10/8/2013

1
Curs de Biofizic
Prof.dr. Cipriana tefnescu
Disciplina de Biofizic
i Fizic medical
5
V rugm: gndii!
Cromatografia
Metod de separare i identificare a
componenilor unui amestec.
2 faze: faza staionar i faza mobil.
Mecanisme diferite de retenie
- 4 tipuri de cromatografie:
1. De adsorbie 3. De permeaie
2. De schimb ionic 4. De afinitate
10/8/2013
2
Definiie:
Concentraia component A n faza staionar
Concentraia component A n faza mobil
Coeficient de distribuie sau de partaj:
Se bazeaz pe retenia diferit a componenilor
amestecului n faza staionar:
coeficient de distribuie sau de partaj.
2
1
c
c
c
P
Cromatografia:
schem
de
principiu
10/8/2013
3
(A)Sarcini electrice,
(B)Filtrare prin pori,
(C) Legturi covalente
sau necovalente
A.Cromatografia
de adsorbie
MikhaelTsvet, (18721919)
botanist rus
1901, separarea clorofilei
prin cromatografie de
adsorbie pe coloan
Retenia la suprafaa
fazei staionare
10/8/2013
4
B. Cromatografia
de afinitate
n cromatografia de afinitate, un ligand care se
cupleaz specific la o protein este fixat covalent de o
matrice poroas (faza staionar)
Cnd un amestec de proteine traverseaz faza
staionar:
- Proteina de separat se cupleaz cu ligandul, iar
celelalte proteine din amestec sunt eliminate din
coloan fr a fi reinute deloc.
- Modificnd condiiile de eluie (pH acid) proteina
reinut se detaeaz de faza staionar i este
eliminat (recuperat).
10/8/2013
5
Ligand fixat
la matrice
Proteina cu
afinitate
pentru
ligand
.
Alte
proteine
Separarea
unui anticorp
dintr-un
amestec
prin
cromatografie
de afinitate
10/8/2013
6
C. Cromatografie prin
schimb ionic
Ex! Generatorul de 99m- Tc
(v. Aplicatii radioizotopi)
Ioni legai electrostatic la un suport insolubil i chimic
inert sunt nlocuii reversibil de ali ioni din amestecul de
separat:
Suport
+
A
-
+ Ion
-
Suport
+
Ion
-
+ A
-
Cromatografie prin schimb ionic
10/8/2013
7
n cromatografia de
permeaie sau de
filtrare n gel,
(cromatografie de
excludere sau
tamisaj molecular),
proteinele sunt
separate dup
mrimea i forma lor.
Frecvent faza staionar este: dextran
(Sephadex), agaroz sau poliacrilamid
D.Cromatografie de permeaie
- prin filtrare n gel
Cromatografie de permeaie
10/8/2013
8
Cromatografia de permeaie se poate folosi
pentru estimarea masei moleculare
Exemplu: Purificarea nucleazei stafilococului prin
cromatografie de afinitate - compusul reprezentat
n (b) a fost legat covalent la faza staionar
(agaroz)