Universitatea ’’Alexandru Ioan Cuza’’ Iași Gorbănescu Andreea

Facultatea de Biologie- Master Genetică moleculară Anul I

CUANTIFICAREA EXPRESIEI GENICE

PRIN REAL TIME PCR

PCR (Reacția de polimerizare în lanț) este o tehnică care permite amplificarea unei

secvențe de ADN în afara unui organism viu.

Spre exemplu, ne interesează o regiune din ADN deoarece suspectăm existența unei
anumite mutații. Pentru a putea fi vizualizată, acea regiune trebuie copiată de un număr suficient
de ori. Cu ajutorul PCR-ului, vom amplifica acea regiune și vom avea milioane de molecule
identice cu regiunea de la care am plecat. Asta face PCR-ul sau reacția de polimerizare în lanț:
amplifică bucăți din ADN cu ajutorul unei enzime numite ADN-polimeraza. Această enzimă nu
poate amplifica ADN-ul când avem ambele catene răsucite una în jurul celeilalte. Pentu ca
enzima să poată acționa, cele 2 catene ale ADN-ului trebuiesc rupte una de cealaltă. Astfel,
putem vorbi despre cele 3 etape ale reacției de polimerizare în lanț: denaturare, hibridizarea
primerilor, elongație.

1
Universitatea ’’Alexandru Ioan Cuza’’ Iași Gorbănescu Andreea
Facultatea de Biologie- Master Genetică moleculară Anul I

Prima etapă, denaturarea, presupune ruperea celor 2 catene de ADN. Amestecul de

reacție va fi încălzit la 94oC timp de 10 minute, timp în care ADN-ul țintă va fi separat
(denaturat) în 2 catene.

Enzima nu poate copia catena de ADN din orice punct, ci are nevoie de o mică bucată de
ADN, numită PRIMER, pe care enzima o recunoaște. Astefel putem vorbi de a 2a etapă,
hibridizarea primerilor: la 55-65ºC, primerii se vor atașa complementar la capetele celor 2
catene. Practic, acesta este punctul din care enzima începe copierea catenei originale într-o
catenă complementară.

În cea de a 3a etapă, elongația, la 72ºC, ADN-polimeraza va extinde primerii atașați în

lungul matriței țintă și va produce un amplicon ADN (parte din ADN care reprezintă sursa
amplificarii sau replicarii ). La finalul procesului, nr catenelor Adn se va dubla. Ciclul se va
repeta până în momentul în care se obține o cantitate suficientă de adn pentru a se putea lucra cu
el. Dintr o singură molecula de adn putem obține peste 1 miliard de copii ale fragmentului
inițial, în doar 4 ore.

PCR “în timp real” este o metodă de cuantificare care oferă o analiză mai ușoară și mai
precisă a produșilor de amplificare, comparativ cu metodele clasice. Acumularea datelor de
amplificare se realizează cu ajutorul unor fluorocromi, a căror concentrație crește pe parcursul
reacției, permițând cuantificarea produșilor de amplificare pe măsură ce aceștia se formează. Cu
cât numărul de copii din secvența de interes este mai mare la începutul reacției, cu atât mai
puține cicluri de amplificare vor fi necesare pentru a genera numărul minim de ampliconi care
pot fi detectați (fluorescența atinge lungimea de undă necesară detecției). Se pot amplifica atât
probe ADN cât și probe ADNc cu aceeași viteză și eficiență