Medicina regenerativa

si inginerie tisulara

Ingineria tesuturilor moi

Ingineria tisulara a vaselor de sange

Sistemul vascular al corpului uman este alctuit dintr-un mare
numr de vase care asigur transportul sngelui prin ntregul
sistem circulator. Numai prin intermediul acestei reele
extinse de artere, vene i capilare este posibil:
meninerea funcionalitii celulare (creterea i dezvoltarea),
absorbia nutrienilor eseniali (vitamine i minerale),
reglarea homeostaziei celulare (ndeprtarea produilor de
metabolism).

Sistemul vascular, n ciuda unor diferene complexe

regionale i de organ, prezint o organizare
histologic unitar.
La modul general, marea majoritate a vaselor
sangvine este alctuit din trei regiuni histologice
distincte.
Fiecare regiune conine proporii variabile de celule
musculare netede i elastin.

Staturi din care este constituit tesutul vascular:

-intima, in constitutia careia se gasesc celule endoteliale;
-media, care contine celule musculare;
-adventicea

Schema unei artere

musculare

Tunica intern, de obicei cea mai subire dintre cele trei tunici, este
alctuit dintr-un singur strat de celule endoteliale aezate pe o
membran bazal (lamina bazal). Sub aceasta exist un strat de
esut de legtur subendotelial, fibro-elastic i un strat organizat al
laminei elastice interne care asigur stabilitatea i flexibilitatea
celulelor endoteliale. De asemenea n strns legtur cu celulele
endoteliale se afl celulele perivasculare denumite pericite.

Figura 2. Descrierea schematic a direciei de curgere a

sngelui n sistemul circulator. n partea de jos a figurii
sunt prezentate diferenele structurale generale dintre
artere i vene. Ambele vase sangvine prezint tunica
intern, tunica medie i tunica extern dar proporia
relativ de celule musculare netede, fibre elastice i
colagen prezint variaii semnificative

Celule endoteliale (contactul direct cu sngele) ndeplinesc un

rol critic n toate aspectele homeostaziei tisulare.
Celulele endoteliale
-regleaz tonusul vascular interacionnd cu componentele
sistemului nervos periferic
- sunt implicate n procesele de tromboliz i coagulare.
-sunt implicate n procesele inflamatorii i imunologice avnd
astfel un rol important n patogenia aterosclerotic precum i n
afeciunile vasculare ocluzive.
Membrana celulelor endoteliale este alctuit la exterior dintrun strat glicoproteic (glicocalix). Acesta asigur, n condiii
fiziologice, formarea unei bariere locale ncrcate electric care
previne migrarea transendotelial a celulelor din snge precum
i a proteinelor plasmatice.

Tunica medie este alctuit preponderent din celule

musculare netede i fibre de elastin.
-Straturile celulare prezint tendina de a fi din ce n ce mai
organizate n arterele mari datorit rolului pe care-l
ndeplinesc n micarea unor volume mari de snge.
- Un strat comun acestei regiuni a vasului sangvin este
lamina elastic extern care asigur suportul structural.
Stratul extern al unui vas sangvin este reprezentat de tunica
extern (adventicea). Acest strat este alctuit aproape n
totalitate din esut de legtur fibro-elastic.

Componenta arterial i venoas a sistemului

cardiovascular
Sngele oxigenat care se ntoarce de la plamni este ejectat din
ventricolul stng al cordului n reeaua arterial. Arterele pot fi
clasificate, funcie de diferenele histologice, n dou tipuri distincte:
elastice i musculare.
Arterele elastice (conductoare) sunt prezente n apropierea
cordului i a altor organe asociate cu deplasarea unor volume mari
de snge. Aceste tipuri de artere, cum ar fi aorta, sunt alctuite din
mai multe straturi de membran elastic perforat fiind n consecin
adaptate ntr-un mod particular modificrilor pe care le presupun
deplasrile unor volume mari de snge. Natura elastic a pereilor
acestor vase sangvine asigur amortizarea oscilaiilor mari care
apar n curgerea sngelui fiind responsabil astfel de omogenizarea
micrii sngelui la distan de cord.

Funcia arterelor musculare (distribuitoare) este de a

asigura distribuia rapid i complet a sngelui ctre toate
organele i esuturile. n timp ce natura pereilor acestor
artere este predominant muscular, studiile histologice au
pus n eviden faptul c acestea conin fibre elastice
discontinui n interiorul stratului de celule musculare netede.
Bifurcarea continu a arterelor conduce la formarea
arteriolelor. Funcia acestora este de a reduce viteza de
curgere a sngelui din arterele mai mari. Aceast reducere
este necesar pentru a preveni afectarea capilarelor (vase
fragile care realizeaz conexiunea dintre arborele vascular
areterial i sistemul venos).

Capilarele la rndul lor realizeaz reglarea microcirculaiei prin

intermediul unor interaciuni complexe cu hormoni i
neurotransmitori eliberai din sinapsele simpatice. Aceste
interaciuni au drept rezultat modificarea tonusului musculaturii
netede din peretele arteriolar.
Tranziia de la arborele vascular arterial la sistemul vascular este
realizat prin intermediul reelei capilare. Din punct de vedere
histologic capilarele sunt lipsite de prezena musculaturii netede. n
alctuirea lor intr un singur strat de celule endoteliale (cu grosimea
de 0,25 m) care se afl pe o membran bazal. Capilarul este
nconjurat de pericite sau celule Rouget. Acestea variaz ca
distribuie n paturile vasculare.

Suprafaa total generat de capilarele din corpul uman

este de 1000 m2 (suprafaa unui teren de tenis). La nivelul
acestei suprafee mari a patului capilar are loc schimbul de
nutrieni, substane solubile i ap ntre snge i esuturile
nconjurtoare.

Schimbul de ap i substane are loc de obicei ca urmare a

difuziei simple conform gradientului de concentraie,
presiunii hidrostatice i osmotice. Pot fi deosebite mai multe
tipuri de capilare: continui, fenestrate i discontinui.

Capilarele continui prezint un endoteliu continuu i

stratul membranei bazale. Sunt ntlnite n marea
majoritate a organelor cum ar fi: cord, plaman, rinichi
i creier.
Capilarele fenestrate sunt de obicei mai rar ntlnite
i se gsesc la nivelul organelor endocrine precum i
la nivel glomerular. Aceste capilare sunt perforate de
pori cilindrici, stabili din punct de vedere anatomic, cu
diametrul ntre 75 i 100 . Aceti pori restricioneaz
transferul proteinelor dar permit transferul relativ liber
al apei i al soluilor.

Capilarele discontinui (sinusoide) sunt ntlnite numai la

nivelul organelor nalt specializate cum ar fi ficatul i organele
formatoare de snge cum ar fi mduva osoas i splina. Porii
mari dintre celulele endoteliale din cazul acestor capilare
(1500-2000 ) permit realizarea schimbului de constitueni
celulari ntre snge i esuturi.
Returul sngelui spre cord prin sistemul venos ncepe prin
micarea sa prin venulele postcapilare care concresc pentru
a forma vene mai mari. Tranziia de la capilare la vene este
marcat de reapariia gradual a celulelor musculare netede
n tunica medie a peretelui vascular precum i a unui strat de
colagen i fibre elastice n adventice.
Diametrul venelor variaz ntre 1 10 mm i unele vene, cum ar fi cele
localizate la nivelul membrelor inferioare ale corpului, conin valve
semilunare unidirecionale care previn acumularea sngelui n extremiti.
Att venele mici ct i cele mijlocii prezint un nivel ridicat al celulelor
musculare n tunica medie n timp ce venele mari conin o cantitate
ridicat de esut de legtur n acest strat.

Proprieti fizice ale vaselor sangvine

Utiliznd dinamica fluidelor se poate descrie scderea vitezei de curgere a sngelui
odat cu scderea diametrului vaselor sangvine. Daca se consider c sngele curge
printr-un vas sangvin cu raza r, la presiunea P pe unitatea de lungime L i innd
cont de faptul c odat cu scderea razei vaselor sangvine suprafaa de seciune a
sistemului vascular crete se poate scrie relaie matematic:
QB = VC x A
unde QB este debitul sangvin, VC este viteza de curgere i A este aria seciunii.
Totui curgerea sngelui prin vase nu este uniform (nu este laminar). Din acest
motiv, ntr-o situaie ideal n care curgerea sngelui este uniform de-a lungul
vasului, confrom mecanicii fluidului (legea Newton) viteza are tendina s fie mai
mare de-a lungul axei centrale a vasului i mai mic la nivelul pereilor. Datorit
faptului c viteza de curgere vaiaz de-a lungul sistemului vascular, n determinarea
rezistenei la curgere sunt implicai mai muli factori. Aceti factori includ: diferena
de presiune P inregistrat la capetele vasului sangvin, raza r i lungimea L ale
acestuia, vscozitatea sngelui . Astfel debitul sangvin printr-un vas poate fi
exprimat (legea Poiseuille) conform ecuaiei:

Q B Pr 4 / 8L

Conform legii Starling curgerea fluidului de-a lungul

endoteliului este rezultatul echilibrului realizat ntre forele
hidrostatice responsabile de deplasarea fluidului spre spaiile
extravasculare i presiunea oncotic ce se opune micrii
fluidului din capilare. Astfel aceast ipotez implic faptul c
diferena dintre presiunea capilar (PC) i presiunea
hidrostatic tisular (PT) este echivalent cu diferena dintre
presiunea oncotic a plasmei dizolvate (p) i a proteinelor
tisulare (T):
PT - PC = p - T.

Boala aterosclerotic cardiovascular ramne principala

cauz de mortalitate n lumea occidental. Aceast boal
produce reducerea localizat a fluxului sangvin prin artere,
evolund pn la obstrucia complet a vasului afectat.
Solutie: utilizarea unei grefe artificiale sau a venei safen.
n mod curent, n operaiile care presupun restabilirea fluxului
sangvin printr-un vas cu diametrul mai mic de 6 mm se
utilizeaz autogrefe de ven safen. n cazul arterelor coronare
se utilizeaz grefa arterial autolog (artera toracic intern,
artera gastroepiploic, artera epigastric inferioar, artera
radial).

Alogrefele crioconservate au fost de asemenea utilizate

pentru by-pass-ul arterelor coronare dar ratele mari de ocluzie
i problemele legate de apariia anevrismelor au condus la
limitarea utilizrii lor la situaiile n care nu sunt disponibile
grefe autologe. Funcionarea corespunztoare a acestor grefe
naturale este pus pe seama prezenei celulelor endoteliale
viabile pe suprafaa luminal.
Dei utilizarea autogrefelor venoase sau arteriale conduce la
obinerea de rezultate bune, ea nu este lipsit de prezena
ctorva dezavantaje:
necesitatea efecturii unui numr ridicat de proceduri
chirurgicale care sporesc riscurile i costurile operaiei n
ansamblu. n plus, grefele venoase prezint perei subiri i pot
fi deteriorate n cursul transplantrii n sistemul arterial. Exist
totui situaii n care, funcie de natura bolii vasculare, prezena
amputaiilor sau a recoltarilor anterioare de esut, pacienii nu
prezint vene corespunztoare grefrii.

Biomateriale utilizate pentru realizarea protezelor

vasculare
Poliuretanii

Cea mai simpla reprezentare a PU este liniara fiind de forma:

unde R2 reprezinta un lant hidrocarbonatat iar R este o hidrocarbura care contine

gruparea OH.

Proteze vasculare nebiodegradabile

n ultimii ani au fost dezvoltate mai multe proteze vasculare din PU
modificati n scopul prevenirii biodegradarii, reducerii caracterului trombogenic si
pentru a le mbunatati proprietatile legate de ingineria tisulara. Acestea includ
Chronoflex, Chronoflex modificat, Thoratec (grefa de acces vascular), PU acoperit
cu L-lactida, PU policarbonat, Thoratec-ePTFE, Corvita, Pulsetec.

Proteza MyoLink ramforsata

(a); modificarile diametrului
intern al unei grefe MyoLink
de 4 mm pe parcursul uni ciclu
cardiac

Poli(etilentereftalatul) si poli(tetrafluoretilena)

Cele mai utilizate materiale n chirurgia cardiovasculara

moderna

sunt

poli(etilentereftalatul)

(denumirea

comerciala

Dacron) si poli(tetrafluoretilena) (denumirea comerciala Teflon).

Complicatiile cele mai severe legate de utilizarea acestui tip de
biomateriale sunt formarea trombilor si infectiile bacteriene.

Grefe sintetice
Functioneaza pentru

diametre mari(6-10 mm)

Dificultati la inlocuirea
diametrelor mici(3-5 mm)

de ce???
Tromboza

Inginerie tisulara?
tisulara?
Celule

Celule endoteliale
Celule musculare
Fibroblaste & miofibroblaste
Celule modificate genetic
Celule stem

Suport

Sintetic
(PET, ePTFE, PGA, PLA, PU)
Natural (colagen)
Matrice biologica decelularizata

Stimulare mecanica

Sisteme de curgere pulsatile

Deformatie longitudinala ciclica
Factori de semnal

Factori de crestere
(bFGF, PDGF, VEGF)
Citokine

Structura

Celule se pot modela si reorganiza in gel colagenic

Colagen crestere rezistenta prin diferite tehnici
(prealiniere magnetica, glicare, antrenare mecanica)

Solicitari mecanice ciclice

(antrenare mecanica)

Straturi autoansamblabile

Arhitectura 3D adecvata
Rezistenta mecanica buna
Dezavantaje: sursa de celule,
necesita> 2 luni pentru realizare

Principiul de realizare a autogrefelor de vase de snge

Suport colagenic

Celulele endoteliate se dezvolta mult mai usor pe materiale

colagenice sau compozite cu laminina dect pe alte tipuri de
produse, asa cum se poate observa din datele prezentate in tabelul
3.
Tabelul 3. Durata de formare a structurii tubulare endoteliale pe diferite
substraturi
Tip celule
SEC
SEC
HUVEC
HUVEC

Substrat
Matrigel
Colagen I +laminina
Matrigel
Matrigel + trombina

Timp de formare
6h
8h
8h
18h

HUVEC
BAEC

1 sapt.
4 sapt.

BAEC

Fibrinogen proteolizat
Copolimer cu grupe de
acid fenilboranic
Alchil-celuloza

BAEC

Colagen I

4zile

10zile

Observatii
Nici o invazie in gel
factor de crestere suplimentar
Efect al trombinei numai la
concentratii mai mici de 2%
Nu se formeaza structura
tubulara
Necesitatea unoi hidrofobicitati
avansate

SEC- celule endoteliale sinusoidale; HUVEC- celule endoteliale umane; BAEC- celule
endoteliale provenite din aorta bovina.

S-au efectuat de asemenea studii de imobilizare a colagenului pe materiale

sintetice, n scopul mbunatatirii adeziunii celulelor endoteliale si cresterii
hemocompatibilitatii materialelor sintetizate. Literatura de specialitate considera
ca cea mai performanta metoda de hemocompatibilizare este acoperirea corpurilor
straine cu celule endoteliale, genernd astfel suprafete hibride

Fixarea celulelor endoteliale pe

implant prin intermediul
colagenului

Ingineria tisulara in sistemul nervos

Eforturile ingineriei tisulare in sistemul nervos au ca obiective:
o
inlocuirea functiei unui component neuroactiv lipsa;
o
salvarea sau regenerarea unui tesut neural vatamat;
o
stimularea elementelor de cuplare neurale.
Furnizarea de molecule neuroactive sistemului nervos
Exista cteva modalitati de proiectare a unor sisteme care pot
furniza acesti factori. Pentru aceasta trebuie luate in considerare:
stabilitatea factorilor;
dozajul necesar;
solubilitatea;
tesutul tinta;
posibilele efecte secundare.

Principalele modalitati utilizate sunt:

Pompele prezinta inconveniente legate de faptul ca
trebuie rencarcate la fiecare 4 saptamni si sunt
susceptibile la formarea de depozite de substante
neuroactive, la infectii si apar probleme la difuzie.
Sisteme polimere cu eliberare lenta a moleculelor
Acestea sunt matrici polimerice ce include moleculele necesare
si pe care le elibereaza lent prin difuzie o anumita perioada de timp.
Exemple de sisteme polimere utilizate:
-poli(etilen vinil acetat);
-elastomeri siliconici;
-poliesteri;
-microsfere din poli(acid lactic-acid glicolic)
Dezavantajul acestor sisteme il reprezinta faptul ca permit
incarcarea cu o cantitate limita de molecule neuroactive precum si
faptul ca ritmul de cedare este ajustat de catre polimer.

Transplantul de celule
Acest mod de eliberare a moleculelor neuroactive se poate
realiza in urmatoarele maniere:
1)
transplantul celulelor primare autologe
Aceasta tehnica presupune procurarea celulelor primare de la gazda,
proliferarea lor daca este necesara generarea unei cantitati de tesut,
modificarea prin inginerie genetica(daca este cazul) si apoi transplantate
inapoi la donor, intr-o zona apropiata.
Dezavantajul principal il constituie faptul ca nu intotdeauna este posibil
sa se procure tesut autolog.
2)
Transplantul de tesut fetal
Unul dintre avantajele unui astfel de sistem il reprezinta abilitatea
acestuia de a supravietui si de a se integra in creierul adultului gazda.
Transplantul de tesut neural fetal alogen poate fi util in tratarea bolii
Parkinson.

3)Transplantul de tesut xenogenic (exogen) incapsulat

- realizarea unor capsule cu pori suficient de mari pentru ca nutrientii sa
ajunga la tesutul transplantat si sa permita eliberarea factorilor
neuroactivi, dar cu o marime suficient de mica pentru a impiedica
patrunderea in tesutul transplantat a moleculelor si celulelor

Incapsularea tesutului xenogenic in membrane polimere semipermeabile

Implicarea inginerie tisulare in optimizarea tehnicii de incapsulare

presupune:
a)

tipul si configuratia membranei de incapsulare.

Un factor important ce determina marimea dispozitivului il reprezinta difuzia

oxigenului spre celulele incapsulate, astfel inct distanta dintre sursa de oxigen
si miezul intern al tesutului transplantat sa fie minima. Marimea si configuratia
dispozitivului influenteaza si cinetica de eliberare a moleculelor neuroactive,
timpul de raspuns fiind mai mic in capsulele mari cu peretii membranei mai
grosi.
Avantajul principal al acestor sisteme il constituie faptul ca nu au nevoie de un
solvent organic in formarea capsulelor si pot fi mai putin citotoxice, insa
rezistenta mecanica si stabilitatea lor in mediul ionic fiziologic este discutabila.

b)

Alegerea celulelor si tesuturilor pentru incapsulare.

Se utilizeaza trei tipuri de celule: postmitotice, liniare si care se divid
lent.

c)

b)
Matricile pentru incapsulare pot fi clasificate in
urmatoarele tipuri:
polielectroliti reticulati, solutie de colagen sau granule
poroase;
derivati ai matricii extracelulare, cum ar fi Matrigel;
hidrogeluri biosintetice.

Matricea are ca functii:

prevenirea formarii unor mari agregate celulare care
conduc la dezvoltarea necrozelor centrale ca o consecinta a
insuficientei oxigenului si a accesului de nutrienti;
permit ancorarea celulelor;
pot induce diferentierea celulelor.

Reconstructia tisulara. Regenerarea nervului

In studiul mecanismului de baza al regenerarii nervilor periferici sau utilizat canale sintetice de ghidare a nervilor pentru intensificarea
procesului de regenerare. Canalele de ghidare pot simplifica repararea
capetelor(terminatiilor) si pot fi utile in intreruperile lungi ale nervilor.

Exemplu de canale de ghidare a nervilor

Canalele de ghidare au rolul:

-reduc tensiunea pe linia suturii;
protejeaza regenerarea nervului de infiltratii;
directioneaza axonii spre tintele periferice(distale).
Optimizarea si intensificarea regenerarii nervului se pot realiza prin:
proprietatile canalului, matricea care umple canalul, celulele insamntate in
lumenul canalului si sudarea axonilor indusa polimeric.
Canalele de ghidare a nervilor pot fi:
1)
peretele canalului:
polimeri inerti: elastomer siliconic, PVC, polietilena.
polimeri permeabili: copolimer de acrilonitril si clorura de vinil, colagen,
PTFEe;
polimeri resorbabili: acid poliglicolic, acid poli-L-lactic, colagen;
polimeri incarcati electric: poliviniliden fluorura(piezoelectric), PTFE;
polimeri cu eliberare a factorilor trofici: copolimer etilena-acetat de vinil.
2)
Matricea lumenului poate fi:
fibrina;
suport colagen-glicozoaminoglicani.
3)
Celule insamntate pentru suportul trofic:
-celule Schwann.

Utilizarea eficienta a proprietatilor canalului de ghidare ia in considerare:

1)Suprafata canalului- microgeometria
Morfologia nervilor periferici care se regenereaza este modelata de catre
microgeometria suprafetei canalelor polimerice de ghidare. Canalele cu peretii interiori
netezi dau nastere la matrici de fibrina longitudinale, organizate, rezultnd lanturi
nervoase mobile cu numerosi axoni mielinizati. Canalele cu suprafata interna rugoasa
dau nastere unei matrici de fibrina neorganizata cu fascicule nervoase difuze intr-un
tesut conjunctiv slab ce umple intregul lumen.
2) Proprietatile electrice.
Regenerarea in vivo urmeaza sectiunea leziunii in sistemul nervos periferic si poate fi
sporita prin curenti galvanici produsi in canalele siliconice prevazute cu mansoane de
electrozi.
3) Eliberarea factorilor bioactivi din peretele canalului
Canalele polimere de ghidare pot fi incarcate cu diferiti factori care sporesc regenerarea
nervilor. Factorul de crestere al fibroblastelor, eliberat dintr-un canal de ghidare pe baza
de copolimer etilena- acetat de vinil faciliteaza regenerarea nervilor periferici de-a
lungul nervului afectat.
4)Peretele canalului resorbabil
Odata cu terminarea regenerarii, canalul dispare fara interventie chirurgicala. Astfel de
comportament au cele obtinute din acid poliglicolic si, respectiv, din poli-L-lactic acid.
Aceste canale trebuie insa sa-si mentina proprietatile mecanice timp de 4-12 saptamni,
iar produsele lor de degradare sa nu interfere cu procesul de regenerare a nervului.