Diagnostic de laborator în

afecțiunile mediate imun

 Cuprins

1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție

imună modificată
2. Evaluarea imunității înnăscute
3. Evaluarea imunității dobândite
1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu
funcție imună modificată

Sunt folosite împreună cu alte proceduri clinice sau de laborator

pentru testarea funcției imune în diferite stadii diagnostice de boală
Bolile autoimune, alergiile, astmul, transplantul de organe și de
măduvă osoasă hematogenă, procesele maligne limfoide, cu
plasmocite sau tumorile solide, imunodeficiențele primare și
secundare

- Teste ale funcției sistemului imun înnăscut (evaluarea fagocitelor,

celulelor cu rol mediator, NK și complementul)
- Teste ale funcției sistemului imun dobândit (activitatea limfocitelor
T și B)
1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu
funcție imună modificată

Clasificarea testelor imunologice încearcă să ofere un

algoritm practic pentru diagnostic în funcție de
complexitatea acestora:

1.Teste primare (screening)

2.Teste secundare (funcționale)
3.Teste terțiare (specializate)
 Categorie Componentă Primar Secundar Terțiar
(screening) (funcțional) (specializat)
Sistem imun înnăscut
Fagocite Mo/Macrofage Hemoleucograma Aderență Molecule de
Neutrofile Chemotaxie adeziune
Eozinofile Fagocitoză Chemokine
Celule dendritice Activitate bactericidă Preluarea
particulelor
Oxidaza NADPH
Specii reactive ale
oxigenului (ROS)

Celule cu rol Mastocite Hemoleucogramă Triptaza Histamina,

mediator Bazofile tisulară prostaglandine,
leukotriene
Celule NK Perforine / CD3- / CD16+CD56+ Activitate citolitică Perforine
granzime
ADCC
Funcția C1-C9 CH50, C3, C4 Opsonic (C3b)
complementul Anafilatoxina (C3a, C5a)
ui Chemotactic (C5a)
Citolitic (C5-9)
 Categorie Componentă Primar Secundar Terțiar
(screening) (funcțional) (specializat)

Sistem imun dobândit

Funcția Limfocite Hemoleucograma Imunofenotipare Răspuns specific
limfocitelor B IgM, IgG, IgA, IgE CD19, CD20 la anticorpi pre-
IgG1, IgG2, IgG3, /postexpunere
IgG4

Funcția Limfocite Hemoleucogramă Teste de Analiza citokinică

limfocitelor T Imunofenotipare limfoproliferare in Activitatea
diferențială vivo la antigen și citolitică
CD3+/CD4+ mitogen
CD3+/CD8+
Testarea
hipersensibilității
de tip întârziat in
vitro
 1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție imună
modificată
Descoperirile majore ale secolului XX cu cel mai mare
impact asupra diagnosticului imunologic:

- Tehnologia hibridoamelor
• Kohler și Milstein (1975)
• producerea in vitro a unor cantități crescute
de anticorpi omogeni cu o singură specificitate
antigenică – anticorpi monoclonali

- Celulele splenice ale unui șoarece care a fost imunizat cu

antigenul dorit sunt sursa de celule B secretoare de
anticorpi
- Fuzionează cu celule mielomice ale unui șoarece cu mielom
- După fuziune rezultă un număr mare de clone hibride, fiind
selectate doar clonele de interes expandate în culturi
celulare pentru a produce cantități de anticorpi
monoclonali
 1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție
imună modificată
Flowcitometria (FCM) – fluorescent activated cell sorting (FACS)
 tehnologie pentru separarea şi identificarea celulară; cînd se referă la
caracterizarea L şi subpopulaţiilor lor - IMUNOFENOTIPARE
 utilizarea anticorpilor monoclonali
 detectarea și caracterizarea diferitelor celule și molecule ale sistemului imun
 epidemia SIDA în 1981 – recunoașterea și măsurarea limfocitelor T CD4+
(diagnostic, tratament, follow-up al pacienților infectați cu HIV)
 evaluarea afecțiunilor limfoproliferative, imunodeficiențelor și alte boli mediate
imun
 1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție
imună modificată

Flowcitometria (FCM) – fluorescent activated cell sorting (FACS)

 Metodă de măsurare a caracteristicilor fizice
şi/sau biochimice ale particulelor:
 Mărimea
 Granularitatea ETAPE
 Cantitatea de ADN 1. Prepararea suspensiei de celule
 Antigene de suprafaţă 2. Marcarea celulelor
3. Achiziţia datelor
 Metodă de sortare a celulelor
4. Stocarea datelor
5. Interpretarea datelor
COMPONENTELE CITOMETRULUI DE FLUX
• Sistem fluidic - Curent intern unicelular – “şir AcM sunt conjugaţi cu fluorocromi
indian”; Intersectare cu un fascicul de lumină
• Sistem optic
• Sistem electronic
1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul
afecțiunilor cu funcție imună modificată

Prezentarea rezultatelor:
Histograme – 1 parametru
Grafice – 2 parametri: 1 punct = 1 particulă
(dot-plot)
Considerații generale asupra pacienților Condiții clinice asociate
suspectați cu imunodeficiențe primare imunodeficiențelor primare (PID)
sau secundare Infecții
Neobișnuit de severe
Recurente
Suspiciune de imunodeficiență Agenți patogeni neobișnuiți
primară (PID)
Infecții ale sinusurilor
Antecedente heredocolaterale Malabsorpție
Infecții Autoimunitate
Tipul agentului infecțios Boală reumatoidă
Localizarea și frecvența infecțiilor Sindroame lupus-like
Eșecul antibioterapiei în eradicarea
infecției Abcese, leziuni tegumentare
Severitatea infecției Diaree cronică
Anomalii congenitale Vindecare incompletă a rănilor
Valori ale parametrilor de laborator Reacții adverse la vaccinurile vii
Autoimunitate Absența ganglionilor
Incidența crescută a proceselor maligne limfatici/amigdale
Absența timusului pe Rx
Considerații generale asupra pacienților suspectați cu
imunodeficiențe primare sau secundare
Agenți infecțioși asociați PID Agenți infecțioși asociați PID
Deficit al fagocitelor/fagocitozei Deficitul de anticorpi
Specii Pseudomonas Hemophilus influenzae
Specii Klebsiella Streptococcus pneumonie
Staphylococcus aureus Giardia lamblia
Serratia marcescens Specii de Cryptosporidium
Specii Nocardia Enterovirusuri
Specii Aspergillus Deficit al imunității celulare sau
Deficit complement sau ale combinată
componentelor complementului Candida albicans
Neisseria meningitides Pneumocystis carinii (jiroveci)
Neisseria gonorrhoeae Specii de Mycobacterium
Cytomegalovirus
Virus Epstein-Barr
Virus Varicella
Enterovirusuri
2. Evaluarea imunității Nitroblue tetrazolium
Istoric medical
Tipuri de agenți patogeni Dihydrorhodamine
Recurența infecțiilor

Rezultate hemoleucogramă și diagnostic diferențial

Evaluarea flowcitometrică a
subpopulațiilor limfocitare

Limfocite B Limfocite T PMN Complement

Cantitație imunoglobuline Test limfoproliferare Testarea fenotipică (FCM) CH50
Izohemaglutinine in vitro CD18/CD11 C3, C4
(anti-A, anti-B) AH50
Electroforeza proteinelor
serice Răspuns DHT la
antigene

Răspuns la Producerea de citokine Teste funcționale Cantitație componente C

imunizare specifică specific-antigenice Nefelometrie
(FCM, ELISA)

Fagocitoză, Testarea
Răspuns la Examinare Examinare Efecte respiratorii chemotaxie, funcțională
anticorpi țesut limfoid țesut limfoid NBT, DHR bactericidie componente C
2. Evaluarea imunității înnăscute

2.1. Evaluarea funcției fagocitelor

- Ce? Monocite circulante, macrofage tisulare, celule mieloide circulante (neutrofile) –

fagocitoză, activitate intracelulară bactericidă, inflamație; celule prezentatoare de
antigen (APC)
- Când? Infecții bacteriene recurente
- Cum? Cantitativ și calitativ Când suspectăm o disfuncție fagocitară?
• Infecții cutanate – S. aureus
• Gingivită
• Afecțiuni periodontale
• Ulcerații orale

Anomalii neutrofilice relevante din punct de vedere clinic:

 Neutropenie
 Anomalii de aderență și locomoție neutrofilică
 Anomalii ale formării granulelor intracitoplasmatice
 Anomalii ale funcției fagocitare
2. Evaluarea imunității înnăscute
Defecte cantitative ale fagocitelor

Tipul de celulă Defect al Exemple Manifestări clinice

sistemului imun
înnăscut
Defect al Neutropenie Congenital, infecțios, Creșterea
numărului de malign, boli susceptibilității la
neutrofile autoimune infecții bacteriene
Defect al Splenectomie Îndepărtarea Creșterea
numărului de chirurgicală a splinei susceptibilității la
macrofage ca urmare a unui infecții bacteriene
traumatism
Splenectomie Anemia sickle-cell
funcțională (siclemia)
2. Evaluarea imunității înnăscute
Defecte calitative ale fagocitelor
Componentă Defect al sistemului imun Exemple Manifestări clinice
înnăscut
Granule primare și Defecte de formare și de Sindrom Chediak- Albinism parțial, lizozomi
secundare conținut ale granulelor Higashi uriași, NK și CTL, scăderea
traficului lizozomal, infecții
bacteriene recurente
Oxidaza NADPH Defecte ale metabolismului Boală Formarea granuloamelor,
oxidativ granulomatoasă creșterea susceptibilității la
cronică infecții bacteriene și fungice
Defecte de adeziune Defecte ale aderenței și Deficit de Întârzierea separării
leucocitară (LAD) chemotaxiei datorate adeziune cordonului ombilica,
mutațiilor integrinei, care leucocitară tip 1 ulcerații tegumentare,
duc la defecte ale CD18 și (LAD1) periodontită, leucocitoză
CD15, absența/scăderea
adeziunii leucocitare și
emigrarea celulară
Interferon / IL-12 Defecte ale căii interferon / BCG Susceptibilitate la infecții cu
IL-12 Salmonella și mycobacterium
2. Evaluarea imunității înnăscute
2.2. Evaluarea funcției celulelor cu rol mediator
- celulele cu rol mediator sunt: bazofile, mastocite și eozinofile (au și activitate
fagocitară)
- au fost identificate 2 tipuri de mastocite:
mucoasa intestinală și țesutul peretelui alveolar – conțin doar triptază [MC(T)]
tegumentul normal și submucoasa intestinală – conțin triptază și chimază [MC(TC)]
triptaza este crescută în reacțiile anafilactice și mastocitoză (valoare diagnostică ca
marker al acestor afecțiuni)
- Histamina
mediator vasoactiv potent stocat ca moleculă pre-formată în granulele
citoplasmatice ale bazofilelor și mastocitelor
eliberată împreună cu alți mediatori ai inflamației (leukotriene) în reacții de
hipersensibilitate tip I (imediată)
eliberarea bazofilică de histamină (BHR) - test cantitativ de potență alergenică
(ingestia unui alergen alimentar) și model in vitro de studiu al factorilor declanșatori
ai eliberării mediatorului din bazofile
- Peptidul cationic eozinofilic (ECP) – nivel crescut în spută, ser și secreții nazale ale
pacienților cu infecții parazitare, rinită alergică, astm
 2. Evaluarea imunității înnăscute
2.3. Evaluarea funcției celulelor NK
- Rol important în apărarea anti-tumorală și anti-virală apoptoză (direct - perforine și
granzime; indirect - precipitarea IgG și inducerea ADCC = antigen-dependent cellular
cytoxicity)

- Când suspectăm o disfuncție a NK?

NK în sângele periferic la pacienții cu AIDS, infecții recurente cu virusul herpetic
NK + CTL sunt asociate cu un răspuns inflamator incontrolabil indus de infecție
injurie multiplă de organe = limfohistiocitoză hemofagocitică (HLH); un tip de
HLH este sindromul limfoproliferativ X-lincat (XLP) = răspuns imun anormal la
infecția cu EBV deces în cazul în care nu se efectuează transplant de măduvă
osoasă

- Investigații de laborator?
imunofenotipare (FCM)
teste de citotoxicitate – eliberarea de 51Cr la 4 ore
evaluarea flowcitometrică intracelulară pentru molecule defective în XPL1 și XPL2:
SLAM-associated protein (SAP), X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)
2. Evaluarea imunității înnăscute
2.4. Evaluarea funcției complementului

Când suspecăm o disfuncție a complementului?

Disfuncțiile complemetului sunt rare (0,03% din populație)!!
- Pacienți cu afecțiuni autoimune
- Pacienți cu infecții recurente
- Pacienți cu angioedem cronic recurent (defici autozomal dominant de C1 Inhibitor sau
prezenţei autoanticorpilor anti C1 INH, care conduc la o continuă activare şi consum a factorilor
sistemului complement).

Calea clasică (C1q, C1r, C4 și C2) – simptome lupus eritematos autoimun-like, cu infecții
recurente sino-pulmonare
Defecte ale C3 – infecții bacteriene recurente cu Streptococcus penumoniae
Defecte ale căii lectinei – infecții acute recurente ale tractului respirator, mai ales la copii
(S. Pneumoniae și N. meningitidis), precum și creșterea incidenței bolii reumatismale
Defecte ale căii alternative – infecții recurente cu N. Meningitidis
2. Evaluarea imunității înnăscute

2.4. Evaluarea funcției complementului

Cum evaluăm funcția complementului?

-Complementul hemolitic total – CH50

(calea clasică)

-Funcția căii alternative – AH50

-Nefelometria – prezența și cantitatea

componentelor complemetului, dar nu
determină funcția acestora
3. Evaluarea imunității dobândite

Standard – imunofenotipare
flowcitometrică (FCM)
- Limfocite T citotoxice (CD3+CD8+)
- Limfocite T helper (CD3+CD4+)
- NK (CD16+CD56+)
- Limfocite B (CD19+) (4-10%
limfocite)
3. Evaluarea imunității dobândite

3.1. Evaluarea funcției limfocitelor B

Când suspectăm o disfuncție a limfocitelor B?

- Agamaglobulinemia X-lincată (Bruton, 1952)

- Infecții repetate cauzate de microorganisme comune încapsulate: S.
Pneumoniae, S. Aureus, H. Influenzae tip b, N. meningitidis
- Diaree (25% din pacienții) asociată cu infecții cu Giardia lamblia
- Pacienți care nu răspund la imunizarea specifică – tetanos/difteria,
vaccinul anti-H. Influenza tip b (vaccin cu virus atenuat), vaccinul
anti-polio (vaccin cu virus viu administrat oral)
Markerii limfocitari şi distribuţia lor normală pe limfocitele B, T, NK
la adult la FCM:
3. Evaluarea imunității dobândite

3.1. Evaluarea funcției limfocitelor B

Evaluarea de laborator a funcției limfocitelor B

Testarea limfocitelor B se face prin teste in vivo - vaccinare

Vaccinurile proteice (tetanos) – evaluează răspunsul imun dependent
de limfocitele T
Vaccinurile polizaharidice (Pneumovax) – evaluează răspunsul imun
independent de limfocitele T
Antigenele recall – anticorpii produși au făcut switching-ul de clasă
(IgG)
Neoantigene – antigenul este nou pentru sistemul imun; anticorpii
produși sunt de tip IgM la prima vaccinare și de tip IgG la a doua
vaccinare
3. Evaluarea imunității dobândite
3.1. Evaluarea funcției limfocitelor B
Teste de screening
- CBC (complete blood count = hemoleucograma)
- Nivelul de imunoglobuline – nefelometrie (IgM, IgG, IgA) și IgE (ELISA);
niveluri < 300 mg/dl la adolescenţi/adulți și < 95% valoare de referință la
copii deficit imunoglobulinic
- Electroforeza proteinelor serice
- Determinarea anticorpilor naturali anti-grup sanguin (izohemaglutinine)
- Imunizarea pacientului cu vaccin proteic (tetanos/difteria) și vaccin
polizaharidic (vaccinul penumococic) și determinarea titrului anticorpilor
înainte și la 3-4 săptămâni de la imunizare

Teste specifice
- Flowcitometrie (CD19+, CD20+)
- Teste in vitro de stimulare a proliferării cu agenți mitogeni (PHA, LPS,
Concavalina A)
Nivelul de Ig corelat cu vîrsta IgE Seric total (UI/ml)
3. Evaluarea imunității dobândite
3.2. Evaluarea funcției limfocitelor T

Când suspectăm o disfuncție a limfocitelor T?

- diaree, infecții recurente cu agenți patogeni oportuniști (Candida albicans,

Pneumocystis jiroveci, CMV), infecții bacteriene cu localizări multiple,
infecții persistente, în ciuda tratamentului corespunzător
- erupții cutanate
- noduli limfatici nepalpabili, absența timusului (atenție! Stressul poate
induce reducerea imaginii Rx a timusului în 50% cazuri)
3. Evaluarea imunității dobândite

Când suspectăm o disfuncție a limfocitelor T?

Evaluarea de laborator a funcției - Teste de screening

limfocitelor T - Teste specifice
3. Evaluarea imunității dobândite
3.2. Evaluarea funcției limfocitelor T

Nivelul testului Investigații

diagnostic
Teste de screening CBC
Testare HIV
Imunofenotipare limfocitară
Testare cutanată a hipersensibilității de tip întârziat (adm. s/c Ag: 48-72
ore indurație: +/-)
Teste specifice Proliferarea limfocitelor T (agenți mitogeni)
Producția de citokine limfocitare (ELISA)
Evaluare flowcitometrică a proteinelor de suprafață sau
intracitoplasmatice – CD40L (CD154 pe suprafața limfocitelor T activate),
lanțul g al IL-2R (CD132), MHC-I, lanțul a al IL-7R (CD127), lanțurile
CD3, WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein)
Teste enzimatice: adenozin deaminaza
FISH pentru deleția 22q11
Analiza repertoriului TCR
Analize mutaționale
3. Evaluarea imunității dobândite

3.2. Evaluarea funcției limfocitelor T