Tuberculoza

notiuni introductive
-24 martie 1882, bacteriologul german Robert Koch a prezentat la Societatea de Medicina
din Berlin o comunicare despre bacilul tuberculozei (Koch).
-El a propus primele metode de identificare si de cultivare in laborator a bacilului.
-Pentru aceasta descoperire, Koch a primit Premiul Nobel in 1905.
-1891, Robert Koch a incercat un tratament cu tuberculina - ineficient, agravează
simptomele bolii.
-1907, vienezul Clemens von Pirquet a descoperit intradermoreactia la tuberculina (IDR).
Testul evidentiaza prezenta bacilului Koch in organism si are in continuare un rol important
in combaterea tuberculozei.
0 Este o boală infecto-contagioasă specifică, produsă de bacterii din genul
Mycobacterium tuberculosis
0 Particularități ale infecției bacilare
0 date istorice – dg de tuberculoză 6000 de ani ,
0 răspândire largă,
0 caracter endemic,
0 afectează toate grupele de vârstă,
0 diagnostic dificil prin afectarea pluriorganică

0 Genul Mycobacterium cuprinde peste 70 de specii care au în comun:

0 Forma bacilară,
0 Imobilitatea,
0 Acidoalcoolorezistența,
0 Multiplicarea lentă,
0 Aerobioza obligatorie,
Clasificare
I. Mycobacterii tuberculoase patogene
II. Mycobacterii netuberculoase patogene
III. Mycobacterii netuberculoase nepatogene
Clasificare genul Mycobacterium:
0 Mycobacterii tuberculoase patogene
0 M. Tuberculosis
0 M. Bovis
0 M. Africanum
0 Mycobacterii netuberculoase patogene
0 cu crestere lentă –M .Avium, M.Kansasii,
0 Cu creștere rapidă – M.Fortuitum, M. Chelonei
0 M. Leprae ( nu se cultivă)
0 Mycobacterii netuberculoase nepatogene
0 Cu creștere lentă – M. Gastri
0 Cu crestere rapidă – M. Smegmatis

Morfologia microscopică a bacililor tuberculoși

0 Au aspect de bastonașe drepte sau încurbate, cu capete rotunjite,
0 Lungime 1-5 micrometri,
0 Groase 0,2-0,5 micrometri,
0 Dispuse : izolat sau în gramezi
0 Evidentierea lor se face pe baza proprietatii lor de acidoalcoolorezistență
0 Coloratia Ziehl – Neelsen – fond albastru de metil pe care micobacteriile
apar ca bastonașe roșii pe fond albastru,
0 Coloratia florescentă – la examinarea in raze ultraviolete micobacteriile
apar ca bastonșe fluorescente pe fond întunecat
Morfologia microscopica a bacililor tuberculosi

Mediile de cultura
0 Mediile solide - temperatură 35-37C, pH-7-7,5, creștere lentă, noncromogene (alb-
crem), aerobioză obligatorie, timp de creștere M.t. 3-8 săptămâni,
0 Loewenstei-Jensen -mediu de cultura in vitro, contine elemente nutritive
esentiale, saruri minerale, ou, amidon din cartof, verde malachit (indicator
de pH) si substanțe reprezentând surse de carbon și azot,
0 Tebeglut – sursa de azot- acidul glutamic
0 Middle -brook 7H10 sau 7H11
0 Mediile lichide - timp de creștere 1-2 săptamâni
0 aparate BACTECTB460, BACTEC MGIT 960, ( se monitorizează producerea de
CO2)
0 Versa TREK, ( se monitorizează consumul de oxigen)
0 cantitatea produsa/ consumată este direct proportională cu rata de
multiplicare, evaluare se face prin vizualizarea precipitinelor sau prin
semnal optic si/sau acustic de aparat
mediu Loewenstein Jensen -coloniile de M.tuberculosis au aspect alb-gabui
conopidiformcoloniile de M.bovis sunt netede, plate, albicioase
Teste biochimice de identificare genică
au rolul de a diferenția tipurile de mycobacterii
testul se efectuează i ̂n primele 24-48 de ore după pozitivarea culturii pe mediu solid sau
lichid,
este un test obigatoriu pentru pentru a putea evita falsele reacţii negative.
sensibilitatea testului este de 98,6%, iar specificitatea de 97,7%
in prezent se foloseste testul
Ag MPT 64 - test imunocromatografic ce poate detecta tulpinile de micobacterii aparţinând
MTC i ̂n mai puţin de 15 minute. Acest test pune i ̂n evidenţă antigenul specific pentru
M.tuberculosis
Reacţia de polimerizare in̂ lanţ şi analiza enzimelor de restricţie pentru identificarea
micobacteriilor din cultură
Este o metodă dezvoltată i ̂n 1993 de Telenţi şi colaboratorii, ce se bazează pe amplificarea
secven- ţei 441-bp a genei hsp65 prin tehnica de PCR, urmată de restricţia produsului de
amplificare cu ajutorul a două enzime de restricţie BstEll şi Haell.
Fragmentele rezultate i ̂n urma digestiei cu enzime restrictive sunt apoi analizate prin
electrofereza i ̂n gel de agaroza şi comparate cu un algoritm preexis- tent.
Testul poate fi finalizat i ̂ntr-o singură zi

Metode moleculare de diagnostic

1. -Detecţia directă a micobacteriilor din prelevalul clinic,
2. -Identificarea speciilor şi testarea rapidă a sensibilităti̧ i la medicamentele anti-
tuberculoase pentru M. tuberculosis din culturi bacteriene, metode ce au făcut
posibilă scurtarea timpului de diagnostic (3,4).
3. -Totodată, metodele de tipare moleculară au făcut posibilă descrierea unor variaţii
ale fenotipurilor de M. tuberculosis cum ar fi
 -virulenţa,
 -caracterele de creştere,
 -imunogenicitatea
 -transmisibilitatea

Metode de detective
0 metoda de amplificare a acizilor nucleici - evidențiază ADN sau ARN micobacterian -
acuratețe dediagnostic- 100% pentru M.Tuberculosis
 0 sistemul de hibridizare pe bandă - ex. Geno type mycobacterium - - detectează
polimorfismul unei singure nucleotide din gena gyrB si se bazează pe prezența sau
absența regiunilor de diferențiere;testele sunt relativ uşor de efectuat, uşor de
interpretat şi sunt rapide. Sensibilitatea acestor teste, comparativ cu sec- venţa 16S
din gena ARNr este de 97,9-99,3%, iar specificitatea de 92,4-99,4%
0 Tehnica de secvenţiere a ADN-ului. Ea constă i ̂n efectuarea unei amplificări a ADN-
ului micobac- terian extras din cultura cu primeri genus-specifici, urmată de o
secvenţiere a ampliconilor i ̂ntr-un sis- tem automat. Identificarea ulterioară a tulpinii
mi- cobacteriene se face prin compararea secvenţei de nucleotide cu o bază
cunoscută de secvenţiere.

Antibiograma
-compara cresterea bacteriana de pe tuburile test, continand medicamente cu cea de pe
tuburile martor, dupa insamantarea unui esantion reprezentativ din populatia bacilara de
testat
0 metode de diagnostic:
metoda proportiilor (Canetti) – masoara proportia de bacili rezistenti din totalul bacililor
cultivati, la o concentratie data de antibiotic
metoda concentratiilor absolute (Meissner) – se ia in considerare cea mai mica de
concentratie de substanta antituberculoasa care inhiba cresterea sau permite o crestere a
mai putin de 1% inoculul standardizat
metoda raportului rezistentei (Mitchinson) – se compara pentru fiecare tulpina si substanta
antituberculoasa CMI cu CMI a tulpinii H37Rv
metoda BACTEC - radiometrica

Teste pentru detectarea rapidă a rezisteței la medicația antituberculoasă

TB-MDR constituie actualmente o serioasă ameninţare prin medicația deficitară si durata
lungă de tratament
M. tuberculosis devine rezistent la medicamentele antituberculoase i ̂n urma mutaţiilor ce
apar la nivelul locilor cromozomali. Mutaţiile punctiforme determină apariţia rezistenţei la
un singur medicament, iar acumularea mai multor astfel de mutaţii punctiforme duce la
apariţia MDR-TB şi XDR-TB.
Apariţia metodelor moleculare este cea care a făcut posibilă scurtarea perioadei de
detectare a rezistenţei.
Mutaţia cea mai bine studiată este cea care determină rezistenţa M. tuberculosis la
rifampicina (RIF). RIF este un antibiotic antimicobacterian ce face parte din terapia standard
a TB. I ̂n 96% din cazurile de rezistenţă la RIF, aceasta se datorează mutaţiilor i ̂n segmentul
81-pb al genei rpoB ce codează subunitatea β a ARN polimerazei (9,20,21).
Rezistenţa la izoniazidă (INH) este determinată de alterări i ̂n mai multe gene, dar mutaţiile
i ̂n genele katG şi inhA s-au găsit i ̂n proporţie de 75-85% la tulpinile de M. tuberculosis
rezistente la INH.
GeneXpert MTB/RIF (Cepheid GeneXpert System, Sunnyvale) este un sistem i ̂nchis, complet
automatizat, cu card, pentru detecţia MTC şi a rezistenţei la RIF. Metoda constă i ̂ntr-o
reacţie de PCR i ̂n timp real şi analiza fragmentelor genetice de amplificare. Rezultatul se
obţine i ̂n decurs de două ore şi riscul de contaminare este foarte mic. Dezavantajul este dat
de costul ridicat al echipamentului şi al cardurilor de unică folosinţă.
Prin comparaţie cu antibiograma fenotipică pentru detecţia rezistenţei la RIF, sensibilitatea
metodei este de 99,2%, până la 100% pentru prelevatele clinice pozitive la examinarea
microscopică şi de 72,5% până la 84,6% pentru prelevatele clinice negative la examinarea
microscopică, dar pozitive la cultură
OMS recomandă i ̂ncă din anul 2010 utilizarea acestui sistem i ̂n ţările cu endemie TB crescută
i ̂n diagnosticul iniţial al suspecţilor de MDR-TB şi al celor cu asociere HIV/TB, ştiut fiind că i ̂n
85% dintre cazuri rezistenţa la RIF se asociază rezistenţei la INH.

Rezistenta M.Tuberculosis
0 sunt rezistenți față de acțiunea agenților fizici și chimici, datorită hidrofobiei
peretelui bacilar, bogat în lipide, precum și datorită grupării germenilor în gramezi
0 rezistența crește prin înglobarea germenilor în înveliș organic protector- sputa
0 sunt insensibili la frig - până la -180 C
0 foarte rezistenți la uscăciune,
0 pot fi omorâți prin expunere la lumină, căldură și substanțe antiseptice (15 min-24
ore)
0 agenți folosiți pentru sterilizare
0 lumina solară și razele ultraviolete,
0 caldura umedă - fierbere, autoclavare
0 substanțe antiseptice - cloramina 5-10%, clorura de var 20%, hipoclorit de
sodiu 0,5%, fenol 0,5%,
Surse de infectie tuberculoasa:
0 bolnavii de tuberculoză pulmonară
0 bolnavii de tuberculoză extrapulmonară activi cu leziuni deschise sau fistulizate -
urogenitale, osteo-articulare, ganglionare
0 animale bolnave de tuberculoză - raspândesc infecția prin:
0 produsele lor naturale și patologice ( lapte, urină, fecale)
0 animale domestice bolnave -pisici, caini
0 animale de laborator

Mecanismele contaminarii
0 1. Contaminarea prin inhalare
0 inhalare de particule bacilifere - sub 5 micrometri
0 picaturile Flugge - picaturi bacilifere - produse de tuse sau strănut, au
diametru mare, devin contaminante abia după deshidratare , fiecare picătura
conținând 1-2 bacili
0 picăturile bacilifere de spută se transformă prin uscare în praf bacilifer cu
însușiri contaminante, chiar la distanțe mari
0 2 Contaminarea digestivă - rară, este nevoie de un număr de 3.000 de ori mai mare
de germeni decât în infecția aeriană,
0 3.Contaminarea cutanată - la nivelul unorleziuni cutanate preexistente, sau
transplacentaă de la mama cu tuberculoză

Infectia tuberculoasa in organism:

0 fenomenul Koch
0 descris in 1891 - secvență de reacții produse de o nouă inoculare subcutanată de
bacili virulenți efectuată în alt punct al organismului, după constituirea leziunilor
locale a inoculării inițiale.
0 reacția secundară - apare rapid 24-48 ore, nodulul necrotic care a apare se elimină
rapid, infecția nu se propagă dincolo de locul inoculării inițiale, bacilii sunt distruși,
eliminați pe loc, ulcerația se vindecă spontan
0 concluzii
0 un organism infectat va induce o stare de imunitate față de bacilii tubercuoși, cu
limitarea unei infecții secundare celei inițiale
Mecanismul raspunsului imun
0 Răspunsul mediat celular în tuberculoză este rezultatul interacțiunii dintre
macrofage și subpopulația limfocitară T
0 macrofagele au capacitatea de a fagocita și digera parțial germenii, transformându-i
în macromolecule antigenice - epitopi - care împreună cu complexul major de
histocompatibilitate sunt proiectate la supafața membranei celulare și “prezentate “
limfocitelor T
0 bacilii tuberculoși virulențipot paralizza sau atenua mec antibacteriene
celulare, putând persista timp îndelungat în bacterioliză sau se pot multiplica
distrugând macrofagul.
0 limfocitele T recunosc Ag prezentați
0 reacția Ag- Receptor, este urmată de activarea celulelor implicate
0 limfocitele T-CD4 -
0 intervin in hipersensibilitatea întârzâiată - au rol în recrutarea
chemotactică de celule cu infiltrare celulară, se denumește
“întârzâiată” pentru că procesul atinge punctul maxim în 24 - 72 ore
(ex. reacția la tuberculina)
0 induc imunitatea protectoare - prin elib de limfokine potențând
activitatea macrofagelor
0 rod de memorie - supravegherea epidemiologică a gazdei
 0 induc răspuns imun umoral, prin activarea limfocitelor B, diferențierea
lor în plasmocite producătoare de Ag specifici
0 limfocitele T-CD8 - rol citotoxic - recunosc Ag și-l distrug prin eliberare de
limfotoxine
0 PMN - sunt atrase în focar și activate de macrofage, intervenția lor directă este
nesemnificativă
0 Raspunsul umoral
0 cresc Ig M,G,A
0 rol în serodiagnosticul infecției tuberculoase

Diagnosticul infectiei tuberculoase

IDR - injectarea strict intradermica de antigene din MTB
denumite PPD = derivat de proteina purificata
0,1 ml=2 ui PPD
Vaccinarea BCG
- se folosesc culturi avirulente ale bacilului Calmette Guerin suspendat în soluţie de glutamat de
Na 1,5% cu o concentraţie de 4-5 milioane germeni (tulpina de Mycobacterium bovis) vii la un
vaccin;

- în trusa existentă acelaşi număr de fiole de diluant reprezentat de mediul Souton (aspect
limpede, incolor necesar reconstituirii suspensiei vaccinale); se păstrează la întuneric şi la
4 0C
- injectie intradermica în regiunea deltoidiana a bratului DREPT, la nivelul treimii
inferioare, deaspura insertiei muschiului deltoid
- doze:
0,05 ml sub 1 an,
0,10 ml peste 1 an
- se urmareste formarea unei papule

In Romania
0 Doar n.n. Varsta – 3-4 zile
0 Fara testare tuberculinica
0 La nou-nascut peste 2500 g
 singura data!!! Fara RAPEL!
Exceptii

 NU a fost vaccinat in maternitate

 Recuperat vaccinal de catre medicul pneumolog pana la varsta de 3 luni, fara testare
la PPD
 Dupa 3 luni cu testare la PPD si istoricul de vaccinari,
 Recuperarea celor nevaccinati pana la 4 ani
NU se vaccinează

 Copilul HIV pozitiv

 Copilul nascut din mama HIV pozitiva se testeaza HIV la 2 luni de la nastere si se
vaccineaza daca este HIV negativ
 n.n. Sub 2500 g
 Imunizarea sa aiba loc o singura data!!!
contraindicatii

 Temporare – febra, lez tegumentare

 Absolute –CSO, Imunosupresie, HIV

RAPI
RAPI locale
Reactie la locul inocularii, care dureaza mai mult de 2 luni
Limfadenopatia axilara, peste 1,5 cm, evolutiv ( fistula, abces, supuratie, adenoflegmon,
necroza) ; apare la 1-12 luni de la inoculare – in DREAPTA!!!
 RAPI sistemice
Infectie BCG diseminata – febra, scadere G, sindrom meningeal, hepatosplenomegalie –
confirmare prin izolare de tulpina cu Mycobacterium bovis
Osteita/osteomielita –la 8-16 luni dupa vaccinare
Simptome respiratorii – tuse, dispnee, imagine radiologica anormala
NU necesita tratament antituberculos sau chirurgical

Factor de risc pentru Incidenta

transformarea infectiei TB (la
in boala 100.000
loc)

infectie TB recenta (< 1 2000 -

an) 8000

infectie TB recenta 1-7 200

ani

infectie HIV 3500 -

14000

toxicomanie iv + 4000 -
infectie HIV 10000

toxicomanie iv fara 1000

HIV

silicoza 3000 -
7000

anomalii Rx sechele TB 200 - 400

insuficienta renala 400 - 900

diabet zaharat 300

subponderal 200 - 260

absenta factorilor de 100

mai sus