UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA BUCURESTI FACULTATEA DE HORTICULTURA

TEZ DE DOCTORAT

CONDUCTOR TIIN IFIC, PROF.UNIV.DR.CMPEANU GHEORGHE

DOCTORAND ING.CORNELIA CMPEANU

2010

UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA BUCURESTI FACULTATEA DE HORTICULTURA

TEZ DE DOCTORAT
CERCETRI PRIVIND OB INEREA BIOETANOLULUI DIN MATERII VEGETALE AUTOHTONE

CONDUCTOR TIIN IFIC, PROF.UNIV.DR.CMPEANU GHEORGHE Doctorand ING.CORNELIA CMPEANU

2010

UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA BUCURESTI FACULTATEA DE HORTICULTURA

TEMA: CERCETRI PRIVIND OB INEREA

BIOETANOLULUI DIN MATERII VEGETALE AUTOHTONE

CONDUCTOR TIIN IFIC, PROF.UNIV.DR.CMPEANU GHEORGHE Doctorand ING.CORNELIA CMPEANU

2010

PhD THESIS
RESEARCH ON OBTAINING BIOETHANOL FROM INDIGENOUS VEGETABLE RAW MATERIALS

CUPRINS

CAP. I. STADIUL ACTUAL AL CERCETRILOR PRIVIND BIOETANOLUL CARBURANT ECOLOGIC DIN MATERII PRIME VEGETALE 1.1. Noutati si abordari actuale la producerea bioetanolului 1.2. Etanolul din generatia I de biocombustibili: prezent si perspective 1.3. Descrierea principalelor materii prime agricole pentru producerea de bioetanol 1.3.1 Materii prime cerealiere 1.3.1.1 Orzul 1.3.1.2 Grul 1.3.1.3 Secara 1.3.1.4 Sorgul 1.3.1.5 Porumbul 1.3.2 Materii prime tuberculi 1.3.2.1.Cartoful 1.3.2.2 Topinamburul 1.3.3 Sfecla de zahar 1.3.4 Melasa 1.4. Utilizarea preparatelor enzimatice exogene pentru industria etanolului 1.4.1 Folosirea preparatelor enzimatice pentru moderarea parametrilor de prelucrare a materiilor prime 1.4.2 Enzime care degradeaza amidonul 1.4.3 Prezentarea tehnologiilor utilizate in industria spirtului din materii prime amidonoase aplicate in ar 1.4.4 Procedeul tehnologic de plamadire-zaharificare cu plamezi de densitate inalta (Very High Gravity ) 1.5. Microorganismele capabile s produc fermenta ia alcoolic 1.5.1 Drojdii versus bacterii utilizate in fermenta ia alcoolic. Drojdii versus bacterii utilizate n fermentatia alcoolica 1.5.2. Microorganisme / drojdii termorezistente 1.5.3. Microorganisme / drojdii alcoolotolerante

1 1 11 16 17 17 17 17 18 18 19 19 19 19 20 21 21 23 25 30 32 32 45 49

CAP.II.OBIECTIVELE TIIN IFICE ALE TEZEI DE DOCTORAT CAP.III. MATERIALE I METODE UTILIZATE N EXPERIMENTRILE EFECTUATE

57

59 3.1. Materii prime 3.2. Preparate enzimatice 3.2.3 Tulpini de drojdie utilizate 3.2.4.Izolarea de tulpini de drojdie producatoare de alcool 3.3. Metode utilizate n experimentri 3.3.1.Controlul plmezilor de cereale n curs de fermentare 3.3.2. Studierea, testarea si caracterizarea din punct de vedere fizico chimic, bacteriologic si al continutului de micotoxine pentru diferite resurse agricole indigene regenerabile si identificarea acelor resurse care asigure randamente tehnologice optime, la obtinerea de bioetanol 3.3.2.1. Testarea si caracterizarea cerealelor (considerate energy crops) 3.4. Aparatur utilizat n experimentri 3.4.1 Aparatura de laborator 3.4.2. Instala iile pilot 59 59 64 64 66 66 73

73 109 109 110 112

CAP.IV. REZULTATELE CERCETRILOR PROPRII PRIVIND CARACTERISTICILE MATERIILOR PRIME UTILIZATE N OB INEREA BIOETANOLULUI 4.1. Studierea si caracterizarea din punct de vedere fizico chimic a cerealelor 4.2. Studierea si caracterizarea din punct de vedere bacteriologic 4.3. Studierea si caracterizarea din punct de vedere al continutului de micotoxine CAP.V. TESTAREA, STUDIEREA I VERIFICAREA IN LABORATOR A UNOR PREPARATE ENZIMATICE DE ULTIM GENERA IE, DESTINATE OB INERII BIOETANOLULUI 5.1. Metode analitice de determinare a activitatii enzimatice 5.1.1. Determinarea activitatii alfa-amilazice bacteriene 5.1.2. Determinarea activitatii amiloglucozidazice fungice (metoda Sumyzyme) 5.2. Rezultatele studiului la nivel de laborator al comportarii enzimelor amilolitice destinate fabricarii etanolului combustibil din materii prime amidonoase de la firma Novozymes

112 113 114 119

119 119 120 121

CAP.VI. SELECTIONAREA UNOR CULTURI DE DROJDIE TERMOREZISTENTE SI ALCOOLOTOLERANTE SI IDENTIFICAREA UNOR SUE CARE SA PERMITA OBTINEREA UNUI CONTINUT CAT MAI RIDICAT DE ALCOOL 6.1. Experimentri de laborator privind izolarea, selec ionarea i testarea unor tulpini de drojdie capabile s realizeze randamente superioare de fermentare. Metode de izolare, testare, selectie, verificare si pastrare a drojdiilor 6.1.1. Izolarea de tulpini de drojdie producatoare de alcool. Materialul biologic si metoda de cercetare 6.1.2. Examinarea caracterelor morfologice si culturale ale tulpinilor de drojdii izolate, Diagrama morfologica si diagrama Dalmau 6.1.3. Identificarea tulpinilor i ntocmirea fielor tulpinilor de drojdii izolate. Fiele de caracterizare morfologic a tulpinilor 6.1.4. Stabilirea condi iilor de conservare a tulpinilor de drojdie selec ionate 6.2. Drojdii termorezistente si alcoolotolerante 6.2.1.Experien e privind drojdiile termorezistente 6.2.2. Experien e privind drojdiile alcolotolerante 6.3. Experimentari pilot pentru testarea si verificarea caracteristicilor tulpinilor de drojdie izolate de a forma concentratii ridicate de alcool CAP.VII. STABILIREA TEHNOLOGIEI CADRU DE OBTINERE A BIOETANOLULUI DIN MATERII MATERII PRIME AMIDONOASE (CEREALE) 7.1. Varianta tehnologic n cazul utilizrii enzimelor NOVOZYMES destinate producerii de bioetanol 7.2. Varianta tehnologica n cazul utilizarii enzimelor enzime GENENCOR destinate producerii de bioetanol CAP.VIII.CONCLUZII FINALE ALE CERCETARILOR PRIVIND OBTINEREA BIOETANOLULUI DIN MATERII PRIME VEGETALE AUTOHTONE Bibliografie

126

126 126 128 134 148 149 149 151 154

161

161 167

172 179

TABLE OF CONTENTS
CHAPTER. I. CURRENT STAGE OF RESEARCH ON BIOETHANOL ECOLOGICAL FUEL FROM VEGETABLE RAW MATERIALS 1.1. News and current approaches in producing bioethanol 1.2.The ethanol from the first biofuels generation: present and future 1.3. Description of the main agricultural raw materials for bioethanol production 1.3.1 Starch crops: Cereals (Feedstock: Cereals) Feedstock 1.3.1.1 Barley 1.3.1.2 Wheat 1.3.1.3 Rye 1.3.1.4 Sorghum 1.3.1.5 Corn 1.3.2 Starch crops: Tubers (Feedstock: Tubers) 1.3.2.1.Potato 1.3.2.2 Topinambur 1.3.3 Sugar beet 1.3.4 Molasses 1.4. The use of exogenous enzyme preparations for ethanol industry 1.4.1 The use of enzyme preparations for moderating raw materials processing parameters 1.4.2 Enzymes altering the starch 1.4.3 Prezentation of the nationwide technologies used in the industry of alcohol obtaind from starch crops 1.4.4 The technological process of leaven-saccharification with high density meals 1.5. Microorganisms able of producing alcoholic fermentation 1.5.1Yeasts versus bacteria used in alcoholic fermentation 1.5.2. Microorganisms / thermoresistant yeasts 1.5.3. Microorganisme / alcohol-tolerant yeasts 1 1 11 16 17 17 17 17 18 18 19 19 19 19 20 21 21 23 25 30 32 32 45 49 57

CHAPTER II. SCIENTIFIC OBJECTIVES OF PhD THESIS CHAPTER.III. MATERIALS AND METHODS USED IN THE EXPERIMENTS CONDUCTED

59 3.1. Raw materials 3.2. Enzyme preparations 3.2.3 Yeast 3.3. Methods used in experiments 3.3.1. The control of cereal meals under fermentation 3.3.2. The study, testing and physico-chemical, bacteriological and mycotoxins-content characterization of various indigenous renewable agricultural resources and identification of those resources that ensure optimal technological efficiencies in order to obtain bioethanol 3.3.2.1. The testing and characterization of cereals considered energy crops 3.4. Equipment used for experiments 3.4.1 Laboratory equipment 3.4.2 Pilot instalations CHAPTER IV. THE RESULTS OF OWN RESEARCH ON THE CHARACTERISTICS OF RAW MATERIALS USED IN OBTAINING BIOETHANOL 4.1. The study and physico-chemical characterization of cereals 4.2.The study and bacteriological characterization 4.3.The study and mycotoxines-content characterization CHAPTER V. THE TESTING, STUDY AND VERIFICATION IN LABORATORY AND PILOT INSTALLATIONS, OF LAST GENERATION ENZYME PREPARATIONS, SET FOR BIOETHANOL PRODUCTION 5.1. Analytical methods to determine the enzymatic activity 5.1.1. Determination of alpha-amylase bacterial activity 5.1.2. Determination of fungal amyloglucosidase activity (Sumyzyme method) 5.2. The results of laboratory study concerning the behaviour of amylolytic enzymes set for the production of fuel ethanol from starchy materials from Novozymes company CAP.VI. THE SELECTION OF SOME THERMORESISTANT AND ALCOHOL-TOLERANT YEASTS CULTURES AND IDENTIFICATION OF SOME STRAINS ABLE TO ALLOW THE ACHIEVEMENT OF AN ALCOHOL CONTENT AS HIGHEST AS POSSIBLE 59 59 64 64 66 66

73 73 109 109 110 112 112 113 114

119 119 119 120

121

6.1. Laboratory experiments for isolation, selection and testing of some yeast strains able to achieve superior returns by fermentation. Methods for yeasts isolation, testing, selection, verification and storage 6.1.1. Isolation of yeast producing alcohol strains. Biological material and reseach method 6.1.2. Examination of morphological and cultural properties of isolated yeast strains. Morphological chart and Dalmau chart 6.1.3. Identification of strains and preparation of isolated yeast strains schedules. Schedules of strains morphological characterization 6.1.4. Determination of conditions for conservation of selected yeast strains 6.2. Thermoresistant and alcohol-tolerant yeasts 6.2.1. Experiments on thermoresistant yeasts 6.2.2. Experiments on alcohol-tolerant yeasts 6.3. Pilot experiments to test and verify the characteristics of isolated yeast strains to form high concentrations of alcohol

126 126 126 128 134 148 149 149 151

CHAPTER VII. DETERMINATION OF THE TECHNOLOGY FOR OBTAINING BIOETHANOL FROM STARCH CROPS 7.1. Technological variant if using NOVOZYMES enzymes for bioethanol production 7.2.Technological variant if using GENENCOR enzymes for bioethanol production CHAPTER VIII.FINAL CONCLUSSIONS REGARDING THE BIOETHANOL TEHNOLOGY FROM RAW MATERIALS

154 161 167 172

179 Bibliography

CERCETRI PRIVIND OB INEREA BIOETANOLULUI DIN MATERII VEGETALE AUTOHTONE Drd.Cornelia Cimpeanu In conformitate cu documentul oficial de politic energetic a Romniei pentru perioada 2006 2009 (Energie sigur, accesibil i curat, pentru Romnia), obiectivul principal urmrit n promovarea utilizrii biocarburan ilor sau a altor carburan i regenerabili pentru nlocuirea benzinei i motorinei folosit n transporturi, se refer la ndeplinirea angajamentelor privind schimbrile climatice, precum i la promovarea resurselor regenerabile de energie (Proiect Politica energetic a Romniei, 2006). Cercetarile efectuate in Romania privind ob inerea de bioetanol din biomasa vegetale energy crops se afl n faza incipient, iar dezvoltarea rapid a acestui gen de cercetari este impus de necesitatea nlocuirii ct mai rapide a unei propor ii de combustibili fosili cu combustibili proveniti din resurse vegetale regenerabile. tiin a in acest domeniu a facut pai uriai, care se bazeaz pe unele realizari de prestigiu de pe plan mondial, printre care vom men iona: descoperirea preparatelor enzimatice de ultim genera ie i a culturii de drojdie care permite zaharificarea amidonului i fermentarea glucozei n acelasi timp. Aceasta conduce la o serioas economie de energie estimata la cca. 30% din energia utilizat pentru producerea de alcool etilic de uz alimentar; promovarea sitelor moleculare pentru deshidratarea alcoolului etilic ob inut; dezvoltarea principiilor de produc ie ecologic prin minimalizarea consumurilor de materii prime, materiale auxiliare i utilit i.

Producerea efectiv a bioetanolului prin utilizarea de resurse energetice agricole, implic trei principii de baz: - utilizarea uneia sau mai multor materii prime agricole regenerabile autohtone specifice zonei n care este localizat fabrica de bioetanol; - micorarea ct de mult (posibil) a consumului energetic, att la ob inerea plmezii dulci, ct i la distilarea i uscarea bioetanolului, precum i ob inerea unor randamente mai nalte de etanol; - utilizarea tuturor deeurilor i produilor secundari rezulta i conform tehnologiei de ob inere a bioetanolului aplicate, n cazul nostru dioxidul de carbon i borhotul de cereale. Producerea de energy crops este condi ionat de condi iile de mediu ntr-o regiune dat i de managementul agricol, care poate asigura produc ii mari i constante la hectar, cu disponibilit i pentru bioetanol. Producerea de energy crops, care pentru Romnia este reprezentat n primul rnd de porumb, prezint o serie de avantaje, aa cum sunt:

- porumbul reprezint o produc ie specific pentru Romnia, practicabil la scar larg i care este regenerabil; - asigur locuri de munc pentru localit ile rurale i ctiguri suplimentare pentru organismele locale; - borhotul poate fi utilizat n furajarea anumitor categorii de animale, la o paritate de 0,8 / 1 (borhotul rezultat de la prelucrarea porumbului de pe 1 hectar echivaleaz ca valoare nutritiv cu porumbul de pe o suprafa de 0,8 hectare). Culturile energetice pentru Romnia sunt declarate rapi , floarea soarelui, soia i porumb (www.maap.ro). Tema prezentei teze, Cercetari privind ob inerea carburan ilor ecologici din materii prime vegetale autohtone, se nscrie n efortul comun al specialitilor i al multor institu ii din ara noastr, de a obtine bioetanol n condi ii de eficien economic. Obiectivul principal al tezei a fost ob inerea de bioetanol de generatia I din resurse agricole energetice regenerabile autohtone. Pn la ora actual, n Romnia nu s-a produs niciodata bioetanol, indiferent de genera ie. Cercetarile efectuate la nivelul anilor '80, de ob inere a alcoolului carburant din paie, stuf, tulpini de floarea soarelui, coceni de porumb, au dat rezultate nesatisfacatoare din punct de vedere economic. Este pentru prima data in Romnia cnd la zaharificarea plmezilor se folosesc preparatele enzimatice de ultima genera ie STARGEN, destinate exclusiv producerii bioetanolului, precum i drojdia specifica ETHANOL RED. Teza are n vedere, de asemenea, i propunerea unor solu ii tiin ifice i tehnice viabile de ordin practic, de absolut noutate pentru Romnia, pentru ob inerea de alcool carburant din materii prime agricole indigene regenerabile, aplicnd tehnologii ecologice. Obiectivele specifice ale lucrrii de doctorat sunt: studierea, testarea i caracterizarea din punct de vedere fizico chimic i bacteriologic a unor diferite resurse agricole indigene regenerabile, pe care le vom denumi biomasa vegetal i identificarea acelor resurse care asigur randamente tehnologice optime; testarea, studierea i verificarea, att n laborator, ct i n instala ia pilot, a unor preparate enzimatice de ultima genera ie. Prin testarea se are n vedere stabilirea activit ii enzimatice la un moment dat, precum i pierderi de activitate enzimatic pe parcursul pstrrii n anumite condi ii de temperatur i umiditate relativ a aerului; stabilirea dozelor optime de preparate enzimatice industriale i a parametrilor optimi de ac iune asupra amidonului, precum i urmrirea evolu iei proceselor enzimatice de hidroliz a amidonului; selec ionarea unor culturi de drojdie termorezistente i alcoolotolerante i identificarea unor sue care s permit ob inerea unui con inut ct mai ridicat de alcool; elaborarea unor metode de izolare, testare, selec ie, verificare i pstrare a unor noi tulpini de drojdie termorezistente i alcoolotolerante, specifice pentru Romnia;

elaborarea unor floxuri tehnologice pe baza studiilor i experimentarilor efectuate n instala ia pilot pentru propunerea unei tehnologii optime, cu poten ial de aplicare practic. Resursele agricole indigene regenerabile principale care au fost luate n studiu n cadrul tezei de doctorat, n scopul valorificrii lor pentru producerea de bioetanol, au fost porumbul i graul. Toate materiile prime energetice au fost de provenien intern i au fost furnizate de agricultori i de fabrici productoare de alcool din ar. Materiile prime selectate au fost studiate i caracterizate din punct de vedere fizico chimic, bacteriologic, dar i al con inutului de micotoxine. Acestea au fost grupate pe categorii, analizele fiind efectuate n func ie de specificul fiecarei grupe. Astfel, n cadrul studiilor i experimentarilor derulate s-au avut n vedere abordarea a dou categorii principale de preparate enzimatice destinate producerii de bioetanol: - preparatele enzimatice dezvoltate de compania danez NOVOZYMES, care n Romnia sunt comercializate prin intermediul firmei G & G INTERNATIONAL, cu sediul in Avrig (Sibiu); - preparatele enzimatice dezvoltate de compania americana GENENCOR INTERNATIONAL, care la ora actuala a devenit parte a companiei DANISCO i care au fost pentru prima dat testate n Romnia, n vederea producerii de bioetanol la nivel de laborator i pilot. Enzimele furnizate de GENENCOR sunt comercializate prin intermediul firmei Enzymes & Derivates Romania, cu sediul in Costia (Neam ). Teza con ine, sub form de anexe, fiele tehnice ale tuturor preparatelor enzimatice, n original. Preparatele enzimatice NOVOZYMES utilizate n experimentari au fost urmatoarele: - Liquozyme SC DS; - Spirizyme Fuel. Preparatele enzimatice GENENCOR utilizate n experimentri au fost urmatoarele: - STARGEN 001 (complex enzimatic compus dintr-o amilaz i o amiloglucozidaz); - FERMGEN (proteaz). Pentru fermentarea plmezilor de cereale n scopul ob inerii de bioetanol am folosit, separat de drojdiile selectionate, o drojdie uscat activ special destinat ob inerii de concentra ii ridicate de etanol. Drojdia este produs de compania FERMENTIS (Franta) i are denumirea comerciala de ETHANOL RED. Cercetrile privind ob inerea bioetanolului s-au efectuat la dou cereale considerate energy crops pentru Romnia i anume la gru i porumb lundu-se n considerare 20 probe de porumb i 15 probe de gru. Aceste probe au fost testate prin metodele specifice prezentate n capitolul de material i metode iar apoi s-a trecut la experimentarea acestora n sta ia pilot pentru estimarea cantit ii i calit ii bioetanolului ob inut.

Toate materiile prime energetice au fost de provenien intern i au fost furnizate de agricultori i de fabrici productoare de alcool din ar. Materiile prime selectate au fost studiate i caracterizate din punct de vedere fizico chimic, bacteriologic, dar i al con inutului de micotoxine. Acestea au fost grupate pe categorii, analizele fiind efectuate n func ie de specificul fiecarei grupe. 1.Con inutul de protein, grsime, celuloz i amidon se ncadreaz n limitele prrezentate de literatura de specialitate pentru cele dou cereale; 2. ncrcarea microbiologic a materiilor prime este normal; 3. Legislatia romneasca n vigoare limiteaz la maximum 4 ppb prezen a aflatoxinelor totale n gru i respectiv 10 ppb pentru porumb.Se constata c toate probele analizate sau ncadrat n valoarea maxima admisa pentru con inutul de aflatoxine; 4. n cazul orchratoxin limita maxim admis n Romnia 5 ppb-cereale brute i 3 ppbproduse derivate din cereale. Se constat c toate probele analizate s-au ncadrat n valoarea maxim admis; 5. In Romnia, limita maxima n cazul DON pentru cereale neprocesate este 1250 ppb.Din analizele efectuate la probele de gru i porumb se constat c toate probele analizate s-au ncadrat n valoarea maxim admis. In cadrul tezei au fost testate, studiate i verificate n laborator i n instala iile pilot preparate enzimatice NOVOZYMES destinate producerii de bioetanol, de ultim genera ie, Testrile au avut ca scop stabilirea varia iei n timp a activitatii enzimatice, n anumite condi ii determinate de temperatur i umiditate relativ a aerului. Studiul a fost constituit din dou componente: - studiul n condi ii de laborator al comportamentului enzimelor amilolitice destinate fabricrii etanolului combustibil din materii prime amidonoase, de la firma Novozymes Danemarca; - studiul n condi ii pilot al comportamentului enzimelor amilolitice destinate fabricrii etanolului combustibil din materii prime amidonoase. La nivel de laborator a fost determinat evolu ia n timp a activita ii enzimatice a preparatului de amilaza Liquozyme SC DS i a preparatului de amiloglucozidaza Spirizyme Fuel, n diferite condi ii de temperatur i umiditate relativ a aerului. Studiul a fost efectuat pe parcursul a 7 luni, pe parcursul prezentei etape, dar astfel ncat s permit i analiza i interpretarea rezultatelor. Regimurile la care au fost pstrate enzimele i pentru care s-au determinat apoi activit ile enzimatice au fost urmatoarele: 1. temperatura de depozitare: 4C / umiditate relativa a aerului 70% 2. temperatura de depozitare: 25C / umiditate relativa a aerului 70% 3. temperatura de depozitare: 35C / umiditate relativa a aerului 70% 4. temperatura de depozitare: 25C / umiditate relativa a aerului 85% 5. temperatura de depozitare: 25C / umiditate relativa a aerului 90% Rezultatele experimentrilor au artat: n cazul Liquozyme SC DS

1. S-a constatat c, dup 7 luni de depozitare la temperatura de 4C i umiditate relativ a aerului 70%, preparatul cu activitate -amilazica nc mai pastreaz cca. 96,5% din activitatea sa ini ial. 2. In urma cercetrilor realizate, s-a constatat o scdere a activita ii enzimatice amilolitice a preparatului Liquozyme SC DS cu circa 12,4%, dupa men inerea sa timp de 7 luni la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativa a aerului 70%. 3. S-a constatat c, prin men inerea preparatului Liquozyme SC DS timp de 7 luni, la o temperatur de 35C, activitatea amilolitica a acestuia a sczut cu circa 65%. 4. In urma cercetarilor realizate, s-a constatat o scdere a activita ii enzimatice amilolitice a preparatului Liquozyme SC DS cu circa 23%, dupa men inerea sa timp de 7 luni la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativ a aerului 85%, 5. In urma cercetrilor realizate, s-a constatat o scdere a activita ii enzimatice amilolitice a preparatului Liquozyme SC DS cu circa 30%, dup men inerea sa timp de 7 luni la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativ a aerului 90%. n cazul Spirizyme Fuel 1. S-a constatat c, dupa 7 luni de depozitare la temperatura de 4C i umiditate relativa a aerului 70%, preparatul enzimatic cu activitate glucoamilazica nc mai pastreaz cca. 97% din activitatea sa ini iala. 2. In urma cercetrilor realizate, s-a constatat o scdere a activita ii enzimatice glucoamilazice a preparatului Spirizyme Fuel cu circa 15%, dup men inerea sa timp de 7 luni la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativ a aerului 70%, 3. S-a constatat c, prin men inerea timp de 7 luni a preparatului Spirizyme Fuel la o temperatur de 35C i umiditate relativ a aerului 70%, activitatea glucoamilazic a acestuia a sczut cu cca. 39%. 4. In urma studiilor realizate, s-a constatat o scdere a activita ii enzimatice amilolitice a preparatului Spirizyme Fuel cu circa 31%, dup men inerea sa timp de 7 luni la o temperatur a mediului de 25C umiditate relativ a aerului 85%. 5. In urma cercetarilor realizate, s-a constatat o scdere a activita ii enzimatice amilolitice a preparatului Spirizyme Fuel cu circa 44%, dup men inerea sa timp de 7 luni la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativ a aerului 90%, Un alt capirtol at tezei s-a bazat pe selec ionarea unor culturi de drojdie termorezistent i alcolotolerante i identificarea unor sue care s permit ob inerea unui con inut ct mai ridicat de alcool. In cadrul acestui capitol s-au realizat urmatoarele activita i: - Izolarea de drojdii nalt productoare de alcool; - Stabilizarea tulpinilor izolate i care au dat cele mai bune rezultate n ceea ce priveste acumularea de alcool pe parcursul fermenta iei alcoolice; - Caracterizarea morfologica, fiziologica, biochimica a tulpinilor pure i identificarea lor taxonomic. De asemenea, s-a studiat i mbunat it performan ele unor tulpini de drojdie izolate. Pentru izolare s-au folosit medii naturale, urmrindu-se etapele: - izolarea drojdiilor sub form de culturi pure; - caracterizarea macroscopic i microscopic a drojdiilor izolate; - caracterizarea fiziologic i studierea comportamentului fermentativ a drojdiilor alese.

Studiul selec iei unor tulpini de drojdie capabile s fermenteze, n condi ii optime, mediile ce con in ca substrat fermentescibil zaharoza, urmrete att aspectul cantitativ, ct i pe cel calitativ, al producerii etanolului de fermenta ie. n cazul subcapitolului Izolarea de tulpini de drojdie producatoare de alcool ob inerea de colonii izolate de drojdii s-a realizat prin aplicarea tehnicii dilu iilor succesive, avndu-se ca reper densitatea celulelor de drojdie, determinat folosind camera Thoma. S-au izolat un numr de 41 tulpini de drojdii. Pentru izolare s-au folosit att medii naturale, ct i medii speciale, pregtite n laborator. Drojdiile care au format cel mai bogat sediment, au fost izolate din nou n cultur pur i au fost studiate amnun it n ce privete calit ile lor pentru producerea de biomasa. Pentru repicare i conservare s-a utilizat ca mediu de cultur mustul de mal cu agar (MMA). S-au fcut repicri n eprubete cu MMA nclinat, iar termostatarea s-a efectuat timp de 3-5 zile la 20-260C. Mediul de cultur utilizat con ine must de mal cu concentra ia de 8% s.u. cu adaos de agar-agar 2 %. Examinarea caracterelor morfologice si culturale ale tulpinilor de drojdii izolate,s-a efectuat cu ajutorul Diagramei morfologice si a diagramei Dalmau.
Diagrama Dalmau Tulpina E27 M17 F3 F7 M18 M21 D7 Celule Forma Celule rotunde si rotund ovale Celule rotund- ovale Celule rotund-ovale Celule rotund-ovale Celule rotund-ovale Celule rotund-ovale Celule rotund-ovale Pseudomiceliu Grupare izolate sau grupate in grupuri mici grupate in grupuri mari, rar izolate izolate sau grupate in grupuri mici izolate sau grupate in grupuri mici izolate sau grupate in grupuri mici izolate sau grupate in grupuri mici izolate sau grupate in grupuri mici Mod de inmugurire muguras unipolar muguras unipolar muguras unipolar muguras unipolar muguras unipolar muguras unipolar muguras unipolar nu formeaza formeaza pseudomicelii nu formeaza nu formeaza formeaza pseudomicelii formeaza pseudomicelii nu formeaza Sporulare 1-4 spori 1 - 4 spori 1 - 4 spori 1 - 4 spori 1-4 spori 1-4 spori 1 - 4 spori

API ID32C pentru cele 7 tulpini de drojdie izolate i selectionate la nivel de laborator, apoi testate la nivel pilot, au dovedit c toate drojdiile apar in genului Saccharomyces, specia
Rezultatele testului cerevisiae. Rezultatele testelor API pentru tulpinile de drojdie selectionate i testate sunt prezentate ca anexe la teza de doctorat. Stabilind pe baza testelor efectuate c drojdiile izolate apartin genului Saccharomyces, s-a procedat apoi la efectuarea de teste suplimentare, pentru stabilirea speciei. Astfel, s-a folosit mediul WLD.

Stabilirea speciei prin efectuare de teste suplimentare

Tulpina de drojdie E27 M18 F7 D7 M17 F3 M21 Rezultate examen macroscopic Colonii verde deschis, lucioase, cu mediul decolorat Colonii verde nchis, lucioase, cu mediul decolorat puternic Colonii verzi, lucioase, cu mediul decolorat Colonii verzi, lucioase, cu mediul decolorat Colonii verde nchis, lucioase, cu mediul decolorat puternic Colonii verzi, lucioase, cu mediul decolorat Colonii verde nchis, lucioase, cu mediul decolorat puternic

Urmtoarea etap a fost satbilirea capacit ii de fermentare a principalelor zaharuri, ca metod s-a folosit metoda auxonografic. Compuii de carbon utiliza i au fost: glucoz, zaharoz, maltoz, fructoz, galactoz i rafinoz. Capacitatea de fermentare a drojdiilor
Tulpina E27 M18 F7 D7 M17 F3 M21 Glucoz +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Zaharoz ++ ++ ++ + ++ ++ ++ Maltoz ++ +++ ++ + ++ +++ ++ +++ Galactoz +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Fructoz ++ ++ ++ + ++ ++ ++ Rafinoz +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

+ + + Tubul Durham este plin cu CO2 fermentare energic + + Tubul Durham este doar 2/3 plin cu bule de gaz fermentare lent + Tubul Durham este 1/3 plin cu bule de gaz

Microorganismele pstrate n colec ie trebuie men inute viabile i cu activitate de biosintez la nivelul poten ialului maxim. Metoda de conservare adoptat a fost cea a trecerilor succesive pe medii de must de mal - agar, n eprubete nclinate. S-a trecut apoi la determinarea drojdiilor termorezistente. Lucrrile efectuate n prezenta etap au avut n vedere cercetri privind comportamentul tulpinilor de drojdie selec ionate la concentra ii superioare de D-glucoz, la temperaturi ridicate (370C), n vederea caracterizrii i identificrii lor din punct de vedere fiziologic. Termorezisten a tulpinilor de drojdii izolate s-a eviden iat prin testarea creterii lor la 370C pe mediul extract de mal -agar. Rezultate privind osmosensibilitatea unor tulpini de drojdii
Osomosensibilitatea Termorezisten a (mal drojdie + 50% glucoz) E27 + (+) F7 + (+) D7 + (+) M18 + (+) M17 + (+) F3 + (+) M21 + (+) + rspuns pozitiv; - rspuns negativ; V rspuns variabil; (+) rspuns pozitiv printr-o dezvoltare moderat, Tulpina de drojdie

In ceea ce privete osmosensibilitatea, din datele prezentate n tabel se observ c toate tulpinile de drojdii izolate au rspuns pozitiv, prin dezvoltare moderat pe mediile testate, dup o perioad mai lung de timp (3 - 4 zile). Determinarea alcoolorezisten ei drojdiilor s-a efectuat prin experimentri care au avut ca scop selec ionarea cu ajutorul alcoolului etilic, n musturi cu concentra ii ridicate, a celor 7 tulpini de drojdii izolate. Aprecierea fermentrii s-a fcut n compara ie cu dou drojdii ce servesc drept martor i cu probe de must fr alcool. Rezultatele ob inute n studierea capacit ii tulpinilor de drojdii izolate de a fermenta mustul de mal n concentra ii de 8 pn la 16% alcool sunt ilustrate n tabelul nr.27 Se poate vedea din acest tabel ca n toate probele de must fr alcool fermenta ia demareaz n primele 24 ore. n probele cu must de 8 % concentra ie alcoolic fermenta ia demareaz n primele 24 de ore de la nsmn are. n probele cu must de 9 % concentra ie alcoolic fermenta ia demareaz, n primele 24 de ore de la nsmn are. n probele cu must de 10 % concentra ie alcoolic fermenta ia demareaz n primele 24 de ore de la nsmn are. n probele cu must de 11 % concentra ie alcoolic fermenta ia demareaz n primele 24 de ore de la nsmn are. n probele cu must de 12 % concentra ie alcoolic fermenta ia demareaz n primele 24 de ore de la nsmn are. n probele cu must de 14 % concentra ie alcoolic fermenta ia demareaz n primele 24 de ore de la nsmn are. n probele cu must de 16 % concentra ie alcoolic fermenta ia demareaz n primele 24 de ore de la nsmn are. Pentru toate tulpinile de drojdii izolate, testate pe must cu concentra ii diferite de alcool (8 16% v/v), comparativ cu probe martor (must fr alcool), se remarc o alcoolorezisten ridicat. Experien ele au continuat n sta ii pilot pe materialul vegetal porumb. Experimentrile efectuate n condi ii de laborator i pilot, pe plmezi pe baz de melas i porumb, au demonstrat c se pot realiza culturi de drojdie cu poten ial alcooligen, capabile s fermenteze materii prime diferite. Experimentrile n sta ie pilot s-au axat pe testarea a 7 tulpini de drojdie, izolate din diverse medii. Condi iile de lucru au fost identice n toate cazurile, att din punct de vedere tehnologic, ct i al utilajului. n urma testelor de laborator, din cele 41 tulpini de drojdie luate n lucru, au fost selec ionate 7. Selec ia s-a realizat pe baza nsuirilor de fermentare specifice fiecrei tulpini, principalul indicator fiind con inutul de alcool n plmada fermentat. Prin testele efectuate n sta ia pilot s-a remarcat tulpina F7, care a produs cea mai mare cantitate de alcool n plmada fermentat. Tulpina F7 a produs rezultate bune n cazul fermentrii plmezilor de melas i porumb. Randament practic n etanol este de 93,9% din randamentul teoretic, ceea ce reprezint un randament excelent, la un consum specific de 259,57 kg porumb / 100 litri etanol absolut.

Teza a continuat cu stabilirea tehnologiei cadru de obtinere a bioetanolului din materii materii prime amidonoase (cereale).Rezultatele ob inute arat c: - experimentarile efectuate la temperatura de 300C au nregistrat rezultate mai slabe dect cele efectuate la temperatura de 350C, ilustrate de con inutul de alcool ob inut n plmada fermentat, dar mai ales de zaharul rezidual la finalul fermentarii; - procesul de fermentare n cazul arjelor 1 4 s-a oprit dup o perioad de timp mai mare de 72 de ore; - n cazul arjelor 1 4 cantitatea de zahr rezidual, respectiv glucoz, rmase neconsumate la finalul procesului de fermentare sunt mari, reprezentnd pierderi, ceea ce denot c procesul de fermentare nu a decurs n condi ii optime; - temperatura optima de desfaurare a ntregului proces este de 350C; - randamentul practic n etanol pentru sarjele 1 4 se situeaza n intervalul 84,58 87,73% din randamentul teoretic, ceea ce reprezint un randament bun, la o medie a consumului specific de 294,16 kg porumb / 100 litri etanol absolut; - randamentul practic n etanol pentru sarjele 5 8 se situeaz n intervalul 89,61 90,55% din randamentul teoretic, ceea ce reprezint un randament foarte bun, la o medie a consumului specific de 267,38 kg porumb / 100 litri etanol absolut.

Porumb

Ap de plmdire

Plmdire

Plmad

Alfa-amilaza

Dextrinizare

Amiloglucozidaza

Zaharificare

Drojdie

Fermentare

Plmad fermentat

Distilare

Borhot

Etanol 95% v/v

Site moleculare Ap indepartat

Deshidratare

Regenerare site moleculare

BIOETANOL Procesul tehnologic de obtinere a etanolului din cereale (porumb), utiliznd preparate enzimatice NOVOZYMES

Porumb

Ap de plmdire

Plmdire

Plmad

Enzime + Drojdie

DextrinizareZaharificareFermentare Plmad fermentat Distilare Etanol 95% v/v

Borhot

Site moleculare Ap indepartat

Deshidratare

Regenerare site moleculare

BIOETANOL

Procesul tehnologic de obtinere a etanolului din cereale (porumb), utilizand preparate enzimatice GENENCOR Pe baza experimentarilor efectuate la nivel de laborator i apoi verificate i validate la nivel pilot, propunem urmatoarele variante tehnologice, cu potential de aplicare practica la nivel industrial: A. Fluxul tehnologic propus n cazul preparatele enzimatice NOVOZYMES mcinarea porumbului la o moar cu ciocnele, cu site cu orificii de 1 mm; hidromodul porumb : apa = 1 kg : 2 litri; adaos de Liquozyme SC in doza de 0,2 g / kg porumb ; adaos de ioni Ca+2 in doza de 2 ppm (sub forma de clorura de calciu);

plmadire 10 minute, la temperatura de 500C ; creterea temperaturii plmezii pn la 850C; men inere la 850C timp de 90 minute ; rcirea plmezii pn la 700C, temperatura de adaos a amiloglucozidazei ; adaos de Spirizyme Fuel n doza de 0,5 ml / kg porumb; rcirea n continuare a plmezii pn la temperatura de 320C, temperatura de nsmn are cu drojdie; - nsmn area cu drojdie Ethanol Red sub form de solu ie cu 20% substan uscat, adgat n plmad n doz de 0,5% m/v; - fermentarea alcoolica a plamezii s-a desfurat n urmtoarele condi ii: - temperatur - 320C; - pH - 4,5 4,8; - adaos de uree n doza de 1000 ppm; - s-a lucrat n varianta tehnologic cu reglarea valorii de pH la 4,5 prin adaos de H2SO4 concentratie 1/6, urmat de men inerea pe tot parcursul fermentrii a acestei valori prin adaos de ap amoniacal concentra ie 25%, B. Fluxul tehnologic propus n cazul preparatele enzimatice GENENCOR - mcinarea porumbului la o moar cu ciocnele, cu site cu orificii de 0,6 mm (min, 95% mcintur de dimensiuni 0,59 mm); - raport porumb : apa = 1 : 2 (1 kg mcintur de porumb : 2 litri ap); - dozarea porumbului macinat n apa i agitare timp de 1 or la temperatura de ini iere a procesului de 350C, Procesul s-a realizat sub form de agitare uoar i continu, care s permit men inerea permanent n suspensie a particulelor de mcintur; - dupa o or s-au adugat cele dou preparate enzimatice i ureea, astfel: - adaos de preparat enzimatic STARGEN n doz de 1,7 g / kg porumb; - adaos de preparat enzimatic FERMGEN n doz de 0,4 g / kg porumb; - adaos de uree n doz de 1000 ppm; - reglarea pH cu acid sulfuric concentra ie 1/6 pn la valoarea de 4,2 fr reglarea ulterioara a valorii de pH; - nsmn area cu drojdie Ethanol Red sub form de solu ie cu 20% substan uscat, adgat n plmad n doz de 0,5% m/v.