Hemostaza si fibrinoliza

Lucrarea Practica nr. 3

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina Proteins C Proteina S Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Antiplasmina D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei Panelul de hipercoagulare Panelul CID

Cascada Coagulrii
Calea intrinsec Calea extrinsec

IX

XI

TF(III)-VIIa X
HMW Kininogen
Ca2+

Calea comun

XIIa

PL Protrombina (II) Xa
PL, Ca2+

XIa XII

IXa

PL, Ca2+ VIIIa

Va Trombina (IIa)

XIII

Colagen Prekalicreina

Fibrinogen (I)

Fibrina (Ia)

Monomeri XIIIa

Fibrin
Slide 25

Polimeri

Inhibitorii procesului de coagulare

Antitrombina formeaz complexe cu toi factorii coagulrii serin-proteazici, cu excepia FVII. Viteza de formare a complexelor este crescut sub efectul heparinei i al moleculelor cu aciune heparin-like de pe suprafaa celulelor endoteliale. Proteina C este transformat n enzim activ de ctre trombin, dup fixarea trombinei la nivelul unei proteine endoteliale (trombomodulin). Proteina C activat inactiveaz consecutiv cofactorii plasmatici V i VIII (prin proteoliz limitat). Funcia inhibitoare a proteinei C este amplificat de proteina S.

V,VIII

Trombina + Antitrombina

Proteina C activata

Proteina C

Trombina Proteina S

TM + trombina

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI Antitrombina

Proteina C Proteina S Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Antiplasmina D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei Panelul de hipercoagulare Panelul CID

ANTITROMBINA
Antitrombina este o proteina anticoagulanta Deficienta de antitrombina conduce la un status hipercoagulant si risc de TV Deficienta dobandita este mult mai frecventa comparativ cu deficienta ereditara de antitrombina

ANTITROMBINA
Recoltare:
Venopunctie; Vacutainer tub albastru (citrat);

Timp de lucru:
maxim 4 ore de la colectare; Separarea plasmei de celule realizata cat mai rapid posibil;

Valori normale:
80 130%; 17-39 mg/dl;

ANTITROMBINA
Metodologie:
Metoda functionala: se adauga trombina + substrat cromogenic
Heparina + Trombina + Antitrombina Substrat cromogenic

heparina

SPECTROFOTOMETRIE

Metoda imunologica: determinarea cantitativa a antitrombinei cu ajutorul anticorpilor impotriva antitrombinei

ANTITROMBINA
DEFICIT DE ANTITROMBINA (0,17%)

Test functional

Alte cauze

Test imunologic Deficit cantitativ (tip I) 0,02%

Deficit caliativ (tip II) 0,15%

ANTITROMBINA
Deficienta dobandita este intalnita in: scarderea sintezei hepatice, tratament cu Lasparaginaza, consum (tromboza, CID), cresterea clearenceului hepatic (doze mari de heparina), proteinurie, nivele crescute de estrogen (sarcina). Deficienta ereditara:
Heterozigoti au nivele AT = 45-75%, riscul de tromboza de 5 ori mai mare; Homozigotii incompatibile cu viata (exceptie mutatiile heparin-binding care au nivele normale ale antitrombinei dar activitate mai scazuta (deficienta tip II).

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina

Proteina C
Proteina S Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Antiplasmina D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei Panelul de hipercoagulare Panelul CID

Inhibitorii procesului de coagulare

V,VIII

Trombina + Antitrombina

Proteina C activata

Proteina C

Trombina Proteina S

TM + trombina

Proteina C este transformat n enzim activ de ctre trombin, dup fixarea trombinei la nivelul unei proteine endoteliale (trombomodulin). Proteina C activat inactiveaz consecutiv cofactorii plasmatici V i VIII (prin proteoliz limitat). Funcia inhibitoare a proteinei C este amplificat de proteina S.

PROTEINA C
Proteina C este natural anticoagulanta Deficienta de Proteina C conduce la un status hipercoagulant si risc de TV

Deficienta dobandita este mult mai frecventa comparativ cu deficienta ereditara de antitrombina si creste riscul de tromboza de 7 ori
! ! ! Nivelele Proteinei C sunt scazute de catre WARFARINA (Coumadin)

PROTEINA C
Recoltare:
Venopunctie; Vacutainer tub albastru (citrat);

Timp de lucru:
maxim 4 ore de la colectare; Separarea plasmei de celule realizata cat mai rapid posibil;

Valori normale:
70 140%

PROTEINA C Metoda functionala (colorimetrica):

Proteina C este activata prin adaugarea unui venin de sarpe specific;
Proteina C + Venin sarpe Substrat cromogenic Spectrofotometrie

Metoda imunologica:
ELISA; Detecteaza doar deficitele tip I;
!!! Se efectueaza la 10 zile de la intreruperea tratamentului cu Warfarina

PROTEINA C
Deficienta dobandita este intalnita in: scarderea sintezei hepatice, tratament cu L-asparaginaza, consum (tromboza, CID), deficit de vitamina K sau tratament cu Warfarina, prezenta de autoanticorpi. !!! Una din primele proteine care scad in disfunctia hepatica (T1/2 = 6-8 ore) Deficienta ereditara: Heterozigoti au nivele protein C = 35-65%, riscul de tromboza de 7 ori mai mare; Homozigotii rare, fatale daca sunt netratate (purpura fulminans sau CID in perioada neonatala)

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina Proteins C

Proteina S
Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Antiplasmina D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei Panelul de hipercoagulare Panelul CID

Inhibitorii procesului de coagulare

Proteina S este o proteina vitaminK dependenta
V,VIII

Trombina + Antitrombina

este un cofactor necesar pentru activitatea anticoagulanta a proteinei C. Proteina C cu proteina S ca si cofactor degradeaza partial factorii V si VIII.

Proteina C activata

Proteina C

Trombina Proteina S

TM + trombina

60% din proteina S totala este legata de C4b-binding protein, fiind inactiva. 40% din cantitatea de proteina S este libera, fiind activa functional.

PROTEINA S
Prepararea pacientului: 10 zile de la intreruperea tratamentuluicu Warfarina; Verificat daca pacienta este insarcinata sau sub tratament cu estrogeni; Recoltare: Venopunctie; Vacutainer tub albastru (citrat); Timp de lucru: maxim 4 ore de la colectare; Separarea plasmei de celule realizata cat mai rapid posibil; Valori normale: 70 140%

PROTEINA S

Metoda functionala:
masoara capacitatea proteinei S de a servi drept cofactor al proteinei C de a degrada factorii V si VIII si de a prelungi APTT sau PT. se realizeaza de prima intentie;

Metoda imunologica:
ELISA; Doua tehnici: Proteina S totala; Proteina S libera;

PROTEINA S
Deficit dobandit de proteina S:
Disfunctie hepatica; Tratament cu L-asparaginaza; Deficit de vitamina K sau tratament cu Warfarina; Consum (tromboza, CID); Sarcina sau tratament cu contraceptive, estrogeni; Reactii de faza acuta (cresterea C4b-binding protein) Varicela, HIV; Sindrom nefrotic.

PROTEINA S
Deficite ereditare de proteina S:
0,7% in populatia generala; Heterozigoti:
Activitate a proteinei S de 20-60%; Tromboze cu debut intre 10 si 50 ani;

Homozigoti:
In perioada neonatala purpura fulminans sau CID; Type Test functional Proteina S libera FAA Proteina S totala TAA

I
II (IIb) III (IIa)

n n

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina Proteins C Proteina S

Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden

Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Antiplasmina D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei Panelul de hipercoagulare Panelul CID

Inhibitorii procesului de coagulare

Activitatea anticoagulanta a proteinei C implica degradarea proteolitica a factorilor V si VIII la nivelul unor reziduri specifice arg, cu inactivarea acestora;
Factor V Leiden este o mutatie punctiforma G1691A (Arg506Glu);
Trombina Proteina S

V,VIII
Trombina + Antitrombina

Proteina C activata

Proteina C

Apare la 5% caucaziana;

din

populatia

TM + trombina

Mai exista alte doua mutatii activatoare ale factorului V, cauzatoare de rezistenta la proteina C.

FACTORUL V LEIDEN
Recoltare: Venopunctie; Vacutainer: - citrat analiza screening; - EDTA analiza genetica; Timp de lucru: In functie de test:
maxim 4 ore de la colectare - screening; 24 ore analiza ADN;

Separarea plasmei de celule realizata cat mai rapid posibil; Valori normale: PCA prelungeste APTT de doua ori la indivizii normali si < 2 la pacientii cu Factor V Leiden.

FACTORUL V LEIDEN
Metoda functionala:
Proba e diluata 1:5 cu plasma deficienta in factor V; Se efectueaza APTT pe proba diluata inainte si dupa adaugarea de PCA; Specificitate 100%, sensibilitate 100%;

Metoda PCR:
Se extrage AND-ul din proba nediluata, necentrifugata; Se determina prezenta mutatiei prin tehnici ca PCR-RFLP, TaqMan, etc. Singura care poate determina homo- sau heterozigotia;

Echilibrul coagulare - fibrinoliza

Calea intrinseca
activarea la contact

Calea extrinseca
eliberare de factor tisular

XII XI

XIIa XIa Ca2+

Fosfolipide

III VII IXa Plasminogen Xa Va Ca2+ Fosfolipide

(suprafata fibrinei)

VIIa

Inhibarea fibrinolizei PAI-1 Plasminogen

(faza fluida)

IX

VIII

Ca2+

t-PA / u-PA Protrombina

(Factor II)

Factor IIa
(trombina)

Plasmina XIII XIIIa

(insolubila) (suprafata fibrinei)

- antiplasmina

Plasmina
(faza fluida)

Fibrinogen

Fibrina
(solubila)

Fibrina

Produsi de degradare ai fibrinei

Fibrinopeptide A si B

COAGULAREA

FIBRINOLIZA

FIBRINOLIZA

http://www.ki.se/labmed/klinkem/f.gif

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina Proteins C Proteina S

Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden

Plasminogen
Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Antiplasmina D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei Panelul de hipercoagulare Panelul CID

PLASMINOGEN
Precursorul plasminei ce distruge trombii de fibrina; Plasminogenul e activat de t-PA sau u-PA; Plasmina degradeaza fibrinogenul si fibrina; Plasmina inactiveaza factorii Va si VIIIa; Deficienta ereditara este rara predispunand la tromboza;

PLASMINOGEN Recoltare:
Venopunctie; Vacutainer tub albastru (citrat);

Timp de lucru:
maxim 4 ore de la colectare; Separarea plasmei de celule realizata cat mai rapid posibil;

Valori normale:
75 130 %; 6 14 g/dl.

PLASMINOGEN
Metodologie:
Metoda functionala:
Se adauga streptokinaza + substrat cromogenic;
Plasma pacientului cu plasminogen + Steptokinaza

Plasmina

Substrat cromogenic

Spectrofotometrie

Metoda imunologica:
Radial imunodiffusion assay; Determina cantitatea de plasminogen.

PLASMINOGEN Deficienta dobandita:

Terapie trombolitica; Disfunctie hepatica; Consum (CID);

Deficienta ereditara:
Rara; Deficitul sever e asociat cu conjunctivitis lignosa: conjunctivita pseudomembranoasa caracterizata prin depozite masive de fibrina; depozitele de fibrina se datoreaza absentei sau scaderii clearence-ului fibrinei de catre plasminogen.

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina Proteins C Proteina S Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Plasminogen

Inhibitorul activatorului plasminogenului 1

Antiplasmina D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei Panelul de hipercoagulare Panelul CID

INHIBITORUL ACTIVATORULUI PLASMINOGENULUI 1

PAI-1 inhiba activatorul tisular al plasminogenului, tPA;

Nivele crescute de PAI-1 sunt asociate cu tromboza arteriala datorata inhibarii fibrinolizei; Deficitul de PAI-1 se asociaza cu sindromul hemoragipar datorita fibrinolizei excesive;

INHIBITORUL ACTIVATORULUI PLASMINOGENULUI 1

!!! PAI-1 prezinta ritm circadian ridicat dimineata !!! Recoltare:
Venopunctie; Vacutainer tub albastru (citrat);

Timp de lucru:
maxim 2 ore de la colectare; Separarea plasmei de celule realizata cat mai rapid posibil (centrifugare 2000-3000 g pentruu 15 minute);

Valori normale:
4 40 ng/ml (metada imunologica); 0 12 unitati/ml (metoda functionala).

INHIBITORUL ACTIVATORULUI PLASMINOGENULUI 1

Metoda functionala:
Plasma este adaugata unei cantitati cunoscute de urokinaza, PAI-1 din plasma pacientului leaga urokinaza, restul de urokinaza este inactivat prin adaugare de plasminogen, care va fi transformat in plasmina. Plasmina cliveaza un substrat cromogenic spectrofotometrie.

Metoda imunologica:
Anticorpi specifici;

INHIBITORUL ACTIVATORULUI PLASMINOGENULUI 1

Este un reactant de faza acuta; Sinteza lui e stimulata de nivelele de insulina sau glucoza;

Creste dupa evenimente trombotice si in sarcina; Nu este un test de rutina in clinica medicala;
Poate fi determinat la pacientii cu infarct miocardic la varste tinere.

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina Proteins C Proteina S Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1

Antiplasmina
D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei Panelul de hipercoagulare Panelul CID

ANTIPLASMINA
Plasmina mediaza fibrinoliza si antiplasmina inhiba plasmina; Factorul XIII activat leaga antiplasmnia la fibrina, protejand-o de fibrinoliza; Antiplasmina se leaga, de asemenea de plasminogen si il poate impiedica sa se lege la fibrina; Determinarea antiplasminei nu se face de rutina.

ANTIPLASMINA Recoltare:
Venopunctie; Vacutainer tub albastru (citrat);

Timp de lucru:
maxim 4 ore de la colectare; Separarea plasmei de celule realizata cat mai rapid posibil;

Valori normale:
48 80 mg/dl (metada imunologica); 80 130% (metoda functionala).

ANTIPLASMINA

Metoda functionala:
Plasmina in exces este adaugata peste plasma, excesul cliveaza un substrat cromogenic, eliberandu-l si putand fi detectat prin spectrofotometrie.

Metoda imunologica:
Foloseste anticorpi specifici anti-antiplasmina.

ANTIPLASMINA

Deficit dobandit de antiplasmina:

Disfunctie hepatica; Terapie trombolitica; Consum (CID)

Deficit ereditar de antiplasmina:

Cantitativ tip I; Calitativ tip II;

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina Proteina C Proteina S Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Antiplasmina

D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei

Panelul de hipercoagulare Panelul CID

D-DIMERI SI PRODUSI DE DEGRADARE AI FIBRINEI

Fibrinoliza este mediata de plasmina; Plasmina degradeaza :
trombii de fibrina la D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei (PDF); Fibrinogenul intact generand produsi de degradare ai fibrinogenului (PDF);

Prezenta indica:
D-dimerilor fibrina s-a format si a fost degradata; PDF fibrina/fibrinogen sunt degradate;

D-DIMERI SI PRODUSI DE DEGRADARE AI FIBRINEI

Recoltare:
Venopunctie; Vacutainer tub albastru (citrat);

Timp de lucru:
maxim 8 ore de la colectare; Separarea plasmei de celule realizata cat mai rapid posibil;

Valori normale:
D-dimeri < 0,5 micrograme/ml; PDF < 5 micrograme/ml;

D-DIMERI SI PRODUSI DE DEGRADARE AI FIBRINEI

Metodologie:
Latex aglutinare semicantitativa si cantitativa; ELISA - cantitativa; SimpliRed (sange integral) - semicantitativa;

Nu se foloseste de rutina pentru monitorizarea terapiei trombolitice; Nivele ridicate de FR pot conduce la rezultate fals pozitive;

D-DIMERI SI PRODUSI DE DEGRADARE AI FIBRINEI

D-dimerii si PDF sunt pozitive in:
CID; Tromboza venoasa; Infarct miocardic; Disfunctie hepatica (scade clearence-ul hepatic); Postoperator; Sangerare semnificativa; Hemodializa; Eclamsie; Cancer (grad scazut de CID cronic); Sarcina;

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina Proteins C Proteina S Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Antiplasmina D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei

Panelul de hipercoagulare
Panelul CID

Panelul de hipercoagulare
Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Antitrombina Antiplasmina Proteina C Proteina S Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Teste de agregare plachetara; Timp de trombina; Timp de reptilaza; Anticorpi antifosfolipidici; Mutatia G20210A a protrombinei;

Panelul de hipercoagulare
Cauze ereditare
Boala Deficienta de antitrombina Deficienta de proteina C Deficienta de proteina S Protrombina G20210A Hiperhomocisteinemie Factor V Leiden Prevalenta in populatia Prevalenta in populatia generala cu TV 0,17 0,14 0,5 0,7 2 5-10 5 (Caucazieni) 1-5 3-9 2-8 6 10-25 20-50

Panelul de hipercoagulare
Cauze dobandite
Varsta inaintata; Boli de colagen; Trombocitemie indusa de heparina; Hiperhomocisteinemie; Estrogen; Imobilizare / trauma; Boala Inflamatorie intestinala; Sindrom antifosfolipidic; Neoplazii; Sindrom nefrotic; Boli mieloproliferative; Postoperator; obezitate;.

Anticorpi antifosfolipidici Anticorpi anti-cardiolpina:

ELISA; Reactioneaza incrucisat cu antigenele dinsifilis;

Lupusul anticoagulant:
Pare sa se lege de fosfolipide impiedicand actiunea acestora de cofactor in cascaada coagularii; Doua teste screening + test mixing (daca e +) + teste de confirmare (cu exces de fosfolipide); Daca LA este prezent testele de coagulare raman prelungite dupa efectuarea mixingului.

Anticorpi antifosfolipidici

Teste screening:
APTT, timp de kaolin;

Teste de confirmare:
Testul de screening initial la care se adauga exces de fosfolipide pentru saturarea anticorpilor, conducand la scurtarea timpului de coagulare folosit.

Anticorpi antifosfolipidici
TESTE SCREENING

alungit STUDII DE MIXING

normal

nemodificat

scurtare

Identificarea deficitului de factor de coagulare

TESTE DE CONFIRMARE (cu fosfolipide in exces)

Scurtarea timpului de coagulare

Anticorpi antifosfolipidici Recoltare:

Venopunctie; Vacutainer tub albastru (citrat);

Timp de lucru:
maxim 4 ore de la colectare; Separarea plasmei de celule realizata cat mai rapid posibil;

Valori normale:
Negativ pentru lupus anticoagulant; Anticorpi anticardiolipina < 15 unitati;

Anticorpi antifosfolipidici
Diagnosticul de sindrom antifosfolipidic teste pozitive la doua determinari diferite separate de cel putin 6 saptamani. Anticorpii pot aparea tranzitor in:
Sifilis (anti-cardiolipina); HIV; Tratament cu medicamente phenitoina)

(hidralazina,

Mutatia G20210A a protrombinei

Este o mutatie comuna care predispune la tromboza; Este prezenta in 2,3% din populatia generala; Prezenta ei este asociata cu nivele ridicate de protrombina si risc crescut de tromboza venoasa de 2-3 ori; Este detectata prin tehnica PCR-RFLP (HindIII);

EXPORAREA TROMBOZEI SI FIBRINOLIZEI

Antitrombina Proteins C Proteina S Rezistenta la proteina C activata si mutatia factorului V Leiden Plasminogen Inhibitorul activatorului plasminogenului 1 Antiplasmina D-dimeri si produsi de degradare ai fibrinei Panelul de hipercoagulare

Panelul CID

PANELUL CID
Timpul partial de tromboplastina activata (APTT); Timpul de protrombina (PT); Hemograma completa; D-dimeri; Produsi de degradare ai fibrinei/fibrinogenului (PDF) Fibrinogen;

PANELUL CID
CID acut:
Cresterea D-dimeri, PDF; Prelungirea APTT (50% din cazuri) si PT (70% din cazuri); Scaderea fibrinogenului (50% din cazuri); Scaderea numarului de plachete; !!! Toate aceste teste pot fi uneori normale !!!

CID cronic:
Cresterea fibrinogenului si plachetelor; Scurtarea PT si APTT; Cresterea D-dimeri, PDF;