O nouă sursă biotehnologică de acid

rosmarinic și flavonoide în culturi

”hairy roots” de Dracocephalum
Kotshyi

Candidat Conf. Dr.

ANDREI ADELINA SMARANDA VÂNTU
 Dracocephalum kotschyi Boiss
Dracocephalum kotschyi Boiss este o plantă erbacee edemică din
Iran care crește in zona montană.
Studiile au arătat că toate părțile plantei conțin constituienți activi.
Uleiurile esențiale și piesele aeriene au fost principalele componente
studiate. Este folosită ca medicament popular tradițional dar si ca
aditiv pentru imbunătățirea gustului si mirosului alimentelor.

Figura 1. Planta Dracocephalum kotschyi Boiss

Importanța Dracocephalum kotschyi
De-a lungul timpului au fost raportate o serie de proprietăți
medicinale cum ar fi:efecte antioxidante, antibacteriene,
anticancerigene, antinoceptive, antihiperlipidemice, antispasmodice,
citotoxice și imunomodulatoare.
De asemenea planta a fost de asemena raportată ca un remediu
pentru durerile de cap, dureri inflamatorii, spasme
musculare,tulburări de ficat, dureri de stomac, dureri articulare si
multe altele.

Recoltarea excesivă a plantei sălbatice din zonele limitate de

distribuție dar și din lipsa de cultivare și domesticire, motiv pentru
care acum este considerată plantă pe cale de dispariție.
Metaboliți secundari
Mai multe clase de mataboliți secundari au fost izolați de D.
Kotshyi inclusiv uleiuri esential, glicozide monoterpene tripanocide
terpenoide, flavonoide și acid rosmarinic.
Flavonoidele metoxilate de la D. Kotschyi au efect anticancer,
inclusiv xanthomicrol, epigenina, cirsimaritină, luteolina, penduletină,
calicopterină etc, prin activitatea lor antiproliferativă împotriva
celulelor maligne.
Moghaddam și alti colaboratori, au raportat că flavonoidele de la D.
Kotschyi au prezentat preferință pentru celulele tumorale. Rezultatele
studiului au dezvăluit că luteolina a indus apoptoza în celule
tumorale.
 Acidul rosmarinic, o altă componentă majoră a D. Kotschyi , fiind
un ester al acidului cafeic și al acidului 3.4- dihidroxifenillactic. Multe
produse au fost preparate din acidul rosmarinic în industria
cosmetică, farmaceutică și alimentară. Pe lângă proprietățile
farmacologice ale acidului rosmaric se numără și activitățile
antioxidante, antivirale, antiinflamtorii și antitumoral.

Figura 2. Structura chimică a acidului rosmarinic

 Scopul lucrarii

Scopul principal al studiului a fost dezvoltarea unui sistem

biotehnologic pentru producerea de compuși fenolici bioactivi de
D. kotschyi ca o alternativă la recoltarea plantei sălbatice aflată
pe cale de dispariție.
 Metoda culturilor ”hairy roots”
Metoda utilizată vizează tehnologia de obținere a plantelor
trangenice ”in vitro” prin infecția plantelor cu tulpini de
Agrobactterium rhizogenes și obținerea de culturi ”hairy roots” .
Tulpinile de A. rhizogenes sunt utilizate ca instrumente de cultură a
țesuturilor pentru producerea de metaboliți secundari.
Avantajele culturilor ”hairy roots” sunt :
- sunt stabile din punct de vedere genetic și biologic;
-sunt producători fiabili de substanțe chimice active;
-utilizează materiale vegetale primare foarte puține;
-produce metaboliți într-un timp foarte scurt;
-este un instrument puternic în gestionarea metaboliților și aplicarea
elicitorilor.
 Metoda de lucru
Etapele de inducere a culturilor ”hairy roots”

Semințele de la D. Kotschyi au fost pregătite în vedera îndepărtării inhibitorilor externi de
germinare și pentru obținerea de plante sterile.


Semințele au fost cultivate ”in vitro” pe un mediu MS, iar după 5 săptămâni plantulele au fost
utilizate pentru inducerea culturilor hairy roots .


Rănirea explantelor (fragmente de frunze și tulpini) prin intermediul unui ac steril încarcat cu
suspensii de Agrobacterium rhizogenes , au fost ulterior amplasate pe un mediu de cultură MS
solid.


După o scurtă perioadă de 1-4 săptămani în cultură au inceput să apară rădăcinile pe locurile de
infecție.


Obținerea liniilor de rădăcină, rădăcinile unice au fost prelevate și plasate pe medii noi cu
cefotoxamină până cand bacteriile au fost eliminate.


Culturile hairy roots lipsite acum de contaminare bacteriană au fost transferate pe un alt mediu de
cultură solid MS , iar după o perioadă de 2 saptămâni au fost trasnferate într-un mediu lichid MS
menținute într-un agitator rotativ și subcultivate la 2 săptămani.
Figura 3. Inducerea ”hairy roots” la explante de frunze după 4 săptămâni de la infestarea
cu A. Rhizogenes(a,b,c,d,e,f) . Brunarea explantului la g și inducerea tumorii la ”hairy
roots” la h.
Extracția de flavonoide și acid rosmarinic

Uscate prin congelare , pudra de ”hairy roots ” a fost supusă unui tratament de
soluții care mai apoi au fost transferate în flacoane HPLC .
Ulterior a avut loc injectarea automată pentru dozarea compușilor.
 Rezultate
Morfologia și capacitatea de creștere a culturilor ”hairy roots”
Rata de inducție ”hairy roots” a explanților a avut debutul dupa 1-
4 săptămani de la infecția cu A rhizogenes, dar cea mai mare rată de
inducție a fost obținută după 4 de la infecție. S-au semnalat putine
probe moarte și necrotice.
Numărul cel mai mare de rădăcini s-au înregistrat pe explantul de
tulpini comparativ cu explantul de frunze care a prezentat un număr
mai redus de rădăcini.
Deoarece fiecare rădăcină provine dintr-o celulă , ele au fost
considerate linii. Au fost stabilite 70 de linii de rădăcini de D. Kotschyi
cu două tipuri morfologice diferite: ”hairy roots” tipice și rădăcini
asemănătoare calusului.
Conform unei evaluari preliminare, 70% din linii au prezentat
trăsături tipice ”hairy roots”.
Analiza bazată pe PCR a ”hairy roots”
A utilizat Agrobacterium rhizogenes aux1, rolC, și virD, în vederea
transformării genetice a liniilor celulare stabile.
Genele aux1 și rolC au fost localizate în segmentul TR și TL ,
respectiv pRi au fost utilizate pentru a confirma prezența ambelor
fragmente în genomul plantei și vir D localizat în afara segmentului T-
ADN A rhizogenes, a fost utilizată pentru a confirma absența totală de
Agrobacterium.
Analiza genelor de referință au demonstrat că majoritatea liniilor
”hairy roots” stabile au purtat gene rol C și aux1 în genom, lipsind
virD, care confirmă transformarea genică a rădăcinilor și eliminarea
bacteriilor care induc ”hairy roots”.
Producția de acid rosmarinic și flavonoide metoxilate în
liniile ”hairy roots”
Tabel 1. Acid rosmarinic și conținut de flavonoide în liniile ”hairy roots”(μg / g DW)
ale D. kotschyi, după o perioadă de cultură de 4 săptămâni în mediu solid MS.
 Concluzii
Explantele de tulpini din culturi celulare vegetale ”in vitro”ale D kotskyi
au fost
transformate cu mai mult succes de A . Rhizogenes decât explantele de frunze.
Analizele PCR ale genelor de refrință au arătat că majoritatea liniillor ”hairy roots”stabile
au purtat gene rolC și aux1, iar absența vir D a confirmat transformarea genetică a
rădăcinilor ș i eliminarea bacteriilor care induc ”hairy roots”.
Inducerea ”hairy roots” stabile nu necesită prezența ambelor segmente (TL și TR) a T-ADN al
A rhizogenes.
Prin inducția ”hairy roots” acestea au acumulat cantități semnificativ mai mari de acid
rosmarinic comparativ cu rădăcinile de control netransformate.
Se poate deduce că eficiența genelor rolC contribuie la îmbunătățirea biosintezei metaboliților
secundari din culurile ”in votro”.
Desi partea aeriană a plantei este situsul principal pentru acumularea de flavonoizi
metoxilați, acești compuși pot fi de asemenea produși și în culturile ”hairy roots” de D
Kotschyi.
În marea majoritate a liniilor
”hairy roots” s-a constatat o acumularea de flavonoizi în
cantități mult mai mari comparativ cu rădăcinile de control intacte.
În ansamblu , rezultatele experimentului
arată că prin culturile ”hairy roots” se poate induce
un sistem de producere a unor compusi naturali valoroși , biosintetizați de specii de plante pe
cale de dispariție.
1.
Bibliografie
Heydari P., Yavari M, Adibi P., Asghari G., Ghanadian S.M., Dida G.O., and Khamsipour F.,
Medicinal Properties and Active Constituents of Dracocephalum kotschyi and Its Significance in
Iran: A Systematic Review Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume,
2019, Article ID 9465309.
2. Sharafi A., Sohi H.H., Azadi P., Sharafi A.A., Hairy root induction and plant regeneration of
medicinal plant Dracocephalum kotschyi , Physiol Mol Biol Plants, 2014 20(2):257–262 .
3. Fattahi M., Nazeria V., Tarras-Claveria L., Sefidkon F., Cusino M.R., Zamani Z., Palazon J., A
new biotechnological source of rosmarinic acid and surface flavonoids: Hairy root cultures of
Dracocephalum kotschyi Boiss , Industrial Crops and Products, 2013 2 56–263.
4. Fattahi, M., Nazeri, V., Sefidkon, F., Zamani, Z., Palazon, J., The effect of presowing treatments
and light on seed germination of Dracocephalum kotschyi Boiss: an endangered medicinal plant
in Iran. Horticulture, Environment, and Biotechnology 2011, 52, 559–566.
5. Jahaniani, F., Ebrahimi, S.A., Rahbar-Roshandel, N., Mahmoudian, M.,. Xanthomicrol is the
main cytotoxic component of Dracocephalum kotschyii and a potential anti-cancer agent.
Phytochemistry 2005, 66, 1581–1592
6. Gohari, A.R., Saeidnia, S., Matsuo, K., Uchiyama, N., Yagura, T., Ito, M., Kiuchi, F., Honda, G.,
Flavonoid constituents of Dracocephalum kotschyi growing in Iran and their trypanocidal
activity. Journal of Natural Medicines 2003 ,57, 250–252.
7. Moghaddam G., Ebrahimi, S.A., Rahbar-Roshandel, N., Foroumadi, A., Antiproliferative
activity of flavonoids influence of the sequential methoxylation state of the flavonoid structure.
Phytotherapy Research 2012, 26, 1023–1028.