Microbiologie medical

Definiii

microbiologia = tiina care se ocup cu studiul microorganismelor.

Microorganism = organism unicelular care poate fi pus n eviden numai cu ajutorul

microscopului optic sau electronic.

Istoric
sute de ani existena microbilor a fost bnuit dar prezena lor a putut fi documentat doar
odat cu apariia microscopului;
1665 Robert Hooke, un tnr cercettor englez, a fost primul care a vzut i descris fungii cu
ajutorul unui microscop rudimentar.
n 1673 Antonius van Leeuwenhoek, cercettor olandez, a observat primele microorganisme tot
la un microscop propriu, rudimentar.
Este considerat printele microbiologiei
Desenele cu animalculi publicate la Londra n 1784 au zdruncinat lumea tiinific de atunci.
A fost pentru prima dat cnd bacteriile au putut fi vzute.
Teoria generaiei spontane
Francesco Redi, un filosof italian, a artat c viermii nu se nasc spontan din carne ci din oule
depuse de mute.
John Needham, un preot englez, susinea c moleculele inerte din lichidele biologice se pot
grupa formnd animalculi
Lazaro Spallanzani, n 1765, a demonstrat
c un bulion fiert, lsat n contact cu aerul, dup cteva zile se tulbur, dar rmne limpede
dac balonul este nchis............................................p 2-3. Biblio (D. Buiuc)

 n 1859 chimistul francez Louis Pasteur discrediteaz definitiv aceast teorie prin conceperea
balonului cu gt de lebd n care aerul nu avea acces i bulionul fiert putea fi pstrat indefinit
fr ca n el s se dezvolte microorganisme.

Consecinele acestor experimente au fost:

imaginarea primului mediu de cultur pentru bacterii bulionul de carne - folosit i

astzi;

elaborarea unor metode simple de dezinfecie (distrugerea tuturor microorganismelor

dar nu i a sporilor);

introducerea conceptului manipulrii aseptice a obiectelor, produselor patologice, etc.

(la adpost de microorganisme);

Intemeietorii microbiologiei:
Luis Pasteur (1822-1895)
-

Pune bazele sterilizrii i metodicii lucrului aseptic.

Descoper natura microbian a proceselor de fermentare anormal a vinului.

Face legatura ntre bolile vinului i unele boli infecto-contagioase la animale i om.

Descoper numeroi ageni etiologici ai acestora.

Realizeaz vaccinuri prin inactivarea sau atenuarea patogenitii unor microorganisme

(rabie, antrax, holera ginilor).

n 1776, Edward Jenner, medic englez, realizeaz prima vaccinare experimental mpotriva
variolei.
In prezent, variola este singura boal infecioas eradicat.
n 1841, cu 30 de ani nainte de formularea teoriei germenilor, Ignaz Semmelweis introduce
pentru prima dat n lume splatul pe mini i folosirea halatelor curate n maternitatea pe
care a condus-o la Viena (prima aplicaie practic a antisepsiei).
Teoria germenilor
n anii 1870 Robert Koch, medic german, a evideniat agentul etiologic al antraxului, holerei i
tuberculozei;

a introdus mediile solide n practica microbiologic.

Robert Koch (1843-1910)

A examinat microorganismele n preparate fixate prin caldur i colorate cu colorani bazici.

A introdus mediile solide n practica diagnosticului microbiologic.

A reprodus experimental boli infecioase prin inocularea agentului etiologic la animale de

laborator.

A descris secvene experimentale pentru susinerea relaiei cauzale ntre un microorganism i

manifestrile de boal (postulatele lui Koch):

microorganismul care a determinat boala este depistat la toi bolnavii iar distribuia n
organism corespunde leziunilor caracteristice bolii;

microorganismul care a determinat boala poate fi izolat n cultur pur i subcultivat

pentru a fi studiat;

cultura pur inoculat la un animal receptiv reproduce boala cu leziuni specifice de unde
poate fi reizolat.

Chirurgul englez Joseph Lister a folosit principiile antiseptizrii i asepsiei i a redus, n 1860, la
15% mortalitatea datorat interveniilor chirurgicale.
Alte descoperiri importante:

1884 - Cristian Gram dezvolt o metod de colorare i difereniere a bacteriilor;

 1887 - Petri realizeaz plcile Petri;

1892 - Ivanovski descoper virusurile;
1910 - Paul Eahrlich descoper salvarsanul primul chimioterapic folosit n terapia sifilisului;
1928: Alexander Fleming descoper penicilina;
1977: Gilbert i Sanger secvenializeaz ADN-ul;
1983: Mullis pune bazele reaciei de amplificare genic (PCR);
1983/1984: Luc Montaigner i Robert Gallo descoper HIV;
Microbiologi romni: Victor Babe (co-autor la primul tratat de bacteriologie) i Ion Cantacuzino
(creatorul colii de microbiologie n Romnia).
Lumea microorganismelor
-

Microorganisme cu structur celular:

Eucariote (regnul Eucaryota), constituite din celule cu structur evoluat: fungi i

protozoare;

Procariote (regnul Procaryotae), constituite din celule cu structur primitiv: bacterii i

alge albastre-verzi.

Entiti acelulare, la limita viului: virusuri (strict parazite intracelular).

Clasificarea bacteriilor

1. Clasificarea fenotipic;
2. Clasificarea analitic;
3. Clasificarea genotipic;
Taxonomie: clasificarea sistematic a bacteriilor n grupe ordonate.
Clasificarea fenotipic
Dup afinitatea tinctorial:
Gram pozitive;
Gram negative;
Dup form:
Sferice sau ovalare coci;

 Alungite bacili;
Virgul vibrioni;
Spiralate spirochete;
Coloraia Gram

 Dup caracterele de cultur:

Hemoliza, pigmentogeneza, forma, mrimea coloniilor, mirosul degajat de o cultur;
Dup prezena sau absena unor markeri biochimici specifici.
Serotipare: anticorpii formai fa de antigenele bacteriene unice pot fi folosii pentru
identificarea lor.
Dup comportamentul fa de antibiotice (patern de rezisten).
Clasificarea analitic
Regn ordin familie gen- specie subspecie.
Ex. Ordin: Eubacteriales
Ex. Familie: Enterobacteriaceae
Ex. Gen: Escherichia
Ex. Specie: Escherichia coli
Ex. Subspecie: Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum
Clasificarea genotipic
Analiza materialului genetic:
Raportul guanin citozin
Hibridizarea ADN
Analiza secvenelor nucleotidice
Analiza plasmidelor
Ribotipare
Analiza ADN-ului cromosomal.
Lumea microorganismelor
Bacteriile au dimensiuni cuprinse ntre 1 i 10 m i sunt observate la microscopul optic.
Structura celulei bacteriene
-

Structuri constante

material nuclear sau nucleoid

citoplasm

membran citoplasmatic

perete celular

Structuri facultative

glicocalix

flageli

pili comuni (fimbrii) i pili sexuali

endospor

STRUCTURI ESENTIALE:
Materialul nuclear
Citoplasma
Membrana citoplasmatica
Peretele bacterian (exceptie: Mollicutes - Mycoplasma)

Material nuclear
echivalentul nucleului celulelor eucariote, fr membran nuclear i nucleol;

 molecul circular unic de ADN (1000-2000 m) cu structur bicatenar complementar i

antiparalel;
pentru a ocupa un spaiu ct mai redus, dublul helix este rulat n sens negativ sub efectul ADNgirazei;
unele bacterii au n citoplasm plasmide, molecule mici circulare de ADN care confer avantaje
selective (e.g. rezistena la antibiotice, producerea de toxine, etc.)
funcii:
reprezint suportul genetic al caracterelor ereditare;
transmite informaia genetic la celulele fiice prin autoreplicare;
transmite informaia catre ribozomi prin heteroreplicare;
Cromozomul bacterian i plasmidele

Citoplasma
hidrogel coloidal ce prezint:
- o faz dispersant ce conine ap, substane organice i sruri anorganice;
- o faz dispersat reprezentat de:
ribozomi, mai mici dect la celulele eucariote 70S (format din 2 subuniti de
50S i 30S), sediul sintezelor proteice;
incluzii, acumulri de substane organice sau anorganice prezente la unele
bacterii (reprezint depozite de nutrieni; pot avea carcater taxonomic e.g.
granulaiile de volutin prezente la Corynebacterium diphteriae).

RIBOZOMIIConstata de sedimentare: 70S

Cele dou subuniti se unesc cu ajutorul unui complex stabilizat prin ioni de Mg si poliamine.
Cinetic rapid: aprox 500/min.
In total, o bacterie de dimensiuni medii, prezint 20.000 ribozomi.
Sunt dispui ca polisomi n lungul moleculelor de ARNm (pe care le citesc rapid i le traduc foarte
eficient).

INCLUZIILE
Au caracter de specie.
Sunt constant prezente (pot fi folosite drept caractere taxonomice), fiind observabile la MO.
Compuse din:
- Polizaharide: amidon (la Clostridium, Neisseria) sau glicogen (ex. Bacillus);
- polimetafosfat (Corynebacterium diphteriae);
- lipide (Bacillus, Clostridium, Pseudomonas).
Membrana citoplasmatic

mrginete la exterior citoplasma;

constituit din dou straturi fosfolipidice n care floteaz molecule proteice
nu conine steroli (excepie micoplasmele);
funcii:
barier osmotic, cu proprieti de permeabilitate i transport selective;
sediul metabolismului energetic;
include enzime implicate n sinteza unor structuri celulare;

 rol n chimiotaxie;
structura i funcionalitatea pot fi afectate de unele antibiotice i dezinfectante.

structur particular celulelor procariote;

nvelete protoplastul n contact intim cu membrana citoplasmatic;
structura sa diferit condiioneaz comportamentul bacteriilor n coloraiile
difereniale: Gram i Ziehl-Neelsen;
peptidoglicanul sau mureina reprezint constituentul de baz, constant prezent la
bacterii
(excepie chlamidiile i micoplasmele).

Compoziia peretelui dicteaz comportamentul diferit in coloraia Gram

Coloraia Gram
Gram negativ (roii)
Gram pozitiv (violet)
Bacterii Gram pozitiv Streptococcus
(coci sferici, n lanuri)
Bacterii Gram negativ b.g.n.
(Ex. Escherichia, Salmonella) (b.g.n., celule inflamatorii)

Coloraia Ziehl- Neelsen

(b.a.a.r i ne-a.a.r.)
Peretele bacteriilor Gram (+)

Peretele bacteriilor Gram (-)

Structura peptidoglicanului
reea macromolecular alctuit din lanuri glicanice legate prin puni peptidice;

este mai bine reprezentat cantitativ la bacteriile gram-pozitive;

lanurile glicanice sunt formate din alternana a dou aminozaharuri: Nacetilglucozamina i acidul N-acetilmuramic;

lanurile tetrapeptidice constituite din alternana unor aminoacizi n forma L sau D se

leag de gruprile carboxil ale acidului N-acetilmuramic ;

la bacteriile gram-pozitive unitile tetrapeptidice ale lanurilor glicanice adiacente

sunt legate prin puni transversale polipeptidice.

Sinteza peptidoglicanulu
i controlat de enzime de pe suprafaa extern a membranei citoplasmatice
(sunt proteinele de legare ale penicilinei PLP analog strutural de D-ala-D-ala, se fixeaz pe PLP si
inhib sinteza peptidoglicanului)
Controlat de enzime de pe suprafaa extern a membranei citoplasmatice:
-

transglicozilazele, leag cele 2 zaharuri;

transpeptidazele, catalizeaz formarea subunitilor i punilor peptidice structuri care

conin dipeptidul D-alanin-D-alanin.

Peretele bacterian este ancorat n MC, prin lanurile de glican in formare.

Enzimele care controleaz sinteza peptidoglicanului sunt denumite: proteinele de legare ale
penicilinei PLP analog strutural de D-ala-D-ala;
Penicilina se fixeaz pe PLP si inhib sinteza peptidoglicanului penicilina face parte dintre
antibioticele care acioneaz asupra bacteriilor prin distrugerea peretelui.
Funciile petidoglicanului
structur rigid i rezistent, previne explozia protoplastului n medii hipotone
echilibreaz presiunea osmotic intracelular (5-20 atm);

confer forma stabil caracteristic: coci, bacili, cocobacili, spirili, spirochete;

particip la diviziunea celular;

reprezint inta de aciune pentru lizozim i unele antibiotice.
Interes medical
sensibilitatea la lizozim;
este inta unor antibiotice active asupra peretelui bacterian (e.g. penicilinele);
are proprieti antigenice i de adjuvant imunologic.

Forma bacteriilor

Structuri speciale ale peretelui la bacterii gram-pozitive

acizi teichoici (legai de peptidoglican) i lipoteichoici (legai de membrana citoplasmatic)

polizaharide neutre (e.g. antigenele Lancefield la streptococi)

proteine de suprafa cu funcie de

adezine (implicate n ataare) sau cu

efect antifagocitar (proteina M, proteina A, proteine de legare la fibronectin etc)

acizi teichoici (legai de peptidoglican) i lipoteicoici (legai de membrana citoplasmatic)

-

apar ca structuri fibrilare pe suprafaa celulei

au urmtoarele funii:

Ag de specificitate;

leag ioni de Mg i enzime autolitice;

se ataeaz de suprafaa celulelor eucariote (factori de ataare/colonizare);

se leag de receptori de pe suprafaa macrofagelor, cu eliberare de citokine

proinflamatorii;

prezint receptori pentru bacteriofagi (virusuri ale bacteriilor) sau bacteriocine

(antibiotice produse de bacterii);

membrana extern reprezentat de

2 straturi asimetrice din fosfolipide;

stratul extern care include LPS (lipopolizaharidul), molecul complex cu trei regiuni:

lipidul A (endotoxina);

core (miez) sau Ag R, de natur polizaharidic;

Ag O, cu specificitate de grup, format din uniti oligozaharidice repetate;

lipoproteine care leag membrana extern de peptidoglican;

porine, molecule proteice n triplet, care formeaz pori pentru pasajul unor molecule hidrofile;

proteine cu rol n transportul specific al unor molecule (vit. B12, aa, nucleozide);

proteine receptor pentru complexul Fe-siderofor, pentru bacteriofagi sau bacteriocine;

proteine cu rol n patogenitate (adezine sau cu efect antifagocitar).

Membrana extern
* Membrana extern oprete accesul spre protoplast a unor substane cu greutate
molecular mare i a unor molecule hidrofobe potenial nocive.
* In consecin, bacteriile gram-negative sunt mai rezistente dect cele gram-pozitive
la dezinfectante, antiseptice, antibiotice.

Spaiul periplasmic

situat ntre membrana extern i membrana citoplasmatic;

conine peptidoglican, lipoproteine, proteine de transport i enzime degradative (hidrolaze,

enzime de degradare a unor antibiotice);

enzimele stocate n spaiul periplasmic sunt eliberate dup necesiti in mediul extracelular,
spre deosebire de bacteriile gram-pozitive care le elibereaz imediat dup ce au fost
sintetizate.

Consecina:
- b.g.n. sunt mai puin pretenioase nutritiv, comparativ cu b.g.p.!!!
- Unele dintre ele cresc n medii nutritive srace (e.g. Pseudomonas).
Structuri speciale ale peretelui la bacterii a.a.r.
arabinogalactan, polizaharid cu unele proprieti ale endotoxinei;

acizi micolici acizi grai cu catene lung (C70-C90)

Complexul arabinogalactan acizi micolici confer:

-

comportarea particular n coloraia Ziehl-Neelsen;

rezistena la factori de mediu (desicaie, dezinfectante, antibiotice);

lipide de suprafa (sulfolipide, fosfolipide, cord factor), cu rol in patogenitate; complexul

lipoarabinoglican si fosfilipide, induce reacia tisular caracteristic (formarea de granuloame,
metaplazierea macrofagelor n celule gigante (celule Langhans) i celule epitelioide)

micozide (sunt peptidoglicolipide, glicolipide), formeaz la exterior un nveli, care contribuie

la supravieuirea in celule fagocitare (rezistent la enzimele lizozomale din fagolizozomul
macrofagelor) sunt bacterii facultativ intracelulare.

Bacterii cu perete modificat

protoplati (la bacterii gram-pozitive ) i sferoplati (la bacterii gram-negative);

apar sub efectul unor ageni inhibitori ai peptidoglicanului (lizozim, antibiotice);

pot supravieui n medii hipertone, pot fi metabolic active dar nu pot s se multiplice;

sferoplatii, n absena agentului inductor, pot reveni la forma de origine.

forme L
-

apar spontan sau sub efectul unor ageni inductori (oc osmotic sau termic,
antibiotice);

pot s se multiplice (mai lent), dnd colonii cu aspect particular (aspect de ou prjit);

pot fi reversibile sau stabile.

Este posibil ca n medulara renal, sub efectul unor antibiotice beta-lactamice

s apar sferoplati care pot explica recderi ale infeciei renale dup ntreruperea
antibioterapiei.
STRUCTURI FACULTATIVE
Glicocalix

a treia structur de nveli, constiuit din polizaharide ( la Bacillus anthracis structur

polipeptidic);

se prezint sub dou forme:

capsula (glicocalix dens: nu poate fi separat prin centrifugare, nu este penetrat de

colorani, deci este vizibil doar in coloraii negative cu tu de India sau nigrozin)

glicocalix lax (slime: poate fi separat prin centrifugare, este penetrat de particule
colorate vizibil in ME, dup coloraii speciale rou ruteniu).

unii autori descriu i microcapsula ()

funcii:
-

confer rezisten la fagocitoz i ageni chimici (antibiotice);

ligant la receptorii de pe suprafaa celulelor eucariote sau suprafee inerte;

Ag de specificitate (Ag K).

Flageli
structuri filamentoase lungi i subiri, de natur proteic (flagelina);

constituii din filament flagelar flexuos, articulat printr-un croet la corpusculul/complexul

bazal - cilindru axial asociat cu unul sau dou perechi de inele (la bacteriile gram-pozitiv: inelul
M si S, respectiv gram-negativ: inelele M si S, la care se adaug P i L); M- flotant in ME, S
supramembranar; P n stratul de peptidoglican; L flotant n ME (membrana extern).

numrul i dispoziia flagelilor reprezint un caracter taxonomic;

confer mobilitate bacteriilor (bacili, vibrioni, spirili, spirochete);

prezint Ag cu specificitate de tip (Ag H).

Fimbrii (pili comuni)

structuri fibrilare , mai scurte dect flagelii, prezeni pe toat suprafaa unor bacterii gramnegative;

constituite din subuniti proteice (pilina);

ader la receptori specifici celulari (importani factori de colonizare);

pot funciona ca Ag specifice.

Pili sexuali
structuri fibrilare n numr mai redus, mai lungi dect flagelii, cu extremitatea liber
butonat;

au rol n transferul ADN prin conjugare.

Endospor

celul bacterian inactiv metabolic, cu citoplasma deshidratat, protejat de structuri de

suprafa suplimentare (cortex, tunic, exosporium);

protoplastul deshidratat conine cantiti mari de dipicolinat de Ca (confer termorezistena);

sporul este deosebit de rezistent la factori de mediu (ageni fizici i chimici);

prezena, forma i dispoziia sporului constituie criteriu taxonomic;

poate germina n condiii favorabile de mediu, genernd bacteria de origine.

Sporularea versus germinarea

Sporularea -transformarea bacteriei n spor n stare deshidratat, supravieuire ndelungat.

Condiii favorabile germinarea: este activat o autolizin a cortexului; apa i nutrienii
difuzeaz spre protoplast rehidratare ruperea nveliurilor sporale eliberarea bacteriei
sub form vegetativ.
Bacterii cu structur particular
Mycoplasma
Chlamydia
Rickettsia
Mycoplasma
Definiie: micoplasmele sunt mici bacterii polimorfe delimitate numai de o membran
trilaminat i lipsite de perete celular rigid ca i de informaia genetic necesar sintezei
precursorilor specifici peretelui (de aceea sunt rezistente la tratamentul cu inhibitori ai
peretelui bacterian);
independente de formele L bacterine;

cultura pe medii acelulare este inhibat de anticorpi specifici.

 Se nmulesc ntr-un ciclu care include, alternativ, elongarea i fragmentarea unor forme
filamentoase n forme cocoide i diviziune acestora.

Ordinul Mollicutes cuprinde 4 familii, dintre care doar una prezint interes medical:
familia Mycoplasmataceae cu genurile:

Mycoplasma i

Ureaplasma
Principala diferen dintre Mycoplasma i Ureaplasma este capacitatea celor din urm de a
utiliza ureea ca surs de energie.
Chlamydia
Definiie: chlamidiile sunt mici bacterii cocoide, parazite energetic, total dependente de ATPul oferit de celula gazd, dei sunt capabile i de sinteze proprii.
Nu cultiv pe medii arificiale.
Au un ciclu particular de reproducere.
Ciclu reproductiv (1)

Se reproduc dup un ciclu complex n care identificm:

- forma infectiv extracelular, corpul elementar (CE) cu diametrul de 200-300 nm i cu perete
gros (rigid, multilaminat);

CE este endocitat de celula gazd unde se tranform n

- form vegetativ, neinfecioas, corpul reticulat (CR) perete mai fin, 0.8 1.5 m diametru.

Consecinte ale parazitismului strict intracelular

Patogenetic: infecia cronic latent coexist cu fenomene de hipersensibilizare (de tip IV).
Diagnostic: chlamidiile cultiv numai in sacul vitelin al OE de gina sau n CC (culturi de celule).
Terapeutic: antibiotice cu bun penetra-bilitate intracelular.
Rickettsiile
Definiie: Rickettsiile sunt mici microorganisme pleomorfe (cocobacili si bacili), gzduite de
artropode;
patogene pentru om i vertebrate.
Compoziia peretelui (peptidoglican cu acid muramic i acid diaminopimelic) le aseamn cu
bacteriile gram-negativ.
Se divid ca bacteriile (prin diviziune), iar n culturi de celule timpul de generaie este de 8-10
ore, la 34C.
Observabile la microscop prin coloraii speciale.
Sunt microorganisme parazite intracelular: chiar dac au capacitii de biosintez
independente i au metabilism energetic nu pot fosforila glucoza ca substrat energetic,
folosind metabolii intermediari ai gazdei (ATP-ul obinut prin oxidarea glutamatului).
Gazde vii:
-

animale de laborator,

OE (n sacul vitelin, la 32C),

CC.

In familia Rickettsiaceae, funcie de spectrul de gazde, s-au diferenait trei triburi, 2 dintre ele
fiind implicate n patologia vertebratelor.

Tribul I Rickettsiae, cu specii patogene pentru om, cuprinde trei genuri:

- Rickettsia;
- Coxiella;
- Ehrlihia.
- Rickettsia: trec repede din fagozom in citoplasm unde se nmulesc; unele ajung in nucleu i
se nmulesc; fragile n mediul extern, se transmit prin vectori.
- Coxiella: supravieuiete i crete in fagolizozom. Formeaz endospori (se transmite prin
aerosoli i pulberi contaminate); se poate transmite i prin vectori (cpue).

Ehrlihia: se inmulete n fagozomi, dup fuzionarea fagozomului cu lizozomii, sub form de

aglomerri muriforme (morule), observabile la microscop ca incluzii citplasmnatice.

Se transmite tot prin vectori