UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCURESTI

PRINCIPIILE MASURARII
PARAMETRILOR FIZICO-CHIMICI

MASTERAND: Avirvarei Elena Cristina ( PCCCP, ANUL I ).

Determinarea rapid i selectiv a reziduurilor de peroxid de

hidrogen din lapte prin serii de analiz prin injectare cu ajutorul
amperometrului

Prezentam o metod analitic foarte rapida, precisa, selectiv i sensibil pentru

determinarea apei oxigenate din lapte utiliznd analiza seriei-injectate (BIA) cu detectare
amperometric la un Prusia albastru vrac cu grafit compozit modificat- electrod. O micropipet
electronic injecteaza pri alicote 100L de probe diluate de 10 ori (laptele cu continut mare i
mic de grsime) direct pe electrodul modificat cufundat n celula BIA.
Caracteristicile analitice ale metodei noastre propuse include RSD sczut ntreinjec ii
(0,76%, n = 9), limita de detecie redusa(10 mol L -1) de frecven analitica ridicat (pn la 80 h 1

) i valorile de recuperare satisfctoare pentru probe inte.

O suprafata noua si foarte reproductive poate fi simplu obtinuta prin simpla lustruitre

mecanica (RSD = 1.6%,n= 5). Stabilitatea la depozitare a grafitului-compozit PB-modificat a

depit 1 an in pstrarea a unei performane echivalente aa cum este prezentat ini ial. Asocierea
BIA cu un detector amperometric mbuntit ofer o mare promisiune pentru monitorizarea de
rutin a peroxid de hidrogen n laptele i alte buturi.
1. Introducere:
Peroxidul de hidrogen (H2O2) este foarte folosit in industria alimentara, pentru
sterilizarea echipamentelor folosite de amestecare, de transport, de imbuteliere i de ambalare. n
timpul sterilizrii, H2O2 se poate ncorpora n suprafaa sticlelor i a pachetelor, ulterior fiind
necesar un proces suplimentar pentru a descompune sau elimina H2O2 rezidual (Hsu, Chang, si
Kuo, 2008). In plus, cu H2O2 a fost utilizat pe scar larg pentru pstrarea laptelui crud, datorit
proprietilor sale bactericide (Haddadin, Ibrahim, i Robinson, 1996).
Cu toate acestea, excesul cu H2O2 poate aduce efecte nocive asupra valorii nutritive a
laptelui, cum ar fi degradarea acidului folic, care este o vitamin esenial pentru corpul uman
(Taher & Lashmaiah, 1992). Mai mult dect att, ingestia cu H2O2 la un nivel ridicat poate
cauza probleme gastrointestinale severe. Adaosul de H2O2 n lapte, la orice concentraie nu este

permis n Brazilia n aa fel nct produsul care conine H2O2 este considerat falsificat (Brasil,
2002). n septembrie 2007 productorii brazilieni au falsificat lapte pur si l-au vndut
companiilor de producie i utilizatorilor finali cu costuri reduse pentru a crete durata de via a
produsului prin adugarea de H2O2 (Paixo & Bertotti, 2009). Cu toate acestea in Brazilia, a fost
raportat recent prezena substantelor de adaos (inclusiv H2O2) in laptele procesat (UHT), din
diferite regiuni ale rii. (Souza i colab., 2011).
Exist cteva metode analitice de determinare a H2O2 din lapte. O metod fluorometric
extrem de sensibila a fost descris pentru determinarea H2O2 n lapte (Abbas, Luo, Zhou, &
Tang, 2010). O limitare a acestei metode pentru aplicatii de rutina este prealabil etapa sa de
preparare a probei, care a implicat o reacie 9-min nainte msurtori. Au fost prezentati si
biosenzorii electrochimici pentru analiza laptelui (Alpat, Alpat, Dursun, si Telefoncu, 2010;
Campuzano, Pedrero, si Pingarron, 2005; Liang & Mu, 2008).
Astfel de sisteme de analiz sunt adesea scumpe i prezint o durat de via scurt
limitate la conditii speciale de conservare a enzimei ncorporate n biosenzor. Un senzor
electrochimic lipsit de enzim a fost prezentat pentru determinarea H2O2 bazat pe un electrod
modificat - albastru de Prusia acoperit cu un strat de polimer de Nafion (Ping et al., 2010).
Datorit selectivitii mare oferite de Prusia-albastru (PB) - electrozi modificati fa de detec ie
H2O2, astfel de senzori electrochimici au fost exprimate ca "peroxidaz artificial" (Karyakin &
Karyakina, 1999; Lu, Cagan, Munoz, Tangkuaram, i Wang, 2006 , Munoz, Lu, Cagan, i Wang,
2007). Cu toate acestea, acoperirea cu Nafion fost necesar pentru a elimina interferen ele din
matricea probei care pot afecta rspunsul electrodului i n consecin ce perturb precizia
metodei (Ping colab., 2010).
Metodele analitice de nalt performan sunt obligatorii n laboratoarele de analiz de
rutin alimentare. (BIA) este o tehnica promitatoare pentru a participa la astfel de cereri datorit
mbuntirii sale n flexibilitate, reproductibilitate, frecvena de analiz, portabilitate i
dimensiunea eantionului. mbinarea cu detectoare electrochimice ofer avantaje suplimentare
ale senzorilor electrochimici precum selectivitate, sensibilitate i rspuns rapid la dezvoltarea
unor metode analitice (Quintino & Angnes, 2004). O micropipet electronic injecteaza fi e
precise de prob (la o vitez programabil) direct pe suprafaa electrodului de lucru, care este
cufundat ntr-o soluie martor-volum mare, i un rspuns rapid electrochimic proporional cu

concentraia de analit este nregistrata. n aceast lucrare, ne-am raporta aplicarea BIA cu
detectare amperometric pentru metoda extrem de rapid, selectiv i sensibil pentru
determinarea H2O2 n probele de lapte cu continutul mare sau mic de grsime.
2. SECIUNEA EXPERIMENTAL
2.1. Chimie
Soluiile au fost preparate cu ap deionizat (Direct-Q3, Millipore, Bedford, MA, USA)
cu o rezistivitate nu mai puin de 18.2 M-cm. Araldite din Brascola (Joinville, Brazilia),
ciclohexanon i peroxid de hidrogen , grafit (: 1-2m), fier (III) clorur , fosfat monoacid de
potasiu, potasiu dihidrogen fosfat i fericianura de potasiu, au fost de calitate analitic i se
utilizeaz fr nici o purificare suplimentar. Soluia tampon de fosfat (pH = 7,2, 0,05 mol L -1
K2HPO4 / KH2PO4) coninnd 0,1 mol L -1 KCl a fost utilizat ca electrolit de suport. Soluiile
stoc de peroxid de hidrogen au fost proaspt preparate chiar nainte de experimente.
2.2. Aparate
Toate msurtorile electrochimice au fost realizate cu ajutorul unui tip AUTOLAB III
(Eco Chemie, Utrecht, Olanda), controlat de software GPES 4.9.007. Injeciile cu soluii standard
sau mostre au fost efectuate folosind un micropipete Eppendorf electronice (flux Multipette),
care permite injecii de la 10- 1000L (utiliznd un 1 ml Combitip) cu o rat de distribuire
programabil (de la 28 -330L-1).
Msurtori amperometrice au fost realizate folosind o celul fcuta n cas lot-de
injectare electrochimic adaptate baza unui raport anterior (Tormin, Gimenes, Richter, i Munoz,
2011) .Fig. 1, ilustreaz o diagram schematic a celulei lot-injectare, care const dintr-un
cilindru de sticl 180 ml (cu diametrul interior = 7 cm) i dou capace de polietilen, care au fost
ferm montate pe partea de sus i de jos a cilindrului. Pe partea de sus, capacul de polietilen
coninea trei gauri pentru s contraatace referin i electrozii i vrful micropipetei.distana
dintre vrful micropipetelor electrice (diametrul exterior = 6,6 mm) i centrul de electrodul de
lucru (poziionat opus la vrful micropipetei) a fost ajustat n jur de 2 mm.

Fig. 1 Schema de principiu a celulei- lot de injectare care conine trei electrodul de sistem
2.3. Prepararea compozitului grafit modificat-PB.
Modificarea pudrei de grafit cu particule PB folosite n senzori pentru H2O2 fost
realizat adugnd 2,0 g grafit sub agitare (10 min) pentru un amestec echimolar (40 ml) de fier
(III) i fericianur de potasiu (0,1 mol L -1) care conine 10 moli L-1 de HCI. Astfel, grafitul se
filtreaz i se pstreaz la 100 grade C timp de 1,5 h pentru activarea particulelor PB adsorbite pe
grafit (Moscone, D'Ottavi, Compagnone, & Palleschi, 2011).
A fost introdus ntr-un tub poliamid (i = 7,2 mm), la care un fir de cupru a fost stabilit
anterior (contact electric) fluid. Timpul de vindecare a fost de 24 de ore la temperatura camerei.
Dup aceea, electrodul fost lustruite cu 400 si 1200 mirghel pietri n prezena apei.
nainte msurtorilor amperometrice de H2O2, electrodul compozitului a fost prezentat
un experiment voltametrie ciclica n intervalul de? 0,1 i 0.35 V n electrolit sprijinirea la 20 mV
s-1 timp de 30 de cicluri.

3. Rezultate i discuii
Intr-un studiu preliminar, compoziia-grafit compozitului electrodul modificat-PB a fost
investigat pe baza rspunsului amperometric studiilor H2O2and rezisten ei electrice (Silva i

colab., 2011). Sa constatat c un compozit coninnd 30% (n greutate.) De grafit PB-modificat i

70% (n greutate.) De grafit pur furnizat cea mai mare sensibilitate pentru determinarea H2O2.
Compozite care conin cantiti mai mari de grafit PB-modificat (> 30%) au prezentat efecte mari
pictur ohmice, deoarece particulelor PB prezentat o conductivitate mai mic particule de grafit
(Silva i colab., 2011). n aceast lucrare, electrodul de lucru a fost produs cu 30% (n greutate.)
Din grafit PB-modificat (70% n greutate. Din grafit pur).
Pentru a obine cea mai mare selectivitate, nregistrrile amperometrici au fost efectuate
sub aplicarea 0.0 . Detectarea redusa de potenial a H2O2 elimin interferentele de substan e
electroactive care pot fi gsite n probele de lapte. Selecia tampon fosfat (pH 7,2) i 0,1 mol L -1
KCl ca electrolit a fost legat de cea mai bun performan a electrodului de lucru PB-modificat
(Karyakin, Karyakina, & Gorton, 1999).
Dup selectarea componenei electrodului de lucru i electrolitului,-grafit compozitului
electrodul modificat-PB fost inserat n celula BIA pentru nregistrri amperometrice rapide i
precise. Parametrii BIA cum ar fi viteza de pipet i de injectare volumul programabil au fost
evaluate. O rat de distribuire de 100Ls -1, cu condiia cea mai mare rspunsul curent i apoi
acest parametru a fost inut constant. Fig. 2 prezint variaia rspunsului curent n func ie de
volumul injectat de 100 mol L-1 soluii standard de H2O2 i variaia frecvenei analitic.

Fig. 2 variaia rspunsului curent n funcie de volumul injectat de 100 mol L-1 soluii
standard de H2O2 i variaia frecvenei analitic.

Msurarea curentului de vrf a crescut semnificativ odat cu creterea volumul de

injecie, de la 25 la 100lL, i a continuat s creasc uor de la 100 la 200lL. Cum era de a teptat,
frecvena analitic (numr de injecii de prob pe or) a sczut cu volume mai mari injectat
aproape liniar. Prin urmare, volumul optim de injectare pentru sistemul de BIA a fost 100L,
care a furnizat frecven analitic mare (aprox 80 h -1) pstrarea unui semnal amperometric mare
pentru H2O2.
Fig. 3 prezint rspunsuri amperometrice nregistrate la 0.0 V pentru preparate injectabile
de 100L (n dublu exemplar) de soluii cu coninut de cretere i scdere concentra iilor de
H2O2 (a-f: 100-600mol L-1 ) i curbele de calibrare respective. Curbele de calibrare (fig. 3) s-au
dovedit pentru fi liniare (R = 0.999), cu valori similare de pant (? 34.1 i? 34.7 A L mol -1)
pentru mrirea i scderea concentraiilor de H2O2), care au confirmat lipsa de efect de
memorie. Rspunsul amperometrice al electrodului de modificat a fost stabil i liniare ntr-un
interval larg de concentraii (0.1-4.0 mol L -1) din sistemul BIA. Un experiment repetat a fost
obinut din injecii succesive a 100 mol L-1 H2O2 i valoarea deviaiei standard relative (RSD) a
fost de 0,85% (n = 10). Limita de detecie n condiii optimizate a fost estimat n 10 moli L -1 (cu
un raport semnal-zgomot de S / N = 3).

Fig. 3 rspunsurile amperometrice nregistrate la 0.0 V

Metoda BIA-amperometric propus sa aplicat pentru analiza laptelui. Efectul de diluie a
probei pe detectarea amperometric H2O2 fost evaluat. Probe mic i mare de grsime din lapte
au fost diluate n electrolit nainte de injectare la diferite rapoarte volumetrice (50, 10, 5 i 2 ori

de diluie). Dac eantioanele au fost de 2 sau 5 ori diluat, valorile de recuperare sczut (<70%)
s-au obinut pentru probele ghimpat cu 0,88 i 2,35 mmol L-1 H2O2.
Souza i colab. (2011) au raportat prezena H2O2 n mai mult de 60% din probele
analizate de lapte UHT brazilian din principalele zone productoare ale rii. Identificarea H2O2
a implicat un test colorimetric calitativ bazat pe oxidarea guaiacol (incolor) de H2O2 catalizat de
peroxidaz (proteine tipic prezentat n lapte UHT-procesat). Aceast metod colorimetric este n
conformitate cu protocolul oficial brazilian pentru analiza laptelui (Brasil, 2006). n acest fel,
ase probe de lapte UHT braziliene prelucrate n instalaiile industriale situate n regiunile
selectate n activitatea de Souza et al. (2011) au fost analizate (patru e antioane din regiunea de
Sud-Est i dou probe din regiunea mijloc-vest).
Peroxidul de hidrogen nu a fost detectat n toate probele prin metoda amperometric BIA
propus. Pentru a evalua acurateea metodei BIA propus pentru analiza laptelui, toate probele au
fost fixat cu 300 i 800 mg L-1 H2O2 (8,8 i 23,5 mmol? 1) i analizate dup o dilu ie de 10 ori
folosind o curb de calibrare de la 0,34 pentru 3,40 mmol L -1 H2O2. S-au obinut valori de
recuperare de la 85% la 107%, pentru analiza probelor de lapte mica si mare in grasimi, care pot
fi considerate acceptabile pentru o astfel de prob.
4. Concluzii
Am demonstrat aplicarea BIA cu detectare amperometric de determinare foarte selectiv
i sensibil H2O2 n lapte folosind un-grafit compozitului electrod modificat-PB.
Probe de lapte sczut i ridicat de grsimi necesare pentru o diluie de 10 ori n
electrolit nainte de analiz. Metoda propus este foarte precis (RSD = 0,76%, n = 9), ccurate
(confirmat prin teste de recuperare), i prezint frecvena analitic ridicat (aprox 80 h -1)
folosirea unei poriune 100L. O suprafa electrodului de proaspete i de reproducere poate fi
uor obinut prin lustruire mecanic simpl i stabilitatea la depozitare a grafitului-compozitului
PB-modificat depit de 1 an.
Metoda BIA-amperometric propus este promitatoare pentru monitorizarea de rutin a
peroxid de hidrogen n lapte i alte buturi i poate fi aplicat usor pentru analiz la faa locului.
Cuprins:

2. Abbas, M. E., Luo, W., Zou, J., & Tang, H. (2010). Fluorometric determination of hydrogen
peroxide in milk by using a Fenton reaction system.Food Chemistry, 120, 327331.
3. Alpat, S., Alpat, K. S., Dursun, Z., & Telefoncu, A. (2010). Development of a new biosensor
for mediatorless voltammetric determination of hydrogen peroxide and its application in milk
samples. Journal of Applied Electrochemistry, 39, 971977
4. Brasil (2002). Instruo Normativa no. 51 de 19 de setembro de 2002. Available in:
5. www.agricultura.gov.br. Accessed on October 2011.
6. Brasil (2006). Instruo Normativa no. 22 de 19 de abril de 2006. Available in:
www.agricultura.gov.br. Accessed on October 2011.
7. Campuzano, S., Pedrero, M., & Pingarron, J. M. (2005). A peroxidase tetrathiafulvalene
biosensor based on self-assembled monolayer modified Au electrodes for the flow-injection
determination of hydrogen peroxide.Talanta, 66, 13101319
8. Haddadin, M. S., Ibrahim, S. A., & Robinson, R. K. (1996). Preservation of raw milk by
activation of the natural lactoperoxidase systems.Food Control, 7, 149152
9. Hsu, C.-L., Chang, K.-S., & Kuo, J.-C. (2008). Determination of hydrogen peroxide residues
in aseptically packaged beverages using an amperometric sensor based on a palladium
electrode.Food Control, 19, 223230
10. Karyakin, A. A., & Karyakina, E. E. (1999). Prussian blue-based artificial peroxidase as a
transducer for hydrogen peroxide detection: Application to biosensors. Sensors and Actuators
B-Chemical, 57, 268273
11. Karyakin, A. A., Karyakina, E. E., & Gorton, Lo (1999). On the mechanism of H2O2
reduction at Prussian blue modified electrodes. Electrochemistry Communications, 1, 7882
12. Liang, K.-Z., & Mu, W.-J. (2008). ZrO2/DNA-derivated polyion hybrid complex membrane
for the determination of hydrogen peroxide in milk.Ionics, 14,533539.
13. Lu, D. L., Cagan, A., Munoz, R. A. A., Tangkuaram, T., & Wang, J. (2006). Highly sensitive
electrochemical detection of trace liquid peroxide explosives at a Prussian-blue artificialperoxidase modified electrode. Analyst, 131,12791281
14. Moscone, D., DOttavi, D., Compagnone, D., & Palleschi, G. (2011). Construction and
analytical characterization of Prussian blue-based carbon paste electrodes and their assembly
as oxidase enzyme sensors.Analytical Chemistry, 73, 25292535
15. Munoz, R. A. A., Lu, D. L., Cagan, A., & Wang, J. (2007). One-step simplified
electrochemical sensing of TATP based on its acid treatment. Analyst, 132,560565.
16. Paixao, T. R. L. C., & Bertotti, M. (2009). Fabrication of disposable voltammetric electronic
tongues by using Prussian blue films electrodeposited onto CD-R gold surfaces and
recognition of milk adulteration.Sensors and Actuators B-Chemical, 137, 266273.
17. Ping, J., Mao, X., Fan, K., Li, D., Ru, S., Wu, J., et al. (2010). A Prussian blue-based
amperometric sensor for the determination of hydrogen peroxide residues in milk.Ionics, 16,
523527.

18. Quintino, M. S. M., & Angnes, L. (2004). Batch injection analysis: An almost unexplored
powerful tool.Electroanalysis, 16, 513523.
19. Ricci, F., Amine, A., Tuta, C. S., Ciucu, A. A., Lucarelli, F., Palleschi, G., et al.
(2003).Prussian blue and enzyme bulk-modified screen-printed electrodes for hydrogen
peroxide and glucose determination with improved storage and operational stability.Analytica
Chimica Acta, 485, 111120.
20. Silva, R. A. B., Gimenes, D. T., Tormin, T. F., Munoz, R. A. A., & Richter, E. M.
(2011).Batch injection analysis with amperometric detection: application for simultaneous
analysis using a single working electrode.Analytical Methods, 3,28042808
21. Silva, R. A. B., Montes, R. H. O., Munoz, R. A. A., & Richter, E. M. (2011).Determination of
hydrogen peroxide in antiseptic mouthwash using a microdevice containing Prussian blue
particles.Quimica Nova, 34, 987991
22. Silva, R. A. B., Rabelo, A. C., Bottecchia, O. L., Munoz, R. A. A., & Richter, E. M. (2010).
Development, characterization and electroanalytical application of a fluid composite made of
epoxy adhesive, graphite, and cyclohexanone. Quimica Nova, 33, 13981402.
23. Souza, S. S., Cruz, A. G., Walter, E. H. M., Faria, J. A. F., Celeghini, R. M. S., Ferreira, M.
M. C., et al. (2011). Monitoring the authenticity of Brazilian UHT milk: A chemometric
approach.Food Chemistry, 124, 692695
24. Taher, M. M., & Lashmaiah, N. (1992). Folic acid stability in hydrogen peroxide potassium
thiocyanate-treated milk.Food Chemistry, 44, 343347.
25. Tormin, T. F., Gimenes, D. T., Richter, E. M., & Munoz, R. A. A. (2011). Fast and direct
determination of butylated hydroxyanisole in biodiesel by batch injection analysis with
amperometric detection.Talanta, 85, 12741278