Bacilul acido-alcoolo rezistent

Micobacterium tuberculosis
Micobacterium tuberculosis

• Familia Mycobacteriaceae are în componenţă un

• singur gen:
• Genul Mycobacterium
• cuprinde următoarele specii:
• grupul „tuberculosis”
• Mycobacterium tuberculosis
• Mycobacterium africanum
• Mycobacterium bovis
• grupul „mycobacteriilor atipice”
• Mycobacterium leprae
bacili „acido-alcoolo-rezistenţi”
• această proprietate se datorează cantităţii mari de lipide şi
ceruri din peretele bacterian
Caractere generale
• Este agentul cauzal al tuberculozei
descoperit de Robert Koch în 1882
neoficial se mai numeşte şi „bacilul Koch”
numele genului se datorează asemănării
morfologice cu fungii microscopici filamentoşi
myces = fung + bakterion = baston mic
Habitat

• este un patogen strict uman

• poate infecta şi animalele de companie:
• papagal
• câine
• pisică
• maimuţă
Caractere morfofuncţionale
• bacil fin
• uşor încurbat
• dimensiuni de 2-5 μm lungime
• are structura peretelui asemănătoare cu a
bacteriilor Gram pozitive cu conţinut mare în
lipide şi ceruri
• se colorează greu cu coloraţia Gram
pentru evidenţierea pe frotiu se foloseşte
coloraţia Ziehl-Neelsen
Micobacterium tuberculosis
coloraţia Ziehl-Neelsen
Micobacterium tuberculosis coloraţia Ziehl-Neelsen
Mocobacterium tuberculosis
coloraţia Ziehl-Neelsen
From an immuno-suppressed adult, who had received immune suppressing
drugs following a renal transplant. A few of the granulomas contain large
numbers of red-staining M. tuberculosis, visible with the x40 (high dry)
Caractere de cultură
• cultivă lent
• timpul de generaţie este de 20 de ore
• este un germene aerob
• se dezvoltă la 36°C
• necesită medii de cultură speciale
• mediul Loewenstein-Jensen
• conţine printre altele ou, cartof, asparagină, glicerină, săruri minerale,
• verde de malachit
• coloniile apar în interval de 15-30 de zile
• de tip R: rugoase, cu suprafaţa zbârcită, uscate, conopidiforme
• asemănate cu firimiturile de pâine
• coloniile pot fi pigmentate crem-bej.
• pe mediul lichid
• creşte sub forma unei membrane groase, cu multe pliuri, care se ridică pe peretele
flaconului de cultură
Caractere de cultură
Caractere de cultură
Caractere de cultură
Caractere biochimice şi de metabolism
• este o bacterie strict aerobă
Rezistenţa faţă de factori fizici chimici
şi biologici
• sensibil la
• căldură
• lumina solară
• radiațiile UV
• radiațiile X
• Sol cloramină de 5%

• rezistenț la
• frig
• antiseptice
• dezinfectante
• detergeni
• supravieţuieşte de la câteva luni la un an în mediul extern
• în produse patologice uscate
• la adăpost de lumina solară
• dezvoltă rezistenţă faţă de tuberculostatice prin mutaţii
Structură antigenică
• constituenţii peretelui celular induc apariţia
• unui răspuns imun de tip celular
• a unei hipersensibilităţi de tip IV
• Mycobacterium tuberculosis prezintă la nivelul peretelui
• celular următoarele structuri antigenice:
• tuberculolipidele
• ▪ acizii nucleeci
• ▪ ceruri
• ▪ alcooli superiori
• tuberculoproteinele
• ▪ induc sensibilizare de tip anafilactic
• ▪ în asociere cu tuberculolipide induc răspuns imun predominant celular
• polizaharidele
• ▪ induc formarea de anticorpi circulani
Răspuns imun
• Imunitatea
• indusă doar de bacteriile vii
• nu este niciodată totală
• o stare de rezistenţă faţă de o nouă infecţie
• mediată celular
• dispare după vindecarea microbiologică
• anticorpii decelabili nu au rol protector
• Reactia Mantu numită „alergie tuberculinică” evidenţiată prin intradermoreacţia
la tuberculină folosită în scop de diagnostic
Caractere de patogenitate
• Mycobacterium tuberculosis nu produce toxine
• este patogen prin capacitatea sa de a se multiplica în
organismul gazdă
• distrugerea bacteriei se soldează cu eliberarea de
constituenţi
• antigenici care induc o reacţie imunitară de hipersensibilitate
ce stă la baza transformării cazeoase.
Patogenie. Boala la om
• Tuberculoza se manifestă cel mai frecvent sub formă de:
• tuberculoză pulmonară
• ▪ primoinfecţie latentă
• ▪ primoinfecţie manifestă
• ▪ forma cavitară comună
• ▪ pleurezie
• ▪ forme mediastinale
• ▪ forme miliare
• tuberculoză extrapulmonară
• ▪ rară
• ▪ are localizări
• ▪ meningiene, renale, genitale, osoase, articulare, ganglionare, digestive
Patogenie. Boala la om
• Bolnavul cu tuberculoză pulmonară
• elimină bacilii tuberculoşi
• prin spută prin picăturile Pflügger
• Aerosolii sunt inhalaţi ajung în alveole
• bacilul este fagocitat de macrofage
• o parte din bacili rămân pe loc
• altă parte este vehiculată pe cale limfatică spre ganglionii regionali
Patogenie. Boala la om
• se multiplică
• determină răspunsul imun
• stă la baza formării leziunii caracteristice
• numită „tubercul”
• tuberculul se cazeifică
• ţesutul în care s-au dezvoltat bacilii suferă o necroză solidă cu
• apariţia de „cazeum”
• tuberculul cazeos se rămoleşte
• se formează caverna pulmonară
• care se înconjoară de un strat fibros
• din acest moment substanţele antibacteriene vor ajunge greu în
focarul infecţios
• diseminarea pe cale hematogenă este responsabilă de instalarea
localizărilor extrapulmonare
From an eighteen-month old boy who died of miliary tuberculosis and
subsequent tuberculous meningitis
Diagnistic de laborator
• probele trebuie recoltate în mod repetat şi înainte de
• începerea tratamentului antibacterian
• în tuberculoza pulmonară
• spută eliminată după un puseu de tuse
• la copii
• recoltată prin spălătură gastrică
• secreţii bronşice în cursul bronhoscopiei
• lichid de spălătură bronşică
• în tuberculoza extrapulmonară
• lichid cefalo-rahidian, urină, secreii vaginale, lichid de puncţie etc.
Diagnistic de laborator
• examenul microscopic al frotiului efectuat
• din produsul patologic
• se colorează cu metoda Ziehl-Neelsen
• fondul preparatului
• albastru
• Mycobacterium tuberculosis
• bacil fin
• uşor încurbat
• colorat în roşu
• uniform sau neuniform
Prepararea frotiurilor
• Prepararea frotiurilor trebuie să se efectuieze în camera
de lucru special destinată acestui scop. Suprafaţa de
lucru unde se execută manevra trebuie să fie netedă şi
dintr-un material, care poate fi uşor prelucrat cu
substanţe dezinfectante.
• Înainte de executarea frotiurilor se va pregăti locul de
lucru cu toate rechizitele strict necesare pentru această
operaţiune, se vor marca lamele pe care urmează să se
întindă frotiurile. Se marchează atîtea lame, cîte produse
patologice se pot lucra odată. Prepararea a mai mult de
15-20 frotiuri la o singură dată duce la majorarea
riscului infectării personalului prin aerozoli şi paralel
Prepararea frotiurilor
• sporeşte riscul erorilor, care influenţează asupra
exactităţii rezultatelor.
• Pe masa de lucru se vor amplasa numai
rechizitele necesare pentru această operaţiune,
într-o ordine corespunzătoare.
• Prepararea frotiurilor poate fi efectuată direct
din produsul patologic sau după utilizarea
prealabilă a unei tehnici de îmbogăţire.
Prepararea frotiurilor din spută prin
metoda directă
• Containerele pentru spută sunt aranjate în
ordinea succesivă. Numerele de laborator
trebuie să corespundă Formularului pentru
examinarea sputei TB-05. Este recomandată
utilizarea lamelor noi. Numărul de rînd va fi
marcat cu marcherul pe partea executării
frotiului şi la marginea lamei.
• Se va deschide atent containerul cu spută şi se
vor alege particulele consistente din acesta,
corespunzătoare celor purulente.
Prepararea frotiurilor din spută prin
metoda directă
• Particulele purulente sunt întinse cu ansa pe
lamă într-un strat cât mai subţire, pînă ce se
realizează uniformizarea frotiului pe suprafaţa
de 2x3 cm. ( ansa după efectuarea frotiurilor din
spută, se v-a steriliza prin flambare la roşu,
protejată de o eprubetă pentru evitarea degajării
de aerosoli infectaţi).
Fixarea frotiurilor
• Frotiurile pregătite se aşează pe un suport de lame şi se
lasă la aer sau la termostat timp de 15-30 min. pentru a
se usca. În nici un caz nu se va practica uscarea
frotiurilor folosind flacăra spirtierei sau la temperaturi
înalte. După uscarea deplină frotiurile se fixează.
• Se va utiliza fixarea prin încălzire.
• Pentru metoda de colorare Ziehl-Neelsen se va utiliza
metoda clasică de fixare prin încălzire uşoară, trecând de
trei ori deasupra unei flăcări timp de 3-5 secunde.
Colorarea frotiurilor
• Colorarea micobacteriilor se bazează pe fenomenul
de acido-alcoolo-rezistenţă, propriu tutoror speciilor
genului Mycobacterium, care este determinat de
structura fizico-chimică a peretelul celular, foarte
bogat în lipide (peste 60%).
• Metoda de selecţie pentru microscopia sputei este
tehnica de colorare după Ziehl-Neelsen, deoarece
această metodă este singura care oferă de fiecare
dată rezultate bune şi nu necesită echpament
special.
Prepararea reactivelor pentru
metoda Ziehl-Neelsen:
Soluţia 1. Soluţie alcoolică saturată de fuxină:
-dizolvaţi 0,3 g de fixină bazică cu 2-3 picături de
glicerină în piuliţă, adăugaţi în picături 10 ml de
alcool etilic de 96%.
Soluţia 2. Soluţie de fenol (soluţia apoasă de 5%):
- Topiţi 5g de fenol cristalin şi turnaţi apă
purificată încălzită până la la 45 C atingând
volumul general până la 100 ml.
Metoda de colorare Ziehl-Neelsen
(metoda clasică)
• Soluţia 3. Soluţie de fuxină fenicată:
-în 90 ml de soluţie de fenol obţinută adăugaţi 10
ml de soluţie de fucsină saturată.
Soluţia 4. Soluţie decolorantă
a)de acid sulfuric:
-la 75 ml de apă purificată adăugaţi cu prudenţă
25 ml de acid sulfuric concentrat, turnâd lent pe
peretele vasului. Amestecaţi. Conţinutul se va
încălzi. Niciodată nu adăugaţi apă în acid.
Metoda de colorare Ziehl-Neelsen
(metoda clasică)
• b) de alcool clorhidric 3%:
• În loc de acid sulfuric pentru decolorare se poate
utiliza alcoolul clorhidric de 3%
• Alcool etilic 96% -97ml
• Acid clorhidric concentrat -3 ml
• La 97 ml de alcool etilic adăugaţi cu acurateţe 3
ml acid clorhidric concentrat.
• De fiecare dată turnaţi cu prudenţă acid
în alcool şi nu invers.
Metoda de colorare Ziehl-Neelsen
(metoda clasică)
• Soluţia 6 soluţie de albastru de metilen:
-dizolvaţi 0,3g de clorură de albastru de metilen în
100 ml de apă purificată.
(toate soluţiile pregătite trebuie filtrate print-un
filtru de hîrtie şi plasate în flacoane sticlă
întunecată închise ermetic. Fiecare flacon
trebuie să aibă inscripţia cu denumirea soluţiei,
data pregătirii şi termenul de valabilitate.)
Metoda de colorare Ziehl-Neelsen
(metoda clasică)

• 1. Frotiul fixat se acoperă cu o fîşie de hîrtie de

filtru (puţin mai mare decât frotiu), peste care se
toarnă o soluţie de fucsină fenicată.
• Lama se încălzeşte la flacără pînă la emiterea de
vapori, de 3-4 ori, cu repaus, procedura de
colorare realizîndu-se timp de nu mai puţin de 5
minute.
• 2. Se înlătură hîrtia de filtru şi se spală lama cu
apă de robinet.
• 3. Se decolorează frotiul timp de 2-3 min cu o
soluţie de 20% acid sulfuric.
• 4. Se varsă decolorantul, se spală din nou lama,
frotiul trebuind să rămînă aproape incolor sau
cel mult cu o vagă nuanţă roz. Dacă frotiul a
rămas roşu, se repetă decolorarea.
• 5. Se recolorează timp de 1-2 minute cu o soluţie
apoasă de 1% albastru de metilen.
• 6. se spală şi se usucă.
• Calitatea executării şi colorării frotiului din
spută:
• Frotiul colorat calitativ trebuie să fie de culoare
albastră deschisă datorată soluţiei de albastru
de metilen. În cazul cînd are culoare albastru
întunecată, de ex. atunci când un ziar plasat sub
lamă nu poate fi citit, frotiul se consideră prea
gros.
Examinarea frotiurilor
• Examinarea frotiurilor colorate prin metoda
Ziehl-Neelsen se va efectua cu ajutorul unui
microscop binocular cu oculare10x sau 7x şi
obiectiv 100x sau 90x.

• Micobacteriile, privite la microscop, sunt

colorate uniform, uneori prezintă granulaţii. Au
forma de bastonaşe drepte sau de cele mai multe
ori curbate. Bacilii apar sub
• forma de agregate, împerecheaţi caracteristic în
unghi sau, mai frecvent, sunt dispuşi aparte în
câmpul microscopic.
• Micobacteria tuberculozei acido-alcool-reistente
este aproximativ de 2-5 µm în lungime (dar se
pot depista şi între 1-10 µm ) şi de la 0,2-0,3
până la 0,5-06 µm în lăţime.
• La colorare cu fuxină fenicată micobacteriile
tuberculozei se depistează sub formă de bacili
fini, uşor încurbaţi de culoare roşie-zmeurie, ce
conţin cantităţi diferite de granule.
Microorganismele situate câte unu, câte doi sau
în grupe se vizualizează bine pe fonul albastru al
altor componente ale preparatului. Aşezarea
caracteristică a celulelor bacteriene este sub
forma cifrei romane “V”.
• În interiorul unor celule bacteriene pot fi
depistate regiuni de colorare mai intensă, în
urma căreaia ele se aseamănă cu “mărgele”, iar
regiunile colorate mai slab se vizualizează sub
formă de “făşii”.
• De asemenea, în preparat pot fi depistate şi
forme modificate ale agentului patogen sub
formă de aglomerare de granule acidorezistente,
structuri rotunde sferice
• L-transformate sau sub formă de miceliu. Totuşi,
în caz de detectare a formelor modificate ale
microorganismelor acidorezistente, rezultatul
pozitiv trebuie confirmat prin metode
suplimentare de examinare. În caz contrar
rezultatul trebuie considerat negativ.
• Unele microorganisme, care nu aparţin la
M.tuberculosis, pot avea diferite forme –
• de la bacili lungi până la coci cu diferită intensitate de
colorare.
• Micobacteriile nontuberculoase pot să difere după gradul
de acidoalcoolrezistenţă, ceea ce se poate evidenţia la
decolorarea frotiului- pierderea parţială a colorării
acidorezistente ele capătă culoare violet-zmeurie.
• Se examinează 100 câmpuri microscopice. Dacă
în 100 câmpuri microscopice se vor depista 1-3
MBT, examinarea se va prelungi până la 300
câmpuri microscopice. De asemenea în cazuri
unice, dacă după examinarea a 100 câmpuri
microscopice rezultatul este negativ, pentru
confirmare se recomandă de examinat până la
300 câmpuri microscopice.
Examinarea microscopică
• Examinarea microscopică trebuie să fie
sistematizată şi standartizată. Ea se începe de la
marginea stângă a frotiului. Citirea se începe de
la periferie şi se finalizează în centrul câmpului
de vedere. După ce citirea câmpului este finisată,
lama se mişcă longitudinal pentru a examina
câmpurile adiacente. Lama poate fi plasată
orizontal pentru a citi al doilea rând de la
dreapta la stînga. Există aproximativ 100
câmpuri de imersie pe axa de 2 cm a frotiului.
• În cazul cantităţii semnificative a BAAR este
suficient de examinat 20-50 câmpuri
microscopice.
• Se recomandă următoarea ordine de examinare
a preparatului.
• Exemplu: Dacă în primele 20 câmpuri de vedere
s-au depistat: mai mult de 200 BAAR (în mediu
10 BAAR într-un câmp microscopic),
examinarea frotiului se finisează şi rezultatul se
prezintă sub forma 3+.
• Aprecierea rezultatelor examenărilor microscopice al frotiurilor prin
metoda Ziehl-Neelsen se face în funcţie de numărul de bacili şi de
cîmpurile examinate:
• 0 bacili /100 cîmpuri - negativ
• 1-3 bacili /100 cîmpuri – se notează numărul bacililor găsiţi şi se va
cere repetarea – dubios;
• 4-9 bacili /100 cîmpuri – slab pozitiv (+);
• 10-100 bacili /100 cîmpuri – pozitiv moderat (+ +)
• Peste 200 bacili /100 cîmpuri – pozitiv intens (+ + +).
•
TBC cutanat
Spleen: Miliary tuberculosis
Lung & Small
Intestine:
Tuberculosis
Kidney: Tuberculosis
Lung: Miliary tuberculosis
Lung: Primary complex with
miliary spread
Lung: Post-primary
tuberculosis