Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
5.1. Transcrierea
ADN are dou funcii primare: funcia autocatalitic, reprezentat de
realizarea procesului de replicare i funcia heterocatalitic ce const n procesul
dirijrii de ctre ADN a sintezei unor molecule specifice, n esen proteine. Dac
funcia autocatalitic o ndeplinete prin natura structurii sale bicatenare, funcia
heterocatalitic a ADN este ndeplinit prin intervenia unor intermediari ntre ADN
i proteinele sintetizate cu funcii variate. Aceti intermediari sunt reprezentai de
diferitele categorii de acizi ribonucleici (ARN) celulari. Sinteza acestora este dirijat
de ctre ADN, la nivelul unor secvene specifice ale acestuia.
Procesul de sintez a diferitelor categorii de ARN celular se
numete transcriere genetic. Molecula de ARN rezultat n urma acestui proces
este identic n ceea ce privete secvena de nucleotide cu una dintre catenele ADN
(cu excepia faptului c timina este nlocuit de uracil), aceasta fiind numit caten
sens sau codogen i complementar cu cealalt care, de altfel, a servit ca matri
pentru sintez (aceasta fiind denumit catena nonsens) (fig.36).
In celule, indiferent c sunt procariote sau eucariote, exist mai multe tipuri de
ARN care sunt implicate n procesul de biosintez proteic. Acizii ribonucleici sunt
compui ribonucleotidici sintetizai prin polimerizarea a patru tipuri de ribonucleotide
(AMP, GMP, UMP i CMP)(tabelul 3), reacia fiind catalizat de transcriptaz sau
ARN-polimeraza dependent de ADN.
Cercetrile lui Chargaff (1950) au indicat c n macromoleculele de ARN
raporturile molare dintre baze variaz n limite foarte largi i nu se mai respect
principiile stabilite pentru ADN dublu catenar.
Structura primar a ARN este reprezentat de ordinea ribonucleotidelor din
monocatena sa. Lungimea diferitelor tipuri de ARN variaz ntre 75 la 10.000
nucleotide. Cele mai mici molecule de ARN sunt reprezentate de ARN de transfer
(ARNt - 80 nucleotide).
ARN-polimeraza are capacitatea de a recunoate cu mare exactitate secvene
specifice de baze azotate de pe matria de ADN, realiznd polimerizarea unor
ribonucleozid-trifosfai liberi aliniai pe matri n virtutea complementaritii
dintre bazele azotate: adeninei din matri i corespunde uracilul n catena ARN,
timinei i corespunde adenina iar guaninei i va corespunde citozina (i invers),
specific fiind faptul c nucleotidele care intr n componena ARN conin n
structura lor riboza (sunt ribonucleotide).
ARN-polimeraza catalizeaz formarea de legturi fosfodiesterice ntre
ribonucleotidele succesive. Majoritatea procariotelor conin o singur ARNpolimeraz (cel mai bine fiind studiat cea de la E.coli), n timp ce n celulele
eucariote au fost identificate trei tipuri de ARN-polimeraze, cu localizare nuclear
(fie n nucleoplasm fie la nivelul nucleolului), specializate n sinteza unui anumit
tip de ARN.
Transcrierea necesit existena matriei ADN fapt pentru care, la nivelul
unor regiuni specifice, cele dou catene ale ADN se separ (are loc o denaturare
fiziologic), iar una dintre ele (catena nonsens) servete ca matri pentru sinteza
ARN. ARN-polimeraza are capacitatea de a iniia sinteza de novo a unei catene
ARN fr a fi necesar existena unui primer; ea citete catena de ADN pe care o
copiaz n sensul 35, iar sinteza ARN se realizeaz n sensul 53. In acest mod,
ribonucleozid-trifosfaii sunt adugai pe rnd la nivelul gruprii 3OH a
ribonucleotidei anterioare, n urma reaciei de polimerizare fiind eliberate grupri
pirofosfat. Transcrierea realizat de ARN-polimeraz este, n esen, asemntoare
cu replicarea i prezint etapele de iniiere, elongare i terminare.
ADN ncepe sinteza ARN, prima ribonucleotid fiind, de regul, purinic (AMP sau
GTP).
Deseori, n procesul de iniiere a transcrierii, regiunea promotor este mult mai
mult dect un situs de legare pentru ARN-polimeraz. Ea conine informaia pentru
legarea, n unele cazuri, a factorilor de reglare accesorii, de tipul AMP c - CAP
(adenozin-monofosfat ciclic cataboliteactivation protein = CAP = proteina
receptoare a AMPc= CRP).
O situaie special este cea a genelor suprapuse: la bacteriofagul X174, un
genom de numai 5,3 kb nu ar putea conine 10 gene cte s-au identificat pe baza
proteinelor virale codificate, iar analiza atent a codonilor de iniiere i de terminare
a dus la concluzia c dou gene sunt complet incluse n alte dou gene (B n A i E n
D), fiind folosite dou cadre de citire diferite n aceeai secven de ADN. O alt
gen K acoper genele A i C (fig.39).
Fig.39. Evidenierea celor trei cadre de citirea diferite ale mesajului genetic la
bacteriofagulX174
5.1.1.2. Alungirea ARN
Iniierea transcrierii face s fie ataat la matri primul NTP care ofer
gruparea 3'-OH ce va fi pus n legtur de ctre ARN-polimeraza cu gruparea 5'fosfat a nucleotidului urmtor prin reacia ce poart numele de atac nucleofilic.
Subunitatea a enzimei catalizeaz formarea legturii fosfodiesterice i astfel
ncepe procesul de elongaie a monocatenei poliribonucleotidice, finalizat printr-o
molecul de ARN.
Sinteza catenei ARN, adic transcrierea genetic se realizeaz n direcia
5'3', aceasta fiind direcia de elongaie, matria de ADN fiind citit totdeauna n
direcia 3'5', astfel c matria i produsul de transcriere sunt antiparalele.
Spre deosebire de ADN-polimeraz care are numai specificitate de direcie,
ARN-polimeraza are i specificitate de secven recunoscnd promotorul genei care
trebuie s funcioneze la un moment dat.
5.1.1.3. Terminarea transcrierii
nucleoplasm. Toate cele trei enzime sunt agregate macromoleculare, de cel puin
500 kD, avnd mai multe subuniti polipeptidice (8-14 subuniti). La eucariote, pe
lng ARN-polimerazele nucleare au mai fost identificate i ARN-polimeraze care
funcioneaz la nivelul organitelor citoplasmatice (mitocondrii i cloroplaste), dar
acestea sunt de dimensiuni mai mici i sunt asemntoare enzimelor bacteriene.
Nici una dintre cele trei tipuri de ARN-polimeraze de la eucariote nu
recunosc promotorul n mod direct ci prin intermediul unor factori de transcriere,
iniiindu-se astfel procesul de transcriere. Factorii de transcriere au aceleai funcii
pentru toate tipurile de ARN-polimeraze, numrul lor fiind mai mare n cazul ARNpolimerazei II; ei au fost grupai n trei categorii:
factori generali necesari pentru iniierea sintezei ARN indiferent de
ARN (de exemplu, ARNr) dei numrul cistronilor transcrii la ARNm este
aproximativ de 1000 de ori mai mare dect al celor ribosomali.
La eucariote durata de via a unei celule este mai mare dect la procariote i
deci ARNm este mai stabil. Aceasta se datoreaz faptului c, la organismele
pluricelulare celulele se gsesc ntr-un mediu intern mult mai stabil n privina
parametrilor si.
Exist o serie de exemple de molecule de ARNm cu durat mai mare de via
dect cea specific: de exemplu, ARNm din celulele de Bacillus cereus ce sporuleaz
triete aproximativ 6 ore; ARNm necesar pentru sinteza hemoglobinei la
mamifere este sintetizat pe baza mesajului din ADN al reticulocitelor din stadiul
nucleat i pstrat pentru mai multe zile n eritrocitele anucleate n care are loc
sinteza hemoglobinei. In cazul oulor i seminelor care au stadiu de dorman
(inactivitate), ARNm este meninut ntr-o form stabil luni i chiar ani. Moleculele
de ARNm cu durat lung de via care pot fi pstrate perioade lungi de timp
nainte de a fi traduse sunt protejate fa de atacul ribonucleazelor prin asocierea
lor cu proteine, asocieri care se denumesc informosomi sau informomere.
Din punct de vedere structural, ARNm prezint trei regiuni distincte:
secvena leader de la captul 5 al moleculei; secvena codificatoare i regiunea 3
terminal. Regiunea leader este important pentru iniierea traducerii dar nici
una dintre nucleotide nu particip la decodificare (aceast secven nu este tradus).
Secvena codificatoare determin structura primar a unei catene polipeptidice
(constituie matria pentru sinteza unei catene polipeptidice) n timp ce regiunea
terminal conine nucleotide care nu vor fi traduse, rolul su fiind legat de
asigurarea stabilitii moleculei de ARNm.
La nivelul ARNm de la procariote exist o secven particular de baze
numit situs de legare la ribosom sau secven Shine-Dalgarno care prezint
complementaritate cu o secven de la captul 3 al ARNr 16S din subunitatea mic a
ribosomilor. De asemenea, la nivelul ARNm policistronic se gsesc, de obicei, secvene
de spaiere (spacer sequences) lungi de 10 pb, care separ secvenele codificatoare
pentru fiecare polipeptid (Watson i colab., 1993).
La eucariote de regul ARNm este monocistronic, el este sintetizat sub forma
unui precursor numit pre-ARNm sau ARN premesager care este supus prelucrrilor
posttranscripionale n urma crora se obine ARNm matur. Acesta trece n
citoplasm unde se asociaz cu ribosomii cu care formeaz polisomi sau
poliribosomi. Lungimea ARN matur nu corespunde secvenei genelor numai preARNm este corespunztor cu aceasta, deoarece n cadrul prelucrrilor
genetice care funcioneaz ca matri pentru sinteza ARNr sunt separate de poriuni
netranscrise numite ADN spaiator sau silenios.
polipeptidic;
structura secundar: se refer la plierea specific a catenei polipeptidice
catene polipeptidice; aceast structur este de cele mai multe ori asociat cu
proprietile biologic active ale proteinei;
structura cuaternar reprezint asocierea mai multor catene polipeptidice cu
formarea unor complexe multimerice. In anumite cazuri, catenele
polipeptidice pot fi asociate i cu grupri neproteice (prostetice), formnd
macromolecule funcionale aa cum este exemplul hemoglobinei (format din
patru catene polipeptidice, 2 i 2, asociate cu o grupare hem, ceea ce
confer macromoleculei capacitatea de a lega oxigenul)(fig.44).
A treia baz a
codonului
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
formil metionin, pe cnd acelai codon aflat n interiorul moleculei de ARNm este
recunoscut de ARNt pentru valin.
6. Utilizarea preferenial a unor codoni. Faptul c exist mai muli codoni
pentru un acelai aminoacid a pus problema dac aceti codoni sinonimi sunt folosii
mai frecvent dect alii. Folosirea unuia sau altuia dintre codonii sinonimi se
datoreaz ntmplrii dar este cert c, n cadrul grupelor taxonomice mari, exist o
anumit preferin pentru anumii codoni sinonimi. Alegerea preferenial a
codonilor ar putea rezulta dintr-o armonizare ntre compoziia n codoni a mesajelor
genetice i ansamblul moleculelor de care dispune celula pentru a traduce aceste
mesaje (n special ARNt din care, pn n prezent s-au izolat doar 54 de tipuri).
7. Universalitatea codului genetic evideniaz faptul c aceleai uniti de
codificare (codonii) specific aceiai aminoacizi la toate organismele, indiferent de
poziia lor taxonomic. In sprijinul acestei concluzii teoretice au fost aduse i date
experimentale din rndul celor denumite himere, care folosesc sisteme acelulare de
sintez a proteinelor provenite de la o specie i ADN sau ARN provenit de la o alta. De
exemplu, ARN genomic provenit de la VMT produce aceeai secven de aminoacizi
nu numai n plantele pe care le infecteaz (tutun), ci n orice alt plant n care este
activ. ARN din fagul f2 dirijeaz sinteza unei proteine capsidale normale att n
extractele acelulare provenite de la gazda sa normal (E.coli), ct i de la Euglena
gracilis. In mod similar, mesagerii sintetici determin ncorporarea n polipeptide a
acelorai aminoacizi indiferent de natura i proveniena sistemului acelular de
sintez proteic.
Utilizarea ARNm pentru sinteza polipeptidelor ce alctuiesc hemoglobina,
provenit din reticulocite de iepure ntr-un sistem acelular de la E. coli pentru sinteza
proteic a dus la obinerea unor polipeptide tipice hemoglobinei de iepure.
Universalitatea codului genetic sugereaz nu numai o origine comun a vieii
pe Pmnt, dar i imposibilitatea schimbrii lui (ipoteza accidentului ngheat)
odat ce viaa a dobndit un anumit grad de complexitate. Mutaiile care ar altera
codul genetic ar fi letale pentru celul n cazul n care un codon ar fi tradus
ntotdeauna eronat. Toate acestea converg pentru a demonstra existena unui cod
genetic comun tuturor organismelor, fr a exclude ca aceast universalitate s nu
fie absolut, n sensul c n anumite privine codul genetic nu putea fi diferit de la o
specie la alta (Gavril, 1986).
Dei caracterul universal al codului genetic prea definitiv stabilit, un numr
important de lucrri au scos n eviden faptul c ADNmt are un cod genetic puin
diferit de cel nuclear. Astfel, ADNmt uman i de oarece codific numai pentru 22
tipuri de ARNt, iar cel de levuri 24 tipuri, din care unii leag mai muli aminoacizi.
In plus, s-au descris aa numiii codoni eretici sau disideni care nu respect codul
genetic universal n sinteza proteic dirijat de ADNmt:
la fungi i mamifere, triptofanul este codificat n mitocondrii nu numai de
tripleta normal UGG ci i de UGA, care n mod normal este stop;
n sinteza polipeptidelor, metionina este codificat nu numai de codonul
AUG (normal) ci i de codonii AUA i probabil AUU, care semnific normal
izoleucina;
codonii AGA i AGG care n citoplasm codific arginina, n ADNmt au rolul
de codoni terminali.
Variaiile codului genetic mitocondrial observate la diferite microorganisme
eucariote sugereaz c aceste modificri s-au stabilit n perioade de timp diferite n
cursul evoluiei, probabil dup divergena dintre plante pe de o parte i animale i
fungi pe de alt parte.
5.2.3. Traducerea informaiei genetice
Biosinteza propriu-zis a proteinelor este un proces complex n cursul cruia
informaia coninut n ADN, transmis n citoplasm (la ribosomi) prin
intermediul ARNm este tradus ntr-o secven polipeptidic prin asamblarea
aminoacizilor ntr-o ordine specific, prescris de informaia genetic. Acest proces
implic activitatea mai multor constitueni ai mainriei celulare de sintez a
proteinelor i evolueaz n mai multe etape.
Toate procesele metabolice ale celulei se bazeaz pe existena i funcionarea
proteinelor, care pot avea rol structural (cum ar fi, colagenul), transportor
(hemoglobinele), de aprare a organismului (imunoglobulinele) sau rol enzimatic.
In cadrul biosintezei proteinelor particip att acizi nucleici, ct i proteine.
Pentru sinteza unei singure catene polipeptidice sunt mobilizate sute de alte proteine
cu rol structural i enzimatic.
Proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, iar polimerizarea acestora se
desfoar la nivelul ribosomilor prin reacia de condensare dintre gruparea
carboxil a unui aminoacid i cea amino a altui aminoacid, cu eliberarea unei
molecule de ap.
Unele proteine sunt alctuite dintr-o singur caten polipeptidic, altele au
mai multe catene polipeptidice identice sau diferite. n acest din urm caz, fiecare
caten este sintetizat pe baza informaiei genetice inclus n gene diferite. Aa se
ARNt
E1
aminoacil~AMP +
aminoacil~ARNt1 + AMP
secven format din 37 nucleotide aflat la captul 3' al moleculei ARNr 16 S din
subunitatea ribosomal mic.
In cazul eucariotelor, ARNm nu conine secvena Shine-Dalgarno,
dovedindu-se c ribosomii citoplasmatici nu se leag direct la situsul de iniiere al
traducerii. In acest caz, primul eveniment ce precede iniierea traducerii la
eucariote este recunoaterea de ctre subunitatea ribosomal mic (40S) a secvenei
terminale 5, metilat (secvena cap) de la nivelul ARNm, dup care el migreaz
spre situsul specific de legare (ribosome-binding site). Intre cele dou regiuni ale
ARNm exist o secven de aproximativ 1000 nucleotide.
Migrarea subunitii ribosomale se oprete atunci cnd este ntlnit
codonul de iniiere (AUG) plasat ntr-un context corespunztor (secvena
GCCACCAUGG sau GCCGCCAUGG). Ulterior, subunitatea ribosomal 40S
stabilizat la nivelul situsului de iniiere se asociaz cu subunitatea 60S, iar procesul
de sintez a proteinelor ncepe.
La procariote, iniierea sintezei catenei polipeptidice este asigurat de
intervenia unor factori proteici citoplasmatici de iniiere, desemnai IF1, IF2, IF3.
Astfel, factorul IF3 mediaz legarea subunitii ribosomale 30S cu ARNm i previne
reasocierea prematur cu subunitatea ribosomal 50S; un al doilea factor de iniere,
IF2, se leag la nivelul unei molecule de GTP i a ARNt iniiator (pentru formilmetionin) i direcioneaz ARNt respectiv spre complexul ARNm-30S. In ceea ce
privete rolul factorului de iniiere IF1, acesta este complex i se refer la stimularea
iniierii, recunoaterea regiunii de iniiere, reciclarea IF2 i disocierea ribosomilor
70S (Zarnea, 1986).
La complexul de iniiere 30S reprezentat de ARNm + subunitatea ribosomal
mic + fMet-ARNt + factori de iniiere + GTP ARNm30S se ataeaz i subunitatea
ribosomal mare, de 50 Si se formeaz complexul de iniiere 70S. Procesul este nsoit
de hidroliza GTP cu eliberarea GMP, a pirofosfatului i a factorilor de iniiere.
Ribosomul astfel asamblat conine dou situsuri de legare a ARNt: situsul A
(acceptor) care este situsul pentru aminoacil-ARNt (ARNt asociat cu aminoacidul
specific) i situsul P (sau situs donor) este situsul la care se ataeaz ARNt iniiator
(Meti-ARNtMet) n cursul procesului de iniiere i peptidil-ARNt (ARNt asociat cu
catena peptidic n curs de alungire) n cursul etapei de elongare (fig.45).
(situsul A)
R
ARNt OH + fMet CO NH CH CO O ARNt
(situsul P)
(situsul A)
R
Dup formarea primei legturi peptidice, la nivelul situsului A se gsete
peptidil-ARNt, iar situsul P conine o molecul ARNt nelegat de nici un aminoacid
(format prin separarea de aminoacidul purtat). In acest moment are loc
repoziionarea ribosomului prin deplasarea cu un codon de-a lungul ARNm,
proces numit translocare. ARNt lipsit de aminoacid aflat n situsul P este mutat la
nivelul unui al treilea situs ribosomal, situs de ieire (exit site= situs E), de unde
este liberat n citoplasm putnd fi refolosit. Deplasarea ribosomului de-a lungul
moleculei de ARNm n direcia 5 3 necesit participarea unui alt factor de
elongare, EF-G care mai este denumit i translocaz. Procesul de translocaie
necesit energie care este furnizat prin hidroliza GTP.
Dup ce situsul P a fost ocupat de dipeptidil-ARNt, la situsul A liber poziionat
pe al treilea codon al ARNm se ataeaz aminoacil-ARNt corespunztor complexat
cu EF-Tu-GT. La nivelul acestuia se adaug apoi gruparea peptidil de la situsul P,
ARNt descrcat se deplasez spre situsul de ieire, iar noul complex peptidilARNt se deplaseaz din situsul A n situsul P dup care ciclul se reia (fig.47).
La E.coli, sinteza unei proteine de dimensiune medie la nivelul unui singur
ribosom se realizeaz n 20 secunde (viteza de sintez este de, aproximativ, 15
aminoacizi/secund). Prin urmare, teoretic, dac sinteza unei proteine s-ar realiza la
nivelul unui singur ribosom s-ar sintetiza cte o copie a respectivei proteine la
fiecare 20 secunde.
i dou cu pliere de tip (pliere a catenei polipeptidice n care segmente rectilinii ale
acesteia sunt juxtapuse n zigzag, ca un metru de tmplrie incomplet strns)
(Zarnea i Dumitru, 1996; Lasmezas i colab., 1997). In schimb, n cazul proteinelor
anormale PrPsc plierea este aproape n ntregime de tip , acest tip de structur
explicnd insolubilitatea n detergeni i rezistena la proteoliz.
Inocularea animalelor de laborator cu diluii foarte mari de omogenat de
creier infectat cu prioni este urmat de o acumulare n creierul acestora a unui
numr mare de proteine infecioase (PrPsc). Descoperirea mecanismului de
rearanjare conformaional (-helix -pliere) in vitro a PrP normale, catalizat
de forma sa patologic, a permis stabilirea unui scenariu n care primele molecule
de PrPsc aprute (prin infecie sau prin mutaie genic) interacioneaz direct cu
PrP pe msur ce acestea se formeaz, impunndu-le propria lor conformaie
(Zarnea i Dumitru, 1996).
Secreia proteinelor. Odat sintetizate, proteinele sunt redistribuite la nivelul
celulelor n vederea ndeplinirii funciei pe care o au. Majoritatea proteinelor sunt
citoplasmatice deoarece, dup sintez rmn la nivelul citoplasmei. O alt parte a
proteinelor celulare sunt localizate la nivelul membranei plasmatice sau sunt
liberate n spaiul extracelular. In cazul celulelor eucariote, proteinele sintetizate n
citoplasm trebuie s ajung la nivelul mitocondriilor, a lizozomilor, a peroxizomilor
sau a nucleului (proteinele nucleare).
Studiile efectuate asupra unor tipuri de celule eucariote (de exemplu, celule
pancreatice) au dovedit c proteinele care au alt destinaie dect citoplasma
(proteinele extracelulare i cele lizozomale), dup sintez, ajung mai nti n
interiorul reticulului endoplasmic (RE). Aa cum se cunoate, reticulul endoplasmic
reprezint un sistem de canalicule la nivelul citoplasmei, asigurnd transportul
intra- i intercelular al unor substane. O parte a reticulului endoplasmic este
asociat cu ribosomi, astfel c proteinele nou sintetizate trec rapid n lumenul RE. Se
pune ns problema modului n care aceste proteine traverseaz membrana RE.
Cercetrile realizate n cazul unor tipuri variate de proteine au dovedit c, n
cazul celor ce vor fi secretate, sau care ajung la nivelul membranei plasmatice, n
lizozomi sau n lumenul RE, la captul amino terminal exist o secven special
format din 25 1 aminoacizi denumit secven leader (sau secven semnal).
Ea este separat de restul proteinei (proteina matur) printr-un situs special numit
situs de clivare proteolitic, recunoscut de o proteaz specific.
O parte dintre proteinele ce ajung n lumenul RE sunt supuse unui proces
de glicozilare (N-glicozilare la nivelul gruprii NH2 a asparaginei sau O-glicozilare