viruşi.
Această practică este recomandată de Societatea Internaţională de Transfer
Embrionar şi conferă o siguranţă sanitară pentru stocarea sau folosirea unui
embrion sănătos.

2.3.6. Congelarea-decongelarea embrionilor

Într-un interval de timp care nu depăşeşte două ore de la colectare, după

clătire, embrionii sunt trecuţi prin mai multe băi succesive de PBS adiţionat cu
glicerol: 0,7 M (10 minute), apoi 1,4 M (10 minute) sau etilen glicol 0,5 M (5
minute), 1 M (5 minute), 1,5 M (5 minute), asemănător celor precizate la bovine.
Embrionii sunt condiţionaţi în paiete mici (0,25 ml) şi congelaţi treptat, scăderea
temperaturii mediului făcându-se cu circa 1oC/minut până la -7oC. În acest stadiu,
cristalizarea este indusă (vezi cele menţionate la congelarea embrionilor bovini),
apoi scăderea temperaturii se face cu câte 0,3 oC/minut până la -35oC, după care
paietele sunt introduse direct în azot lichid.
Decongelarea se face, ca şi la embrionii bovini, prin imersia paietelor cu
embrioni, timp de 30 secunde, într-o baie-marie la 37oC. Apoi embrionii sunt
trecuţi succesiv prin 3-4 băi de PBS, la care s-a adăugat crioprotector în

89
concentraţie descrescândă (invers decât la congelare): glicerol (1,0 M, 0,7 M, 0,3
M, 0,0 M); etilen-glicol (1,0 M, 0,5 M, 0,0 M). Aceasta permite o rehidratare
progresivă a celulelor embrionare.
Se apreciază iarăşi calitatea embrionilor, cei care au suferit în timpul
acestor operaţii fiind eliminaţi.

2.3.7. Transferul embrionilor la femelele receptoare

Transferul embrionilor trebuie să se facă într-un interval cât mai scurt de

timp de la recoltare (sub 4 ore) sau decongelare (30-40 de minute). Transferul se
realizează aproape în exclusivitate chirurgical, laparoscopic.

2.3.7.1. Transferul chirurgical

După anestezia femelei receptoare, se face o incizie de 7-8 cm în lungul

liniei albe, 3-4 cm înaintea ataşării glandei mamare. Se exteriorizează coarnele
uterine, se examinează ovarele pentru a se alege cornul uterin pe care urmează să
se facă transferul. Embrionii sunt aspiraţi într-un volum mic de PBS (30-50 µl),
aplicând principiul celor trei compartimente (vezi transferul de embrioni la
bovine), de regulă într-un cateter adaptat la o seringă de 1 ml. Diametrul extern al
capilarului-cateter trebuie să fie de circa 1 mm. Se puncţionează cornul cu un ac
cu vârful conic, apoi se introduce 2-3 cm capilarul fără a leza mucoasa şi se
expulzează uşor embrionii către treimea superioară a cornului uterin ipsilateral
ovarului care prezintă un corp galben funcţional.
De regulă, se transferă doi embrioni în acelaşi corn uterin. După transfer se
instilă în cavitatea abdominală 1000000 U.I. penicilină, peritoneul şi pielea fiind
apoi suturate (foto 24).

Foto 24 Transferul embrionilor la oile receptoare (I.C.P.C.O.C. Palas-Constanţa)

2.3.7.2. Transferul embrionilor sub controlul endoscopic

90
 Receptoarea anesteziată este fixată în decubit dorsal pe o masă de
contenţie înclinată la 30-35oC. Se pregăteşte şi dezinfectează câmpul operator,
înaintea glandei mamare. Se face o puncţie în abdomen pe unde se introduce
canula endoscopului. Se insuflă puţin aer prin canulă pentru a se uşura
vizualizarea tractusului genital.
O a doua canulă este inserată în partea opusă primei, în apropierea liniei
albe, prin care se introduce o pensă de manipulare atraumatică. Cu ajutorul acestei
pense se controlează răspunsul ovulator pe fiecare ovar şi se alege cornul uterin pe
care urmează să fie transferaţi embrionii, corespunzător ovarului care are corpul
galben funcţional. Cornul uterin ales pentru transferul embrionilor este prins în
apropierea joncţiunii utero-tubare şi puncţionat cu un ac lung de 30 cm şi cu un
diametru de 1,5 mm, în prealabil inserat sub linia albă. Embrionii sunt
cundiţionaţi într-un volum de 30-50 µl (sistem cu 3 compartimente: lichid, aer,
lichid+embrion) într-un capilar lung de 70 mm, cu diametrul de 1 mm, adaptat la
o seringă de 1ml printr-un tub lung de 20 de cm. Capilarul şi furtunul sunt
introduse într-un tub metalic care asigură rigiditatea şi maniabilitatea ansamblului.
Printr-o a 3-a canulă plasată pe linia albă la 15 cm de la ataşarea glandei mamare,
capilarul de transfer este introdus în cavitatea abdominală, apoi, prin punctul de
joncţiune în lumenul uterin unde cei doi embrioni sunt depuşi cu atenţie. După
retragerea instrumentelor, se pulverizează un antibiotic la nivelul celor trei locuri
de puncţie a peretelui abdominal. După căpătarea dexterităţii necesare, transferul
prin endoscopie se poate face în 5-10 minute, iar traumatismul provocat este mult
mai redus decât în cazul transferului pe cale chirurgicală.
Procentajul de reuşită a transferului de embrioni prin cele două metode
variază între 70,5% şi 75,6% la caprine şi între 69% şi 74% la ovine.
Pentru reuşita transferului de embrioni la rumegătoarele mici, o condiţie
importantă constă în sincronizarea cât mai bună a ciclurilor estrale la donatoare şi
receptoare, astfel încât, să existe concordanţă între particularităţile dezvoltării
embrionului şi modificările mediului uterin.

91