ANALIZE FIZICO CHIMICE

CURS 4

HPLC
(High Performance Liquide
Chromatography)

Cromatografia de lichide
de inalta performanta
CLHP
(Chromatographie Liquide De
Haute Performance)
2

Aparatura
Faza
mobila

Rezervor
de solvent
Pompa

Dispozitiv
pentru gradient

Injector
Termoreglare

Coloana

Termoreglare

Detector

Faza
stationara

Inregistrator

Integrator
3

Injector
Pompa

Coloana
Rezervor

Sistem de achizitie

Detector
4

Sistemul de alimentare cu faza

mobila

Rezervorul
Rol: stocarea fazei mobile
Recipienti inchisi (de preferinta)
Pompa
Rol:
Debitarea fazei mobile cu debit constant
Realizarea amestecurilor de solventi ce
compun faza mobila
Regim izocratic = compozitie constanta a fazei
mobile in timp
Gradient de concentratie = variatia compozitiei
fazei mobile in timpul analizei
6

Injectoarele
Rol : introducerea probei in sistem

Injectarea se realizeaza in doua etape:

1. Incarcarea buclei cu proba
2. Injectarea propriu-zisa a probei

Coloana
Rol: realizarea propiu-zisa a separarii
Contine faza stationara
Dimensiuni:
L = 30 250 mm
= 2.1 - 4.6 mm
dimensiunea particulelor: 3 7 m

Detectoarele
Rol: detectarea produsilor separati
Principalele tipuri de detectoare:
Refractometre diferentiale
Detectoare cu absorbtie in UV-vizibil
Fluorimetre
Detectoare electrochimice
Tipul de detector = f(proprietatile substantei
de analizat)

10

Refractometrele diferentiale
Principiu: masurarea in continuu a diferentei
dintre indicele de refractie al fazei mobile
si cel al efluentului de pe coloana
Efluentul din coloana

Efluentul din coloana

n2

n1
n1

Faza mobila

n1

Faza mobila

11

Avantaje:
Detector universal
Dezavantaje:
Sensibilitate redusa
Imposibilitatea realizarii gradientilor de
elutie
Sensibil la variatii de temperatura

12

Detectoare cu absorbtie in UV-Vis

Principiu: legea Beer Lambert
A = l C
A = absorbanta
= coeficient molar de extinctie
l = lungimea drumului optic
C = concentratia

13

Lampa cu
deuteriu

Oglinda
curba

Oglinda
plana
Pubela
Celula
foto

De la
coloana

Oglinda
curba

Lentile
de cuart

Cuva

Oglinda
plana

Sita de
difractie
14

Limitele acestui aparat:

Folosirea solventilor transparenti in zona de

detectie
Substantele trebuie sa contina o grupare
cromofora pentru a putea fi detectate

Substntele ce nu contin cromofori pot fi

derivate:
Precoloana (induce modificarea
caracteristicilor fizico-chimice a compusilor
de separat)
Postcoloana (reactia de culoarea are loc la
iesirea din coloana, inaintea intrarii in
detector)
15

Detectorul fluorimetric

Sensibilitate si selectivitate mare

Numar limitat de compusi fluorescenti

Derivarea pre-/post- coloana

16

Filtru de excitare

Sursa

Coloana

Microcelula

Filtru de emisie
Fotomultiplicator

Inregistrator

17

Detectorul electrochimic
Principiu: utilizeaza proprietatile
oxido-reducatoare ale solutiilor
Se pot clasifica in doua categorii:
Detectoare coulometrice = electroliza totala a
solutului in timpul trecerii sale
Detectoarele amperometrice = electroliza
partiala a solutului

18

Detectorul conductimetric

Principiu: raspunsul detectorului depinde de

conductivitatea solutului care il strabate*
Limitari:
faza mobila nu trebuie sa conduca curentul
se asociaza in special cromatografiei de
schimb ionic

19

Inregistratoare - integratoare
Rol: inregistrarea picurilor cromatografice sub
forma unor cromatograme:
Trasate pe hartie - Integratoare
Inregistrate pe un suport electronic
sisteme de achizitie informatizate

20

Cromatograma

Este reprezentarea variatiei, in timp, a

cantitatii de compus din faza mobila ce iese
din coloana cromatografica
Compusa din mai multe picuri
cromatografice

21

Caracteristicile unui pic Gaussian

22

Dinamica procesului cromatografic

Coeficient si izoterme de distributie

ci s
Ki
ci M

Ki = coeficientul de distributie al componentului i

(ci)s = concentratia componentului i in faza stationara
(ci)M = concentratia componentului i in faza mobila

23

24

Volumul de retentie VR
Volumul de retentie
Corectat (VR)

Volumul
mort
V0

Timpul
mort
t0

Inaltimea
picului
h

2
w1/2
Z

Timpul de retentie corectat tR

Timpul de retentie tR
25

Rezolutia

Z
2Z

R
w1 w2 / 2 w1 w2

R = rezolutia
Z = distanta intre concentratia maxima a picurilor
de elutie pentru cei doi componenti;
w1,w2= latimea fiecarui pic;

Selectivitatea

K1

K2

= selectitatea
K1,K2= coeficientii de distributie ai solutilor;

26

Selectivitate diferita in functie de coloana utilizata

Acclaim C18

2
1
AU

Acclaim PA2

3
1

Minutes

Dimensiunea coloanei: 150x4.6mm

Faza mobila:CH3CN/25 mM
tampon fosfat de
potasiu, pH 3.3 v/v
60/40
Temperatura: 30 C
Debit : 1.0 mL/min
Vol injectat: 5 L
Detectie: UV, 206 nm
g/mL
Picuri: 1. Uracil
7.5
2. Piridina
50
3. Fenol
50
4. N,N-Dimetilanilina
50
5. Toluen
60
6. Acid p-Butilbenzoic
50
10
27

Eficienta

L
H
N

H = inaltimea echivalenta a unui taler teoretic

L = lungimea coloanei
N = numarul de talere teoretice
VR
N 16
w

VR = volumul de retentie
w = latimea picului de elutie

28

Seria solventilor dupa puterea de

elutie
Creste puterea de elutie

Creste puterea de elutie

Eter de petrol
Ciclohexan
Tetraclormetan
Tricloretena
Toluen
Benzen
Diclorometam
Eter dietilic
Triclorometan = cloroform
Etanat de etil
Piridina
Propanona
Propanol-1
Etanol
Metanol
Apa
Acid acetic

29

Polaritatea principalelor grupe

functionale
Creste polaritatea

Creste polaritatea

R-H
R-X
R-NO2
ROR; RCOOR; RCOR; RCHO
RCONHR
RNH2; R2NH; R3N
ROH
H20
ArOH
RCOOH

30

Tiplul de cromatografie

Faza normala Faza inversa

Faza stationara

Polara

Nepolara

Tipul de compusi separati

Polari

Nepolari

Pentru scaderea timpilor de

retentie

Cresterea
Cresterea
proportiei de proportiei de
solvent
solvent polar
apolar in
in faza
faza mobila
mobila

31

Cromatografia in faza normala

Ordinea de elutie
in cromatografia
in faza normala

32

Cromatografia in faza inversa

Ordinea de elutie
in cromatografia
in faza inversa

33

Aplicatii HPLC

34

Acizi organici in sucul de rosii

5

34

(A)
1

9 10

11
5

12

13

0
0
12

10

(B)

15
1

20
25
Minutes

30

35

S
2

0
0

10
Minutes

15

Coloana: IonPac ICE-AS6

Faza mobila:
0.4 mM acid
hepta-fluorobutiric
Metanol gradient
Volumul de injectie: 50 L
Debit : 1.0 mL/min
Detectie:conductimetru
(A) Standard
(B) Suc de rosii
Peaks: 1. axalat Peaks:1. anorganici
40
2. tartrat
2. malonat
3. citrat
3. citrat
4. maleat
4. maleat
5. glicolat
5. formiat
6. formiat
6. necunoscut
7. lactat
8. HIBA
9. acetat
10. sccinat
11. fumarat
12. propionat
13 glutamat
20
35

Analiza aminoacizilor intr-un hidrolizat

de colagen
GalN

400

Lys

GlcN OHPro
OHLys
Thr
Ser
nC Arg
Leu
Gly
Met
Ala
Pro
Val
Ile NLeu

His

A: 200 pmol Standard

Glu

Phe

(Cys)2 Tyr
Asp

0
Gly
Thr OHPro Ile
GlcN
Ser
Arg
Met
Ala
Pro
Lys
Leu NLeu
Val
OHLys

140
nC

10

15

20
25
Minutes

B: Collagen Hydrolysate
Glu
Phe Asp
His

Tyr

30

35

40
14039

Comparatii intre diferite hidrolizate de proteine

OHPro

6 M HCl

4 M MSA

nC

4.2 M NaOH
1

4
3 5

14
7
6

10

10 11
12
9

15

13

16
15

20
25
Minutes

17 18
5 M Standard

30

35

40

19

45

Picuri:
1. Arginine
2. Lysine
3. Alanine
4. Threonine
5. Glycine
6. Valine
7. Serine
8. Proline
9. Isosoleucine
10. Leucine
11. Methionine
12. Norleucine
13. Histidine
14. Phenylalanine
15. Glutamate
16. Aspartate
17. Cystine
18. Tyrosine
19. Tryptophan
37