TEHNOLOGII PCR

Principiul reaciei PCR

Reacia de polimerizare n lan reprezint o metod de amplificare in vitro a
unui fragment ADN, ntr-un mod similar, dar mult simplificat, sintezei in vivo
de ADN. Termenul de "n lan" indic repetarea unui ciclu de 3 etape, la
sfritul fiecrui ciclu obinndu-se dublarea numrului de molecule ADN
intrate n reacie.
PCR clasic
Reacia PCR este constituit din urmtorii pai (fig. 1):

1. denaturare termic iniial - expunerea duplexurilor la temperaturi nalte,

de 94-96C pentru 5-15 min. -, pentru separarea catenelor ADN i accesul
componentelor reaciei la situsul sintezei. De cele mai multe ori, matria este
reprezentat de ADNg, cu un grad mare de complexitate i cu risc foarte

mare de amplificare nespecific, factor deosebit de important n special

atunci cnd inta de amplificat este n numr mic de copii/reacie.
Denaturarea iniial prelungit asigur separarea catenelor, inclusiv n
zonele bogate n resturi GC, mai rezistente la denaturare i mbuntete
eficiena reaciei;
2. un numr de 25-45 de cicluri de trei etape (nu se recomand depirea a
45 de cicluri, ntruct componentele de reacie se epuizeaz, ceea ce scade
dramatic eficiena; de asemenea, crete riscul de sintez de produi
nespecifici. O reacie cu 35 de cicluri genereaz 235~34,35 miliarde copii);
i. denaturare, similar etapei 1 - la temperaturi de 94-96C, timp de 3-30 sec
-, necesar pentru separarea duplexurilor sintetizate n fiecare ciclu de
amplificare;
ii. scderea temperaturii, pentru ataarea primerilor, la o valoare
determinat empiric sau conform cu recomandrile productorului kitului
ori cu cele din literatur, n cazul n care secvena primerilor a fost preluat
dintr-o surs bibliografic. De obicei, aceast etap are loc la 55-65C, timp
de 30-60 sec.;
iii. creterea temperaturii la valoarea corespunztoare activitii optime a
enzimei, de obicei 72C, pentru sinteza propriu-zis a catenelor ADN (etapa
de elongare). n diverse variante ale reaciei PCR sau n funcie de tipul de
ADN polimeraz, aceast temperatur poate fi mai joas (ex. 68C sau,
recent, chiar temperatura camerei), acest lucru conducnd la scurtarea
timpului de reacie. Timpul de elongare se estimeaz n funcie de viteza de
polimerizare a enzimei; de exemplu, Taq polimeraza standard adaug cca.
1.000 pb n 60 sec; cum majoritatea produilor PCR sunt <1.000 pb, aceast
durat este cel mai des folosit;
3. un ultim pas de elongare la temperatura de polimerizare, timp de 7-15
min., conceput pentru a permite finalizarea ultimelor reacii de elongare;
4. pstrarea produilor de reacie la 4C, pe timp nedefinit, pn la analiza
final.
La designul reaciei PCR trebuie luai n considerare urmtorii factori:
- tipul de matri, gradul de complexitate al acesteia, calitatea sa i
cantitatea disponibil; matriele mai complexe pot necesita condiii de
denaturare mai accentuat dect cele mai puin complexe;

- regiunea int numr de copii, coninutul su n GC, lungimea sa;

regiunile cu coninut mare GC pot prezenta dificulti de amplificare. Exist
anumite ADN polimeraze special create pentru acest tip de regiuni.
Majoritatea amplificrilor sunt intite asupra unor regiuni de 75-1.000 pb;
dac regiunea de interes depete 1.000 pb este recomandat utilizarea
PCR long-range i a enzimelor special create;
- tipul de ADN polimeraz disponibil, caracteristicile acesteia;
- specificitatea primerilor;
- controalele necesare: ca orice metod experimental, reacia PCR trebuie
s includ i un set de controale:
- controale negative:
- NTC (no template control, control fr matri): nu conine material biologic
i dovedete absena ADN contaminant n reactivii folosii la reacie;
recomandat pentru orice reacie;
- fr ADN polimeraz, opional;
- n reaciile de revers-trancriere urmate de amplificarea ADNc, se realizeaz
i un control negativ ce conine matria ARN i componentele de amplificare
a ADNc, dar nu i revers-transcriptaz, pentru a proba absena ADN
contaminant n proba ARN (prezena ADN putnd genera rezultate fals
pozitive);
- acolo unde este posibil i fezabil, se recomand folosirea unui control
pozitiv a unui ADN (sau set de ADN-uri) care au modificarea a crei
prezen este urmrit n proba analizat.
Reacia este realizat cu ajutorul unui amestec de reacie liofilizat, disponibil
comercial.
RT-PCR
(reverse transcription PCR PCR de revers transcriere): reacie de
transcriere revers a ARN n ADN (denumit ADN complementar, diferit de
ADNg omolog prin prezena exclusiv a exonilor), catalizat de reverstranscriptaz (enzim de origine retroviral). Aceast reacie se realizeaz
ntr-o singur treapt de temperatur, i necesit prezena unor primeri, care
pot fi hexameri randomici (conin toate succesiunile posibile de 6 baze i,
deci, se pot ataa oriunde la ARN), de tip poli(T) (complementari cozilor

poli(A) ale ARNm) sau locus-specifici. Pornind de la primeri, reverstranscriptaza sintetizeaz catena complementar de ADNc; pentru a se
obine cea de-a doua caten ADN este necesar digestia ARN, de asemenea
catalizat enzimatic de ctre RNaza H sau alte enzime similare. Dup
digestia ARN, ADN monocatenar rezultat, nalt hidrofob, tinde s se plieze
pentru a minimaliza contactul cu mediul hidrofil, producnd astfel bucle n ac
de pr.Buclele formate la captul 3' pot oferi o grupare OH de la care ADN
polimeraza iniiaz sinteza celei de-a doua catene ADNc. Acest ADNc poate fi
folosit drept matri n reacii PCR ulterioare, fie ele de tip clasic sau
cantitativ (RT-PCR n doi pai). RT-PCR se poate realiza i ntr-un singur pas,
folosind ARN total sau fracii ale acestuia drept material de pornire i
amestecuri de revers-transcriptaz, RNaz H i ADN polimeraz sau enzime
care au activitate revers-transcriptazic i ADN polimerazic (ex. polimeraza
Tth).