Factori transcripţionali redox-sensibili de la eucariotele superioare

Mecanismele prin care celulele eucariote detectează şi răspund la modificările

redoxului celular sunt mult mai subtile. Vom discuta două exemple de proteine care
mediază răspunsul celular la creşterea concentraţiei speciilor reactive de oxigen, şi
anume factorul nuclear kB şi AP-1.

Factorul transcripţional NF-kB (nuclear factor kB)

NF-kB a fost primul factor transcripţional de la EK descoperit ca fiind implicat în
răspunsul direct la stresul oxidativ.
NF-kB a fost descoperit de către Baltimore (laureat al premiului Nobel) şi Sen (Cell
47:921-928, 1986). Denumirea provine de la faptul că iniţial a fost identificat ca proteină
nucleară specifică limfocitelor B, ce se leagă de regiunea enhancer a genei pentru
lanţul imunoglobulinic uşor k.
Deşi iniţial NF-kB a fost considerat un factor transcripţional specific celulelor B, ulterior
a fost evidenţiat în numeroase alte tipuri de celule şi s-a demonstrat că acest factor
transcripţional joacă un rol important în procesele inflamatorii, în răspunsul autoimun, în
proliferarea celulară şi în apoptoză, reglând activitatea genelor implicate în aceste
procese.
Factorul nuclear kB în formă activă este un dimer alcătuit din două subunităţi
polipeptidice aparţinând unei familii de proteine înrudite structural. Până în prezent au
fost identificaţi 5 membrii aparţinând acestei familii: NK-kB1 (p50/p105), NF-kB2
(p52/p100), RelA (p65), RelB şi c-Rel. Aceste proteine pot forma homo- sau
heterodimeri.
Toate proteinele aparţinînd familiei NF-kB prezintă în regiunea aminoterminală un
domeniu numit RHD (Rel homology domain), ce este responsabil de fixarea de ADN,
de dimerizare, de interacţia cu subunitatea inhibitorie IkB şi la nivelul căreia există şi o
secvenţa semnal de localizare nucleară NLS (nuclear localization signal).
Forma clasică a factorului NF-kB este reprezentată de heterodimerul p50/p65 (RelA),
formă prezentă în majoritatea tipurilor de celule. Există însă şi alte combinaţii de
structuri dimere ale membrilor familiei de proteine Rel. Astfel, proteina RelB se poate
asocia cu p50 şi p52 rezultînd un heterodimer ce acţionează ca activator al expresiei
genelor ţintă, sau se poate asocia cu proteina RelA (p65) rezultând un heterodimer ce
acţionează ca represor. Un exemplu de structură homodimeră este complexul p50/p50.
Cel mai bine caracterizat este heterodimerul p50/p65 ce se leagă de de ADN cu mare
afinitate (constanta de disociere KD =0,4 x 10-12M).
Subunitatea p65 este responsabilă de activarea transcripţională a genelor ţintă, în timp
ce funcţia majoră a subunităţii p50 este fixarea cu mare afinitate de secvenţele de
ADN. Astfel, subunitatea p50 poate fi considerată o subunitate „helper” pentru
exprimarea funcţiei de activare transcripţională a subunităţii p65. Subunitatea p50 este
sintetizată sub forma unui precursor proteic de 105kDa.

Calea de activare a factorului nuclear kB

NF-kB a fost evidenţiat în numeroase tipuri de celule de la vertebratele superioare.
Acest factor transcripţional este activat în condiţii de stres oxidativ, dar şi sub acţiunea
unor stimuli patogeni primari (virusuri şi bacterii) şi secundari (citokine inflamatorii),
precum şi de substanţe carcinogene, agenţi chemoterapeutici, şi alţi factori de stres
(pH, metale grele). În formă activă factorul kB determină transcrierea rapidă a genelor
ce codifică proteine de semnalizare şi de protecţie, ceea ce sugerează funcţia sa de
mediator rapid al răspunsurilor inflamatorii şi imune.

Subunitatea inhibitorie IkB

Activitatea NF-kB este strâns controlată de interacţia cu o subunitate inhibitorie numită
IkB. Acţiunea sa inhibitorie se exprimă ca urmare a fixării sale de structura
heterodimeră p50/p65, ce are drept consecinţă retenţia în citoplasmă a cestui factor
transcripţional. Mecanismul inhibitoriu constă în faptul că proteina IkB maschează
secvanţa de localizare nucleară NLS din domeniile RHD al structurilor dimere p50/p65
sau al celor înrudite. Date recente sugerează că interacţiunea dimerului p50/p65 cu
subunitatea IkB blochează capacitatea acestuia de a se fixa de ADN menţinînd
localizarea citoplasmatică a acestuia datorită prezenţei în structura IkB a unui semnal
nuclear de export (evidenţiat pentru IkB).
În prezent se cunosc mai multe tipuri de molecule inhibitorii: IkB, IkB, IkB, p105 şi
p100.

În urma expunerii la o serie de stimuli cum sunt speciile reactive de oxigen, lumina UV,
citokinele inflamatorii, toxine bacteriene şi virale (virusul hepatitei B, virusul
imunodeficienţei umane HIV) cascada de semnalizare prin intermediul NF-kB este
activată, ca urmare a eliberării dimerului p50/p65 de subunitatea inhibitorie IkB şi a
degradării proteolitice a acesteia. Eliberarea de subunitatea inhibitorie permite
translocarea factorului kB (dimerul p50/p65) în nucleu unde se leagă de regiunile
promotor sau enhancer al genelor ţintă, reglând transcrierea acestora. Genele reglate
de NF-kB codifică citokine, chemokine, proteine de fază acută, proteine anti-apoptotice,
factori de creştere şi proteine ce stimulează proliferarea (ciclina D1, proteina c-Myc).

Citokinele sunt un grup de proteine secretate de celulele mamiferelor ce acţionează asupra

altor celule din vecinătate interacţionînd cu receptorii lor celulari. Fac parte din categoria
mediatorilor locali. Ele controlează proliferarea celulară, diferenţierea, reglarea răspunsului
imun, hematopoieza şi răspunsul inflamator.
Proteinele da fază acută reprezintă un grup de proteine (cu excepţia anticorpilor) a căror
concentraţie plasmatică creşte în urma declanşării unei infecţii sau a unei leziuni tisulare.
Proteinele de fază acută includ proteinele sistemului complement, proteina C reactivă,
fibrinogenul, interferonul şi o serie de proteine implicate în sistemul coagulării.
Chemokinele sunt proteine mici solubile cu funcţii imunoreglatoare, implicate în procesele acute
şi în inflamaţie. Majoritatea chemokinelor induc chemotaxia leucocitelor: Posedă capacitatea de
a activa funcţia bactericidă a fagocitelor. Pot fi implicate şi în angiogeneză, producerea de
colagen şi proliferarea precursorilor hematopoietici.

S-a demonstrat că activarea factorului nuclear kB este blocată de compuşii antioxidanţi

(vitamina E, N-acetil cisteina) ceea ce sugerează implicarea stresului oxidativ în acest
proces. Efectul de blocare nu depinde natura compusului antioxidant întrucât s-a
dovedit că numeroşi compuşi antioxidanţi cu structuri chimice extrem de diferite
manifestă acest efect de blocare a activării NF-kB. Dintre speciile reactive de oxigen
testate pentru capacitatea de a activa factorul NF-kB peroxidul de hidrogen s-a dovedit
cel mai eficient. Această selectivitate a NF-kB pentru peroxizi poate fi considerată o
reminiscenţă a mecanismului de activare a factorului transcripţional OxyR de la
procariote.
Mecanismul exact prin care SRO ar putea determina disocierea subunităţii inhibitorii
IkB şi implicit activarea şi translocarea NFkB în nucleu nu este complet elucidat. Prin
urmare, semnificaţia reglării directe a acestui factor transcripţional de către redoxul
celular, prin reacţii de oxidare directă, similar mecanismelor de la procariote, necesită
investigaţii suplimentare.

Datele experimentale au demonstrat faptul că activarea NF-kB, prin eliberarea

subunităţii inhibitorii, se realizează printr-un mecanism indirect, complex, corelat cu
calea de semnalizare MAP kinazică. Astfel, s-a dovedit că subunitatea inhibitorie IkB
este fosforilată specific la nivelul unor resturi de Ser din regiunea aminoterminală
(Ser32 şi Ser36 pentru IkB; Ser19 şi Ser23 pentru IkB) sub acţiunea unor serin-
treonin protein kinaze numite IkB kinaze, cum sunt de exemplu IKK-1 şi IKK-2. Aceste
kinaze conţin două subunităţi catalitice (IKKα şi IKK) şi o proteină reglatoare/adaptor
NEMO (IKK). Fosforilarea specifică a resturilor de serină din proteine ţintă IkB
determină poliubiquitinilarea imediată a proteinelor IkB şi degradarea rapidă a acestor
proteine inhibitorii sub acţiunea poroteazomului 26S. Eliberarea dimerului p50/p65 de
IkB permite expunerea NLS şi translocarea în nucleu.

Mecanisme de reglaj la nivelul nucleului

Odată ajuns în nucleu NF-kB este supus altor mecanisme de reglaj ce condiţionează
starea activă sau inactivă a factorului transcripţional. Astfel, în nucleu controlul activităţii
NF-kB este mediat de reacţia de acetilare catalizată de acetiltransferaze. Principala
ţintă este subunitatea p65(RelA) care este modificată prin acetilare pe resturi specifice
de Lys (218, 221, 310). Forma acetilată este activă din punct de vedere transcripţional
şi în plus este rezistentă la efectul inhibitoriu al IkB (în felul acesta este prevenită o
posibilă asociere cu subunitatea inhibitorie şi inactivarea). Inactivarea se realizează sub
control rigoros mediat enzimatic. Astfel, forma activă este convertită în formă inactivă
de către deacetilaze (histon deacetilaza 3 HDAC3). Aşadar deacetilaza funcţionează ca
un comutator molecular intranuclear ce controlează NF-kB. Forma deacetilată a NFkB
fixează moleculele de IkB nou sintetizate care pot pătrunde în nucleu. Fixarea de IkB
determină desprinderea factorului transcripţional de secvenţele de ADN, complexul NF-
kB - kB fiind transportat din nou în citoplasmă.
În prezent se apreciază că activarea NF-kB joacă un rol important în numeroase
procese patologice cu componentă inflamatorie dintre care putem menţiona artrita
reumatoidă, ateroscleroza, diabetul, scleroza multiplă, gastrita asociată infecţei cu
Helicobacter pilori, astmul, precum şi în diferite forme de cancer, în special în cele de
origine limfoidă. În unele celule canceroase limfoide au fost identificate mutaţii sau o
supraexpresie a genelor ce codifică subunităţile NF-kB. In multe celule canceroase NF-
kB este constitutiv activ cu localizare permanent nucleară.

În concluzie, activarea factorului nuclear kB indusă de stresul oxidativ, dar şi de

numeroşi alţi factori, induce fixarea acestuia la regiunile promotor/enhancer ţintă şi
iniţiază activarea transcripţională a unor gene proinflamatorii şi imunomodulatoare.
Activarea NF-kB joacă de asemenea un rol important în reglarea apoptozei, proliferării
celulare, trascrierii şi replicării genomului viral în celulele infectate (ex virusul HIV),
rezistenţa la acţiunea unor agenţi chemoterapeutici.
Înţelegerea mecanismelor de activare şi control a factorului NF-kB permite conceperea
unor agenţi-antitumorali care să blocheze activitatea NF-kB sau să mărească
sensibilitatea lor la agenţi chemoterapeutici convenţionali, ceea ce poate avea
importante consecinţe terapeutice.
 Factorul transcripţional AP-1

Un alt factor transcripţional sensibil la redoxul intracelular este factorul AP-1 (activator
protein-1). AP-1 este un complex proteic cu structură dimeră ce face parte din
categoria factorilor transcripţionali cu motiv „leucine zipper”.

Subunităţile ce formează dimerii aparţin subfamiliilor de proteine c-Fos, c-Jun, ATF

(activating transcription factor) şi JDP (Jun dimerization protein). Cele mai bine studiate
sunt proteinele Jun şi Fos. La randul lor aceste subfamilii de proteine cuprind mai multi
reprezentanti: Fos (c-Fos, Fra-1, Fra-2, FosB, FosD), iar Jun (c-Jun, JunB, JunD).
Proteinele Jun pot forma homodimeri stabili, dar Fos nu formează decât heterodimeri.

AP-1 este o proteină reglatoare implicată în creşterea şi diferenţierea celulară,

transformare, apoptoză, oncogeneză, declanşarea răspunsului imun sau inflamator.
Acest complex poate fi activat de factori de creştere, citokine, factori de creştere, stres,
infecţii bacteriene şi virale. Odată activat, complexul AP-1 reglează expresia mai multor
gene prin creşterea ratei de transcriere. Dimerii Jun/Jun şi Jun/Fos se leagă selectiv de
secvenţe polinucleotidice (5'-TGAG/CTCA-3') specifice răspunsului la forbol esteri
numite secvenţe TRE, ce sunt prezente în regiunile reglatoare ale mai multor gene
(TPA responsive element, TPA este 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetat - diester al
forbolului, compus organic vegetal extras din seminţe de Croton tiglium, implicat în
apariţia tumorilor, prin activarea protein kinazei C). Dimerii Jun/ATF şi homodimerii
ATF/ATF se leagă preferenţial de secvenţe specifice elementului CRE (c-AMP
responsive element).
Subunităţile AP-1 sunt organizate structural pe domenii. De exemplu, proteina c-Jun
conţine următoarele domenii:
a) un domeniu de transactivare la capătul N-terminal. Acest domeniu este implicat
în procesul de activare al promotorilor AP-1, promotori ce stimulează
transcrierea genelor ţintă.
b) un domeniu implicat în recunoaşterea specifică a unei secvenţe de ADN din
promotorul genelor ţintă: secvenţe TRE sau secvenţe CRE.
c) un domeniu de dimerizare constând într-o regiune suprarăsucită numită motiv
leucine zipper

Motivul leucine zipper este un motiv structural reprezentat de o structură secundară de

ordin superior (o suprarăsucire a unor segmente α-helicoidale) ce creează forţe de
adeziune între α-helixuri paralele. Leucine zipper este un domeniu de dimerizare
caracteristic nu numai factorului transcripţional AP-1, ci unei clase de proteine implicate
în reglarea expresiei genelor (factori transcripţionali cu motiv leucine zipper).
Resturile de Leu formează miezul hidrofobic al unei suprarăsuciri. Motivul leucine
zipper este de fapt un segment α-helix, pentru fiecare partener de dimerizare, cu un
rest de leucină în fiecare a 7-a poziţie. Fiecare rest de leucină intră aşadar în contact cu
cel de pe catena opusă (partenerul de dimerizare) la fiecare a 2-a răsucire.
Lipsa acestor domenii în structura complexului AP-1 conduce la pierderea rolului
complexului în proliferare şi diferenţiere.
 Leucine zipper (albastru) fixat de ADN. Resturile de leucină reprezintă “zimţii”
fermoarului (roşu).

Controlul activităţii AP-1 se realizează prin două modalităţi:

1) modularea nivelului de expresie al diferitelor tipuri de subunităţi, şi implicit a
raportului de dimerizare,
2) modularea activităţii AP-1 prin modificări post-translaţionale ale subunităţilor
preexistente sau nou sintetizate.

De exemplu, numeroşi factori inductori de stres oxidativ (peroxidul de hidrogen,

radiaţiile UV şi gamma) activează factorul transcripţional AP-1. Această activare este
mediată de calea MAPK şi constă în inducerea rapidă a transcrierii genelor de răspuns
imediat (de răspuns timpuriu) c-jun şi c-fos.
În plus, activarea AP-1 se realizează şi prin modificări post-translaţionale ale proteinelor
Jun şi Fos preexistente. În mod normal, în absenţa factorilor inductori ai stresului
oxidativ, în citoplasmă există cantităţi reduse ale AP-1 reprezentând o formă inactivă a
factorului transcripţional. Controlul activităţii proteinelor AP-1 preexistente are loc prin
fosforilarea directă a acestora, sub acţiunea unor kinaze specifice, aparţinînd căii de
semnalizare MAP kinazice. De exemplu, activarea proteinei c-Jun este mediată de JNK
(kinaze c-Jun NH2 terminale), prin fosforilarea resturilor de serină din poziţiile 63 şi 73
de la capătul N-terminal, domeniu responsabil de activarea transcripţională (determină
creşterea activităţii transcripţionale). De asemenea, fosforilarea proteinei c-Jun de către
JNK măreşte timpul de viaţă al proteinei c-Jun, determinînd acumularea acestei
proteine, ceea ce contribuie de asemenea la creşterea activităţii transcripţionale a AP-
1.
JNK au denumirea alternativă de MAP kinaze activate de stress (SAPK, stress-
activated protein kinases), pentru că activarea lorse produce ca răspuns la stresul
celular indus de anumiţi stimuli: semnale inflamatorii, radiaţii UV, inhibitori ai sintezei
proteineloretc. Rolul specific al JNK depinde de tipul celular, fiind esenţial în proliferare,
apoptoză, motilitate celulară, controlul unor căi metabolice şi reparea ADN.
Răspunsul celular mediat de kinazele activate de stres funcţionează în contextul global
al unei reţele de semnalizare complexe. Se apreciază că celulele interpretează
activarea tranzitorie a JNK, în contextul activării şi a altor căi de semnalizare, ca pe un
semnal de supravieţuire şi de stimulare a unor mecanisme adaptative. În schimb,
activarea prelungită a JNK este asociată cu apoptoza.
Una din ţintele importante ale semnalizării JNK asocită cu apoptoza, alte decât AP-1,
este proteine p53. Până în prezent au fost identificate peste 50 de proteine ţintă
(substrat) ale kinazelor activate de stress JNK.
 Proteina p53

Proteina p53 este codificată de gena TP53 (tumor protein p53), ce face parte din
familia genelor supresoare de tumori. Acestea sunt gene antiproliferative, inhibă
proliferarea celulară şi dezvoltarea tumorii. În mai mult de jumătate din tumorile umane,
gena TP53 suferă mutaţii, deleţii sau rearanjare genică, de aceea este foarte
importantă în etiologia cancerului.
Celulele umane prezintă 2 copii ale genei TP53, al cărei locus se află pe braţul
scurt al cromozomilor 17, în poziţia 17p13. Gena TP53 constă din 11 exoni şi are o
lungime de aproximativ 20 kpb. În celulele tumorale, ambele alele ale genei TP53 sunt
mutante. Secvenţa evenimentelor asociate cu transformarea malignă este următoarea:
 o mutaţie punctiformă cu sens greşit (missense mutation) determină substituţia
unui aminoacid din catena polipeptidică a proteinei p53 (mutaţia determină
creşterea timpului de viaţă al proteinei ceea ce conduce la acumularea
intracelulară a unei cantităţi mari de p53 modificată structural).
 deleţia alelei normale sau conversia genică.
Proteina codificată de TP53 acţionează ca senzor pentru multiple forme de stres
(genotoxic sau non-genotoxic) şi controlează mai multe procese celulare, cele mai
importante fiind apoptoza şi blocarea derulării ciclului celular. În ultimii ani, au fost
identificate şi studiate două proteine omoloage lui p53, numite p73 şi p63, ce sunt
considerate a avea aceleaşi funcţii în inhibarea dezvoltării tumorilor (Chen, 1999).

Structura şi funcţiile proteinei p53

Proteina p53 este o fosfoproteină nucleară de 53kDa, alcătuită din 393 de
aminoacizi. Catena polipetidică este organizată în mai multe domenii funcţionale:
 Regiunea NH2-terminală (domeniul TAD) reprezintă domeniul de activare
transcripţională, cunoscut sub denumirea de AD1 (domeniul activator 1)
(aminoacizii 1-42)
 Domeniul activator 2 (AD2) important pentru activitatea apoptotică (aminoacizii
43-63).
 Regiunea bogată în resturi de prolină, ce prezintă 5 motive bogate în prolină
PXXP care contribuie la inhibarea creşterii celulare (proline-rich growth
suppression) (aminoacizii 80-94).
 Regiunea centrală „core” sau domeniul de legare la ADN, ce conţine mai multe
resturi de Arg şi un atom de zinc fixat coordinativ de 3 resturi de Cys şi 1 rest de
His (aminoacizii 100-300).
 Secvenţa semnal de localizare nucleară NLS – nuclear localisation signal
(aminoacizii 316-325).
 Domeniul de oligomerizare (aminoacizii 307-355).
 Domeniul COOH-terminal cu caracter bazic şi funcţie de reglare (aminoacizii
356-393).
 Organizarea domeniilor funcţionale la proteina p53 (Chen, 1999).

Marea majoritate a mutaţiilor p53 missense găsite în tumorile umane apar în

regiunea core, responsabilă de fixarea de secvenţe specifice de ADN.
Proteina p53 are o durată de viaţă foarte scurtă (timp de înjumătăţire 15 minute)
şi este localizată intranuclear. În celulele normale, proteina p53 se regăseşte ca
structură tetrameră şi poate exista sub 2 forme: nefosforilată şi fosforilată. Situsurile de
fosforilare sunt localizate în capetele C-terminal şi NH2-terminal. Proteina p53 conţine
un atom de zinc, necesar pentru adoptarea unei conformaţii adecvate care să faciliteze
fixarea de ADN.
Proteina p53 mediază oprirea ciclului celular şi apoptoza celulară ca răspuns la
afectarea ADN. Această proteină supresoare de tumori nu reglează numai tranziţia
celulelor din faza G1 în S sau din faza G2 în faza M, ci este capabilă să inducă moartea
programată a celulelor. În celulele normale, blocarea derulării ciclului celular mediată
de p53 previne replicarea ADN alterat, reduce instabilitatea genetică şi permite
celulelor să realizeze funcţii importante de reparare, înaintea iniţierii ciclului celular, în
timp ce apoptoza indusă de p53 este necesară pentru eliminarea celulelor modificate.
Turn-overul şi degradarea proteinei p53 este mediată de proteina MDM2 (murine
double minute – 2, oncogenă multiplicată în numeroase tipuri de sarcom).
Controlul proliferării celulare de către proteina p53
Proteina p53 se fixează de secvenţe de ADN şi îşi exercită efectul de activare a
trancripţiei unei alte gene reglatoare, waf-1 (wild-type p53-activated factor-1). Proteina
codificată de această genă, numită p21 (WAF-1 sau CIP-1 – cdk interacting protein-1)
se fixează de ciclinele ce acţionează în G1 şi blochează activarea complexelor
ciclină/cdk (cdk – cycline-dependent kinase), oprind celula în faza G1. Proteina p21
poate inhiba direct replicare ADN prin legarea la antigenul nuclear al proliferării celulare
(PCNA – proliferating cell nuclear antigen), ce este o subunitate a ADN polimerazei.
Alte două gene ţintă pentru p53 ce pot provoca supresia creşterii şi stoparea
ciclului celular sunt GADD45 (growth arrest and DNA damage inducible gene) şi BTG2
(B-cell translocation gene 2 antiproliferative). Blocarea derulării ciclului celular în
tranziţia dintre faza G2 şi faza M, proces dependent de p53, este mediată de genele
GADD45 şi 14-3-3 σ. Produsul genei 14-3-3 σ interacţionează cu Cdc25 fosfataza
(inhibându-i funcţia de a promova iniţierea ciclului celular), consecinţa interacţiunii fiind
inactivarea complexului ciclina B/Cdc2, necesar iniţierii mitozei (Chen, 1999).

Procesele celulare mediate de proteina p53 (http://en.wikipedia.org/wiki/P53).

Controlul apoptozei de către proteina p53

Proteina p53 reglează diferenţiat expresia genelor implicate în apoptoză. Expresia
genei bax, genă inductoare a apoptozei, este stimulată, în timp ce expresia genei bcl-2,
genă antiapoptotică, este inhibată. Proteinele Bax (Bcl-2 associated X protein) şi Bcl-2
(B-cell lymphoma 2) au structuri omoloage, dar efectele lor sunt diferite: Bcl-2 creşte
durata de viaţă a celulelor, iar Bax accelerează apoptoza. În celulele normale, proteina
Bcl-2 formează dimeri cu proteinele Bax, blocându-le astfel activitatea de inducere a
apoptozei. În momentul în care celulele sunt supuse unor condiţii de stres, proteina p53
determină modificarea raportului normal între nivelul exprimării genelor bcl-2 şi bax, în
favoarea bax, ceea ce amplifică semnificativ susceptibilitatea la apoptoză.
Alte gene implicate în apoptoza mediată de p53 sunt genele PIG (p53-induced
genes).

În consecinţă, proteina p53 poate induce două seturi de expresii genice la

semnale de stres celular: unul cu funcţie principală de control al creşterii celulare
(p21/WAF-1 şi GADD45), iar celălalt acţionând pe calea apoptozei (proteina Bax)
(Agarwal şi colab., 1998).
 Proteina supresoare de tumori p53 nu pare a avea un rol esenţial pentru viaţa
celulelor normale. Nivelul constitutiv al expresiei acesteia este foarte redus. Dacă
celulele sunt expuse iradierii UV se constată o creştere marcantă a nivelului proteinei
p53, ce conduce la activarea unor căi de semnalizare. Se consideră că acest
mecanism de activare ca rezultat al expunerii la UV este cauzat de stresul oxidativ.
Acest aspect a fost demonstrat prin tratarea celulelor cu N-acetilcisteină (NAC), agent
ce neutralizează stresul oxidativ (Renzing şi colab., 1996). În cazul celulelor tratate cu
NAC şi expuse iradierii UV, s-a evidenţiat atenuarea răspunsului celular, prin scăderea
nivelului proteinei p53. Acest rezultat nu a fost prezent în cazul celulelor tratate cu NAC
dar expuse radiaţiilor ionizante.

Activarea şi reglarea funcţiei proteinei p53

Funcţia proteinei p53 este dependentă de localizarea nucleară. Importul şi
exportul nuclear al p53 sunt două mecanisme riguros reglate.
Importul nuclear este dependent de interacţia proteinei p53 cu reţeaua de
microtubuli şi dineină (o proteină motoare moleculară), ceea ce sugerează că există un
transport activ al proteinei p53 în nucleu. Migrarea în citoplasmă a proteinei p53, ce
conţine la capătul C-terminal un semnal de export nuclear, este mediată de MDM2
(Ryan şi colab., 2001). Secvenţa de export nuclear nu este accesibilă atât timp cât
proteina p53 este în formă tetrameră. Ieşirea din nucleu a proteinei p53 este un proces
indispensabil în direcţionarea p53 spre proteazom pentru degradare.
Radiaţiile UV determină creşterea nivelului expresiei proteinei p53, care va
induce mai multe cascade de semnalizare intracelulară ce au ca scop menţinerea
stabilităţii genetice şi celulare.
Activitatea proteinei p53 se află sub controlul a 2 mecanisme independente:
- complexarea cu diferite proteine celulare şi virale
- modificarea post-translaţională (fosforilare, acetilare, glicozilare).
Mecanismul principal prin care este reglată activitatea p53 este modificarea post-
translaţională
(http://www.rndsystems.com/technical_information_search.aspx?t=all&c=0&k=p53).

Complexarea cu diferite proteine

În celulele ce funcţionează normal, nivelurile de p53 sunt scăzute datorită
interacţiunii acesteia cu MDM2, proteină ce funcţionează atât ca inhibitor al activităţii
transcripţionale a p53, cât şi ca activator al degradării proteinei supresoare de tumori.
Proteina MDM2 este o ubiquitin ligază, ce determină ubiquitinilarea proteinei p53,
direcţionând-o spre proteazom pentru degradare.
Inducerea expresiei proteinei p53 ca răspuns la factori de stres implică inhibarea
funcţiei MDM2, în timp ce mecanismul prin care p53 este degradată include modificări
post-translaţionale ale ambelor proteine (MDM2 şi p53).
Modificarea post-translaţională
Un alt mecanism prin care se produce activarea proteinei p53 ca răspuns la
stresul celular este fosforilarea la diferite situsuri din domeniile C- şi N-terminal.
Procesul de fosforilare reprezintă un semnal pe care proteina p53 îl integrează şi
transmite altor căi de semnalizare.
DNAPK (DNA-dependent protein kinase) poate fosforila resturile de serină 15 şi
37 ale p53 in-vitro (Agarwal şi colab., 1998). Fosforilarea Ser15 afectează funcţiile de
transactivare şi de blocare a derulării ciclului celular.
Funcţia proteinei p53 este reglată de calea MAPK. Una dintre aceste kinaze,
JNK1 fosforilează proteina p53 umană la nivelul restului 37 in-vitro (Steegenga şi
colab., 1996). Celulele care pierd p53 pot tolera nivele mari de MAPK şi prezintă o
pierdere a funcţiilor de blocare a ciclului celular şi de inducere a apoptozei. Alte studii
au arătat că proteina p38 (MAPK) fosforilează Ser46, proces indispensabil pentru
inducţia apoptozei mediată de proteina p53 (Ryan şi colab., 2001).
Stabilizarea proteinei p53 este o consecinţă a reglării induse de ATM kinazei
(ataxia telangiectasia-mutated – kinază ce prezintă mutaţii în maladia genetică recesivă
Ataxia-telangiectasia). Aceasta activează prin fosforilare două serin/treonin kinaze,
Chk1 (Csk homologous kinase) şi Chk2. Ca răspuns la stresul celular, Chk2 activată
fosforilează restul Ser20 al proteinei p53, contribuind la stabilizarea acesteia (Caspari,
2000). Fosforilarea Ser20 blochează interacţiunea p53/MDM2, ducând la acumularea
în nucleu a proteinei p53. În cadrul aceluiaşi experiment, s-a arătat faptul că proteina
Chk2 este necesară în activarea p53 doar în cazul iradierii ionizante. În cazul iradierii
UV, responsabilă pentru declanşarea răspunsului celular este probabil proteina Chk1.
Fosforilarea la Ser15 măreşte capacitatea transcripţională a p53, iar fosforilarea
mediată de kinaza CKII (casein kinase II) determină o creştere a afinităţii proteinei p53
de a se lega la secvenţe ADN (Steegenga şi colab., 1996).
Proteina PML (promyelocytic leukemia protein), activată în urma expunerii
celulelor la diferiţi factori de stres, participă la activarea funcţiei de transcripţie a
proteinei p53, prin acetilare (Ryan şi colab., 2001).
 Toate aceste modificări influenţează specificitatea de legare la ADN, interacţiunile
cu alte proteine sau activarea transcripţională a proteinei p53.

În celulele tumorale, proteina p53 este un inhibitor al factorilor transcripţionali c-

Jun şi c-Fos. De cele mai multe ori, proteinele c-Jun favorizează supravieţuierea
celulară, de aceea celulele deficiente în c-Jun suferă îmbătrânire prematură. Deoarece
procesul de senescenţă prematură a celulelor este dependent de p53, căile de
semnalizare mediate de p53 si cele mediate de c-Jun sunt conectate.

Cert este că lipsa proteina p53 conduce la instabilitate genomică. Celulele

deficiente în p53 se divid continuu şi replicarea ADN are loc înaintea intervenţiei
mecanismelor de reparare ale leziunilor induse de iradierea UV.

Concluzii
Căile de semnalizare a p53 conectează supresorii de tumori şi oncogenele
cunoscute a influenţa ciclul celular. Alterarea unor componente upstream sau
downstream ale p53 conduce la inactivarea proteinei p53, deci dereglarea controlului
ciclului celular, instabilitatea genomică şi dezvoltarea cancerului.
Mutaţiile proteinei p53 sunt detectate în peste 50% din tumori. În celulele
tumorale ambele alele ale genei TP53 sunt mutante. Persoanele care moştenesc de la
genitori o singură copie normală sunt predispuse la cancer şi pot dezvolta tumori în
diverse ţesuturi, chiar la o vârstă timpurie. Mutaţiile determină inactivarea domeniilor
funcţionale ale p53, deci inhibarea genelor necesare pentru repararea ADN şi pentru
apoptoza celulelor afectate .