MINISTERUL EDUCАŢIEI NАȚIONАLE

UNIVERSITАTEА “VАSILE АLECSАNDRI” DIN BАCĂU

FАCULTАTEА DE INGINERIE
SPECIАLIZАREА ȘIPAE

PROIECT

Coordonator: Prof. Univ. Dr. Chim. Fînaru Adriana-Luminița

Ș.l. dr. Ing. Patriciu Oana-Irina Masterand,
Ing. Aldea Mihai

BАCĂU
2017-2018
 IZOLAREA NICOTINEI DIN
EXTRACTUL DE FRUNZE TE TUTUN
 CUPRINS

INTRODUCERE ........................................................................................................................... 1
MATERIALE ŞI METODE ......................................................................................................... 3
Preparare..................................................................................................................................... 3
Migrarea pe coloana cromatografică ........................................................................................ 3
Analiza fracţiei cromatografice .................................................................................................. 4
Rezultate şi discuţii ..................................................................................................................... 4
Concluzie ........................................................................................................................................ 8
Bibliografie ..................................................................................................................................... 9
 INTRODUCERE

Tutunul sau tabacul este o plantă din genul Nicotiana, familia Solanaceae. În lume există
peste 70 de specii de plante de tutun, cea principală din punct de vedere comercial fiind Nicotiana
tabacum. Frunzele uscate de tutun sunt fumate în țigarete, trabucuri și pipe.
Folosirea tabacului este un factor de risc pentru multe boli, în special cele ce
afectează inima, ficatul și plămânii, și poate cauza apariția cancerului. Conform Organizației
Mondiale a Sănătății, tutunul este cea mai importantă cauză de deces prematur în lume.
Anul 1558 este considerat ca fiind dată la care a început răspândirea tutunului în Europa și
apoi în restul lumii. În acest an, Jean Nicot a trimis tutun Caterinei de Medicis, regina-mamă a
Franței, recomandându-l ca o iarbă vindecătoare a tuturor suferințelor și în special a grețurilor de
care suferea suverană, decoctul de tutun fiind proslăvit repede ca panaceu, idee subliniată de
numele de „herba panacea” sau „herba sancta”, atribuite în acele vremuri tutunului. De la curtea
Franței, și apoi în întreaga țară, el a câștigat lumea în câteva decenii.
Trecerea de la utilizarea lui în scop terapeutic, ca și calmant, la utilizarea lui în scop de
relaxare s-a făcut aproape în toată lumea spre sfârșitul secolului al XVI-lea, mai ales prin comerțul
practicat de cetățile italiene. După Europa, tutunul a fost introdus în Orientul Apropiat și apoi în
Africa, Asia și Oceania. În China și India, marinarii spanioli l-au introdus pe la anii 1600-
1605. Pătrunderea tutunului în unele țări și extinderea obiceiului de a fuma nu a fost lipsită și de
asperități.
La noi, tutunul a fost adus de turci la mijlocul sec. al XVI-lea. În Țara Românească se
percepea un bir numit „haraciul tutunului”, în Moldova voievodul Constantin Duca stabilește în
anul 1698 o taxă pe pogonul de tutun cultivat, iar în Transilvania se introduce o amendă pentru
fumători. Singură activitate comparabilă ca efort era cultivarea tutunului – cei care puneau tutun
erau scutiţi de serviciul militar – chiar şi pe front! – şi erau bine plătiţi. În România, primele
informații au fost furnizate de Ion Ionescu de la Brad cu mai mult de 150 de ani în urmă, obiceiul
fiind însă, așa cum s-a văzut, mai vechi, conform unor descoperiri arheologice datând din secolul
al XVI-lea[8].
Restricţiile privind utilizarea frunzelor de tutun uscat pentru producţia de ţigări a dus la
dezvoltarea de produse alternative care sunt fabricate din frunze de tutun. Una dintre alternative
care se poate realiza este de a utiliza compusul de nicotină din extractul de frunze de tutun ca
produs medical, ca şi medicament pentru boala Parkinson sau pentru a fi utilizat ca agent activ la
obţinerea biopesticidelor. Nicotina a fost izolată utilizând metoda cromatografiei pe coloană cu
variaţia fazei mobile, un amestec de eter de petrol şi etanol, în raport de 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, până la
0:10. Toată fracţia cromatografică din raportul fiecărei faze mobile, a fost testat calitativ folosind
cromatografia în strat subţire (TLC) şi de asemenea cantitativ utilizând metoda HPLC. Prin
procesul de cromatografie pe coloana s-a putut izola 4,006% de nicotină din totalul de 4,19% din
extractul de frunze de tutun.. Este de asemenea, cunoscut faptul că etanolul este o soluţie bună
pentru a fi utilizată în cromatografia mobilă pentru izolarea nicotinei din extractul de frunze de
tutun.

1
 Indonezia este unul dintre cei mai mari producători de tutun din lume, cu o recoltă anuală
de aproximativ 166,262 tone pe an, unde aproximativ 99% din producţia totală este utilizată pentru
fabricarea ţigărilor. Cu toate acestea, reglementările guvernului privind limitarea consumului de
țigări conduce la alte alternative pentru a utiliza tutunul necesar pentru a menține vânzările de
tutun în rândul fermierilor.
Din cercetările anterioare, se ştie că frunza de tutun conţine trei alcaloizi ca şi compuşi
activi precum : nicotina, d-limonen şi indol. Aceşti alcaloizi, în special nicotina, pot fi utilizaţi la
fabricarea spray-urilor de ţânţari cu o eficientă de 50% sau la fabricarea medicamentelor utilizate
în terapia Parkinson.
O multitudine de metode au fost utilizate pentru izolarea nicotinei din extractul de frunze
din tutun, cum ar fi extracţia extracţia tip digestie, sub reflux, şi cromatografia pe coloana. În ciuda
faptului, în Indonezia au existat doar câteva cercetări efectuate în vederea izolării nicotinei din
extractul de frunze de tutun.
În această cercetare, a fost efectuată izolarea alcaloizilor, în scopul derivării nicotinei din
frunzele de tutun. Nicotina a fost de asemenea purificata, astfel încât aceasta să poată fi utilizată
ca principal ingredient în obţinerea insecticidelor. Extractul de tutun utilizat în acesta cercetare, a
fost de origine din Virginia, Ponorogo, recoltat la mijlocul anului 2016.
Pentru aceasta metodă, s-a folosit cromatografia pe coloana (CC), împreună cu,
cromatografia în strat subţire (TLC), pentru a observa calitativ compusul de nicotină în toată fracţia
cromatografică. Conţinutul de nicotină pe fiecare fracţie a fost analizat utilizând cromatografia
lichida de înaltă performanţa (HPLC), cu metanol că faza mobilă[1].

2
 MATERIALE ŞI METODE

Preparare
Pentru prepararea fazei staţionare pe coloana, în prima fază se dizolvă 70g silicagel (raport
lungime – diametru 10:1) cu 250 mL eter de petrol (PE) şi amestec de soluţie de etanol ( raportul
amestecului 8:2), care este faza mobila a coloanei cromatografice. Apoi, gelul de silice a fost agitat
cu ajutorul unei baghete de sticlă până când va deveni o suspensie. Suspensia este încărcată în
coloana până în momentul când aceasta este perfect solidă.
Înainte de introducerea probei în coloană, se amesteca 2 grame de extract din frunze de
tutun cu 2 grame de silicagel pudră. Proba se lasă la uscat timp de 15 minute, urmând ca apoi a se
introduce uşor în coloana pe partea superioară a patului de silicagel[2].

Migrarea pe coloana cromatografică

După încărcarea eşantionului în coloană, se introduc următoarele : 250 mL soluţie eter de petrol,
ce urmează a fi folosită ca prim raport cromatografic de faza mobilă, după care robinetul
coloanei se deschide, şi se lasa să se scurgă faza mobilă, ce conduce la începerea procesulului de
cromatografie. În timpul procesului, faza mobila a fost adăugată pentru a preveni silicagelul
(faza staţionară) de la uscare.

a) b)
Fig.1. Proccesul coloanei cromatografice. a) Diagrama coloanei cromatografice b) Migrarea
coloanei cromatografice

După ce faza mobila a început să îşi modifice culoarea, aceasta s-a colectat utilizând un
balon de câte 20 mL pentru fiecare fracţiune. Aceasta colectare a fost finalizata atunci când faza
mobila ce curge din coloana a fost limpede sau nu a prezentat niciun spot pe placa TLC[6].
Polaritatea fazei mobile a fost apoi marita pentru a continua procesul cromatografic pentru a atrage
mai mulţi compuşi de nicotină. Acest lucru s-a făcut prin schimparea raportului de amestec al
soluţiei de etanol la o valoare mai mare, respectiv 6:4, 4:6, 2:8 şi 0:10. La fel ca la prima încercare,
3
atunci când faza mobila a început să îşi schimbe culoarea, fracţia cromatografică a fost colectata
pentru fiecare dintre aceste raporturi într-un balon separat[4].

Analiza fracţiei cromatografice

Fracţiile colectate în urma scurgerii fazei mobile, sunt supuse unor teste pentru a observa
prezenţa unor alcaloizi în substanţă. Pentru a face acest lucru, se utilizează cromatografia lichidă
de înaltă performanţă (HPLC) 030011-2 analizând compusul şi calculând concentraţiile de
alcaloizi, în special a nicotinei. În cadrul metodei HPLC se va folosi Hypersil C18 BDS ( 250 x
4,6mm, 5 μm) ca şi faza staţionară, şi metanol pro analyst ca şi faza mobila[3].

Rezultate şi discuţii
După ce toate fracţiunile cromatografice din fiecare raport de faza mobila au fost testate
prin cromatografie în strat subţire (TLC), fiecare raport a avut doar o singură fracţie colectată, ce
era o combinaţie din toate fracţiunile fazei mobile. Întreaga fracţiune provenită din amestecul
tuturor fazelor mobile este reprezentată în figură 2.

Fig. 2 TLC testat pe o fractiune unica in functe de raportul amestecului fazei mobile

Înainte de a calcula concentraţia de nicotină din întreaga fracţiune, este necesar de a stabili
ecuaţia liniara de la curba standard, pentru a calcula cantitatea de nicotină. Curba standard a fost
realizată prin calcularea ariei vârfului standardului de nicotină în instrumentul HPLC de la
concentraţia de 0, 200, 400, 600, 800, până la 1000 ppm. Ecuaţia liniara ce a fost obţinută de la
curba standard, a fost utilizată pentru a calcula concentraţia de nicotină din toate probele prin
schimbarea variabilei ”X” cu suprafaţa totală a vârfului de cromatograma[5]. Curba standard poate
fi observată în figura 3.

4
 Fig.3. Curba standard a nicotinei

Pentru a compara concentraţia de nicotină din toate fracţiunile, a fost necesară cantitatea
de nicotină din extractul de frunze. Folosind ecuaţia de la curba standard a nicotinei şi rezultatul
HPLC, se poate calcula concentraţia nicotinei în probă de tutun.
Tabel 1 Concentratia nicotinei din extractul de frunze de tutun

Calculul concentraţiei de nicotină în fiecare fracţie de cromatografie a fost realizat, de

asemenea, folosind dispozitivul de cromatografie lichidă de înaltă performanţă. Fiecare fracţie a
fazei mobile a avut cromatograma proprie şi prin utilizarea acestei cromatograme şi a ecuaţiei de
la curba standard a nicotinei, se poate calcula conţinutul de nicotină pe fiecare fracţie.

5
Toate cromatogramele din fiecare fracţiune pot fi observate în figură 4 de mai jos:

Fig.4. Analiza HPLC pentru fiecare fractiune

Tabel 2. Calculul rezultatelor a conținutului de nicotina in fiecare faza mobilă

În urma rezultatului de mai sus, se poate observa că întregul proces de cromatografie a fost
capabil să izoleze nicotina cu un total de 80,12 mg pe extract de 2 grame sau 4.0006% din totalul
extractului de frunze de tutun utiizat. Această cantitate a fost aproape la fel de mare ca şi
concentraţia de nicotină din extractul din frunzele de tutun, care este de 4,19%.
În eluţia iniţială a fost utilizat un raport mixt de 8:2, unde s-a înregistrat cea mai mare
cantititate de nicotină izolată din toate raporturile. Totuşi, când polaritatea fazei mobile a fost
mărită prin schimbarea fazei mobile la 6:4, concentraţia de nicotină din această fracţiune (6,71
mg) a fost cu o treime mai mică decât în raportul anterior (19,89 mg).
6
 Diferenţa rezultatelor celor două rapoarte anterioare, este dată de faptul că cantitatea de
nicotină din ultimul raport de amestec al fazei mobile a fost capabil să izoleze compusul nicotinei
cu o cantitate destul de constanta. Atunci când s-a utilizat soluţia pură de faza mobila (constând în
etanol 100%), rezultatul obţinut a avut în continuare o cantitate substanţială de nicotină, chiar dacă
coloana cromatografică a ajuns la punctul final.
Pe baza acestui fapt, se poate observa că etanolul a reuşit să izolese bine compuşii de
nicotină în procesul cromatografic. Acest lucru a fost dovedid de cantitatea de nicotină izolată cu
succes în majoritatea raporturilor de soluţii de etanol amestec (4:6, 2:8 şi 0:10) cu o valoare
aproape uniformă pentru fiecare raport în parte ( 18,88; 18,32; 16,32), deşi procesul de eluare a
fost efectuat atunci când cea mai mare parte a nicotinei din extractul de frunze de tutun a fost
separat cu succes.
Pentru procesul de eluare iniţial, cantitatea de nicotină care a fost izolată cu succes de faza
mobila din raportul 8:2 a avut cel mai bun randament dintre toate rapoartele. Dar, pentru că eluţia
s-a făcut la începutul cromatografiei. Deci rezultă că încă există o cantitatea mare de nicotină ce
poate fi separată, nu din cauza polarităţii fazei mobile care a fost potrivită pentru izolarea nicotinei.
Prin urmare, s-ar putea deduce că compuşii etanolului au devenit cea mai bună alegere pentru a
izola nicotina din extractele de frunze de tutun.

7
 Concluzie

Izolarea nicotinei a utilizat ca principiu cromatografia pe coloană cu proces un proces de

eluţie ridicat, a fost capabil să separe nicotina din extractul de frunze de tutun, cu un procent
4,006% din totalul de 4,19% de nicotină aflat în frunzele de tunun. Faza mobila cu o majoritate a
etanolului aflat în diferite rapoarte a reuşit să izoleze nicotina într-o cantitate semnificativă şi
constantă în fiecare raport. Etanolul poate fi utilizat ca o fază mobila în procesul cromatografiei
pe coloana pentru izolarea nicotinei.

8
 Bibliografie

1. Gozan, M., Yasman, Wulan, P.P.D.K., Dawitri, Inter. J. Appl. Eng. Res. 9, 2014, 9739-
9749.
2. Jufri M., Irmayanti E., Gozan M. Inter. J. PharmTech Res. 9(7), 2016, 140-145.
3. Miller, L. R. and Salil, K. D. J. EXCLI 6, 2007, 93-99.
4. Amatullah, A., Production of Biopesticide from Tobacco Leaves (Nicotiana tabacum) with
Digestion and Reflux Extractions, Universitas Indonesia, Depok, 2016.
5. Guo, Z., Wang, L., Song, C., Zhang, L., J. Membr. Sci 356(1–2) , 2010, 105–109.
6. Hu, R.S., Wang, J., Li, H., Ni, H., Chen, Y. F., Zhang, Y. W., Xiang, S. P., Li, H. H., Sep.
Purif. Technol, 2015, 146-147
7. Jork H, Thin Layer Chromatography: Reagents and Detection Methods, Wiesbadener
Graphische Betriebe GmbH, Weinheim, 1990, 252-254.
8. www.wikipedia.ro (accesat în data de 14/06/2018).