Măsuri pentru protecția muncii și asigurarea securității în laboratoarele de

biochimie..........................................................................................................................4
Recoltarea sângelui..........................................................................................................6
Condiții de recoltare......................................................................................................6
Recoltarea sângelui capilar............................................................................................7
Recoltarea sângelui venos.............................................................................................7
Condițiile de conservare a probelor recoltate................................................................8
Obținerea plasmei și a serului........................................................................................9
Prepararea soluțiilor procentuale molare, normale....................................................9
Noțiunea de pH..............................................................................................................14
Ionizarea apei și produsul ionic al apei...................................................................14
Scara de pH..............................................................................................................15
Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici..................................15
Demonstrarea capacității de tamponare:.................................................................17
Determinarea colorimetrică a pH-ului prin metoda cu soluții tampon........................18
Volumetrie......................................................................................................................19
Principiile analizei volumetrice...............................................................................19
Clasificarea metodelor volumetrice.........................................................................20
Calcule în analiza volumetrică................................................................................20
Tehnica titrării.........................................................................................................21
Erorile determinărilor volumetrice..........................................................................22
Surse de erori...........................................................................................................22
Acidimetria volumetrică..............................................................................................24
Titrări acido-bazice..................................................................................................24
Titrarea unui acid tare cu o bază tare.......................................................................24
Determinarea factorului unei soluții de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluții etalon..25
Dozarea unei soluții de NaOH cu soluția de HCl 0,1 N cu factor cunoscut............26
Dozarea amoniacului prin diferență........................................................................26
Titrarea unui acid slab cu o bază tare......................................................................27
Aplicație: Dozarea acidului lactic cu o soluție titrată de NaOH............................28
Titrarea unei baze slabe cu un acid tare...................................................................29
Oxidimetria volumetrică..............................................................................................29
Permanganometrie.......................................................................................................30
Stabilirea factorului soluției de KMnO4 0,1N.........................................................31
Determinări permanganometrice în mediu acid......................................................32
Dozarea acidului oxalic (micrometodă)..................................................................32
Dozarea apei oxigenate (macrometodă)..................................................................33
Complexometria volumetrică......................................................................................34
Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometrică (metoda Budesinsky)....36
Dozarea clorurilor prin metoda Volhard.................................................................37
Identificarea glucidelor.................................................................................................38
Reacții de reducere..................................................................................................38
Identificarea dizaharidelor.......................................................................................46
Identificarea polizaharidelor....................................................................................47
Identificarea glucidelor.................................................................................................48
Identificarea aminoacizilor și proteinelor...................................................................49
Reacții de culoare....................................................................................................49
Reacții de precipitare ale proteinelor...........................................................................53
Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Sörensen.........56
Identificarea nucleoproteinelor....................................................................................58

1
Vitamine.........................................................................................................................59
Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografică................................................59
Dozarea iodometrică a acidului ascorbic din urină (metoda Palladin)........................60
Enzime............................................................................................................................61
Influența concentrației substratului asupra vitezei de reacție enzimatică..................63
Determinarea constantei lui Michaelis pentru urează.................................................65
Determinarea activității transaminazelor (metoda colorimetrică cu 2,4-
dinitrofenilhidrazină)...................................................................................................68
Explorarea echilibrului acido-bazic.............................................................................74
Determinarea rapidă a rezervei alcaline (bicarbonat actual)...................................74
Metoda Astrup.........................................................................................................75
Ioni anorganici...............................................................................................................75
Dozarea flamfotometrică a potasiului seric.............................................................75
Dozarea calciului și magneziului.................................................................................76
Dozarea calciului.....................................................................................................76
Determinarea cationului calciu în sânge..................................................................77
Dozarea calciului prin metoda complexonometrică................................................79
Dozarea magneziului prin metoda Mann și Yoe.....................................................81
Dozarea ionului de clor din ser prin metoda Schales..................................................84
Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificată)................................................85
Dozarea fosfatului anorganic din ser prin metoda Briggs ( cu deproteinizare)..........87
Compuși organici...........................................................................................................91
Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl...................................................91
Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului...........................................93
Dozarea proteinelor din lapte......................................................................................96
Determinarea pH-ului laptelui.....................................................................................97
Caracteristicile şi compoziţia laptelui.........................................................................99
Electroforeza proteinelor serice.................................................................................107
Dozarea ureei din ser prin metoda cu urează.............................................................111
Dozarea acidului uric din ser.....................................................................................113
Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin..........................................................115
Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecția van den Bergh......................................116
Dozarea glucozei prin metoda enzimatică (glucozoxidază)..................................118
Teste rapide pentru determinarea glicemiei..........................................................120
Dozarea beta-lipoproteinelor după Burstein..............................................................122
Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatică.....................................124
Dozarea hemoglobinei sub formă de oxihemoglobină..............................................126
Determinarea hemoglobinei glicozilate.....................................................................126
Protocol de lucru pentru dozarea hemoglobinei glicozilate cu Micromat II.............129
Analiza urinei...............................................................................................................132
Examenul fizic al urinei.............................................................................................133
Examenul chimic al urinei.........................................................................................136
Analiza compușilor patologici din urină...................................................................137
Identificarea proteinelor urinare............................................................................137
Evidențierea puroiului...........................................................................................140
Identificarea glucidelor urinare.............................................................................140
Identificarea corpilor cetonici urinari....................................................................145
Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici................................................147
Identificarea acizilor biliari...................................................................................147
Identificarea pigmenților biliari urinari.................................................................148

2
 Identificarea urobilinogenului și stercobilinogenului............................................149
Identificarea sângelui.............................................................................................150
Teste rapide de diagnostic din urină..........................................................................150
Test rapid de sarcină..................................................................................................151
Analiza de laborator a urinei.....................................................................................151
Dozarea acidului uric din urină.............................................................................152
Dozarea creatininei din urină.................................................................................152
Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal.......................................153
Analiza calculilor urinari...........................................................................................154
Identificarea unor componenți prin reacții specifice:............................................154
Analiza sucului gastric................................................................................................155
Determinarea acidității gastrice.................................................................................155
Metode fizice de analiză folosite în laborator...........................................................157
Fotometria..................................................................................................................157
Spectrofotometrul de absorbție atomică....................................................................160
Spectrofotometrul de absorbție atomică................................................................160
Flamfotometria..........................................................................................................161
Fotometrul cu flacără (flamfotometrul).................................................................161
Potențiometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi............................................163
Măsurarea pH-ului cu electrodul de sticlă.............................................................163
Valori patologice de laborator care amenință viața.................................................164
Limitele valorilor normale.........................................................................................165

3
 Măsuri pentru protecția muncii și asigurarea securității în
laboratoarele de biochimie
1. Întregul personal și studenții, trebuie să cunoască și să respecte regulile de protecția
muncii și asigurarea securității, pentru prevenirea accidentelor de muncă.
2. Tot personalul care lucrează în laboratoarele de analize biochimice este obligat să
poarte halate curate.
3. Aparatele electrice (centrifugă, termostate, frigidere, spectrofotometru etc.) trebuie
să aibă prizele împământate și izolare electrică perfectă. Fixarea lor în priză se face
numai cu mâna uscată.
4. Înainte de începerea oricărei lucrări de laborator trebuiesc însușite tehnic
problemele teoretice.
5. Toate reacțiile chimice se execută în conformitate cu condițiile prescrise (cantitatea,
concentrația, vesela, etc.).
6. Masa de lucru se păstrează într-o ordine și curățenie exemplară.
7. Nu se execută nici o operație în vase murdare.
8. După întrebuințare toate vasele de laborator se spală cu apă de robinet și cu apă
distilată.
9. Nu se aglomerează masa cu vase și aparate inutile, pe masă se pun numai reactivii și
vesela necesară pentru lucrarea respectivă.
10. Sticlele cu reactivi să fie întotdeauna închise cu dop. Dacă se folosesc diferiți
reactivi trebuie avut grijă să nu se schimbe dopurile. Excesul luat dintr-un reactiv nu
trebuie turnat înapoi în sticlă.
11. Încăperea unde se prepară acizii minerali, apa de brom, solvenții organici trebuie să
fie prevăzută cu nișă, exhaustor și ventilație electrică.
12. Înainte de folosirea unor substanțe inflamabile (sulfură de carbon, benzină, eter,
etc.) se sting toate becurile de gaz.
13. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu extinctor, să se facă instructaj periodic de
utilizarea extinctorului și să fie precizată o echipă care să intervină în caz de
incendiu.
14. Evaporarea solvenților inflamabili se va face numai pe băi de nisip sau băi de apă
electrice, sub nișe cu tiraj convenabil.

4
15. Trebuie să se lucreze cu mare precauție cu metalele alcaline, fosfor, brom, clor, acid
azotic, substanțe toxice și inflamabile.
16. Pipetarea produselor biologice se face cu pipete prevăzute cu filtru de vată.
17. Pipetarea acizilor concentrați și bazelor se face cu pipetă cu volum mai mare decât
volumul de pipetat și prevăzute cu filtru de vată.
18. Bromul se măsoară numai sub nișă, cu pipete cu bulă, prevăzute cu o pară de
cauciuc pentru aspirare. Acidul sulfuric diluat se prepară prin turnarea acidului
sulfuric concentrat în vasul cu apă și nu invers.
19. În timpul încălzirii unei eprubete care conține un lichid capătul deschis al eprubetei
nu se ține spre cel care efectuează operația și nici spre vecini.
20. Nu se lasă substanțe în vase neetichetate.
21. Substanțele toxice se țin sub cheie și în borcane sau sticle prevăzute cu etichete cu
cap de mort.
22. Este strict oprită gustarea reactivilor deoarece majoritatea substanțelor chimice
folosite sunt toxice sau caustice.
23. Mirosirea substanțelor chimice nu se face prin apropierea nasului direct la gâtul
sticlei cu reactivi, ci prin aducerea unui curent de aer care conține vapori ai
substanțelor de la gâtul sticlei cu ajutorul palmei în apropierea nasului.
24. Când se lucrează cu substanțe care în cursul operației se pot împrăștia sau se pot
produce mici explozii, se folosesc ochelari de protecție.
25. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon și azot lichid se depozitează, în afara
laboratorului. Când sunt strict necesare anumitor operații în laborator ele se
ancorează cu lanț în locuri anume prevăzute.
26. Cromatografia și electroforeza se efectuează în încăperi izolate de restul
laboratorului și prevăzute cu ventilatoare electrice.
27. În legătură cu lucrarea practică efectuată se notează toate observațiile precum și
schița instalației folosite.
28. Acizii minerali și hidroxizii concentrați, hârtiile și eprubetele sparte nu se aruncă în
chiuvete.
29. După terminarea activității, se pun toate vasele la loc, se curăță masa și se
controlează dacă aparatura electrică a fost scoasă din prize și robinetele de apă și
gaz închise.

5
30. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu o trusă de prim ajutor care să conțină
medicamente și material sanitar strict necesar (antinevralgice, cardiotonice,
antibiotice, antiseptice, calmante, feșe, tifon etc.).
31. Este interzisă păstrarea alimentelor în frigidere cu produse biologice,. pentru a evita
pericolul de infectare.
32. Este necesar ca măsurile de protecția muncii, asigurarea securității, prevenirea
toxicității să fie prelucrate cu fiecare grupă de studenți la începutul activității anului
universitar și reamintite periodic.
33. În cazul unor accidente se va apela la conducătorul lucrării.

Recoltarea sângelui
Analizele chimice ale constituenților anorganici și organici sanguini se pot
realiza pe sânge venos, capilar și arterial (foarte rar).
Investigațiile comparative pe sânge capilar și venos au arătat că nu există
diferențe dependente de modul de prelevare pentru următoarele substanțe: sodiu,
potasiu, clor, calciu, fosfor, colesterol, uree, proteine totale. În schimb pentru glucoză s-
au găsit valori mai mici în sângele venos față de cel arterial, pentru piruvat și lactat
valori mai mari în sângele venos decât în cel capilar iar pentru amoniac valorile din
sângele arterial sunt mai mari decât cele din sângele venos.

Condiții de recoltare

În mod curent, recoltarea sângelui se efectuează dimineața, à jeun (pe

nemâncate). Analizându-se influența micului dejun (masă ușoară) asupra concentrației
unor constituenți sanguini, s-a găsit că recoltarea sângelui à jeun nu este obligatorie în
cazul dozării următoarelor elemente: clor, sodiu, potasiu, calciu, bicarbonat, uree,
creatinină, acid uric, proteine totale, colesterol, amilază, ceruloplasmină, fosfatază
alcalină, fosfatază acidă, transaminaze, leucin amino peptidază, colinesterază.
În principiu, utilizarea sângelui total în cadrul diferitelor investigații este admisă
numai în cazul în care concentrația substanței urmărite este aproximativ aceeași în
globulele roșii și în plasmă, așa cum este cazul glucozei și al azotului ureic.
Datorită conținutului diferit în apă al sângelui (81%) și al plasmei sau serului
(93%), valorile glucozei din ser sunt cu 12% mai mari ca cele obținute în sânge.

6
 Concentrațiile medii ale unor componenți organici și anorganici și activitățile medii ale
unor enzime din plasmă și eritrocite sunt redate în tabelul de mai jos.

Component (concentrație) Eritrocite Plasmă Eritrocite

Plasmă
Azot neproteic (mg/100 ml) 44,0 25,0 1,80
Creatinină (mg/100 ml) 1,8 1,1 1,60
Azot ureic (mg/100 ml) 14,0 17,0 0,82
Acid uric (mg/100 ml) 2,5 4,6 0,54
Glucoză (mg/100 ml) 74,0 90,0 0,82
Colesterol (mg/100 ml) 139,0 194,0 0,72
Potasiu (mEq/l) 100,0 4,4 22,7
Sodiu (mEq/l) 16,0 140,0 0,11
Clor (mEq/l) 52,0 104,0 0,50
Calciu (mEq/l) 0,5 5,0 0,10
Magneziu (mEq/l) 5,5 2,2 2,5
Fosfor anorganic (mEq/l) 2,5 3,2 0,78
Bicarbonat (mEq/l) 19,0 26,0 0,73

Utilizarea plasmei în locul serului pentru dozările diferiților constituenți prezintă

un singur avantaj: hemoliza mai slabă a plasmei față de hemoliza produsă în timpul
obținerii serului (recoltare, coagulare, transport).
Cu excepția unor enzime (fosfataza acidă, lactat dehidrogenază și aldolaza) care
se eliberează în timpul coagulării din trombocite, nu se constată diferențe între
concentrația plasmatică și serică a celorlalți constituenți.

Recoltarea sângelui capilar

Recoltarea sângelui capilar se face din pulpa degetului, din călcâi (la nou
născuți) sau din lobul urechii (la pacienții în stare de șoc), după următoarea tehnică :
- se spală locul cu eter se usucă, se înțeapă suficient de adânc cu un ac steril;
- se lasă sângele să curgă spontan până când se formează o picătură apre-
ciabilă din care se recoltează cu ajutorul unei micropipete cantitatea de sânge necesară;
dacă sângele nu curge spontan în cantitate suficientă, se pot folosi manevre ajutătoare:
frecarea degetului în cazul prelevării din pulpă, a gambei în cazul prelevării din călcâi
sau aplicare de alcool 70° în cazul prelevării din lobul urechii; după prelevare se pune
pe locul înțepăturii un tampon steril.

7
 Recoltarea sângelui venos

Recoltarea sângelui venos se efectuează din venele plicii cotului (la adult și copii
mari), din fontanelă și venele jugulare (la sugari și copii mici).
Recoltarea din venele plicii cotului se face după următoarea tehnică:
- se fixează garoul deasupra cotului, se dezinfectează tegumentul în locul
puncționării cu alcool 70 %;
- se puncționează vena și se recoltează sângele cu ac prin aspirare în
vacumtainer;
- după recoltare se îndepărtează garoul și se tamponează locul puncționat cu un
tampon dezinfectant.
Se folosesc ace și vase speciale pentru recoltarea sângelui, vidate
(vacumtainere), de unică utilizare.
Poziția corpului și staza venoasă influențează rezultatele obținute în cazul
determinării elementelor figurate (eritrocitele, etc.) și a celor cu greutate moleculară
mare (proteinele totale, fracțiunile proteice individuale, colesterolul din complexul
lipoproteinelor etc.).
De exemplu: valoarea proteinelor totale crește de la 6,63 g/100 ml în poziție de
deccubit la 7,65g/100 ml în ortostatism.
În cazul determinării substanțelor cu greutate moleculară mică, poziția corpului
și staza venoasă nu afectează valoarea rezultatelor excepție, făcând lactatul, piruvatul și
amoniacul.

Condițiile de conservare a probelor recoltate

Probele de sânge total recoltat pe heparină sau alt anticoagulant, se păstrează la

4° C, iar dozările trebuie făcute în mai puțin de 4 ore de la recoltare. Păstrarea prea
îndelungată (chiar la 4°C) este contraindicată. Conservarea probelor la temperatura
camerei determină perturbări în compoziția electroliților, enzimelor și diferiților
metaboliți.
În cazul plasmei sau serului, determinările metaboliților și enzimelor trebuie
realizate, de asemenea, în decurs de 4 ore de la recoltare, în condițiile păstrării la
temperatura camerei. Fără alterări importante, serul sau plasma pot fi păstrate la 4° C
timp de 24 ore. În cazul dozărilor după 24 ore de la recoltare plasma sau serul trebuie
congelat la temperaturi sub -35°C sau liofilizat, formă de conservare preferabilă

8
adăugării de conservanți (amestec timol-fluoru0ră: 10 mg fluorură de sodiu + 1 mg
timol/ml sânge sau streptomicină 1 mg/l0 ml sănge).

Obținerea plasmei și a serului

Analizele biochimice se pot efectua pe sânge total, plasmă sau ser. Plasma
sanguină se obține prin centrifugarea sângelui proaspăt recoltat pe un anticoagulant
(fluorură de sodiu, amestec de oxalați de potasiu și amoniu, heparină etc.); supernatantul
este constituit din plasma sanguină, iar sedimentul din elementele figurate.
Serul sanguin se obține prin centrifugarea sau decantarea sângelui recoltat fără
anticoagulant, după ce a fost lăsat să coaguleze la temperatura camerei timp de 30-60
minute.
Serul normal este limpede, de culoare galben pai și se deosebește de plasma
sanguină prin faptul că nu mai conține fibrinogen. În condiții fiziologice, aspectul
serului poate fi :
- opalescent datorită particulelor de grăsime provenite dintr-un regim foarte
bogat în lipide, caz în care clarificarea se poate obține prin deproteinizare sau
extracția lipidelor cu amestec alcool-eter (3/1);
- galben-brun datorită substanțelor carotenoide provenite din alimentație excesiv
vegetariană ;
- de la roz la roșu intens datorită prezenței hemoglobinei, rezultat al hemolizei
produsă prin greșeli în tehnica de recoltare a sângelui.
În condiții patologice, serul poate prezenta următoarele modificări de culoare :
- opalescent în nefroza lipoidică;
- galben-brun în ictere de diferite etiologii; în contact cu aerul, bilirubina se
poate transforma în biliverdină, sângele devenind verzui.

Prepararea soluțiilor procentuale molare, normale

O soluție este un amestec omogen de două sau mai multe substanțe inseparabile
prin mijloace mecanice ca filtrarea sau centrifugarea. La o soluție se disting două
componente: solventul sau componenta care dizolvă și solutul(soluții) sau componenta
(componentele) care se dizolvă. Raportul dintre un solut și solvent se exprimă prin
concentrația soluției.

9
 Există mai multe moduri de exprimare a concentrației unei soluții:
a) Concentrația procentuală care la rândul ei poate fi de trei feluri:
- concentrația procentuală de masă - grame solut în 100 g soluție, (m/m)
De exemplu 100 g soluție 15% (m/m) H2SO4 conține 15 g H2SO4 și
85 g apă.
- concentrația procentuală volumetrică - ml solut în 100 ml soluție,
(v/v)
De exemplu 100 ml soluție 4% (v/v) etanol se prepară completând 4
ml CH3CH2OH până la 100 ml cu apă. În acest caz facem abstracție de
contracția de volum, fenomen larg întâlnit în prepararea soluțiilor
procentuale volumetrice. Într-o expresie restrânsă acest fenomen poate
fi scris astfel: v solut +v solvent >v soluție. Pentru soluții diluate el poate fi
neglijat.
- concentrația procentuală mixtă - grame solut în 100 ml soluție, (m/v)
De exemplu 100 ml soluție 0,8% (m/v) NaCl (ser fiziologic) conține
în acest volum 0,8 g NaCl
b) Concentrația molară (m, M) reprezintă numărul de moli de solut aflați într-un
litru de soluție.
c) Concentrația molală, mai rar folosită, se definește prin numărul de moli de
solut dizolvați în 1000 g de solvent.
d) Concentrația normală reprezintă numărul de echivalenți-gram de solut dintr-
un litru de soluție.
Se numește echivalent cantitatea de substanță în greutate care într-o reacție
chimică dată poate înlocui sau lega 8 părți în greutate de oxigen sau 1,008 părți în
greutate de hidrogen. Cantitatea de substanță în grame, egală numeric cu echivalentul,
se numește echivalent-gram.
Pentru calcularea echivalentului-gram se ține cont de următoarele reguli:
 echivalentul-gram a unui acid este egal cu raportul dintre masa moleculară (M) a
acidului și numărul de ioni H+ angajați în reacție. De exemplu, într-o reacție de
neutralizare cu HCl

EgHCl = = 36,5 g HCl,

iar într-o reacție în care H3PO4 cedează toți cei 3 ioni H+ :

10
 = g H3PO4
 echivalentul-gram a unei baze este dat de masa moleculară a sa împărțită la numărul
ionilor HO- care participă la reacție. Dacă toți ionii HO - participă la reacție
echivalentul-gram al bazei se poate calcula împărțind masa moleculară a acesteia la
valența metalului. De exemplu:

EgNaOH = g NaOH g Ca(OH)2

În sensul mai larg al bazelor generalizate, echivalentul gram se calculează
cunoscând numărul de protoni care sunt legați.
 pentru săruri, echivalentul-gram este dat de raportul dintre masa moleculară și
produsul dintre numărul atomilor de metal din molecula de sare și valența acestui
metal, sau raportul dintre masa moleculară și produsul dintre numărul radicalilor acid
și valența acestora. De exemplu:

g Fe2(SO4)3
Ca și în cazul acizilor, bazelor și sărurilor, echivalentul-gram a unei substanțe
oxidante sau reducătoare se calculează pe baza stoicheometriei redox a reacției la care
participă aceasta. În reacțiile de oxido-reducere atomii își schimbă valența. Echivalentul
se definește ca fiind raportul dintre masa moleculară a compusului chimic și numărul de
electroni cedați sau primiți în reacție de atomul (atomii) care se oxidează sau se reduc.
De exemplu, în permanganometrie, în mediu acid ionul de mangan din KMnO 4,
acceptă 5 electroni:
7+ 2+
2KMnO4 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 3H2O + 5[O]

Prin urmare, g KMnO4

- variația stării de oxidație a ionului de mangan din KMnO 4 în mediu slab alcalin
sau neutru este 3.
7+ 4+
2KMnO4 + H2O = 2KOH + MnO2 + 3[O]

g KMnO4

11
 - variația stării de oxidație a manganului din KMnO4 în mediu puternic alcalin
este 1
+7 +6
2KMnO4 + 2KOH = 2K2MnO4 + H2O + [O]

EgKMnO4 = M = 158g KMnO4

1

1. Soluții procentuale
a) Prepararea unei soluții de NaCl 10 % (m/m)
Conform definiției 100 g soluție NaCl 10 % trebuie să conțină 10 g NaCl și 90 g
apă. Se cântăresc 10 g NaCl la balanța tehnică care se introduc într-un pahar Berzelius și
se adaugă 90 ml de H2O distilată. Se omogenizează amestecul cu ajutorul unei baghete
de sticlă.
b) Prepararea unei soluții de CH3COOH 15 % (v/v)
Conform definiției 100 ml soluție CH 3COOH 15 % trebuie să conțină 15 ml
CH3COOH glacial și restul H2O distilată. Se măsoară într-un cilindru gradat 15 ml
CH3COOH glacial și se completează volumul cu H 2O distilată până la 100 ml. Se
omogenizează amestecul cu ajutorul unei baghete de sticlă.
c) Prepararea unei soluții de Na2CO3 5%(m/v)
100 ml soluție Na2CO3 5 % trebuie să conțină 5 g Na2CO3 anhidru și H2O
distilată. Se cântăresc 5 g Na2CO3 anhidru la balanța tehnică, se introduc într-un cilindru
gradat și se completează cu H2O distilată până la 100 ml. Se omogenizează amestecul cu
ajutorul unei baghete de sticlă. În cazul în care se lucrează cu Na 2CO3 . 10 H2O se vor
lua în considerare masele moleculare pentru a se determina cantitatea în grame a sării
hidratate ce corespunde greutății de sare anhidră.

106 g Na2CO3 anh. ............... 286 g Na2CO3.10 H2O

5 g Na2CO3 anh. ............... x
x = 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O

Se vor cântări 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O la balanță și se va proceda în modul

descris mai sus.

12
 Regula amestecurilor

Dintr-o soluție mai concentrată se poate prepara o soluție mai diluată cu ajutorul
regulei amestecurilor. De exemplu, având la dispoziție o soluție de NaCl 2 % (m/m) să
se prepare 20 ml soluție NaCl 0,9 %(m/m). Valorile concentrațiilor celor două soluții,
având concentrația mai mare, respectiv mai mică decât concentrația soluției de preparat,
se așează în colțurile de sus ale unui dreptunghi imaginar. Valoarea concentrației
soluției de preparat, se așează la intersecția celor două diagonale. Valorile numerelor ce
reprezintă concentrațiile se scad pe diagonală (numerele mai mici se scad din cele mai
mari). Rezultatele se scriu în colțurile de jos ale dreptunghiului. Aceste numere
reprezintă părți în greutate din soluțiile respective (grame, kilograme, etc.).

2 0

0,9

0,9 părți NaCl 2 % 1,1 părți H2O distilată…2 părți NaCl 0,9%(m/m)

Deci, se pot amesteca 0,9 părți NaCl 2 % cu 1,1 părți H 2O distilată pentru a
rezulta 2 părți soluție de NaCl 0,9%(m/m). Având în vedere că soluția NaCl 0,9%
(m/m) este diluată putem tolera conversia părților de greutate, în volume. Adică,
20 ml (soluție) NaCl 0,9 %(m/v) ..........x ............y
x = 9 ml NaCl 2 %
y = 11 ml H2O distilată
Aproximația făcută este utilă deoarece este mai ușoară măsurarea volumetrică a
soluțiilor în loc de cea gravimetrică.

2. Soluții molare

a) Prepararea unei soluții de H2SO4 0,1 M având la dispoziție soluție de H2

SO4 20 % (m/m) cu densitatea 1,139 g/cm 3. Conform definiției, 1000 ml H 2SO4 0,1 M
conțin 0,1 moli H2SO4. Deci:

13
 1000 ml H2SO4 0,1 M .................. 9,8 g H2SO4 pur

100 g sol. H2SO4 20 % .............. 20 g H2SO4 pur

x g sol. H2SO4 20 % …………..9,8 g H2SO4 pur
x = 49 g sol. H2SO4 20 %(m/m)

ml sol. H2SO4 20 %(m/m)

În balonul cotat de 1000 ml se introduce o cantitate de H 2O distilată, se adaugă
43,02 ml soluție H2SO4 20 % și apoi se aduce la cotă cu H2O distilată după răcirea
amestecului la temperatura menționată pe balon (20ºC). După ce se fixează dopul
balonului cotat se omogenizează soluția prin agitare energică.

3. Soluții normale
Prepararea unei soluții de H2SO4 0,1 N având la dispoziție soluție H 2SO4 20 %
(m/m) cu densitatea 1,139 g/cm3. Conform definiției 1000 ml sol. H2SO4 0,1 N conțin

0,1 . Deci:
1000 ml H2SO4 0,1 N .............. 4,9 g H2SO4 pur

100 g sol. H2SO4 20 % ........... 20 g H2SO4 pur

x g sol. H2SO4 20 % .......... 4,9 g H2SO4 pur
x = 24,5 g sol. H2SO4 20 %(m/m)

ml sol. H2SO4 20 %

Noțiunea de pH
Ionizarea apei și produsul ionic al apei
Deși apa pură este considerată neelectrolit, ea conduce totuși curentul electric.
Acest lucru se datorează faptului că o parte din moleculele ei sunt ionizate. Ionizarea
apei poate fi scrisă conform ecuației:

H2O + H2O --------- H3O+ + OH-

Are loc un transfer de protoni ducând la un echilibru. Constanta de aciditate a apei va fi:

14
 [ H 3 O+ ] [ OH − ]
2
Ka= [ H2O]
La temperatura de 25C apa se află ionizată în proporție de o moleculă la 555
milioane de molecule. De aceea se consideră că, prin ionizare, concentrația apei (de la
numitor) rămâne practic constantă și deci poate fi înmulțită cu constanta de aciditate.
Ka  [H2O]2 = Pi = [H3O+] [OH-]
Constanta Pi este numită produsul ionic al apei sau constanta de autoprotoliză a
apei. Deoarece la temperatura de 25C produsul ionic al apei are valoarea de
10-14 moli2/l2, înseamnă că în apa pură la 25C concentrația ionilor de hidroniu, egală cu
cea a ionilor de hidroxid, este 10-7moli/l.
[H3O]+ = [OH-] = 10-7moli/l

Scara de pH
În soluții diluate, acizii tari pot fi considerați practic ionizați complet. Astfel,
într-o soluție apoasă 0,1N de HCl (0,1 moli/l) concentrația ionilor de hidroniu este
practic egală cu concentrația totală a acidului. Este comod să se exprime concentrația
ionilor de hidroniu dintr-o soluție apoasă în formă logaritmică. Se numește exponent al
concentrației ionilor de hidroniu sau pH logaritmul zecimal cu semn schimbat al
concentrației ionilor de hidroniu din soluție (Sørensen, 1909):
pH = - lg [H3O+]
Punctul neutru: O soluție apoasă este neutră când concentrațiile ionilor de
hidroniu și ionilor de hidroxid sunt egale, conform ecuației:
[H3O+] = [OH-] = 10-7moli/l
Punctul neutru, în soluții apoase, este la pH = 7. O soluție cu pH  7 este acidă; o soluție
cu pH  7 este bazică.

Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici

Indicatori de pH (acido-bazici) sunt substanțe organice colorate (acizi sau baze

slabe) care își modifică culoarea în funcție de pH. Condițiile pe care trebuie să le
îndeplinească un indicator de pH sunt următoarele: schimbarea de culoare să fie
reversibilă, și să se producă brusc, deci într-un interval de pH cât mai mic, să fie solubil
în apă, să aibă putere de colorare (culoare intensă), chiar la concentrații mici;

15
schimbarea de culoare să se producă la adaosul unor concentrații mici de acid sau de
bază; să fie stabil în condițiile obișnuite de lucru.
Dacă indicatorul este un acid slab (AH), în soluție apoasă are loc reacția
protolitică:
AH + H2O ───── H3O+ + A-

În cazul albastrului de bromtimol, acidul slab AH este galben iar baza conjugată
A- este albastră. Prin schimbarea acidității soluției indicatorului își schimbă culoarea
fenomen numit viraj, datorită trecerii lui din stare protonată în cea deprotonată sau
invers.
Constanta de aciditate al indicatorului va fi:
-
[A ]
Ka = [H ] ────
+

[AH]
În forma logaritmică:
-
[A ]
-
[A ]
lgKa = lg[H+] + lg ──── sau - lg[H+] = -lgKa + lg ───
[AH] [AH]
Adică:
-lg[H+] = pH și -lgKa = pKa, deci:
[A-] [albastru]
________
pH = pKa + lg ─── sau pH = pKa + lg
[AH] [galben]

Ochiul uman nu poate distinge decât cca. 10% dintr-o culoare în prezența unei alte
culori. Dacă [A-] = 10[AH], soluția va fi albastră și pH 1 = pKa + 1. Dacă 10[A-] = [AH],
soluția va fi galbenă și pH2 = pKa - 1. Prin urmare:
pH1 - pH2 = pH = 2
Acest interval de pH se numește intervalul de viraj al indicatorului care înseamnă
intervalul de pH în care are loc schimbarea culorii indicatorului (de la albastru la galben
în cazul nostru) odată cu schimbarea pH-ului soluției. Fiecare indicator are un interval
de viraj specific. La valori de pH inferioare intervalului de viraj indicatorul își păstrează
culoarea, iar peste acest interval la fel. Din culoarea soluției unui indicator se poate
aprecia pH-ul soluției.
Indicatorii acido-bazici pot fi simpli, micști și universali. Indicatorii simpli se
caracterizează printr-un interval de viraj relativ mic (cca 2 unități de pH).
Indicatorii simpli se pot folosi pentru tatonarea pH-ului necunoscut. pH-ul
necunoscut se poate estima cu o eroare de un semiinterval de viraj.

16
 Indicatorii universali sunt amestecuri de indicatori simpli ale căror intervale de
viraj sunt parțial suprapuse sau, în cazul cel mai bun, unul în continuarea celuilalt.
Indicatorii universali au intervale de viraj mai mari decât ale celor simpli. În comerț se
găsesc hârtii indicatoare impregnate cu indicatori universali. Prin compararea culorii
obținute cu o scară de culori etalon, se poate determina pH-ul unei soluții cu o precizie
de aproximativ + 0,5 unități pH.

În tabelul de mai jos apar câteva exemple de indicatori simpli cu caracteristicile

lor:

Intervalul de Sub interval În cadrul Peste

Denumirea
viraj (pH) de viraj intervalului de viraj interval
Metil violet 1,0 - 3,2 verde albastru violet
Metil oranj 3,1 - 4,4 roșu portocaliu galben
Roșu metil 4,4 - 6,2 roșu roz galben
Albastru de
6,2 - 7,6 galben verde albastru
bromtimol
Fenolftaleină 8,2 - 10,0 incolor roz roșu-violet

Sistemele tampon: sunt formate dintr-o sare hidrolizabilă și acidul slab sau baza slabă
rezultată prin hidroliză. O soluție care își schimbă numai puțin pH-ul, la adăugarea unei
cantități mici de acid sau bază tare se numește soluție tampon. O caracteristică a unei
soluții tampon este capacitatea de tamponare.
Capacitatea de tamponare a unei soluții este capacitatea ei de a se opune variației de pH
la adaosul de acid tare sau bază tare și se exprimă prin numărul de echivalenți de acid
sau bază care schimbă pH-ul unui litru de soluție cu o unitate. Ea se micșorează prin
diluare.

Demonstrarea capacității de tamponare:

Reactivi: Indicator Bogen (amestec de roșu metil și albastru de bromtimol,

cu intervalul de viraj între pH 4,4-7,6)
Sol. tampon fosfat pH = 7

17
 Sol.de HCl N/10
Sol. de NaOH N/10

Modul de lucru:
În două pahare Berzelius (1, 1a) se pune apă distilată și se adaugă câte 2 ml de
indicator. Dacă apa este neutră culoarea soluțiilor este verde. În alte două pahare (2, 2a)
de aceiași mărime se prepară soluție tampon cu pH = 7, la care se adaugă câte 2 ml
soluție de indicator obținându-se tot culoarea verde. Se adaugă câte 1 ml HCl N/10 în
paharele 1și 2 și se amestecă cu bagheta: se observă o puternică variație a culorii
soluției din paharul 1 ceea ce indică o mare variație a pH-ului. În paharele 1a și 2a se
adaugă câte 1 ml NaOH N/10, se amestecă cu bagheta și se observă la fel o mare
variație a culorii soluției din paharul 1a. În paharele 2 și 2a culoarea se schimbă foarte
puțin, deoarece pH-ul s-a modificat foarte puțin.
În două pahare Berzelius (1, 1a) se prepară soluție tampon cu pH = 7 și se adaugă
câte 2 ml indicator. În alte 2 pahare (2, 2a) se prepară soluție tampon cu același pH, însă
de zece ori mai diluat, adăugând câte 2 ml indicator și în aceste pahare. Se pipetează
câte 1 ml HCl N/10 în paharele 1 și 2, și câte 1 ml NaOH N/10 în paharele 1a și 2a. Se
amestecă cu bagheta. În paharele 2 și 2a se observă schimbarea mai pronunțată a culorii
indicatorului deoarece, soluțiile tampon fiind mai diluate, li s-a micșorat capacitatea de
tamponare.

Determinarea colorimetrică a pH-ului prin metoda cu soluții tampon

Principiu:
Se adaugă soluției de cercetat un anumit volum dintr-un indicator potrivit și se
compară culoarea pe care o capătă soluția, cu culoarea produsă de aceiași cantitate de
indicator adăugată unei serii de soluții tampon cu pH-uri cunoscute. pH-ul soluției de
cercetat va fi egal cu pH-ul soluției de referință cu culoarea identică.
Reactivi: - Sol. de CH3COOH N/10
- Sol. de CH3COONa N/10
- Sol. de KH2PO4 M/15
- Sol. de Na2HPO4 M/15

18
 - Indicator Bogen (amestec de roșu metil și albastru de bromtimol)
Modul de lucru:
Se prepară în două serii de eprubete soluții tampon cu pH diferit conform
tabelelor:

Tampon acetat (Walpole)

CH3COOH N/10 ml 8,2 6,3 4,0 2,1 1,0

CH3COONa N/10 ml 1,8 3,7 6,0 7,9 9,0
pH 4 4,4 4,8 5,2 5,6

Tampon fosfat (Sørensen)

KH2PO4 M/15 ml 8,8 7,3 5,1 2,8 1,3 0,5

Na2HPO4 M/15 ml 1,2 2,7 4,9 7,2 8,7 9,5
pH 6 6,4 6,8 7,2 7,6 8,0

În fiecare soluție se adaugă câte 0,2 ml indicator Bogen. Eprubetele se agită

energic pentru omogenizarea culorii. Culoarea soluțiilor va fi diferită în fiecare eprubetă
în funcție de pH. Se adaugă 0,2 ml indicator la 10 ml din soluția de cercetat și se
omogenizează. Se compară culoarea obținută cu culorile seriei. Dacă culoarea soluției
cercetate este identică cu culoarea uneia din soluțiile tampon (acetat sau fosfat), pH-ul
lor este identic. Dacă culoarea se încadrează între culorile a două soluții tampon
consecutive se consideră că pH-ul soluției cercetate este media aritmetică a valorilor de
pH a celor două soluții tampon.

Volumetrie
Principiile analizei volumetrice
Analiza volumetrică se bazează pe măsurarea de volume, operație ce se execută
comod cu vase calibrate (cilindrii gradați, baloane cotate, pipete, biurete). Principiul
analizelor volumetrice constă în măsurarea volumului de reactiv necesar producerii
reacției cantitative cu substanța de determinat ce se află în soluția de analizat. Operația
de adaos a soluției de reactiv se face în pică- turi, din biuretă și se numește titrare.

19
 Pot fi urmărite volumetric numai acele reacții care au loc univoc, (fără reacții
secundare și cantitativ) și cu viteză foarte mare. Pentru marcarea sfârșitului reacției,
respectiv a punctului de echivalență, se folosesc fenomene ce pot fi puse în evidență
prin observare vizuală (schimbări de culoare, apariții de precipitate) sau instrumentală
(potențiometru, conductometru, spectrofotometru). Pentru observarea vizuală a
sfârșitului titrării în modul cel mai obișnuit se folosesc indicatorii, substanțe care își
schimbă culoarea în punctul de echivalență.
La punctul de echivalență reactanții sunt prezenți în cantități echivalente, deci în
amestecul de reactivi nu se află în exces nici substanța de dozat și nici reactivul titrat.
Volumul de reactiv adăugat pentru atingerea punctului de echivalență se numește volum
de echivalență.
Spre a putea stabili concentrația substanței de analizat este necesar ca soluția de
reactiv folosită la titrare să fie de concentrație cunoscută, să fie suficient de stabilă și să
se prepare relativ ușor.
Metodele volumetrice se caracterizează prin rapiditate, în majoritatea cazurilor o
determinare volumetrică se face în câteva minute.

Clasificarea metodelor volumetrice

Metodele volumetrice pot fi: a) directe
b) indirecte - prin retitrare
- prin intermediul unui substituent
În cazul metodelor de titrare directă, reacția dintre componentul de determinat și
reactivul de titrare este de echivalent la echivalent. Prin retitrare se titrează excesul unui
reactant adăugat soluție de analizat (vezi dozarea NH 3). În cazul folosirii unui
substituent, produsul de reacție titrabil rezultat prin substituție se formează în cantitate
echivalentă cu componentul de determinat (ex. complexometria).

În ceea ce privește natura reacțiilor care stau la baza metodelor volumetrice,

clasificarea acestora este:
a.) metode de titrare acido-bazică sau neutralizare
b.) metode de titrare redox (permanganometria, iodometria)
c.) metode de titrare prin formare de complecși (complexometria)
d.) metode de titrare prin formare de precipitat (ex. argentometria)

20
 Calcule în analiza volumetrică
Raportul de concentrație între soluția reală (aproximativ normală) și cea
teoretică (exact normală) se numește factorul soluției.
Factorul exprimă numărul de ml de soluție exact normală care echivalează cu 1
ml din soluția preparată:

unde: Vt - volumul teoretic (a soluției exact normale)

Vr - volumul real ( a soluției preparate)

Factorul soluțiilor exact normale este 1,000. Ele folosesc ca soluții etalon și cu
ajutorul lor se determină factorul soluțiilor aproximativ normale. Soluțiile mai diluate
au un factor subunitar, soluțiile mai concentrate au un factor supraunitar. Practic
valoarea factorului trebuie să fie între 0,8000-1,2000.
Pe lângă factor concentrația exactă a soluțiilor se poate exprima și cu ajutorul
titrului. Titrul unei soluții reprezintă cantitatea de substanță exprimată în grame din 1 ml
soluție. De exemplu: pentru o soluție de NaOH care conține 4,653 g pe litru titrul are
valoarea de 0,004653.

Tehnica titrării
Pregătirea instrumentelor pentru titrare
Biureta se spală cu apă distilată și apoi se clătește cu soluția de titrare de două
ori. După utilizarea mai îndelungată a biuretei este necesară degresarea tubului gradat al
acesteia. Aceasta se poate realiza cu amestec cromic sau cu soluție de detergent.
Se umple biureta cu soluția de titrare peste gradația 0, apoi se scoate pâlnia care
a servit pentru introducerea lichidului în biuretă și se potrivește la zero nivelul lichidului
lăsând să cadă încet lichidul în exces într-un vas colector. Dacă robinetul se mișcă greu
sau biureta picură, se scoate robinetul, se șterge de umezeală și se unge cu un strat
subțire și uniform de vaselină. Partea inferioară a manșonului robinetului se usucă cu
ajutorul hârtiei de filtru și apoi se introduce robinetul uns la locul lui. Bulele de aer
prezente în biuretă pot să cauzeze erori la titrare ceea ce impune îndepărtarea lor.
Modul de lucru:
La începutul titrării dăm drumul soluției din biuretă în picături repezi agitând în
continuu conținutul flaconului Erlenmayer, în care se găsesc, exact măsurat, volumul

21
soluției de titrat plus indicatorul. De obicei se observă o schimbare temporară de culoare
a indicatorului în locul unde cad picături de reactiv în soluție. Spre sfârșitul titrării
concentrația substanței de dozat scade și la contactul picăturilor de reactiv cu soluția de
dozat schimbarea temporară a culorii soluției este mai persistentă. În această fază viteza
de picurare se reduce treptat în așa fel încât după adăugarea ultimei picături necesare, să
fie posibilă închiderea rapidă a robinetului. Picătura aderată pe vârful biuretei se
introduce în vasul de titrare prin atingerea de peretele interior al acestuia și se amestecă
cu lichidul de titrat aplecând vasul în direcția lichidului ce se prelinge pe peretele
vasului. Titrarea se consideră terminată când ultima picătură produce o schimbare slabă
dar sesizabilă și stabilă a culorii lichidului.
Erorile determinărilor volumetrice
În analizele chimice pot interveni două tipuri de erori:
- erori sistematice
- erori întâmplătoare
Erorile sistematice au valori constante și sunt întotdeauna pozitive sau negative.
Erorile întâmplătoare au valori și semne diferite. Ele se pot elimina prin
efectuarea unui mare număr de determinări și prin calcularea mediei aritmetice a
volumelor de echivalență cu valori apropiate. Volumele de echivalență ale căror valori
sunt exagerat de îndepărtate se exclud
Practic se efectuează titrarea a trei probe paralele efectuându-se media aritmetică
între volumele de echivalență identice sau cele cu valoare foarte apropiată. Se acceptă o
diferență între volumele de echivalență mai mică sau egală cu 0,2 ml. Să luăm un
exemplu. Volumele de echivalență obținute la titrarea a trei probe paralele sunt: V 1 = 7
ml; V2 = 7,1 ml; V3 = 7,4 ml. Diferențele V3 - V1 și V3 - V2 sunt mai mari de 0,2 ml, deci

V3 se exclude. Volumul mediu ( ) luat în calcul va fi în acest caz media aritmetică

dintre V1 și V2 și are valoarea de 7,05 ml. Dacă toate probele au valori foarte diferite
rezultatele nu sunt interpretabile iar titrările trebuie să fie repetate.
Surse de erori
Eroarea de paralaxă ( eroarea de citire) intervine la citirea incorectă a nivelului
soluției din vasul de măsurat. Volumul de soluție într-un vas de măsurat este egal cu
volumul nominal al vasului în cazul în care punctul inferior al meniscului lichidului este
tangent la cota de pe vas. Pentru citirea corectă a poziției meniscului ochiul

22
observatorului trebuie să fie pe orizontală într-un plan tangent la menisc iar vasul
trebuie să aibă o poziție verticală.

Vorbim despre eroarea de paralaxă în minus când ochiul observatorului este

deasupra acestei orizontale, respectiv eroare de paralaxă în plus, când ochiul se găsește
sub nivelul orizontului. Pentru evitarea erorii de paralaxă se folosesc biuretele
Schellbach care sunt prevăzute cu o dungă albastră pe un fond alb. La nivelul
meniscului dunga albastră se întrerupe formând două vârfuri ascuțite care se ating într-
un punct. Se citește poziția acestui punct de contact.
Eroarea de scurgere se datorează faptului că soluțiile apoase umezesc sticla și, la
golirea rapidă o parte din lichid aderă pe suprafața biuretei, deci soluția nu se scurge
cantitativ în vasul de titrare. Pentru evitarea acestei erori, viteza de scurgere pe
parcursul titrării trebuie să fie mică.
Eroarea de picurare
În analiza volumetrică, soluției de analizat i se adaugă soluția titrată până când
ultima picătură produce o schimbare sesizabilă și stabilă a culorii soluției. În cele mai
multe cazuri acest efect se datorează unui exces a soluției cu care se titrează. Pentru
reducerea acestui exces, ciocul biuretei trebuie să fie cât mai subțire pentru ca picăturile
de titrant să fie cât mai mici.
Eroarea de temperatură
Vasele de măsurat volume, biurete, baloane cotate, pipete sunt etalonate pentru o
anumită temperatură (200C). Diferența dintre temperatura de etalonare a vasului și
temperatura reală a soluției de măsurat determină o diferență de volum, care poartă
denumirea de eroare de temperatură. Se poate evita această eroare prin respectarea

23
temperaturii de etalonare. Diferențele mici de 1-20C sunt, în majoritatea cazurilor,
neglijabile.

Acidimetria volumetrică

Titrări acido-bazice
În titrările de neutralizare, stabilirea volumului de echivalență sau de
neutralizare se face cu ajutorul indicatorilor acido-bazici care, cum am arătat sunt în
formă neionizată acizi slabi (AH) sau baze slabe (B). În tabelul de mai jos sunt
exemplificați mai mulți indicatori acido-bazici cu precizarea naturii lor de acid sau bază.
Sunt incluși și câțiva din indicatorii utilizați la determinarea pH-ului (vezi mai sus).
Evident, tăria acestor acizi crește către cel al cărui interval de pH este cel mai mult sub
valoarea 7.
Pentru prepararea soluțiilor de indicatori se folosesc ca solvenți apa, dar mai ales
alcool apos, cei mai mulți în concentrație de 0,1 %.

Indicatorul AH = acid; B = bază Interval de pH Culorile limită

Acidă Alcalină
Albastru de timol (AH) 1,2 - 2,8 roșie galbenă
Albastru de bromfenol (AH) 3,0 - 4,6 galbenă vilet-albastră
Metiloranj (B) 3,1 - 4,4 roșie oranj
Verde de bromcrezol (AH) 4,0 - 5,6 galbenă albastră
Roșu de metil (AH) 4,4 - 6,2 roșie galbenă
Purpură de bromcrezol (AH) 5,2 - 6,8 galbenă purpurie
Albastru de bromtimol (AH) 6,2 - 7,6 galbenă albastră
Roșu neutral (B) 6,8 - 8,0 roșie galbenă
Roșu de crezol (AH) 7,2 - 8,8 galben roșie
Fenolftaleină (AH) 8,0 - 10,0 incoloră roșie
Albastru de timol (AH) 8,0 - 9,6 galbenă albastră
Timolftaleină (AH) 9,4 - 10,6 incoloră albastră
Galben de alizarină (AH) 10,0 - 12,0 galben liliachie

Titrarea unui acid tare cu o bază tare

Principiu: În cazul titrării unui acid tare, de exemplu HCl, cu o bază tare, de
exemplu NaOH, la echivalență se formează o sare nehidrolizabilă, în exemplul dat NaCl
și mediul devine perfect neutru. La neutralitate avem:

ioni g/l pHechiv. = 7

24
 pe parcursul titrării este egală cu concentrația acidului rămas netitrat.

După echivalență este egală cu concentrația bazei introdusă în exces. Pentru

alegerea indicatorului adecvat, este necesară cunoașterea pH-ului la punctul de
echivalență. La un exces (eroare) de 1% reactiv pH-ul soluției variază brusc. La titrarea
unui acid tare cu o bază tare intervalul de eroare corespunde aproximativ intervalului de
pH 4-10, ceea ce înseamnă că se poate folosi orice indicator care are un interval de viraj

între pH 4-10. În figura de mai jos apare curba de titrare a unui acid tare cu o bază tare
cu precizarea a doi indicatori ce permit punerea în evidență a punctului de echivalență
(P.E.) al reacției

Determinarea factorului unei soluții de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluții

etalon
Prepararea unei soluții de HCl aproximativ 0,1 N
Ne propunem să preparăm 1 litru sol. HCl aproximativ 0,1 N având la dispoziție
o soluție HCl 15% (g/100 g) cu  = 1,075 g/cm3.
Din definiția concentrației normale:
1000 ml HCl 0,1 N conțin 0,1 Eq HCl = 3,65 g HCl
100 g HCl 15 % .............15 g HCl
x g HCl 15 %............. 3,65 g HCl
x = 24,33 g HCl 15 %

 = V= = 22,6 ml HCl 15 %
Într-un balon cotat de 1000 ml se introduce o cantitate mică de H 2O bidistilată,
se adaugă 22,6 ml HCl 15 % și se completează cu H 2O bidistilată până la cotă.
Omogenizarea soluției se realizează prin agitarea energică.

25
 Stabilirea factorului soluției de HCl 0,1 N preparată
Pentru stabilirea factorului soluțiilor se folosesc soluțiile etalon, stabile din punct
de vedere chimic și cu factor cunoscut (eventual F = 1,000). O astfel de soluție etalon se
poate prepara prin cântărirea și dizolvarea în apă a KHCO 3, necesar în titrarea de mai
jos.
Pentru determinarea factorului soluției de HCl 0,1 N preparată anterior se
măsoară exact cu ajutorul unei pipete câte 10 ml sol. KHCO 3 în 3 pahare Erlenmeyer.
Se adaugă câte 3 picături de metiloranj și se titrează, cele trei probe paralele, până la
virajul indicatorului de la galben la portocaliu. CO 2 format în urma reacției se
îndepărtează prin fierberea probelor 2-3 minute. În cazul în care după răcirea probelor
culoarea a revenit la galben, se continuă titrarea până la portocaliu.

Din cele 3 volume de echivalență se face media aritmetică și se obține HCl . La

baza calcului stă relația:

HCl . FHCl = .

10 x FKHCO3
de unde FHCl = ————
HCl
Dozarea unei soluții de NaOH cu soluția de HCl 0,1 N cu factor cunoscut
În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml sol. NaOH, se adaugă câte 3
picături de metiloranj și se titrează cu soluție titrată de HCl 0,1 N până la virajul
indicatorului de la galben la portocaliu. Concentrația procentuală mixtă a soluției de
NaOH se exprimă în g/100 ml și se calculează în felul următor:

- se face media aritmetică a celor trei volume de echivalență și se obține HCl

- conform definiției concentrației normale, 1000 ml HCl 1 N conțin 1 EgHCl

- din ecuația reacției chimice NaOH + HCl = NaCl + H 2O rezultă că 1 EqHCl
reacționează cu 1 EqNaOH deci:
1000 ml HCl 1 N ............. 40 g NaOH
1000 ml HCl 0,1 N............ 4 g NaOH

HCl FHCl ................... x g NaOH

26
 x= - reprezintă g NaOH conținute în volumul sol. de
NaOH titrate (10 ml).
CNaOH%(m/v) = 10 • x, reprezintă concentrația procentuală mixtă a soluției de
NaOH.
Dozarea amoniacului prin diferență

Principiu:
Metoda directă de dozare a amoniacului cu o soluție titrată de HCl 0,1 N, în
prezență de metiloranj, este în general evitată datorită pierderilor de amoniac prin
desorbție. Este preferată metoda dozării amoniacului prin diferență. Soluția de amoniac
se tratează cu un volum de soluție titrată de HCl, ce conține un exces de acid și se
determină excesul de HCl prin titrare cu o soluție titrată de NaOH în prezență de
metiloranj. Reacțiile sunt următoarele:
NH3 + HCl = NH4Cl; NaOH + HCl = NaCl + H2O.
Reactivi: - Soluție de HCl 0,1N cu factor cunoscut
- Metilorange, soluție alcoolică 0,1%
Modul de lucru:
În trei flacoane Erlenmeyer se introduc câte 10 ml HCl 0,1 N, 5 ml soluție de
NH3, 1-2 picături de metiloranj și se titrează excesul de acid cu o soluție titrată de
NaOH 0,1 N până la virajul indicatorului de la roșu la portocaliu.
Calcul:
1000ml HCl 0,1 N ................……. 1,7 g NH3

vHCl FHCl - NaOH FNaOH ...........…x

x = g NH3/ 5 ml

vHCl FHCl - NaOH FNaOH = volumul teoretic de HCl, obținut pe cale

titrimetrică, ce conține cantitatea de HCl care a reacționat cu NH 3 din

probă; vHCl = 10 ml; NaOH 0,1 N = media aritmetică a volumelor de

echivalență obținute la titrarea celor 3 probe paralele.
Concentrația soluției de amoniac se exprimă în g/100 ml, adică C NH3 %(m/v) = 20 • x

27
 Titrarea unui acid slab cu o bază tare
Principiu:
La titrarea unui acid slab cu o bază tare se formează o sare hidrolizabilă. De
exemplu titrarea acidului lactic cu o soluție titrată de NaOH implică următoarele
procese chimice:

H2O H+ + OH -

Din ecuații reiese că anionii acidului slab, rezultați prin ionizarea completă a

sării, se combină cu H+ rezultați în urma procesului de disociere a H 2O . Astfel

descrește, iar  ceea ce determină reacția alcalină a soluției. La punctul

de echivalență soluția are un pH  7. În general, soluțiile apoase ale sărurilor acizilor
slabi cu baze tari sunt alcaline. Se alege acel indicator al cărui interval de viraj conține
valoarea pH-ului soluției sării hidrolizabile. În cazul de față este folosit indicatorul
fenolftaleină, al cărui interval de viraj este cuprins între 8-10 unități de pH. Așa cum se
vede în figura de mai jos, în care acidul slab este CH 3COOH, folosirea unui indicator cu

interval de viraj în mediul acid nu permite punerea în evidență cu precizie punctul de

echivalență al reacției

Aplicație: Dozarea acidului lactic cu o soluție titrată de NaOH

Reactivi: - Soluție NaOH 0,1N cu factorul cunoscut
- Soluție alcoolică de fenolftaleină 0,1%
Modul de lucru:

28
 În trei flacoane Erlenmayer se măsoară câte 10 ml soluție acid lactic, se adaugă
3-4 picături de fenolftaleină și se titrează cele trei probe cu o soluție titrată de NaOH 0,1
N, până la virajul indicatorului de la incolor la roz slab persistent cel puțin 20 de
secunde .
Concentrația acidului lactic se exprimă în procente mixte și se calculează în felul
următor:
1000 ml NaOH 0,1 N ............... 9 g acid lactic

FNaOH ............................ x
x = g/10 ml c% (m/v) = 10 • x

Titrarea unei baze slabe cu un acid tare

Principiu:
La titrarea unei baze slabe cu un acid tare se formează o sare hidrolizabilă, pH-ul
în punctul de echivalență fiind mai mic decât 7. În general soluțiile apoase ale sărurilor
acizilor tari cu baze slabe sunt acide. De exemplu titrarea unei soluții de NH 3 cu o
soluție titrată de HCl implică următoarele procese chimice:
NH3 + H2O NH4OH

+
NH4OH + H+ + Cl- NH4 + Cl- + H2O

H2O H+ + OH-

NH+4 + OH- NH4OH

Ionii OH- rezultați în urma procesului de disociere a H 2O au tendința de a

reacționa cu o parte din ionii de amoniu formați. Astfel descrește, iar 

ceea ce determină reacția acidă a soluției. La punctul de echivalență soluția are

un pH  7. Prin urmare se alege acel indicator al cărui interval de viraj conține pH-ul
soluției sării rezultate în urma titrării (NH 4Cl). În acest caz se poate folosi metiloranjul
(figura de mai jos).

29
 Titrările acizilor slabi cu baze slabe (și invers), nu produc variații bruște și mari
a pH-ului în jurul punctului de echivalență. De aceea ele sunt rar utilizate în titrimetria
acido-bazică.

Oxidimetria volumetrică

Date generale
În oxidimetrie toate reacțiile chimice au loc cu transfer de electroni, ele
denumindu-se oxido-reduceri sau reacții redox.
După reactivii utilizați oxidimetria se poate împărți în:
a) Permanganometria, care folosește drept componentă oxidantă KMnO4.
b) Iodometrie, în care ca reactiv se folosește I 2 sau I-, ca oxidant respectiv reducător,
după caz.
c) Alte procedee bromatometrie(KBrO3), cerimetrie (Ce(SO4)2), bicromatometrie
(K2Cr2O7), iodatometrie (KIO3) utilizează compușii precizați între paranteze ca
oxidanți.
Reacțiile redox pot fi utilizate în vederea unor dozări, dacă ele întrunesc anumite
condiții:
- să fie totale în sensul dorit ( adică să fie cantitative),
- să decurgă cu viteză mare, pentru ca deteminările să se efectueze într-un timp scurt,
- să se poată observa ușor punctul de echivalență, care arată sfârșitul reacției chimice.
Grupa metodelor volumetrice bazate pe reacții redox cuprinde procedee de
determinare cantitativă, care se realizează prin titrarea substanțelor reducătoare cu
oxidanți și a substanțelor oxidante cu reducători.
Majoritatea reacțiilor redox sunt reversibile, al căror echilibru dinamic poate fi
deplasat într-un sens sau altul în funcție de condițiile de lucru.
Ca în oricare altă metodă volumetrică și în oxidimetrie (titrimetria redox) se
urmărește atingerea punctului de echivalență care se poate indica vizual sau

30
instrumental. De exemplu, în permanganometrie, permanganatul de potasiu este o
substanță colorată ce poate să funcționeze ca indicator, fiindcă un mic exces de reactiv
produce o schimbare de culoare ușor sesizabilă. În cazul titrărilor iodometrice, la
punctul de echivalență poate să apară un exces de iod molecular sau să dispară acest
exces, ceea ce se poate indica cu ajutorul amidonului știut fiind că amidonul formează
cu I2 un complex violet intens colorat.

Permanganometrie

Principii:
Permanganatul de potasiu, KMnO4, este unul dintre oxidanții cei mai folosiți,
datorită potențialului de oxidare mare al sistemului MnO 4-/Mn2+. Oxidarea se poate
efectua atât în mediu acid cât și în mediu neutru sau alcalin. Puterea oxidantă a
permanganatului scade mult cu creșterea pH-lui soluției. Reacțiile care se petrec în
diferite medii sunt cele arătate mai înainte la calcularea echivalenților-gram ai KMnO 4.
Rescrierea simplificată a lor pune în evidență numărul de electroni acceptați de
o moleculă de oxidant:
- în mediu acid KMnO4 acceptă 5 electroni/moleculă:
MnO4- + 8H+ + 5e-  Mn 2+ + 4H2O;
- în mediu neutru sau aproape neutru se transferă 3 electroni:
MnO4-+ 4H+ + 3e-  MnO2 + 2H2O
- în mediu alcalin, acceptă un singur electron:
MnO4- + e-  MnO4 2-
Permanganatul de potasiu cristalin este de culoare violetă, aproape neagră.
Lumina, creșterea temperaturii, a diluării, a acidității sau a alcalinității soluției, prezența
corpilor străini mai ales în pulbere, accelerează descompunerea permanganatului. De
aceea soluțiile de KMnO4 se păstrează în soluție neutră, în sticle brune (la întuneric) și la
temperatura obișnuită.

Stabilirea factorului soluției de KMnO4 0,1N

Având în vedere instabilitatea KMnO 4 este necesară determinarea periodică a
factorului soluției de KMnO4 folosindu-se ca substanță etalon acidul oxalic.
Reactivi: - Soluție (COOH)2 0,1N cu factor cunoscut
- Soluție H2SO4 20%

31
 Modul de lucru:
În trei baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluție de acid oxalic 0,1N cu
factor cunoscut, se adaugă câte 10 ml H 2SO4 20%, se încălzește la 70-80C și se titrează
cu KMnO4 0,1N până la roz slab, persistent cel puțin 10 secunde.
Factorul soluției de KmnO4 se calculează după formula:
VKMnO4  F KMnO4 = V acid oxalic  F acid oxalic unde VKMnO4 este media aritmetică a volumelor de
echivalență a celor trei probe paralele.
Vacid oxalic • Facid oxalic
FKMnO4 = ———————
VKMnO4

Determinări permanganometrice în mediu acid

Permanganatul de potasiu în mediu puternic acid (H 2SO4 20%), la temperatura
de 70-80 C, se reduce la sarea manganoasă (MnSO 4) punând în libertate oxigen,
conform reacției cunoscute
2KMnO4 + 3H2SO4 = K2SO4 + 2MnSO4 +3H2O +5O
Reacția decurge autocatalitic deoarece ionii manganoși (Mn 2+ și Mn3+) formați în
primul moment catalizează reducerea în continuare a permanganatului de potasiu.
Decolorarea soluției se produce datorită faptului că MnSO 4 format este incolor în soluții
diluate.
Soluția acidă de permanganat servește în oxidimetrie, pentru dozarea
volumetrică a acidului oxalic, a apei oxigenate și a altor substanțe (acidului azotos, etc).
Sfârșitul titrării se recunoaște prin dispariția sau apariția culorii violete determinate în
soluție de ionul MnO4-.

Dozarea acidului oxalic (micrometodă)

Principiu:
Reacția titrimetrică este următoarea:
5(COOH)2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +10CO2 +8H2O
Reactivi: - Soluție H2SO4 20%
- Soluție KMnO4 0,01 N cu factor, FKMnO4, cunoscut
Modul de lucru:
În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 1 ml soluție de acid oxalic de dozat.
Se adaugă câte 1 ml H2SO4, 2 ml apă bidistilată și se încălzește până la 70-80C. Se

32
titrează cu KMnO4 0,01N până când soluția rămâne colorată în roz slab cel puțin 10
secunde.
Calcul
1000 ml KMnO4 0,01N reacționează cu 0,01 Eq-gram de acid oxalic= 0,45 g acid oxalic
V KMnO4 F KMnO4 ............................................................ x g acid oxalic
x g (COOH)2 ………...........................…………………… 1 ml soluție
c%(m/v) = 100•x
Această reacție nu se produce direct: o picătură de soluție de permanganat nu se
decolorează imediat când este adăugată într-o soluție conținând exces de acid oxalic și
sulfuric. Culoarea roz a soluției (datorată prezenței ionului MnO 4-) persistă, dispărând
numai după un anumit interval de timp deoarece reacția redox corespunzătoare are o
cinetică lentă până la formarea catalizatorului (Mn 3+). Apoi ionii Mn3+ se reduc la Mn+2,
care este un proces instantaneu. În ultima etapă manganul (II) format reacționează rapid
cu ionul MnO4- (VII), formându-se Mn (III) foarte reactiv care oxidează acidul oxalic,
finalul titrării fiind determinat de epuizarea (COOH) 2 din probă și apariția unui mic
exces de ioni MnO4- care colorează persistent soluția de titrat. Secvența de reacții ale
procesului autocatalitic este următoarea:
(1) Mn(VII) + (COOH)2 ------- Mn(III) +CO2 (lent)
(2) Mn(III) + (COOH)2 ------- Mn(II) + CO2 (instantaneu)
(3) Mn(II) + Mn(VII) --------- Mn(III) (rapid).
În stadiul inițial viteza reacției este controlată de etapa lentă (1). De îndată ce
concentrația ionilor Mn(II) devine apreciabilă, reducerea permanganatului poate să se
desfășoare rapid pe calea procesului (3). Spre finalul titrării culoarea MnO 4- dispare tot
mai greu datorită scăderii concentrației acidului oxalic. Reacția este accelerată în final,
ca și la început, prin încălzire la 70-80ºC .

Dozarea apei oxigenate (macrometodă)

Principiu:
Dozarea se poate face tot prin titrarea directă cu permanganat în soluție de acid
sulfuric. Apa oxigenată (peroxid de hidrogen) funcționează atât ca oxidant, după reacția:

H2O2+2H++2e-  2H2O; cât și ca reducător, după reacția: H2O2  2H++O2;

În soluție acidă permanganatul de potasiu este redus după reacția:

33
 5H2O2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +8H2O +5O2

Modul de lucru:
În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluție de apă oxigenată de
dozat. Se adaugă câte 10 ml H2SO4 20%. Se titrează cu soluție de KMnO4 0,1N cu
factor, FKMnO4, cunoscut până când soluția rămâne colorată în roz slab.

Calcul:
1000 ml KMnO4 0,1N sunt echivalenți cu ...................1,7 g apă oxigenată
V KMnO4 F KMnO4 ............................................................ x g apă oxigenată
x g H2O2………………………………………………… 10 ml soluție
c% (m/v) = 10•x

Complexometria volumetrică

Metodele complexometrice servesc la dozarea cationilor prin titrare cu soluția

agentului complexant. Prin metodele indirecte se pot doza complexometric și anioni,
precum și substanțele organice. Din numărul mare de reactivi unul frecvent folosit este
complexonul III (EDTA Na2) utilizat spre exemplu pentru titrarea ionilor Ca2+.

CH2 COO- 2-
CH2 COOH
N N CH2 C O
CH2 C O
CH2 CH2
O- Na+ + Ca2+ O
O- Na+
Ca + 2 Na+ + 2H+
CH2 CH2 O
CH2 C O
N CH2 C O
N
CH2 COOH
CH2 COO-

complexon III complexonat de

(etilendiamino-tetraacetatul disodic) calciu

Existența mai multor cicluri pentaatomice imprimă moleculei o mare stabilitate.

Stabilitatea complexului format este una din condițiile pe care trebuie să o îndeplinească
o reacție care stă la baza unei metode complexometrice. Stabilitatea se exprimă

34
cantitativ prin constanta de stabilitate K MY. Dacă notăm cu M ionul de metal și cu Y
agentul de complexare, reacția de complexare este următoarea:
M+Y MY
Constanta de stabilitate este exprimată prin relația:

Valoarea constantei de stabilitate depinde de natura complexului și de o serie de alți

factori, cum ar fi pH-ul soluției.
Indicatorii folosiți în complexometrie sunt indicatorii metalocromici, coloranți
organici, care formează complecși interni cu cationii metalici, de altă culoare decât
aceea a indicatorului liber.
Indicatorul trebuie să fie ales în așa fel încât stabilitatea complexului format de
el cu ionii de metal să fie mai mică decât stabilitatea complexului format agentul de
complexare cu ionii metalici. În tabelul de mai jos sunt prezentați principalii indicatori
metalocromici, cationii pentru care sunt folosiți și logaritmul constantelor de stabilitate
ale lor în mediile precizate.

Indicator
Cationi Mediu lg KMY
metalcromic
Eriocrom negru T Cd2+ NaClO4 0,3N 12,74
Co2+ - 20,00
Cu2+ NaClO4 0,3N 21,38
Mg2+ - 7,00

Pb2+ NaClO4 0,3N 13,19

NaClO4 0,3N 12,31
Zn2+

35
 Murexid Ca2+ - 2,68
Cu2+ - 3,50
Ni2+ KNO3 0,1N 3,36
Acid sulfosalicilic Al3+ NaClO4 0,2N 10,01
Cu2+ NH4ClO4 0,2N 9,04
Fe3+ 14,05
-
Ftaleincomplexon Ba, Sr, Ca
Xilenoloranj Be2+ NaClO4 3,92
Bi3+ NaNO3 0,2N 75,60
La3+ NaClO4 0,2N 11,67
Pb2+, Zn2+, - -
Hg2+, Sn2+ - -
Acid Ca2+ - -
calconcarbonic
Cromazurol S Al3+ KCl 0,2N 4,32
Cu2+ NaClO4 0,1N 4,10
Fe3+ KCl 0,1N 15,60
Ni2+ - 9,30
, `- Dipiridil Fe2+ KCl 0,1N 3,70
Zn2+ KCl 0,1N 4,35

Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometrică

(metoda Budesinsky)
Principiu :
Fosfatul cupric, greu solubil în apă, reacționează în mediu neutru cu aminoacizii
formând complecși de tipul chelaților. Un aminoacid monoamino-monocarboxilic
complexează ionii Cu2+ în raport de 2:1 formând un complex solubil în apă. Reacția este
următoarea:

COOH COO R
H H
6 HC NH2 +Cu3(PO4)2 3 HC N Cu N CH + 2PO43- + 6H+
R R H H
OOC

36
 Excesul de fosfat cupric nedizolvat se poate separa prin centrifugare sau filtrare.
Prin adăugare de HCl la filtrat se eliberează ionii cuprici din complex conform reacției:
COO
R COOH
H H
HC N Cu N CH + 2HCl Cu2+ + 2 Cl- + 2 HC NH2
H H
R R
OOC
Ionii cuprici eliberați se dizolvă prin titrare cu complexon III în prezența
indicatorului metalocromic piridilazonaftol (PAN). Reacția titrimetrică de complexare
este următoarea:
2-
CH2 COOH CH2 COO-
N N
CH2 C O
CH2 C O CH2
CH2 O
O- Na+
+ Cu2+ Cu + 2Na+ + H+
O- Na+ CH2
O
CH2 C
CH2 C O CH2 O
N N
CH2 COO-
CH2 COOH

Reactivi: - soluție complexon III 0,01N cu factor cunoscut

- soluție HCl 0,01N
- indicator PAN 0,1 % în soluție etanolică
- suspensie de Cu3(PO4)2
Modul de lucru:
În trei flacoane Erlenmeyer se pipetează câte 5 ml soluție aminoacid, 5 ml
suspensie agitată de Cu3(PO4)2, se agită bine și apoi se lasă 5 minute în repaos.
Amestecul se filtrează și din filtrate se pipetează câte 5 ml în trei flacoane Erlenmeyer
curate. Se adaugă către 1 ml soluție HCl, 3 picături indicator PAN și se titrează ionii Cu
2+
eliberați cu o soluție de complexon III 0,01 M până la virajul indicatorului de la roșu
violet la galben-verzui.
Calcul:
Dacă se cunoaște natura aminoacidului prezent se ia în calcul masa moleculară a
lui. Dacă este vorba de un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici
rezultatul se exprimă în mg N -aminic/100 ml sau mmoli N -aminic/l.
1000 ml sol. complexon III 0,01 M ....................0,01 2 14 g N

37
 FComplexon III ................................... .............................. x

x = .......g/ 2,5 ml c% (m/v) = 40 • x

Dozarea clorurilor prin metoda Volhard

Principiu:
Dozarea indirectă a ionului de clor după Volhard constă în următoarele etape. La
soluția de analizat, acidulată cu HNO3, se adaugă în exces o soluție titrată de AgNO3.
Are loc reacția:
AgNO3 + Cl¯ = AgCl + NO3¯ Excesul de azotat de argint se titrează cu sulfocianură în
prezență de Fe3+ ca indicator. AgNO3 + SCN¯ = AgSCN + NO3¯
Modul de lucru:
În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluție care conține ionii de Cl¯,
se adaugă 20 ml soluție 0,01N de azotat de argint 10 ml acid azotic 10% se aduce la
fierbere, se adaugă 2 ml alaun feric 20%. Se titrează cu o soluție 0,01 N de NH 4SCN
agitând puternic, până la roz slab, persistent timp de 5 – 10 secunde.
Calcul:
Rezultatul se va exprima în mM/l. Fiind vorba de o titrare prin diferență,
raționamentul este identic cu cel din cazul determinării amoniacului.

Identificarea glucidelor

Reacții de reducere
Reacțiile de reducere nu sunt specifice doar glucidele reducătoare, ele fiind date
și de alte substanțe neglucidice cu caracter reducător. Caracterul reducător al
monozaharidelor și a unor dizaharide este datorat prezenței în molecula lor a funcțiunii
carbonilice, care se poate oxida, reducând la cald și în mediu alcalin cationii metalelor
grele: Cu, Ag, Bi, precum și unele substanțe organice ca acidul picric, indigoul, etc.

1. Reacția Fehling

38
 Principiu:
Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce la cald Cu 2+ până la Cu+ din
complexul solubil format în mediu alcalin cu sarea Seignette (tartrat dublu de sodiu și
potasiu). Se formează Cu2O, pulbere de culoare roșie-cărămizie, conform reacțiilor:
CuSO4 + 2KOH → Cu(OH)2 + K2SO4
C6H12O6 + 2 Cu(OH)2 → C6H12O7 + Cu2O + 2 H2O
acid gluconic
Reactivi: - Reactivul Fehling se obține în urma amestecării soluției I și II în
volume egale, operație ce se desfășoară în momentul
întrebuințării.
- Soluția I: CuSO4 35 g/1000 ml soluție
- Soluția II: 150 g sare Seignette și 90 g NaOH la 1000 ml soluție
- Soluții 2% de glucoză, fructoză, lactoză.
Modul de lucru:
Se amestecă într-o eprubetă 1 ml reactiv Fehling I cu 1 ml reactiv Fehling II se
adaugă 2 ml soluție de glucid și se încălzește până la fierbere agitând continuu. În
prezența unui glucid reducător se formesază un precipitat roșu-cărămiziu de Cu2O.

2. Reacția Benedict
Principiu:
Glucidele reducătoare reduc la cald în mediu alcalin hidroxidul de cupru de
culoare albastră în oxid de cupru (I) de culoare roșie-cărămiziu. Reacția Benedict
prezintă avantajul că se folosește un singur reactiv, ionul de Cu 2+ fiind complexat în
soluție de către citratul de sodiu.
Reactivi: - Reactivul Benedict: 173 g citrat de sodiu și 100 g Na 2CO3
anhidru se dizolvă în 800 ml H 2O distilată fierbinte, se filtrează și
se aduce volumul la 850 ml. Se dizolvă separat 17,3 g CuSO 4• 5
H2O în 100 ml H2O distilată, se adaugă sub agitare primei soluții
și se completează volumul soluției finale la 1000 ml.
- Soluții 2% de glucoză, fructoză, lactoză.
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluție de glucid și 3 ml reactiv Benedict, se
încălzește până la fierbere agitând continuu. Apariția unui precipitat roșu-cărămiziu
implică existența în soluție a glucidului reducător.

39
 3. Reacția Tollens
Principiu:
Glucidele reducătoare reduc la cald Ag+, din azotatul de argint amoniacal, la Ag
metalic care se depune pe pereții eprubetei sub forma unei oglinzi (oglinda de argint),
conform reacțiilor:
AgNO3 + NaOH → AgOH + NaNO3
AgOH + 2 NH3 → [Ag(NH3)2]OH
C6H12O6 + 2 [Ag(NH3)2]OH → C6H12O7 + 2 Ag + 4NH3 + H2O
Reactivi: - soluție AgNO3 5% în apă distilată
- soluție NH4OH 20%
- soluții 2% de glucoză, fructoză, lactoză.
Modul de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 1 ml AgNO3, se adaugă picătură cu picătură soluție
de amoniac până la dizolvarea precipitatului format inițial. Se adaugă 1 ml soluție
glucidică și se introduce eprubeta într-o baie de apă încălzită la fierbere. În cazul
existenței unui glucid reducător în soluția glucidică se formează oglinda de argint.
Încălzirea eprubetei se poate face și direct la flacără sub agitare blândă.
4. Reacția Nylander
Principiu:
Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce azotatul de bismut în bismut
metalic de culoare neagră.
Reactivi: - Reactivul Nylander: 20 g azotat bazic de bismut, 40 g sare
Seignette și 100g NaOH se dizolvă în apă pentru 1000 ml soluție.
- Soluții 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Modul de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluție glucidică și 1 ml reactiv Nylander, se
încălzește până la fierbere agitând continuu. În prezența unui glucid reducător în soluție
apare un precipitat negru-brun.

5. Reacția Barfoed

40
 Principiu:
Reacția Barfoed permite diferențierea monozaharidelor reducătoare, pentru care
reacția este pozitivă, de dizaharidelor reducătoare pentru care reacția este negativă.
Principiul reacției constă în reducerea în mediu acid a ionilor de Cu 2+ la Cu+ din Cu2O,
care se depune pe fundul eprubetei sub forma unui precipitat roșu-cărămiziu. De fapt
reacția este potrivită atât pentru monozaharide cât și pentru dizaharide reducătoare.
Diferența constă în vitezele de reacție foarte diferite: mari pentru monozaharide; mici
pentru dizaharidele reducătoare.
Reactivi: - Reactivul Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolvă în 200 ml
H2O distilată, se filtrează și se adaugă 1,8 ml acid acetic glacial.
- Soluții 2% de glucoză, fructoză
Modul de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluție glucidică și 2 ml reactiv Barfoed, se
încălzește până la fierbere agitând continuu timp de 1-2 minute. Apariția unui inel de
precipitat roșu-cărămiziu la suprafața soluției și depunerea de precipitat roșu-cărămiziu
pe fundul eprubetei pune în evidență prezența monozaharidelor.

6. Reacția cu acidul picric

Principiu:
Glucidele reducătoare reduc una din grupările nitro ale acidului picric (de
culoare galbenă) la grupare amino, cu formare de acid picramic (de culoare brun-roșie).

Această reacție poate servi la dozarea colorimetrică a glucidelor reducătoare (metoda

Crecelius-Seifert).
Reactivi: - acid picric 0,5%
- glucoză 1%
- NaOH 10%

41
 Modul de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluție de glucoză, 2 ml acid picric și 1 ml
NaOH. Se încălzește până la fierbere, agitând continuu până la apariția unei colorații
roșii-brune.

Reacții de culoare
Reacțiile de culoare sunt specifice monozaharidelor care sub acțiunea acizilor
minerali concentrați se deshidratează și se transformă în furfurol sau în derivați ai lui.
H H
HO - C - C - OH
CHO
H2C CH - CHO
3 H2O O
O O
H H
furfurol
pentoză

H H
HO - C - C - OH
HO - H2C - CHO
HO - CH2 - HC CH - CHO
3 H2O O
O O
H H
hidroximetil - furfurol
hexoză

Furfurolul și derivații lui pot reacționa cu fenolii, în urma reacției rezultând

compuși colorați.

1. Reacția Molisch

Principiu:
În prezența acidului sulfuric concentrat, monozaharidele (pentozele, hexozele) se
transformă în furfurol (hidroximetil furfurol) care reacționează cu -naftolul în raportul
1:2 formând produși de condensare de culoare violetă. Această reacție o dau la cald
toate glucidele deorece, sub acțiunea H2SO4 conc. ele hidrolizează punând în libertate
monozaharidele.

42
 OH

H
R CHO +
H
O H2O

OH
OH

R CH
O

OH

Reactivi: - reactivul Molisch: soluție alcoolică 5% de alfa-naftol

- H2SO4 conc.
- soluție de glucoză 1%

Modul de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluție glucoză 1%, se adaugă 1-2 picături din
soluția de alfa-naftol și apoi se toarnă cu precauție pe peretele înclinat al eprubetei
H2SO4 conc. La suprafața de contact a celor două straturi de lichide cu densități diferite
se formează un inel violet.

2. Reacția Bial
Principiu:
Reacția Bial servește la identificarea pentozelor, pentru care reacția este
pozitivă, față de hexoze, ea fiind negativă.
În prezența acizilor minerali tari, pentozele reacționează cu orcina (5-metil-
rezorcina) formând produși de condensare de culoare violetă sau albastru-verde în
funcție de natura acidului folosit.
Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcină se dizolvă în 200 ml alcool etilic 96%
și se adaugă 40 picături sol. FeCl3 10%
- HCl conc.

43
 - soluție 1% de fructoză, arabinoză, glucoză
Modul de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 2 ml sol. de pentoză, iar în altă eprubetă 2 ml soluție
de glucoză. Se adaugă în fiecare eprubetă 10 picături reactiv Bial și câte 2 ml HCl conc.
Se agită conținutul eprubetelor, se astupă cu dopuri de vată și se lasă într-o baie de apă
ce fierbe timp de 10 minute. Conținutul eprubetei în care se găsește soluția de pentoză
devine albastru-verzui.

3. Reacția Seliwanoff
Principiu:
Reacția Seliwanoff servește la diferențierea cetozelor de aldoze. Monozaharidele
în prezența HCl conc. reacționează cu rezorcina (sau alți polifenoli) formând produșii
de condensare colorați. Reacția este mai rapidă și mai intensă în prezența cetozelor,
când se obțin produși colorați în roșu decât în prezența aldozelor, când se obțin produși
colorați în roz deschis.
Reactivi: - reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcină, 100 ml HCl conc., 200
ml H2O distilată.
- soluție de fructoză, glucoză 2%
Modul de lucru:
Într-o eprubetă se introduce 1 ml soluție fructoză și în altă eprubetă 1 ml soluție
de glucoză. Se adaugă în ambele eprubete câte 2 ml reactiv Seliwanoff și se încălzesc
probele până la fierbere. După răcire, conținutul eprubetei cu fructoză se colorează în
roșu, iar a celei cu glucoză în roz slab.

Reacția cu fenilhidrazina

Reacția este specifică glucidelor reducătoare și are ca rezultat formarea

osazonelor. Osazonele diferitelor glucide se deosebesc între ele prin structura cristalină
ceea ce determină imagini microscopice diferite, așa cum se vede în figura de mai jos.
De asemenea ele se deosebesc prin solubilitate, puncte de topire.

44
 Principiu:
Reacția glucidelor reducătoare cu fenilhidrazina decurge în două etape:
- la rece, se formează fenilhidrazina
- la cald, în prezența unui exces de reactiv, se formează osazona specifică
glucidului folosit. Cetonele reacționează ca și aldozele. Prin RMN s-a
dovedit că osazonele au o structură chelatică ciclică.
Reactivi: - fenilhidrazină solidă
- CH3COONa •H2O
- acid acetic glacial
- soluții 10% de glucoză, lactoză, maltoză

Modul de lucru:
Se introduc câte 5 ml soluție de glucoză, lactoză și maltoză în câte o eprubetă, se
adaugă 0,5 ml acid acetic glacial, puțină fenilhidrazină și o cantitate dublă de acetat de
sodiu. Se agită și se introduc eprubetele într-o baie de apă la fierbere timp de 1/2 de oră.
După răcire apar cristalele galbene specifice, care se vor examina la microscop, punând
1-2 picături din fiecare probă pe o lamelă de sticlă.

45
 H H

C =O C = N - NH - C 6H5
+ H2N - NH - C 6H5
HC - OH fenilhidrazină HC - OH
H2O
R R
fenilhidrazonă
glucid
reducător

C = N - NH - C 6H5
+ H2N - NH - C 6H5
H-C - OH
NH3
R C 6H5 - NH2
H

C = N - NH - C 6H5

C =O

C = N - NH - C 6H5
+ H2N - NH - C 6H5
C =O fenilhidrazină
H2O
R

C = N - NH - C 6H5

C = N - NH - C 6H5

osazonă

Identificarea dizaharidelor
Dizaharidele pot fi reducătoare - maltoză, lactoză sau nereducătoare - zaharoza.
După o prealabilă hidroliză a legăturii glicozidice și cele nereducătoare vor da reacțiile
caracteristice de reducere și culoare ale monozaharidelor.

46
 Reactivi: - reactiv Benedict
- reactiv Barfoed
- acid clorhidric 10%
- hidroxid de sodiu 10%
- soluții 2% de zaharoză, lactoză, maltoză
Modul de lucru:
Se introduc câte 2 ml soluție maltoză, zaharoză și lactoză în câte o eprubetă, se
adaugă 2 ml reactiv Benedict și se încălzesc soluțiile pănâ la fierbere. Reacția este
pozitivă în cazul maltozei și a lactozei care sunt dizaharide reducătoare. Într-o altă
eprubetă se introduc 2 ml zaharoză, 3 picături HCl 10% și se aduce soluția la fierbere.
După răcire se neutralizează cu 3 picături de NaOH 10%, se adaugă apoi 2 ml reactiv
Benedict și se încălzește din nou la fierbere. Reacția va fi pozitivă pentru că în urma
hidrolizei au rezultat două monozaharide reducătoare.

Identificarea polizaharidelor
Principiu:
Polizaharidele cu importanță biologică - amidonul, dextrinele, glicogenul -
formează cu iodul la rece combinații colorate diferit:
- amidonul cu iodul - albastru
- dextrinele cu iodul - brun-roșu clar
- glicogenul cu iodul - cărămiziu opalescent
Aceste combinații sunt termolabile, la cald culoarea dispare și reapare la răcire
ceea ce sugerează termodisocierea lor.
Reactivi: - soluție apoasă de iod: se amestecă 0,2 g I 2 cu 1 g KI și 2 ml apă
distilată. După dizolvare se completează la 100 ml cu apă
distilată.
- soluții 2% de amidon, dextrine, glicogen
Modul de lucru:
Se introduc câte 2 ml soluție amidon, dextrină, glicogen în câte o eprubetă. Se
adaugă apoi 1-2 picături soluție de iod și se observă culorile obținute. Se verifică
dispariția culorilor prin încălzirea eprubetelor și reapariția lor la răcire.

47
 Identificarea glucidelor

1. Reacția cu iod

incolor roșu-brun albastru

amidon
monozaharide clar opalescent
dizaharide dextrine glicogen
sol.fără glucid

2. Reacția Benedict (sau Fehling)

pozitivă negativă
glucid reducător glucid nereducător
soluție fără glucid

3. Reacția Barfoed

pozitivă negativă 3'.Hidroliză acidă

monozaharid dizaharid

4.Reacția Bial 4".Reacția de formare a osazonelor

4'.Reacția Benedict
pozitivă negativă maltosazona lactosazona
pentoze hexoze

pozitivă negativă
zaharoza sol.fără glucid

5. Reacția Selivanov

pozitivă negativă
fructoză glucoza

48
 Identificarea aminoacizilor și proteinelor
Reacții de culoare
Reacțiile de culoare nu sunt specifice moleculei proteice ca un tot, ci sunt date
de prezența în molecula proteică a unor componente structurale, cum ar fi legăturile
peptidice în cazul reacției biuretului sau prezența unor anumiți aminoacizi în cazul
celorlalte reacții.

Reacția biuretului
Principiu:
Substanțele care conțin legături peptidice (începând cu tripeptidele) reacționează
cu Cu2+ în soluție puternic alcalină dând o colorație caracteristică violetă, purpurie,
datorită formării unui complex colorat în care ionul Cu 2+ este unit prin legături
coordinative cu heteroatomi ai aminoacizilor angajați în legătura peptidică. Această
reacție se folosește și pentru dozarea substanțelor proteice prin metodă
spectrofometrică.
Simbolizând cu Ri respectiv Ri+1 radicali ai aminoacizilor legați prin legătura
peptidică, această legătură se poate reprezenta în felul următor:

Cel mai simplu compus care dă această reacție este biuretul, de unde și numele
reacției. Formula biuretului este:

Reactivi: - Sol. CuSO4 1%

- Sol. NaOH 10%
Mod de lucru:
La 1-2 ml soluție de cercetat se adaugă un volum egal de NaOH și 3-5 picături
de soluție de CuSO4. Se obține o colorație albastră - violetă, fotometrabilă.

49
 Reacția ninhidrinei
Principiu:
Ninhidrina (tricetohidrindenhidrat) reacționează cu aminoacizii în soluție
apoasă, neutră sau slab alcalină și la cald, cu formarea unui compus colorat. Colorația
variază pentru diverșii aminoacizi de la roz, roșu la albastru-violet (purpura lui
Ruhemann) și este galbenă pentru prolină, galben-brun pentru hidroxiprolină. Această
reacție este dată nu numai de aminoacizi, ci și de peptide și proteine. Reacția cu
ninhidrină este una din reacțiile generale folosite pentru identificarea și dozarea
aminoacizilor în special la metoda cromatografică.
Reactiv: - Sol. de ninhidrină 0,1% cu adaos de piridină.
Mod de lucru:
La 2-3 ml soluție de cercetat se adaugă 0,5 ml soluție de ninhidrină, se încălzește
soluția la fierbere cca 30 secunde, apoi se răcește. Se observă formarea unei colorații
albastru-violet (fiindcă se lucrează cu un amestec de aminoacizi).
Reacția xantoproteică
Principiu:
Această reacție este caracteristică aminoacizilor aromatici. Astfel fenilalanina,
tirozina, triptofanul dau o colorație galbenă la încălzire cu acidul azotic concentrat.
Reacția este datorată nitrării nucleului benzenic, respectiv imidazolic. Se poate da ca
exemplu reacția fenilalaninei cu acidul azotic:

Reactivi: - HNO3 conc.

- Sol. NaOH 5%

50
 Mod de lucru:
La 1 ml soluție de cercetat se adaugă câteva picături de HNO 3 concentrat. Apare
un precipitat alb sau o tulburare. După fierberea conținutului 1-2 minute apare o culoare
galbenă. La fierbere precipitatul se poate dizolva parțial sau complet. Dacă după răcire
soluția se alcalinizează, culoarea se intensifică, se schimbă în galben portocaliu.
Apariția petelor galbene pe piele în urma acțiunii acidului azotic concentrat se explică
tot prin reacția xantoproteică.
Reacția Adamkiewicz-Hopkins-Cole (reacția triptofanului)
Principiu:
Triptofanul (aminoacid care se găsește în aproape toate proteinele) dă cu acidul
glioxilic (OHC-COOH) o colorație violetă. Se folosește ca reactiv acidul acetic glacial,
care conține ca impuritate acid glioxilic.
Reacția este specifică nucleului indolic, astfel produșii obținuți prin
descompunerea triptofanului (indolul și derivații săi) dau și ei reacția pozitivă.
Reactivi: - Acid acetic glacial
- Acid sulfuric concentrat
Mod de lucru:
La 2 ml soluție de cercetat se adaugă 2 ml acid acetic glacial, se amestecă și se
introduc pe fundul eprubetei 2 ml H 2SO4 concentrat. La suprafața de separație se
formează un inel violet. Reacția se folosește în laboratoarele clinice pentru diferențierea
meningitei tuberculoase de meningitele de altă etiologie, această reacție fiind pozitivă
numai din lichidul cefalo-rahidian al pacienților cu meningită tuberculoasă. Meningita
este inflamația membranelor care învelesc creierul și măduva spinării.

Reacția tioaminoacizilor (reacția cisteinei, cistinei)

Principiu:
Prin fierberea unei soluții alcaline conținând tioaminoacizi sau proteine ce
conțin în moleculă aminoacizi cu sulf, sulful se eliberează ca sulfură de sodiu (Na 2S).
Sulfura de sodiu rezultată se tratează cu acetat de plumb și se formează un precipitat
negru-brun de sulfură de plumb.
Reactivi: - Sol. de NaOH 30%
- Sol. de acetat de plumb 10%

51
 Mod de lucru:
La 1 ml soluție de cercetat se adaugă același volum de NaOH 30% și se fierbe 3-
5 minute. După fierbere se adaugă 1-2 ml soluție de acetat de plumb și se fierbe din nou.
Se obține un precipitat sau numai o colorație brun-neagră.

Reacția Pauli (reacția histidinei și tirozinei)

Principiu:
Tirozina, histidina și proteinele conținând acești aminoacizi, formează prin
cuplare cu acidul diazobenzensulfonic, un colorant azoic roz care se intensifică la roșu
prin alcalinizare. Sinteza sării de diazoniu are loc prin reacția:

Reacția de cuplare este următoarea (se ia în considerare și alcalinizarea):

SO3-
Sarea de diazoniu + tirozină + NaOH

N
Reactivi: - Sol. de acid sulfanilic 1% în HCl 10%

Col
CH2
ora
I
- Sol. de NaNO2 5%
- Sol. de Na2CO3 30% sau NaOH 10%

52
 Mod de lucru:
Se diazotează 1 ml soluție de acid sulfanilic adăugând 1 ml soluție de nitrit de
sodiu. Se amestecă acidul diazobenzensulfonic obținut cu 1 ml soluție de cercetat și
după neutralizare cu 3-4 ml soluție de Na2CO3 (sau câteva picături de NaOH) se obține
o colorație roșie.

Reacția Sakaguchi (reacția argininei)

Principiu:
Soluțiile care conțin substanțe cu radicalul guanidinic în moleculă, dau în mediu
alcalin în prezența alfa-naftolului și a hipocloritului sau hipobromitului de sodiu
combinații colorate în roșu.
Reactivi: - Soluție de hipoclorit de sodiu
- Soluție alfa-naftol: se dizolvă 0,1 g alfa-naftol în aprox. 25 ml
alcool etilic și se diluează cu apă la 100 ml.
- Soluție de NaOH 10%
Mod de lucru:
Se ia într-o eprubetă 1 ml soluție proteică diluată și se alcalinizează cu 1 ml
soluție NaOH 10%. Se adaugă 1 ml soluție alfa-naftol și soluția de hipoclorit de sodiu
picătură cu picătură până la apariția unei culori vișinii. Culoarea dispare la cald.

Reacții de precipitare ale proteinelor

Principiu:
Proteinele sunt precipitate de acizi minerali (H 2SO4, HNO3, HCl) sau organici
(acid tricloracetic, tanic, ferocianic, sulfosalicilic), soluții concentrate de săruri (sulfat
de sodiu, sulfat de amoniu, etc.), alcooli (metanol, etanol, etc.), acetonă, ioni de metale
grele (săruri de argint, mercur, cupru, plumb), încălzire. Precipitarea poate fi reversibilă
sau ireversibilă.

Precipitarea salină
Principiu:
Proteinele sunt macromolecule hidratate în soluție apoasă. Dacă sărurile
metalelor ușoare sau de amoniu (sulfat de amoniu, sulfat de sodiu, clorură de sodiu,

53
sulfat de magneziu) adăugate soluțiilor proteice ating o anumită concentrație,
deshidratează particulele proteice, care precipită. Precipitatul de proteină obținut prin
precipitare salină poate fi redizolvat prin micșorarea concentrației sării (prin dializă,
diluare), deci este o precipitare reversibilă.
Deoarece proteinele precipită la concentrații diferite de săruri, precipitarea salină
(salting-out) poate fi folosită și pentru fracționarea proteinelor. Astfel globulinele
precipită în soluții semisaturate de sulfat de amoniu, iar albuminele numai în soluții
saturate de sulfat de amoniu.
Reactivi: - Sol. de proteină (ser sanguin uman, bovin sau cabalin)
- Sol. saturată de (NH4)2SO4
- (NH4)2SO4 solid
- NaCl solid
- MgSO4 solid
- Acid acetic glacial
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se toarnă 3 ml soluție de proteină. Se adaugă același volum de
soluție saturată de sulfat de amoniu. Astfel obținem o soluție semisaturată de
(NH4)2SO4. După câteva minute precipită globulinele. Precipitatul se separă prin filtrare.
Filtratul conține albuminele. Se pune în filtrat sulfat de amoniu solid până la saturare
(când noi cantități de sare nu se mai solvă). În această soluție vor precipita albuminele.
În două eprubete se toarnă câte 3 ml soluție de proteină. Într-una din eprubete se
adaugă NaCl, în cealaltă MgSO4, până la saturare. După câteva minute în ambele
eprubete precipită globulinele. Precipitatul se filtrează. Filtratul conține albuminele
deoarece sărurile adăugate nu precipită albuminele în soluție neutră. Filtratul se
acidulează cu câteva picături de acid acetic glacial. În această soluție slab acidă
precipită albuminele.

Precipitarea cu ionii metalelor grele

Principiu:
Proteinele cu sărurile metalelor grele (plumb, cupru, mercur, argint, etc.)
formează combinații greu solubile. Precipitarea se produce deja la concentrații mici de
săruri și precipitatul obținut în acest caz nu se mai dizolvă după micșorarea
concentrației sării prin diluare sau dializă, deci este o precipitare ireversibilă.

54
 Reactivi: - Sol. de HgCl2 10%
- Sol. de CuSO4 10%
- Sol. de Pb(CH3COO)2 10%
- Sol. de AgNO3 5%
Mod de lucru:
În 4 eprubete se toarnă câte 1 ml soluție de proteină. În fiecare eprubetă se
adaugă picătură cu picătură soluție din fiecare reactiv. În toate eprubetele se formează
precipitate. Acetatul de plumb și sulfatul de cupru nu trebuiesc adăugate în exces,
deoarece precipitatul format se solvă în exces de reactiv (salting-in).

Precipitarea cu acizii minerali

Reactivi: - HNO3 conc.
- HCl conc.
- H2SO4 conc.
Mod de lucru:
În 3 eprubete se toarnă câte 1 ml de acid azotic, clorhidric respectiv sulfuric. În
fiecare eprubetă se stratifică cu precauție câte 1 ml din soluția de proteină. La suprafața
de separare dintre cele două soluții se obțin precipitate albe sub formă de disc (inel).
Apoi eprubetele se agită. Precipitatele formate se dizolvă în exces de acid clorhidric și
sulfuric, dar nu și în exces de acid azotic. Precipitarea proteinelor cu acid azotic
concentrat servește pentru punerea în evidență a proteinelor din urină patologică.

Precipitarea cu acizi organici

Acidul tricloracetic și acidul sulfosalicilic sunt reactivii specifici pentru
precipitarea proteinelor. Acidul tricloracetic este foarte adecvat pentru deproteinizarea
lichidelor biologice (de ex. ser sanguin), deoarece precipită numai proteinele din soluție,
nu și produșii de degradare ai acestora. Se mai folosește ca precipitant amestecul de acid
picric cu acid citric (reactiv Esbach), util în determinarea cantitativă a proteinelor.
Reactivi: - Sol. de acid sulfosalicilic 20%
- Sol. de acid tricloracetic 10%
- Sol. de acid picric 1,2%
Mod de lucru:
Într-o eprubetă la 1-2 ml soluție de proteină se adaugă câteva picături de reactiv.
Se formează un precipitat abundent.

55
 Precipitarea prin încălzire
Principiu:
Proteinele la încălzire coagulează. Coagularea este cea mai rapidă la punctul
izoelectric. În mediu puternic acid sau bazic proteinele nu coagulează la încălzire,
deoarece sarcina electrică le conferă o mai mare stabilitate în stare dizolvată.
Reactivi: - Sol. de CH3COOH 1%
- Sol. de CH3COOH 10%
- Sol. de NaOH 10%
- NaCl crist.
Mod de lucru:
În 5 eprubete se toarnă câte 1-2 ml soluție de proteină. Se adaugă reactivi
conform tabelului.

Nr. eprubetei Adaos

1. …………………………. -
2. …………………………. 2-3 pic. acid acetic 1%
3. …………………………. 10-15 pic. acid acetic 10%
4. …………………………. 10-15 pic. acid acetic 10% + NaCl (câteva cristale)
5. …………………………. 10-15 pic. NaOH 10%

Aceste eprubete se supun încălzirii și se observă apariția precipitatelor.

Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Sörensen

Principiu:
Aminoacizii au o structură amfiionică. Din această cauză soluțiile lor, datorită
capacității de tamponare, micșorează saltul de pH la adaosul de acid sau bază sare. În
consecință aminoacizii nu pot fi titrați prin metode acidimetrice sau alcalimetrice
curente.
Adăugându-se soluției de aminoacid un exces de formaldehidă, se blochează
gruparea amoniu. Rezultă o bază Schiff, care se comportă ca un acid slab (carboxilic).
Aciditatea grupării carboxilice se titrează cu NaOH, în prezența fenolftaleinei ca
indicator.

- - +
R - CH - COO + H2C = O R - CH - COO + H2O + H
I I

56
 +
NH3 N = CH2
Bază Schiff

- + - +
R - CH - COO + H + NaOH R - CH - COO Na + H2O
I I
N = CH2 N = CH2

Reactivi: - Sol. de NaOH N/10 cu factorul FNaOH

- Fenolftaleină 0,1% în soluție alcoolică
- Formaldehidă (substanța este foarte reactivă, se autooxidează,
deci conține și acid formic ca impuritate. Prezența acestui acid ar
da eroare la titrare. Din acest considerent formaldehida este
alcalinizată cu NaOH în prezență de fenolftaleină până la virajul
indicatorului).
Mod de lucru:
În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10,0 ml soluție probă de aminoacid
(pH  6). Trebuie adusă și această soluție la pH = 9, de aceea se pun câte 3 picături de
fenolftaleină și se adaugă picătură cu picătură sol. de NaOH până la apariția culorii roz.
Acest volum de NaOH folosit nu se ia în considerare la calcul. În fiecare balon se
adaugă câte 2 ml soluție de formaldehidă, sub acțiunea căreia soluția devine acidă (pH 
3). Astfel dispare culoarea roz, soluția devenind incoloră. Fiecare soluție se titrează cu
soluție de NaOH până la virajul indicatorului. Variațiile de pH sunt reprezentate pe
următoarea schemă:

57
Calcul:
Întrucât se lucrează cu un aminoacid oarecare monoamino-monocarboxilic sau
cu un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici, nu putem folosi greutatea
moleculară la calcul. Din acest considerent rezultatul se exprimă în mg % azot alfa-
aminic sau în mmoli N aminic/l. Dacă volumul mediu de titrare a probelor se notează cu
Vm, calculul este următorul:
1 ml NaOH 0,1 N . . . . . . . . . . . .1,4 mg N aminic
Vm  FNaOH . . . . . . . . . . . . . . X mg . . . . . . 10 ml probă

58
 Y mg . . . . . .100 ml probă
100
Y = 10  X mg N % =  X mmoli N aminic/l.
14

Identificarea nucleoproteinelor
Principiu:
Scheletul structural al acizilor nucleici este construit din baze azotate, pentoze și
acid fosforic. Prin hidroliză acidă aceste aceste subunități se eliberează și pot fi puse în
evidență
Reactivi: - Sol de H2SO4 5%
- Sol. de NH3 10%
- HNO3 conc.
- Sol. de molibdat de amoniu
- Sol. amoniacală de AgNO3
- Reactiv Bial
- HCl conc.
Modul de lucru:
a) Hidroliza: într-un balon cu fund rotund se introduc 5-10 g drojdie de bere, la
care se adaugă 40 ml H2SO4 5%. Se astupă balonul cu un dop prevăzut cu un refrigerent
ascendent și se fierbe 60-90 minute. O parte din hidrolizat se filtrează și se împarte în 3
eprubete în care se identifică părțile componente ale acizilor nucleici.
b) Identificarea pentozelor: în prima eprubetă se adaugă 10 picături reactiv Bial
și 2 ml HCl conc. Se agită conținutul eprubetei se astupă cu un dop de vată și se lasă pe
o baie de apă ce fierbe timp de 10 minute. Conținutul eprubetei se colorează în albastru
verde.
c) Identificarea H3PO4: In a doua eprubetă se adaugă soluție de NH 3 până la
reacția slab alcalină, apoi câteva picături de HNO 3 conc., 1 ml soluție de molibdat de
amoniu. La încălzire se obține un precipitat galben de fosfomolibdat de amoniu.
d) Identificarea nucleobazelor: în a treia eprubetă se adaugă soluție de NH 3 până
la reacția alcalină, se filtrează și se adaugă cca. 1 ml soluției amoniacală de AgNO 3.
După câtva timp se formează un precipitat floconos galben-brun de săruri ale bazelor
purinice. Identificarea bazelor purinice din hidrolizat se poate face și cu ajutorul reacției

59
murexidului. Murexidul este un colorant provenit din produsul de oxidare cu HNO 3
conc. a bazelor purinice și amoniac.
Modul de lucru:
1-2 picături din soluția de analizat se usucă pe o placă de porțelan pe baie de
apă. Cu baghetă se adaugă o picătură de HNO3 conc. După evaporare se atinge cu o
baghetă înmuiată în amoniac. Apare o colorație roșie care se schimbă spre albastru
violaceu când se adaugă o picătură de NaOH.

Vitamine

Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografică

Principiu:
Cromatografia este o metodă fizico-chimică de separare a componenților unui
amestec, care utilizează fenomenele ce au loc la interfața a două faze. Ea poate fi
folosită în scopuri analitice sau preparative. Pe suprafața dintre două faze dintre care
una este staționară (faza solidă sau lichidă adsorbită pe un material poros) și una
mobilă (solvent lichid sau gaz) pot avea loc fenomene de adsorbție, schimb de ioni sau
partiție între două faze lichide nemiscibile.
Faza staționară la cromatografia în strat subțire este constituită dintr-un strat de
silicagel sau oxid de aluminiu în stare dispersă depus pe o lamă de sticlă. Developarea
se face cu un solvent apolar (benzen, toluen, petrol) sau un amestec de solvenți apolari.
Dacă substanțele cromatografiate sunt incolore, decelarea petelor (spoturilor)
formate pe placa cromatografică se face cu ajutorul unor reactivi care dau reacții de
culoare cu substanțele amintite.
Identificarea componenților se poate face:
- prin decuparea spoturilor și analiza lor ulterioară prin metode chimice sau fizice.
- prin aplicarea simultană pe placă a substanțelor etalon, spotul format de o anumită
substanță cunoscută se va găsi după developare la aceeași distanță de punctul de start ca
și acela dat de componentul identic din amestec.
- prin determinarea valorii (raportul dintre distanța parcursă de spot și de frontul
solventului în același interval de timp) R f este caracteristic pentru fiecare substanță în
condiții de lucru standardizate.

60
 Modul de lucru:
a) Pregătirea plăcii cromatografice
Se prepară prin agitarea silicagelului în alcool etilic (2 g silicagel, 6 ml alcool) o
suspensie care se toarnă pe suprafața unei plăci de sticlă. Prin mișcarea plăcii se întinde
cât mai uniform suspensia și se continuă mișcarea plăcii până când prin evaporarea
alcoolului mobilitatea suspensiei scade și suspensia rămâne nemișcată. După uscarea
completă a plăcii laturile longitudinale se șterg pe o lățime de 0,5 cm.
b) Aplicarea amestecului de analizat
La o distanță de 1 cm de la unul din capetele plăcii, cu ajutorul unei capilare se
aplică soluția de cercetat precum și soluțiile etalon din vitamine urmărite. Diametrul
maxim admis al probelor aplicate este cca. 5 mm. Cantitatea minimă de vitamină
aplicată este aproximativ 3 g.
c) Developarea
Plăcile se introduc într-un vas cu toluen cu capătul pe care s-au aplicat soluțiile,
așezat în solvent. Placa în timpul developării are o poziție înclinată la 20-30º față de
orizontală. Solventul migrează prin capilaritate de-a lungul stratului de adsorbant.
Pentru a împiedica evaporarea, cromatografia se face într-o atmosferă saturată cu
vaporii solventului, adică vasul este ermetic închis.
d) Localizarea petelor
După uscarea plăcilor, componentele migrate sunt evidențiate cu ajutorul unui
strat subțire de H2SO4 98% turnat pe placă cu ajutorul unei pipete în aceeași parte în
care au fost aplicate probele. Poziția plăcii trebuie să asigure deplasarea acid sulfuric în
sensul în care s-a făcut developarea. Vitaminele liposolubile în contact cu acid sulfuric
se colorează astfel: vitamina A – albastru-violet, - carotenul – albastru, vitamina D2 –
galben-portocaliu, vitaminele E, K1, K2, K3 – brun.

Dozarea iodometrică a acidului ascorbic din urină

(metoda Palladin)

Principiu:
Acidul ascorbic este oxidat în mediu acid de I2 la acid dehidroascorbic

61
 Iodul necesar oxidării rezultă din interacțiunea KIO3 cu KI în mediu acid.
După oxidarea completă a vitaminei C iodul în exces dă o culoare albastră în
prezența amidonului.
Reactivi: - soluție HCl 2%;
- soluție KI 0,1N;
- soluție KIO3 0,004N;
- soluție amidon 0,5%.
Modul de lucru:
Se cântărește 1 g din produsul vegetal de analizat (ace de brad, fructe de măceșe,
etc.) și se triturează cu o soluție de HCl 2% și 5g nisip de cuarț spălat prealabil cu HCl.
Triturarea începe cu o mică cantitate de HCl. După aceea masa omogenă se pune într-un
vas de 50ml, se spală mojarul cu acid clorhidric 2% și după introducerea soluției de
spălare în vasul cotat, se aduce la semn cu HCl 2%. Lichidul se lasă să se limpezească,
decantează și se filtrează prin vată. Primii 10ml se aruncă.
Când se lucrează cu urină se iau 10ml urină în vasul gradat, se aduce la cotă cu
HCl 2%, se amestecă și se filtrează.
10 ml din filtrat se pun într-un flacon conic, se adaugă 30ml apă distilată, 5ml
soluție de iodură de potasiu și 5ml HCl 2%. Se titrează cu o soluție de iodat de potasiu
0,004N folosind ca indicator amidon. Culoarea albastră trebuie să se mențină 30
secunde.
Calculul: se efectuează ținând cont de faptul că 1ml soluție KIO 3 0,004N
corespunde la 0,352mg acid ascorbic (M. acid ascorbic =176). Rezultatul se raportează
la 100g produs analizat sau la cantitatea de urină eliminată in 24 ore.
Valori normale 50-150 μmol/zi (10-30mg/zi). Variațiile lor nu sunt concludente
din punct de vedere clinic. De aceea se folosește proba încărcării cu acid ascorbic.
Se administrează intravenos 1000mg acid ascorbic și după ce se colectează urină
timp de 5 ore, adăugând la fiecare fracțiune de urină câte 10% acid acetic glacial.
În mod normal se elimină in 5 ore cel puțin 400mg acid ascorbic. O eliminare
mai scăzută pledează pentru hipovitaminoză sau avitaminoză C.

62
 Enzime
Introducere
Enzimele, biocatalizatori proteici, sunt produse de materia vie și prezența lor
este necesară pentru desfășurarea reacțiilor chimice în toate sistemele biologice.
Enzimele au și însușiri ale catalizatorilor utilizați în reacțiile chimice din lumea nevie.
Ele sunt însă superioare acestor catalizatori în mai multe privințe:
a) Asigură reacțiilor chimice pe care le catalizează viteze cu câteva ordine de
mărime mai mari,
b) Reacțiile pe care le catalizează au loc în condiții blânde: temperatură sub
50C, presiune atmosferică, pH în jurul valorii 7, forță ionică moderată. Comparativ,
catalizatorii chimici acționează la temperaturi ridicate, presiuni mari și valori extreme
de pH;
c) Au specificitate foarte mare ceea ce asigură ca în reacțiile pe care le
catalizează să nu participe decât substraturile pentru care enzimele sunt specifice.
Multe enzime au și însușiri neîntâlnite la catalizatorii chimici cum sunt:
a) Activitatea lor poate fi reglată (mărită sau micșorată) de anumiți efectori;
b) Catalizează reacții endergonice imposibile d.p.d.v. termodinamic prin
transferul energiei libere necesare de la reacții exergonice.
Cinetica enzimatică studiază viteza reacțiilor catalizate de enzime în funcție de
concentrația substratului [S], de concentrația enzimei [E] și de influențele unor factori
fizico-chimici cum sunt: temperatura, pH-ul, cofactori, etc. Concepția unanim admisă în
enzimologie că formarea din substrat a produsului de reacție implică existența
complexului enzimă-substrat (ES), redată prin ecuația:
K1 K3
E + S  ES ------> E + P,
K2

a fost statuată în primul rând ținând cont de alura dependenței vitezei reacțiilor
catalizate de enzime de concentrația de substrat (Leonor Michaelis și Maud Menten,
1913).
Din punct de vedere al localizării enzimele se clasifică în:
Enzimele secretate cu rol activ în plasmă, ca de exemplu:
a) enzimele plasmatice funcționale, produse în special în ficat (ceruloplasmina)

63
 b) enzimele coagulării, lipoproteinlipaza (LPL), lecitin-colesterol-aciltransferaza
(LCAT).
Nivelul lor plasmatic scade cu lezarea celulelor producătoare.
O O
C C

HO C O C
O + I2 O + 2HI
HO C O C

HC HC

HO CH HO CH
CH2OH CH2OH

Enzimele secreto-excretate, provenind din glandele exocrine și pancreas. Ele

sunt excretate și acționează la nivelul tubului digestiv, de exemplu amilaza, lipaza,
tripsina. Activitățile lor cresc în plasmă prin lezarea celulelor de origine sau prin
prezența unui obstacol la nivelul căilor excretorii precum și prin creșterea
permeabilității membranei celulelor secretorii;
Enzimele celulare cu loc de acțiune în celulele din care provin, a căror activitate
plasmatică crește prin lezarea celulelor de origine. Exemple sunt glutamic-oxalacetic
transaminaza (GOT), glutamic-piruvic transaminaza (GPT), lactat dehidrogenaza
(LDH), fosfataza alcalină și acidă, creatin kinaza (CK), etc.
Concentrația majoritățiilor enzimelor celulare este constantă în timp. Fac
excepție enzimele inductibile/represibile și enzimele plasmatice funcționale intracelular
cum ar fi CK (creatin kinaza), GOT, LDH, GPT, GDH (glutamat dehidrogenaza), GT
(-glutamil-transaminaza), SDH (sorbitoldehidrogenaza), OTC (ornitin transcarba-
milaza) fosfatazele acidă și alcalină, ale căror concentrații cresc sau scad în anumite
stări patologice (leziuni de țesut).
Din punct de vedere medical, enzimologia contribuie astăzi în măsură
hotărâtoare la cunoașterea cauzelor a numeroase boli, diagnosticul și urmărirea evoluției
acestora, elaborarea pe baze științifice a medicamentelor.

64
 Influența concentrației substratului asupra
vitezei de reacție enzimatică

Concentrația substraturilor celor mai multe enzime variază destul de mult în

funcția de starea metabolică a țesutului și de alți factori. Dependența vitezei de reacție
de concentrația substratului constituie aspectul cel mai important al cineticii enzimatice.
Una din principalele mărimi ale cineticii enzimatice este activitatea enzimatică.
Pentru exprimarea activității enzimatice se folosesc în prezent mai multe sisteme
de unități ceea ce îngreunează interpretarea rezultatelor. Uniunea Internațională de
Biochimie recomandă exprimarea activității enzimelor în mod unitar, în ”unități
internaționale” (UI sau U). Unitatea internațională de activitate enzimatică reprezintă
cantitatea de enzimă care transformă un mol de substrat într-un minut, la 25 ºC, în
condiții optime (concentrația maximală a substratului, forța ionică a tamponului, pH
optim).
1UI = 1 mol substrat /min.
Conform SI unitatea de măsură a activității enzimatice este katalul.
1 katal = 1 mol substrat / sec
Se folosesc subunitățile ( m, , n, p) katalului. În determinările pe lichide
biologice se raportează activitatea enzimei la 1000 ml (vezi tabelul „limitele valorilor
normale. Se folosește de asemenea exprimarea și în miliunități internaționale pe
mililitru (mU/ml) ceea ce de fapt nu modifică valorile numerice respective. Chiar și
atunci când se utilizează UI, apar diferențe ale valorilor limitelor normale, datorită
varietății metodelor folosite pentru determinări.
Principiu:
Pentru o cantitate dată de enzimă, viteza,v, a reacției enzimatice crește odată cu
creșterea concentrației substratului S, până când întreaga cantitate de enzimă se
saturează cu substrat. Se atinge astfel viteza maximă,v max, care nu va fi
depășită chiar dacă în continuare concentrația
substratului va crește, în cazul în care substratul în exces nu inhibă propria
enzimă. Acest principiu este descris de ecuația Michaelis-Menten (pentru
deducere vezi cursurile de biochimie):

65
 [S]
v=v max
K M + [ S ] unde K constanta lui Michaelis.
M,

Reprezentarea grafică a lui v în funcție de S (temperatura, pH-ul și E fiind

constante) este o curbă cu alură hiperbolică. Din analiza curbei reiese că v crește liniar
cu creșterea S numai pentru valori mici ale acesteia, apoi creșterea se face tot mai lent
pentru ca la concentații mari de substrat, viteza reacției să rămână constantă. Fiecare
enzimă se caracterizează prin valorile particulare KM și vmax ale lor.

Determinarea constantei lui Michaelis pentru urează

Principiu:
În determinarea experimentală se va folosi ca substrat ureea și ca enzimă ureaza
din boabe de soia. Ureaza catalizează următoarea reacție:
NH 2 ureazã
O=C + H 2O CO2 + 2NH 3
NH 2

Viteza de reacție este proporțională cu cantitatea de amoniac eliberat în unitatea de timp

(1min). Aceasta se determină prin titrare cu o soluție de HCl cu factor cunoscut.
HCl + NH3 --------- NH4Cl
Cunoscând concentrațiile substratului din probe care se consideră constante pe parcursul
fazei de incubație și calculând vitezele de reacție, exprimate în moli uree transformați
într-un minut, pe baza datelor titrimetrice se face reprezentarea grafică (v, [S]) din care
se poate calcula KM pentru urează.

Reactivi: - Soluție de uree 0,1 M

- Soluție de uree 1,0 M
- Soluție de urează: fie o soluție de enzimă cristalizată, fie o
suspensie de făină de soia. Se păstrează în frigider.
- Soluție de tampon fosfat 0,1 M, pH=7
- Soluție de CuSO4 5%
- Indicator roșu de metil 0,1% în soluție alcoolică

66
 Modul de lucru:

Conform tabelului se prepară o serie de 6 probe introducându-se în toate aceeași

cantitate de enzimă și soluții de concentrații crescătoare ale substratului. În tabel vor fi
consemnate pe baza datelor experimentale (titrimetrice) și a efectuării calculelor,
valorile a i , m și v i (i=1,6).
În proba martor se inactivează enzima, înainte de a se introduce substratul,
adăugând 5 picături soluție CuSO4 5%. Reacțiile chimice (în cazul probelor 1-6),
declanșate în momentul amestecării enzimelor cu substratul, sunt lăsate să se
desfășoare timp de 25 min., apoi sunt întrerupte prin adaosul inhibitorului, adică a câte 5
picături soluție CuSO4. Se măsoară în fiecare probă cantitatea de NH 3 format, prin
titrarea cu soluție de HCl în prezența indicatorului roșu metil (3 picături) care virează de
la galben la roșu. Culoarea galben dată de indicator, înaintea virajului, se datorează
amestecului coloristic cu culoarea albastră dată de ionii Cu2+ hidratați.

Calculul:
1mol HCl........................................1 mol NH3..................1/2moli uree
1000 ml HCl N/20............................................. ........._____1_____moli uree
2.20
(ai-m) ml..............................................................................xi____________
x i = (a i -m)•25 moli uree transformați în 25 minute
v i = (a i -m)•25/25 = a i -m moli uree/ 1 min.
Reprezentarea grafică
Pe un sistem rectangular de axe de coordonate trasat pe hârtie milimetrică se
aplică pe ordonată o scară a valorilor vitezelor de reacție. Pe abscisă se trec
concentrațiile molare ale ureei din cele șase probe menționate în tabel. Se reprezintă
grafic punctele (vi, [S]). Curba hiperbolică se trasează printre punctele experimentale.
Porțiunea dreaptă, paralelă cu abscisa (corespunzătoare saturării E cu S), se prelungește
până la intersecția cu ordonata, intersecția corespunzând valorii v max. La valoarea vmax/2,
se duce o dreaptă paralelă cu abscisa până la intersecția cu curba și de la această
intersecție se duce o dreaptă paralelă cu ordonata până la intersecția cu abscisa. Acest
punct corespunde valorii KM (concentrația de substrat corespunzătoare semi-vitezei
maxime). Ea este într-o primă aproximație constanta de disociere a complexului
enzimă-substrat (urează-uree). Deci, se stabilesc (1) vmax, (2) vmax/2 și (3) KM.

67
68
 Interpretarea rezultatelor
Valorile mari ale KM corespund unei legături slabe între E și S iar valorile mici
ale KM corespund unei legături puternice între E și S. Valorile lui K M pentru diverse
enzime sunt cuprinse între 10-1- 10-6 moli/litru. În cazul ureazei, KM10-2 moli/litru ceea
ce plasează această enzimă în rândul celor cu afinitate (constantă de stabilitate a
complexului E-S) mică față de substrat.

Determinarea activității transaminazelor

(metoda colorimetrică cu 2,4-dinitrofenilhidrazină)

Principiu:
Transaminazele catalizează reacția de transfer a grupării amino de la un alfa-
aminoacid la un alfa-cetoacid. Transaminazele cu cea mai mare importanță clinică sunt:
glutamic-oxalacetic-transaminaza (GOT, aspartat aminotransferaza-AST) și glutamic-
piruvic-transaminaza (GPT, alanin aminotransferaza-ALT). Acestea catalizează
următoarele procese reversibile:

GOT este o enzimă localizată în proporție de 60% în citoplasmă și 40% în

mitocondrii, în special în mușchiul scheletic, miocard și ficat. În reacția catalizată de
GOT se folosește ca substrat amestecul aspartat--cetoglutarat din care rezultă
oxalacetat și glutamat. Oxalacetatul se decarboxilează spontan trecând în piruvat.
Piruvat rezultă și din reacția catalizată de GPT având ca substrat amestecul
alanina--cetoglutarat Piruvatul rezultat din aceste reacții reacționează cu 2,4-dinitro-
fenil-hidrazina în mediu alcalin dând dinitro-fenil-hidrazona corespunzătoare de culoare
roșie, care se determină fotometric:

69
 Datorită faptului că și ceilalți alfa-cetoacizi prezenți (alfa-cetoglutarat) formează
fenil-hidrazone, cu absorbții la diferite lungimi de undă, se măsoară extincția dinitro-
fenil-hidrazonei piruvatului la lungimea de undă de 520 nm unde fenil-hidrazona alfa-
cetoglutaratului absoarbe slab.
Intensitatea colorației produse este proporțională cu intensitatea activității
enzimei. Activitatea transaminazelor se calculează în funcție de cantitatea de acid
piruvic care se formează într-un minut.
Reactivi: - Substrat GOT: 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,039 g alfa-
cetoglutarat de sodiu (sau 0,030 g acid alfa-cetoglutaric) și 1,57 g
aspartat de sodiu (sau 1,32 g acid aspartic) se dizolvă în aproximativ
80 ml apă bidistilată. Se ajustează cu NaOH 0,4N pH-ul soluției la
7,4 apoi se completează volumul la 100 ml cu apă bidistilată.
- Substrat GPT: 1,50 g K 2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,030 g acid alfa-
cetoglutaric (sau 0,039 g alfa-cetoglutarat de sodiu) și 1,78 g alanină
se dizolvă în aproximativ 80 ml apă bidistilată, se aduce pH-ul la 7,4
cu NaOH 0,4N, apoi se completează la 100 ml cu apă bidistilată.
- Soluție de 2,4-dinitro-fenil-hidrazină 1 mM în HCl 2M: se dizolvă
19,8 mg dinitro-fenil-hidrazină în 10 ml HCl (d = 1,19 g/cm3) și se
completează la 100 ml cu apă bidistilată.
- Soluție standard de piruvat de sodiu 2 mM: se dizolvă în 100 ml apă
bidistilată 22 mg piruvat de sodiu (1 ml soluție conține 2 µmoli
piruvat). Se adaugă 0,3 ml cloroform pentru conservare.
- Soluție NaOH 0,4N
Modul de lucru:
Atât pentru GOT cât și pentru GPT se pregătesc câte trei eprubete: probă (P),
standard (S) și blanc (B).

GOT GPT
P S B P S B

70
 Sol.substrat GOT (ml) 0,5 0,5 0,5 - - -
Sol.substrat GPT (ml) - - - 0,5 0,5 0,5
Se incubează 5 minute la 37C
Ser (ml) 0,1 - - 0,1 - -
Sol.standard PIR (ml) - 0,1 - - 0,1 -
Se incubează la 37C 60 minute 30 minute
Sol.2,4-dinitrofenilhidrazină (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Ser (ml) - - 0,1 - - 0,1
Sol.NaOH 0,4 N (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Se omogenizează conținutul eprubetelor și după 5 minute se citește extincția

probelor (EP) și a standardului (ES) față de blanc, la 520 nm, în cuva de 1 cm.

Calcul:
Știind că soluția standard conține 0,2 moli piruvat /0,1 ml se calculează
cantitatea de piruvat rezultat din reacția pentru fiecare enzimă și se exprimă activitatea
enzimatică în moli piruvat format/min./1000 ml ser (în condițiile de lucru) și se
notează cu X:

Pentru GOT: X=(EP/EB) • 0,2 • (1/60) • (1/0,1) • 1 000 moli piruvat

Pentru GPT: X=(EP/EB) • 0,2 • (1/30) • 1 000 moli piruvat

Activitatea enzimatică reală nu este dată direct de valoarea obținută colorimetric,

deoarece hidrazona colorată se formează și cu alfa-cetoglutarat din substrat, iar pe de
altă parte, condițiile nu sunt cele optime (37C în loc de 25C și prezența alfa-
cetoglutaratului care formează hidrazonă). S-au calculat tabele de corecție prin
comparație cu datele obținute cu metoda de referință, care exprimă activitatea
enzimatică reală, măsurând spectrofotometric în UV transformarea NADH  H in
NAD+, în prezența enzimelor indicatoare: malat-dehidrogenaza (MDH) în amestec cu
GOT și lactat-dehidrogenaza (LDH) în amestec cu GPT.
Reacțiile enzimatice sunt următoarele:
GOT

alfa-cetoglutarat + L-aspartat -------------- L-glutamat + oxalacetat

MDH

oxalacetat + NADH + H+ ---------------- L-malat + NAD+

71
 GPT

alfa-cetoglutarat + L-alanina -------------- L-glutamat + piruvat

LDH

piruvat + NADH + H+ ---------------- L-lactat + NAD+

Din tabelul de corecție se citește activitatea enzimatică reală (determinată prin metoda
enzimatică) exprimată în Unități Internaționale (UI = moli/min./l, 25C) care
corespunde valorilor X calculate.

UI UI UI UI
X GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT
2 2 1 28 25 10 56 24 82 39
4 3 2 30 27 11 58 25 84 40
6 5 2,5 32 29 12 60 26 86 42
8 6 3 34 31 13 62 27 88 44
10 7 4 36 33 14 64 29 90 46
12 9 4,5 38 35 15 66 30 92 48
14 11 5 40 37 16 68 31 94 50
16 13 6 42 39 17 70 33 96 52
18 15 7 44 41 18 72 34 100 54
20 17 7,5 46 44 19 74 35 96 52
22 19 8 48 47 20 76 36 100 54
23 20 8,5 50 51 21 78 37 102 60
24 21 9 52 55 22 80 38
26 23 9,5 54 60 23

Observații:
1. Dacă activitatea enzimatică depășește 60 UI se va repeta determinarea cu incubație
scurtă: 20 de minute pentru GOT si 10 minute pentru GPT. Rezultatele obținute se
vor înmulți cu 3. Este de preferat ca în locul scurtării timpului de incubație să se
facă diluții ale serului 1:5, 1:10, 1:20 în apă distilată și se reia cu fiecare diluție
tehnica de lucru de la început. La calcul se ține seama de diluție.
2. Sticlăria utilizată trebuie să fie perfect curată, spălată în final cu multă apă distilată,
deoarece urme de detergenți pot inhiba considerabil activitatea enzimatică.
Interpretarea valorilor obținute
Valori normale: GOT: Adulți: 2-20 UI. Copii sub 3 luni: până la 40 UI
GPT: Adulți: 2-16,5 UI. Copii până la 5 ani: 0,2-13 UI

72
 Valori patologice: În cazul leziunilor celulare mai ușoare crește activitatea GPT,
ea fiind o enzimă citoplasmatică, iar în cazul leziunilor mai grave crește și activitatea
GOT (GOT este prezentă și în microsomi)
GOT : - creșteri marcate ( 10-100 ori ) în: infarct miocardic, hepatită virală acută,
necroza toxică a ficatului
- creșteri moderate în: hepatite cronice, icter mecanic, mononucleoza infecțioasă,
anemii hemolitice, boli ale musculaturii striate
GPT: - creșteri marcate ( ~ 100 ori ) în: hepatita virală acută, necroza toxică a ficatului
- creșteri moderate în: hepatite cronice, ciroză, mononucleoza infecțioasă,
hepatita de stază cardiacă.
Raportul de Ritis: GOT/GPT ~ 1,2-1,3. În leziunile inflamatorii ale ficatului
acest raport scade datorită creșterii mai mari ale activității GPT. În leziunile necrotice
raportul crește datorită creșterii mai marcate a activității GOT.

Determinarea activității amilazei serice prin

metoda Wohlgemuth.

Prin acțiunea amilazei salivare (-amilaza) asupra amidonului, în cavitatea

bucală, se rup legăturile 1,4-glicozidice. Cum legăturile 1,6 ca și cele 1,4 din vecinătatea
ramificațiilor, nu pot fi desfăcute de către -amilază, produșii de digestie a amidonului
vor fi, pe lângă maltoză, fragmente oligozaharidice de dimensiuni variabile - dextrine
limită. Dextrinele limită sunt hidrolizate ulterior, sub acțiunea unei hidrolaze, amilo-1,6-
glucozidaza, la maltoză care, în intestin este hidrolizată la glucoză de maltază.
Activitatea amilazică a intestinului se datorează trecerii amilazelor pancreatice și
salivare în sânge. pH-ul optim al amilazei salivare este aproape de neutralitate,
cofactorul fiind ionul Cl-.
Prin adăugarea de iod, amidonul rămas după reacția enzimatică dă un compus de
adiție iod-amidon, de culoare albastră a cărei intensitate este proporțională cu
concentrația amidonului rămas după incubație și invers proporțională cu activitatea
enzimatică. Colorația roșie care poate să apară în soluțiile cu amidonul parțial hidrolizat
se datorează complexelor iod-dextrine.

73
 Principiu:
Se determină cantitatea minimă de amilază serică necesară pentru a hidroliza
complet 2 mg amidon, în 30 minute la 38C.
Reactivi: - Soluție de NaCl 0,9%
- Soluție de amidon 0,1%
- Soluție de KI3 N/10
Modul de lucru:
Se iau 8 eprubete care se numerotează de la 1 la 8. În fiecare se introduce câte un
ml soluție NaCl 0,9%. În prima eprubetă se adaugă 1 ml ser. Pipeta se spală de 3 ori
prin aspirare în amestecul din prima eprubetă și cu aceeași pipetă se trece 1 ml din
amestec în a doua eprubetă. Din nou se spală pipeta prin aspirare în a doua eprubetă și
se trece 1 ml în a treia. Operația se repetă până la ultima eprubetă din care se aruncă 1
ml din amestec. În acest mod se obține următoarea serie de diluții succesive ale serului:
1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, adică 1/2n unde n este numărul de ordine al
eprubetei.
Se adaugă apoi în fiecare eprubetă câte 2 ml soluție amidon. Se agită și se
așează în baie de apă la 38ºC. După 30 de minute se scot, se răcesc repede la un curent
de apă, apoi în fiecare se introduc câte 1-2 picături de soluție de iod. Se agită și se
observă culoarea formată. Culoarea galbenă indică lipsa amidonului, cea roșie arată
prezența produșilor intermediari de hidroliză (dextrine), iar cea albastră semnalează
prezența amidonului nehidrolizat. Se notează ultima eprubetă în care amidonul a fost
hidrolizat.
Cu această metodă nu se poate face diferență între amilaza salivară și cea
pancreatică. Există, însă, metode electroforetice pentru a diferenția cele două izoenzime:
migrarea electroforetică a amilazei salivare este mai rapidă decât a celei pancreatice.
Calcul:
Rezultatul se exprimă în unități Wohlgemuth (UW). Unitatea amilazică Wohlgemuth
reprezintă cantitatea de enzimă necesară pentru a hidroliza un mg amidon în 30 minute
la 38ºC. Pentru calcul se consideră ultima diluție în care nu apare culoarea albastră.
Rezultatul în unități Wohlgemuth se obține înmulțind diluția cu 2. De exemplu, dacă
colorația albastră apare în eprubeta a 5-a înseamnă că amidonul a fost hidrolizat până la
a 4-a eprubetă. Calculăm diluția acestei eprubete care este 1/16 față de serul inițial.
Dacă: 1/16 ml ser hidrolizează 2ml sol. amidon 0,1% atunci, 1 ml ser hidrolizează x ml
sol. amidon 0,1% sau x mg amidon.

74
 1•2
x = ─── = 32 UW
1/16

Interpretarea valorilor obținute:

Valori fiziologice: în sânge: 8-32 U.W.
în urină : 8-64 U.W.
Valori patologice: - activitatea amilazică scăzută apare în afecțiunile
pancreatice, gastrice și duodenale.
- activitatea amilazică crescută apare în afecțiuni ale
ficatului, vezicii biliare, în alterări ale funcției renale, afecțiuni ale glandei salivare
(parotidită acută, sialadenită), sarcină extrauterină, fiindcă cantități mici de amilază
există în trompele uterine, infarct intestinal. Valoarea diagnostică a amilazemiei se
corelează cu tulburările digestive, pancreatita acută, parotidita epidemică.

Observații:
1. Amilaza serică este stabilă timp de o săptămână dacă serul se ține la frigider sau
congelator.
2. Saliva conține de 1000 ori mai multă amilază decât serul de aceea este necesar ca
pipetările să se facă cu atenție evitându-se scurgerea salivei în pipetă.
3. Eprubetele vor fi bine spălate cu apă distilată, de asemenea și pipetele, înlăturându-
se urmele de detergent care ar putea influența reacția enzimatică.

Explorarea echilibrului acido-bazic

Modificările echilibrului acido-bazic a lichidelor din organismul viu, duc la
acidoză sau alcaloză. pH-ul sângelui este cuprins în intervalul 7,35-7,45. În mod
normal, raportul echivalenților de HCO3- și H2CO3 este de 20/1, de exemplu 24 mEq
bicarbonat și 1,2 mEq acid carbonic. În locul raportului [HCO 3-]/[H2CO3], un raport mai
practic este [HCO3-]/pCO2 unde pCO2 este presiunea parțială a CO2 din sânge.
Scăderea acestui raport duce la acidoză, iar creșterea lui la alcaloză. Dacă scade
numărătorul, este vorba de acidoză respiratorie (reducerea eliminării prin expirație a
CO2) sau metabolică. Creșterea raportului datorită creșterii numărătorului indică o
alcaloză metabolică. Scăderea raportului [HCO 3-]/pCO2 datorat creșterii pCO2 produce
acidoză respiratorie. Creșterea raportului determinat de scăderea pCO 2 produce alcaloză

75
respiratorie. În funcție de modificările pH-lui se realizează acidoza sau alcaloza
compensată sau decompensată. Când pH-ul nu este modificat este vorba de acidoză sau
alcaloză compensată. Când pH-ul scade sub 7,35 este vorba de acidoză decompensată,
iar când pH-ul crește peste 7,45 se poate vorbi de alcaloză decompensată. Valori ale pH-
ului sângelui sub 6,9 sau peste 7,9 sunt incompatibile cu viața. Cele mai importante
sisteme tampon care funcționează permanent în organism sunt: sistemul bicarbonat/acid
carbonic, sistemul fosfaților (HPO42-/H2PO4-), sistemul proteinelor si sistemul
hemoglobinei (deprotonată/protonată).

Determinarea rapidă a rezervei alcaline (bicarbonat actual)

Principiu:
Bicarbonații din ser sunt descompuși cu acid azotic, cu degajare de CO 2, iar
excesul de acid azotic se titrează în prezență de roșu de fenol cu soluție de hidroxid de
sodiu.
Reactivi: - soluție acid azotic 0,1 N cu factorul FHNO3
- soluție roșu de fenol 0,04% în alcool etilic de 60%;
- soluție de hidroxid de sodiu 0,1 N cu factorul FNaOH
Modul de lucru:
La 1 ml ser nehemolizat se adaugă 1 ml soluție acid azotic 0,1N și 4 picături
soluție roșu de fenol 0,04%. Se agită timp de 2 minute pentru îndepărtarea dioxidului de
carbon. Se microtitrează cu v ml soluție de hidroxid de sodiu 0,1N până la primul viraj
portocaliu.
Calcul:
−
1 ml NaOH 0,1N ..................................................0,1mEq HCO 3
F HNO −v⋅F NaOH −
3 ................................................... x mEq HCO 3
x = rezerva alcalină dintr-un ml ser.

Obsevație: Factorul soluției de HNO3 0,1N se determină prin titrare cu soluția de

NaOH 0,1N cu factor cunoscut, folosind roșu de fenol ca indicator.

Metoda Astrup
Spre deosebire de măsurătorile de bicarbonați și de pH efectuate în plasmă,
metoda Astrup ține cont și de rolul tamponului de hemoglobină și de intervenția
anhidrazei carbonice din eritrocite. Metoda se bazează pe relația invers proporțională
dintre pCO2 și valorile de pH din sânge. Este o micrometodă în care se utilizează un

76
electrod capilar de sticlă pentru măsurarea pH-ului (dozarea potențiometrică a pH-ului
cu electrod de sticlă, pag.183). Determinările se fac din sânge capilar. Se măsoară trei
valori de pH (în condiții anaerobe, în condiții de pCO 2 scăzut și pCO2 crescut). Cu
ajutorul acestor trei valori se pot calcula factorii principali ai echilibrului acido-bazic
dintr-o nomogramă.

Ioni anorganici

Dozarea flamfotometrică a potasiului seric

În ultimul timp, metodele chimice de determinare ale potasiului au fost înlocuite
prin analiza flamfotometrică. Factorii care au favorizat utilizarea flamfotometriei ca
metodă uzuală în laboratoarele clinice pentru determinarea în lichidele biologice a
metalelor alcaline (Na+ și K+) și metalelor alcalino-pământoase (Ca 2+ și Mg2+), au fost:
simplitatea metodei, rapiditatea metodei, consumul minim de substanțe, limita de eroare
(2-3%) apropiată de limita de eroare din determinările chimice.

Principiu:
Serul nehemolizat se diluează cu apă bidistilată, apoi se pulverizează într-un
dispozitiv special cu ajutorul unui curent de gaz purtător. Aerosolii formați în urma
pulverizării se amestecă cu unul din amestecurile de gaze: metan-aer, propan-aer sau
acetilenă-aer care arde într-un arzător special (Brenner), dând naștere la spectre
caracteristice. Liniile spectrale ale potasiului pot fi selecționate cu ajutorul unui filtru.
Lumina flăcării este proiectată cu ajutorul unei oglinzi concave, prin filtrul de selecție,
pe o celulă fotoelectrică, ceea ce produce un fotocurent, care se poate măsura cu ajutorul
unui galvanometru. Intensitatea fluxului luminos este proporțională cu concentrația
ionilor K+ din ser. Alte detalii privind această analiză instrumentală sunt cuprinse în
capitolul privind unele aparate de analiză fizică de la sfârșitul îndrumătorului.

Dozarea calciului și magneziului

Dozarea calciului

Rolul calciului în organism

77
 Calciu este cel mai abundent mineral din organismul uman. Un adult de 70 kg
conține în țesuturi aproximativ 1,2 kg calciu. Aportul zilnic necesar de calciu este 1
gram, din care se absorb doar 10-20%. Calcemia (concentrația plasmatica a calciului)
normală este 9-11 mg%, 4,5-5,5 mEq/l sau 2,25 -2,75 mmol/l. Calciul îndeplinește în
organism un rol plastic participând prin combinațiile sale insolubile la structura
scheletului osos a cărui principală componentă minerală este hidroxiapatita,
3Ca3(PO4)2•Ca(OH)2 și un rol dinamic sub formă de ioni Ca 2+ prezenți în fluidele, cum
ar fi plasma sau urină, sub forma a trei fracțiuni:
1. Calciu legat de proteine (proteinate de calciu) aproximativ 1 mmol/l. Această formă
depinde de concentrația relativă a proteinelor și calciului din plasmă. Pe baza acestei
dependențe se poate aprecia fracțiunea de calciu ionizat, cunoscând calciul total din
ser sau plasmă și nivelul proteinei din ser sau plasmă. Tehnica constă în folosirea
nomogramei MacLean și Hastings, cunoscând cei doi parametri amintiți anterior se
citește direct valoarea calciului ionizat de pe nomogramă.
2. Calciul legat de molecule mici (complecși de calciu sau chelați) acizi organici,
numit și calciu complexat dializabil. Acesta poate străbate membranele
semipermeabile (celofan) spre deosebire de calciul legat de proteine.
3. Calciul liber, forma biologică activă ce intervine în coagularea sângelui în activarea
enzimelor (proteaze), în buna funcționare a inimii, mușchilor și nervilor.

Determinarea cationului calciu în sânge

Calciul este cationul prezent predominant în spațiul extracelular. În laboratoarele
de analize clinice, calciul din sânge se poate doza prin diferite metode. Metodele fizice
folosite sunt: fotometria de flacără, spectroscopie de absorbție atomică, folosirea
electrozilor ion-selectivi. Metodele chimice folosite sunt precipitarea calciului sub
formă de oxalat și apoi dozarea oxalatului de calciu format cu ajutorul permanganatului
de potasiu și metoda complexonometrică. Metodele optice sunt descrise în principiu la
sfârșitul îndrumătorului. Metodele potențiometrice cu electrod pentru Ca 2+ utilizează un
milivolmetru cu impedanță de intrare mare similar cu pH-metrului care în locul
electrodului de sticlă utilizează electrodul selectiv pentru ionii de Ca 2+.
Metodele chimice (volumetrice) sau fizice cu excitare (flamfotometrie,
spectroscopie de absorbție atomică) permit determinarea concentrației totale a calciului.
Singurele metode care pot determina calciul ionizabil (singurul care este biologic activ)
sunt metodele nernstiene, adică cele care folosesc electrozi selectivi.

78
 Toți electrozii selectivi au ca particularitate o parte care este numită în mod
curent “membrană”. Această membrană conferă selectivitatea electrodului. Membranele
sunt de mai multe tipuri: membrane de sticlă (pentru măsurarea pH-ului), membrane
solide (pentru măsurare concentrației F -, CN-) și membrane lichide (pentru măsurarea
Ca2+, Mg2+).
Electrodul membrană-lichidă pentru Ca2+ este constituit din următoarele
componente principale:
-Un fir de argint metalic acoperit cu clorură de argint, scufundat într-o soluție de
CaCl2
-Un rezervor central în care se află CaCl2 și firul de argint
-O membrană poroasă “millipor” de PVC care joacă rolul unui suport inert,
impregnat cu o soluție organică compusă din sarea de calciu a acidului
didecilfosforic dizolvată într-un solvent nemiscibil cu apa (de exemplu: di – n -
octil fenil fosfat).
Ionul de calciu este comun atât soluției apoase (soluție a cărei concentrație vrem
s-o determinăm) cât și soluției organice cu care este impregnată membrana “millipor”.
În această soluție organică se va reține ionul de calciu de către un contraion (ion cu
semn opus), în cazul de față didecil fosfatul, care fiind insolubil în apă nu poate părăsi
soluția organică. Între cele două soluții (apoasă și organică) apare o diferență de
potențial nernstiană (respectă legea lui Nernst).
Diferența de potențial este măsurată cu ajutorul instrumentului, care este gradat
direct în unități de concentrație a ionilor de Ca 2+ (pCa). Concentrația ionilor de calciu,
poate fi apreciata și indirect folosindu-se nomograme. Sunt două tipuri de nomograme
utilizate în acest scop. Nomograma MacLean-Hastings cu ajutorul căreia se poate
deduce concentrația calciului ionizat, cunoscând calciu total din ser sau plasmă și
concentrația totală a proteinelor din ser sau plasmă.
Cea de a doua nomogramă utilizabilă pentru deducerea concentrației Ca 2+, se
bazează pe faptul că ionizarea ionilor de calciu variază linear în funcție de pH-ul
serului sau plasmei. Acest tip de extrapolare se poate face numai între limitele variației
pH-ului fiziologic (6,8 - 7,8), pentru că numai în această plajă de pH variația este lineară
(vezi figura de mai jos).

79
 În diagrama pH-Ca2+ liber prezentată, ordonata (concentrația ionilor de Ca 2+)
este divizată nelinear. Cunoscând valorile pCa și pH (măsurate cu electrozii selectivi
corespunzători) se poate stabili natura tulburării de care suferă pacientul
(hiper/hipoparatiroidism primar, acidoză/alcaloză acută, etc.).

Dozarea calciului prin metoda complexonometrică

Eliminarea calciului în urină este în funcție de conținutul de calciu din alimente
și de rata de absorbție digestivă.

Principiu:
Ionii de calciu din urină în mediu puternic alcalin se vor titra cu EDTANa 2,
adică complexon III (sarea de sodiu a acidului etilendiaminotetraacetic) în prezența
murexidului (purpurat de amoniu) ca indicator. Indicatorul va fixa ionii de calciu
(culoarea soluției va fi roz) care prin titrare vor fi apoi complexați cu EDTA. Indicatorul
eliberat va colora soluția în violet. Murexidul, indicator metalocromic (pentru calciu și

80
alți cationi) are gradul de ionizare în funcție de pH-ul mediului. Reacțiile prin care ionii
Ca2+ sunt complexați de indicator și de complexon sunt:
Ca2+ + Ind3- ↔ CaInd-
roz
Ca2+ + Y4- ↔ CaY2-
complexonul
deprotonat
Reacția titrimetrică care produce virajul indicatorului este:

CaInd- + Y4- → CaY2- + Ind3-

violet

Reactivi: - soluție complexon III 0,001 N .

- soluție de NaOH 9 N
- soluție indicator murexid 0,1%
Modul de lucru:
Se folosește urină proaspătă, fără conservanți. Se pregătesc două pahare
Erlenmeyer de câte 100 ml și se pipetează în fiecare următoarele:
Exprimarea
Proba Martor
cantităților
Urină ml 2 -
Apă bidistilată ml 50 52
Soluție de NaOH 9 N ml 0,2 0,2
Indicator murexid pic. 1 1
Culoare roz roz-violaceu
Se titrează cu EDTA 0,01N până la violet A ml B ml

Se execută o probă și un martor, martorul se titrează dacă este necesar până la

culoarea violet stabilă, pentru a se lua în calcul și urmele de calciu din reactivi.
Calcul:
În calcularea rezultatelor se are în vedere că complexul din 1 ml soluție
complexează 0,2 mg Ca2+:
1ml EDTA 0,01N-----------------------------------------------0,2 mg Ca
(A-B)•FEDTA------------------------------------------------------x
x= (A-B)• FEDTA•0,2 mg Ca / 2ml
Considerând că urina de 24 ore are volumul de 1500 ml:

81
 g Ca în urina de 24 de ore = (A-B)• FEDTA•0,2 • 1500 / 2 • 1000

g Ca în urina de 24 de ore = (A-B)• FEDTA•0,15

Valori normale:
- ser 9-11 mg / 100 ml la adulți sau
2,2-2,8 mmol / l
7-14 mg / 100 ml la copii sau
1,8-3,5mol / l

- urină sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore - copii și adulți 0,1 - 0,2 g/24
ore
sau 0,25 - 3,5 mmol/24 ore sau 2,5 - 5,0 mmol/24 ore
Valori crescute
- în ser - hiperfuncție paratiroidiană
- neoplazii osoase (osteosarcom, mielom multiplu, unele
leucemii)
- hipervitaminoză D
- deshidratare

- în urină apar în boala Recklinghausen, osteoporoze, după fracturi,

intoxicații cu vitamina D, hipercalciurie ideopatică.
Valori scăzute
- în ser - hipofuncție paratiroidiană
- avitaminoză sau hipovitaminoză D
- uremie
La valori de sub 1,7 mmol / l (6,8 mg%) apar fenomene de tetanie.

- În urină apar în spasmofilie, tetanie infantilă, osteomalacie, rahitism,

hipopara-tiroidism.

82
 Dozarea magneziului prin metoda Mann și Yoe

Un adult de 70 kg conține aproximativ 24 g de magneziu, care este distribuit

inegal în organism, având o concentrație mai mare în țesuturile cu activitate metabolică
mai intensă, cum ar fi creierul, inima, ficatul, rinichii, tiroida. Totuși scheletul conține
60% din magneziu. Mușchii scheletici și miocardul conține 35%, iar 1% se găsește în
compartimentul extra-celular, din acesta aproximativ două treimi fiind sub formă
ionizată, restul fiind legat de albumine. Principalele organe implicate în metabolismul
Mg sunt intestinul și rinichii.
Magneziul are un rol cheie în numeroase funcții mediate enzimatic, fiind
implicat în formarea de substrate enzimatice (ATP Mg, GTP Mg) precum și în activarea
directă a enzimelor. Funcțiile membranare care sunt influențate de magneziu includ
conducerea impulsului nervos și modularea activității canalelor de calciu.
Principiu:
Colorantul Mann și Joe (1- azo - 2 – hidroxi – 3- (2,4 – dimetil carboxamilido)
naftalin – 1’ (2 - hidroxibenzen) – 4 – sulfonat de sodiu) este albastru. În mediu
alcoolic, la pH 9-10, acesta formează cu Mg 2+ (în cantități de ordinul microgramelor) un
complex de culoare roșie, iar intensitatea colorației este proporțională cu concentrația
cationului.

Materiale necesare: - spectrofotometru

- micropipete de 20l (0,02ml)
Reactivi: - Reactivul Mann și Yoe: se dizolvă 8 mg colorant în 75 ml
alcool absolut (eventual prin fierbere cu reflux) și după dizolvare
se aduce la 100 ml cu alcool absolut.
- Soluție tampon (pH 9-10): 20 g tetraborat de sodiu cristalizat cu
10 molecule de apă, se dizolvă la cald în 500 ml apă bidistilată,
apoi se completează cu apă bidistilată la 1000 ml.
- Soluție standard de Mg2+ 2 mg/ 100ml: se dizolvă 203 mg
MgSO4 cristalizat cu 7 molecule de apă în 500 ml apă bidistilată,
se adaugă 1 ml cloroform (conservant), apoi se completează la
1000 ml cu apă bidistilată

83
 - Soluție acid percloric 0,33 N: se dizolvă 2,85 ml HClO 4 70% în
100 ml apă distilată
Modul de lucru:
Se pregătesc în trei eprubete următoarele mixturi:
Probă Blanc Standard
Soluție tampon (ml) 1,0 1,0 1,0
Ser (ml) 0,02 - -
Standard de Mg2+ (ml) - - 0,02
Apă bidistilată (ml) - 0,02 -
Se amestecă bine
Reactiv Mann și Yoe (ml) 1,0 1,0 1,0

Se agită bine mixturile și după 15-30 de minute se citește exticția probei și a

standardului față de blanc în cuva de 1cm la 505 nm.
Calcul:
Ep/Es x 2 = mg Mg% Ep/Es x 1,64 = mEq/l
Valori normale
nou născuți: 1,6 - 2,3 mg% sau 1,32 -1,90 mEq/l sau 0,66-0,95 mmol/l
adulți: 1,6 - 2,4 mg% sau 1,56-2,38 mEq/l sau 0,8-1,2 mmol/l
Modificări patologice
În practica medicală deficitul de magneziu este întâlnit relativ frecvent, dar el nu
este întotdeauna identificat deoarece are expresie medicală mai puțin specifică
comparativ cu carența altor elemente (exemplu ferul) și apare într-un context complex
în asociere cu alte afecțiuni care pot domina tabloul.
Deficitul de magneziu apare în următoarele cazuri:
Aport deficitar, alimentație parenterală, cure drastice de slăbire, alcoolismul
cronic, vărsături datorate alimentației dezechilibrate, hipersudorație, eliminarea crescută
a magneziului prin urină (etanolul antrenează diureza osmotică). Afecțiunile care
evoluează cu malabsorbție, rezecțiile intestinale, enteropatiile acute sau cronice, diarea,
steatoreea, terapia cu diuretice, provoacă de asemenea depleția de magneziu. În practica
pediatrică, deficitul poate apărea din următoarele cauze: disgravidia - sărăcire a
organismului matern cu repercusiuni asupra capitalului de magneziu al nou născutului,
creșterea rapidă a copilului în primele luni, lapte matern sărac în magneziu, tulburări

84
gastrointestinale la această vârstă. Terapia cu calciu și vitamina D în doze mari
favorizează pierderile urinare de magneziu. În diabetul zaharat apare hipomagnezemia
datorită pierderilor urinare de magneziu antrenate de diureza osmotică. Stresul fizic și
psihic favorizează depleția de magneziu.
Manifestări clinice ale deficitului de magneziu (hipomagnezemie) sunt
polimorfe și nespecifice. Ele pot fi: insomnie, anxietate, depresie , cefalee, slăbiciune
musculară, crampe, parestezii, hiperreflexe, dificultăți de înghițire, senzație de
constricție toracică, tulburări de adaptare a vederii.
Supraîncărcare de magneziu se constată la nou născuții ai căror mame au fost
tratate cu sulfat de magneziu în contextul eclampsiei de sarcină. În insuficiența renală,
în special concomitent cu medicația pe bază de Mg 2+ (antacizi, laxative), se produce
hipermagnezemie. Simptomele hipermagnezemiei sunt: hipotensiune, grețuri, vărsături,
bradicardie, hiporeflex osteotendinos, hipotonie musculară.

Dozarea ionului de clor din ser prin

metoda Schales

Principiu:

Ionul Cl-, principal anion al plasmei sanguine, în mediu acid se titrează cu

Hg(NO3)2 formând HgCl2, moleculă nedisociată. Se folosește ca indicator
difenilcarbazona care formează un compus de culoare violet cu ionii Hg 2+ în exces. Nu
este necesară deproteinizarea, cu excepția serurilor puternic icterice.

Reactivi: - Soluție de azotat mercuric 0,01 N

- Soluție indicator de difenilcarbazonă 0,01 M
- Soluție H2SO4 2/3 N
- Soluție standard de clorură de potasiu 0,1 N

85
 Modul de lucru:

În două flacoane Erlenmeyer de 25 ml se pipetează:

Probă Standard
Apă distilată ml 1,0 1,0
Ser ml 0,1 -
Standard KCl ml - 0,1
H2SO4 2/3 N 1 pic. 1 pic.
Indicator difenilcarbazonă 2 pic. 2 pic.

Ambele probe se titrează până la aceiași culoare violet cu Hg(NO 3)2 0,01 N. Se notează
volumul în ml folosit la titrarea probei (v1) și cel folosit la titrarea standardului (v2).
Calcul:
1 ml Hg(NO3)2 0,01 N corespunde la______________________________0,355 mg Cl-
v1 / v2 ________________________________________________________ x
x = mg Cl-/0,1 ml ser = v1 / v2 • 0,355
mg Cl- / 100 ml ser = v1 / v2 • 355
mEq Cl- / l = v1 / v2 • 100
Observații: În cazul serurilor puternic icterice se efectuează deproteinizarea.
După deproteinizare, culoarea indicatorului la viraj tinde spre albastru, pe când la ser
neproteinizat spre violet.

Valori normale pentru adulți:

340 – 390 mg clor/100 ml ser
96 – 110 mEq clor/ litru de ser
Valori scăzute până la 250 mg/100 ml ser se întâlnesc în insuficiență corticosuprarenală
(boala Addison), în diaree sau vărsături prelungite, când organismul pierde pe lângă apă
și o cantitate apreciabilă de NaCl.
Valori crescute se întâlnesc în stări de sete, în hiperfuncția corticosuprarenală și în
insuficiența renală.

86
 Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificată)

Principiu:
Se tratează serul sanguin cu acid clorhidric când se eliberează Fe 3+ din legătura
sa cu proteinele (transferina). Se precipită proteinele serice cu acid tricloracetic, după
filtrare Fe3+ din filtrat este redus cu hidrochinonă la Fe2+. Ionii de Fe2+ formează cu
ortofenantrolina și, mai specific, cu ,’-dipiridil, un complex colorat în roșu.
Intensitatea colorației roșii va fi proporțională cu concentrația ferului din probă.

Reactivi: - Soluție HCl 1N;

- Soluție CCl3COOH 20%;
- Soluție hidrochinonă 2%;
- Soluție ortofenantrolină clorhidrică 1% (se poate utiliza și
ortofenantrolină, iar pentru dizolvare se acidulează inițial cu 2-3
picături de HCl concentrat)
- Soluție semisaturată de CH3COONa. Se diluează extemporaneu o
soluție saturată (la temperatura camerei cu apă bidistilată) în proporție
de 1:1
- Soluție standard concentrată de fer 10 mg%: 0,0497 g FeSO 4· 7H2O, ad
100 ml cu apă bidistilată sau 0,0702 g Fe(NH 4)2(SO4)2· 6H2O, ad 100
ml cu apă bidistilată. Standardul concentrat se păstrează la frigider. Se
diluează extemporaneu 1 ml la 100 ml cu apă bidistilată obținându-se
un standard de lucru de 100 µg Fe % cu stabilitate limitată la 1-2 luni.

Modul de lucru:

În trei eprubete se pipetează conform tabelului:

87
 Probă (ml) Standard (ml) Blanc (ml)
sol. HCl 1 N 1 1 1
ser (nehemolizat) 2 - -
apă bidistilată - - 2
sol. standard de fier (100 g%) - 2 -
Agitare, 10 min. repaus
acid tricloracetic 20% 2 2 2
10 min. repaus, filtrare și apoi în eprubete
filtrat 2 2 2
sol. hidrochinonă 2% 0,2 0,2 0,2
sol. o-fenantrolină 1% 0,1 0,1 0,1
sol. acetat de sodiu 2 2 2

Fiecare eprubetă se agită și după 5 minute se citește extincția probei (E p) și a

standardului (Es) față de blanc, în cuva de 1 cm, la  = 510 nm.
Calcul:
Sideremia se calculează cu următoarea formulă:
Fe g% = Ep/Es•Cst = Ep/Es•100 (Cst = concentrația standardului de fer = 100 g
%)
Valori normale: - femei: 80-130 g% (14,3-23,3 moli/l)
- bărbați: 90-160 g% (16,1-28,6 moli/l)
Valori crescute: creșterea reabsorbției (absența blocadei mucoasei), depozitarea
excesivă a ferului în organism (hemosideroză, hemocromatoză), tratament cu fer în
exces, etc.
Valori scăzute: scăderea aportului (dietă inadecvată, regim făinos-lactat),
scăderea absorbției (rezecții de stomac/intestin, diaree cronică, sindrom de
malabsorbție), aclorhidrie, pierderi mari de sânge.
Proteina plasmatică transportoare de fer este transferina (siderofilina) sintetizată în
ficat. Capacitatea totală de fixare a ferului (CTFFe) corespunde cantității totale de
siderofilină și se exprimă în g Fe/100 ml plasmă. Valorile normale ale CTFFe se
încadrează între 250-420 g% Fe. În deficitul de transferină sunt scăzute atât sideremia
cât și, evident, CTFFE. În anemia feriprivă sideremia este mult scăzută, în timp ce
CTFFe este mult crescută, cauza fiind utilizarea ferului plasmatic pentru producția de
hemoglobină. La rândul ei producția accelerată de hemoglobină poate fi cauzată de
pierderile cronice de sânge, sarcini repetate, hemoragii puternice.

88
 Dozarea fosfatului anorganic din ser prin
metoda Briggs ( cu deproteinizare)

În serul sanguin și alte lichide biologice fosforul se găsește sub trei forme:
1. Combinat în proteine (a) sau acizi nucleici (b) ca:
(a) fosfoproteine ( cazeina din lapte, vitelina din gălbenușul de ou)
(b) nucleoproteine (mediul intracelular animal, etc.).
2. Sub formă acidosolubilă, adică neprecitabilă cu acid tricloracetic:
a. fosfor anorganic ( acid ortofosforic (H3PO4), H2PO4-, HPO42-,
Me4P2O7), b. nucleotide, c. esteri fosforici ai glucidelor, d. acid fosfogliceric, e. acid
fosfopiruvic, f. acid creatinfosforic, g. acizi trifosforici
3. Fosfolipide: lecitine, cefaline, sfingomieline etc.
Fosfații anorganici îndeplinesc unele roluri în lichidele și țesuturile biologice:
a) Sistemul tampon al fosfaților (H2PO4-/ HPO42-). În organismul uman mediul
intern are bazicitatea ușor crescută peste neutralitate, pH = 7,35 -7,45. Menținerea
constantă a pH-ului în mediu intern este realizată, alături de alte sisteme tampon, prin
sistemul tampon al fosfaților. Acest sistem poate fi alcătuit din două săruri: fosfat
monoacid (Na2HPO4 sau K2HPO4) - care constituie componenta bazică a sistemului - și
fosfatul diacid (NaH2PO4 sau KH2PO4) care este componenta acidă. De fapt,
componentele funcționale în cursul tamponării sunt anionii acestor săruri: HPO 42- și
H2PO4-. La pH-ul normal (7,4), concentrația anionului HPO 42- este aproximativ de 5 ori
mai mare decât cea a anionului H2PO4-.
Componenta bazică, HPO42-, tamponează aciditatea mediului prin reacția:
HPO42- + H+ --------- H2PO4-
Componenta acidă, H2PO4-, eliberează protoni care neutralizează ionii OH - ai
bazelor:
H2PO4- + OH- ------------ H2O + HPO42-
După cum se observă, produșii rezultați în ambele cazuri sunt componentele
sistemului tampon.
Sistemul tampon al fosfaților este operant în special în hematii, dar și în celulele
tubulilor renali.
b) În sânge există un raport aproximativ invers proporțional între ionii fosfat și
calciu. La nivel renal, hormonul paratiroidian crește reabsorbția calciului și inhibă

89
reabsorbția ionilor fosfat (acțiune fosfaturică). Efectele la nivelul oaselor și rinichilor,
ale hormonului cresc calcemia, fără o creștere echivalentă a concentrației fosfatului,
împiedicându-se astfel atingerea unor concentrații critice la care acești ioni să formeze
fosfat tricalcic insolubil. De fapt concentrațiile serice ale acestor ioni depășesc pragul de
solubilitate al fosfatului tricalcic. Totuși, conținutul în proteine și alți metaboliți din ser
previne precipitarea sării tricalcice.
Principiu:
Se precipită proteinele cu acid tricloracetic și se separă prin filtrare. În filtratul
acidulat fosfatul anorganic, împreună cu molibdatul de amoniu, formează
fosfomolibdatul de amoniu ( un complex de culoare galbenă):

12 (NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21H+----- (NH4)3PO4  12MoO3 + 21NH4+ +12H2O

(galben)

HPO42- + 12MoO42- + 3NH4+ +23H+  (NH4)3[P(Mo3O10)4].6H2O + 6H2O

Aceasta este redus la albastru de molibden (un amestec de oxizi de molibden,
(MoO2)2.MoO4, fin dispersați în apă) de către hidrochinonă și apoi sulfit de sodiu.
Intensitatea culorii albastre este proporțională cu concentrația complexului, deci cu
cantitatea de fosfat anorganic din probă, adică culoarea produsă de oxizii de molibden
este fotometrabilă (se supune legii Lambert-Beer).
Aparatură: - Spectrofotometru Spekol.
Reactivi: - Acid tricloracetic 20%
- Soluție de molibdat de amoniu în mediu acid obținut prin dizolvarea
a 25g molibdat de amoniu în 300ml H 2O la care se adaugă 75ml
H2SO4 concentrat iar apoi se completează la 500ml cu apă.
- Soluție de hidrochinonă 1% acidulată cu o picătură de H 2SO4
concentrat.
- Soluție sulfit de sodiu 20% care se împrospătează la fiecare serie de
determinări.
- Soluție standard stoc de fosfat (2 mgP/ml) preparată folosind ca
substanță etalon KH2PO4.
- Soluție standard de lucru (20 gP/ml) obținută prin diluarea soluției
stoc de fosfat.
Curba de calibrare

90
 1 2 3 4
În baloane Erlenmeyer se măsoară:
Sol. Standard de lucru de P
(1ml=20gP), ml 0,5 1 3 5
Acid tricloracetic 20%, ml 2 2 2 2
Apă bidistilată, ml 7,5 7 5 3
Din acest amestec se măsoară în
baloane Erlenmeyer: 5 5 5 5
Molibdat de amoniu, ml 1 1 1 1
Sulfit de sodiu 20%, ml 1 1 1 1
Hidrochinonă 1%, ml 1 1 1 1
Apă bidistilată, ml 2 2 2 2

Se omogenizează conținutul baloanelor și după 30 min. se citește extincția față de blanc

la =600 nm.

Modul de lucru:
Se prepară o probă și un blanc în conformitate cu tabelul de mai jos:

Proba Blanc
În baloane Erlenmeyer se măsoară:
Ser, ml 2 -
Apă bidistilată, ml 4 5
Acid triloracetic 20%, ml 4 -
Agitare energică și repaus 10 min
Filtrare în eprubete + -
În baloane Erlenmeyer se măsoară:
Din filtrat, ml 5 -
Molibdat de amoniu, ml 1 1
Sulfit de sodiu 20%, ml 1 1
Hidrochinonă 1%, ml 1 1
Apă bidistilată, ml 2 2

91
 Se omogenizează conținutul baloanelor și după 30 min se citește extincția probei

față de blanc la 600 nm.

Determinarea fosfatemiei se face raportând extincția probei citită față de blanc la
curba de etalonare.

Valori normale: - adulți:2,5-4,5 mg/100 ml ser (0,8-1,5 mmol/l)

- copii: 4-6 mg/100 ml ser (1,3-1,9 mmol/l)

Variații patologice:
Valori scăzute: Hipofosfatemii apar în hiperparatiroidism, rahitism, osteomalacie.
Valori crescute: Hiperfosfatemii apar în hipoparatiroidism, acromegalie,
hipervitaminoză D, tubulopatii renale, insuficiențe renale acute
și cronice.

Compuși organici

Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl

Principiu:
Dozarea azotului din materiale biologice se face după metoda pusă la punct de
către Kjeldahl în 1883. Componentele organice azotate din ser se transformă prin
mineralizare în săruri de amoniu care în aparatul Wagner-Parnas eliberează amoniac.
Amoniacul este captat într-o soluție de H 2SO4 în exces iar excesul de H2SO4 se titrează
cu o soluție de NaOH în prezența indicatorului Groak.
Reactivi: - H2SO4 conc.
- Amestec catalizator CuSO4 . 5 H2O și K2SO4 (1:3), (m:m)
- H2O2 3 %;
- NaOH 30 %;
- H2SO4 N/100;
- NaOH N/100;
- Indicator Groak: la 100 ml sol. alcoolică saturată de roșu metil
se adaugă 4 ml sol. de albastru de metilen 1 %;
Dozarea decurge în trei faze: mineralizarea, antrenarea cu vapori și titrarea

92
 Mineralizarea pentru distrugerea materiei organice se face cu H 2SO4 conc., la
temperatură ridicată și în prezența ionilor de cupru:
2 N + 3 C + 3H2SO4  2 NH3 + 3 CO2 + 3 SO2
Sulfatul de potasiu ridică temperatura de fierbere la 350-400 0 C iar ionii de
cupru, din sulfatul de cupru, au rolul de a cataliza reacția. În cazul mineralizării NH 3
reacționează cu H2SO4 prezent, transformându-se în sulfat de amoniu, conform reacției:
2 NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4
Înaintea antrenării cu vapori, NH 3 se eliberează din sulfatul de amoniu cu NaOH
concentrat:
(NH4)2SO4 + 2 NaOH  Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O
și se antrenează cu vapori în aparatul Wagner-Parnas, într-un volum cunoscut de H 2SO4
N/100. Excesul de H2SO4 N/100 se titrează cu NaOH N/100 în prezență de indicator
Groak.
Aparatură: Aparatul Wagner-Parnas este alcătuit din balonul A (generator de
vapori) în care se formează vaporii de apă, care prin vasul B (deflegmator) trec în
balonul de antrenare C antrenând de aici amoniacul. Aburii sunt condensați în
refrigerentul descendent D, iar soluția apoasă de amoniac se colectează în flaconul
Erlenmayer E care conține soluția de H2SO4 N/100.
Modul de lucru:
1) Mineralizarea :
Într-un balon Kjeldahl de mineralizare se introduc 1 ml H2O distilată, 0,1 ml
ser, 2 ml H2SO4 conc., un vârf de spatulă amestec catalizator și 2-3 picături soluție de
H2O2. Mineralizarea are loc pe flacără mică sub nișă. După 10 minute balonul Kjeldahl
se răcește la temperatura camerei fiind lăsat în repaos sub nișă (atenție, emană vapori
corozivi de H2SO4 !).

93
 .

2) Spălarea aparatului Wagner-Parnas:

Înaintea acestei distilări aparatul Wagner-Parnas, cu reziduuri de la antrenarea
precedentă se spală. Pentru aceasta se procedează în felul următor: Se înlocuiește
flaconul E cu un pahar Berzelius care conține apă distilată. Se spală pâlnia F cu H 2O
distilată, apoi se închide din nou robinetul ei. Prin răcirea și condensarea vaporilor de
apă presiunea din aparat scade sub cea atmosferică și astfel conținutul vasului de
distilare C este aspirat în vasul B, din care apa se îndepărtează prin robinetul H în
paharul Berzelius. Se răcește balonul A cu ajutorul unei cârpe ude până când apa
distilată din pahar este aspirată până în vasul B de unde se îndepărtează prin robinetul H
iar după terminarea spălării se deschide robinetul de siguranță G și se poate pregăti
distilarea.

3) Antrenarea NH3 cu vapori de apă.

Într-un flacon Erlenmeyer (E) de 100 ml se pipetează 20 ml H 2SO4 N/100, se
adaugă 2-3 picături de indicator Groak și flaconul se așează sub refrigerentul D în așa
fel încât capătul acestuia să fie introdus în soluție. Conținutul mineralizat al balonului
Kjeldahl se diluează cu precauție cu 2 ml H 2O distilată și se introduce prin pâlnia F în
vasul de distilare C. Balonul Kjeldahl se spală de 3 ori cu câțiva ml de apa distilată iar
aceasta se colectează tot în pâlnia F.
Se adaugă prin pâlnia F 20 ml NaOH 30%. Se închide robinetul pâlniei F, se
introduce flacăra sub balonul A și apoi se închide robinetul de siguranță G se așteaptă
până când vaporii antrenatori ajung la nivelul refrigerentului D, toate robinetele fiind
închise. Distilarea se face 3 minute, din acest moment, mai precis, după ce prima

94
picătură de condens cade pe tubul refrigerentului descendet D. În acest timp amoniacul
trece cantitativ în flaconul E.
După terminarea distilării se coboară flaconul în care s-a colectat condensul și se
lasă să mai picure câteva picături. Cu ajutorul unei pisete se spală capătul refrigerentului
D în acest flacon. Numai după aceasta se scoate becul de gaz de sub balonul A. După
aceasta se poate trece la spălarea aparatului prin procedeul descris mai sus. Conținutul
flaconului Erlenmayer E se supune titrării.

4) Titrarea
Excesul de H2SO4 N/100 din flaconul Erlenmeyer se titrează cu NaOH N/100 în
prezența indicatorului Groak.

Calcul :
1 ml sol. H2SO4 N/100 ................. 0,14 mg N

................... x

x = ( ) 0,14 mg N/0,1 ml sol.

a = 20 ml H2SO4 N/100
b = volumul de NaOH N/100 consumat la titrare.

Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului

Principiu:
Proteinele reacționează cu ionii de cupru în soluție alcalină formând un complex
proteic de culoare violetă. Avantajul constă în faptul că se folosește un singur reactiv în
care hidroxidul de cupru este menținut în soluție sub formă de complex format cu
tartratul dublu de sodiu și potasiu, stabilizat cu iodură de potasiu. Reacția de complexare
cu ionii Cu2+ este dată de compuși care conțin în molecula lor cel puțin două legături
peptidice.
Cel mai simplu compus care dă această reacție este biuretul, compus care ia
naștere prin încălzirea ureei.

95
 NH2
O C
NH2 t0 CuSO4
2O C NH
NH2 NH3 NaOH
O C
NH2
biuret

Aparatura: Spectrofotometru
Reactivi: - Soluția A: 4,5 g tartrat de sodiu și potasiu se dizolvă în 40 ml
NaOH 0,2 N. Se adaugă sub agitare 1,5 g CuSO 4.5 H2O dizolvat
în 10 ml H2O, apoi 0,5 g KI și se completează cu NaOH 0,2 N
până la 100 ml. Se conservă în sticlă brună timp nelimitat.
- Soluția B: se dizolvă 5 g KI în 1000 ml de NaOH 0,2 N. Se
conservă în sticlă brună timp nelimitat.
- Soluția de lucru: se diluează 1 volum soluție A cu 4 volume
soluție B. Se poate utiliza o săptămână, păstrându-se în sticlă
brună.
- NaCl 0,9 %.

Modul de lucru:

Se lucrează în 2 eprubete conform tabelului:

Proba Blanc
Sol. de lucru ml 5,0 5,0
NaCl 0,9% ml - 0,1
Ser ml 0,1 -

Se omogenizează conținutul eprubetelor și după 30 de minute se măsoară

extincția probei (E) față de blanc, la  = 546 nm, folosind cuva de 1 cm.

96
 Calcul:

c (g/100ml) =

E 18,4 = g proteine/100 ml ser ; VF -volumul final; VP -volumul serului; -coeficientul de

extincție procentual

Valori normale:
6,5 - 8,2 g/100 ml

Valori crescute se întâlnesc în: deshidratări acute produse de vărsături, diaree,

diabet, diabet insipid, poliurie; Hiperproteinemii apar și în: mielom multiplu
macroglobulinemia Waldenstrőm, boala Osler, boala Besnier-Boeck-Schaumann,
anemie pernicioasă, infecții acute și cronice
Valori scăzute: se întâlnesc în: afecțiuni hepatice, ciroze hepatice, intoxicații cu
benzen, CCl4; Proteinemia scade și în stări de șoc produse de arsuri, hemoragii;
Hipoproteinemii se întâlnesc în: afecțiuni renale, tumori maligne, inaniție.
Hiperproteinemie relativă apare în deshidratări acute produse de vărsături,
diaree, poliurie care apare la pacienții cu diabet insipid și diabet zaharat. În cazurile
enumerate nu crește de fapt cantitatea de proteine circulante ci crește doar concentrația
lor din cauza pierderii de lichid din organism.
Hiperproteinemie absolută apare în boli inflamatorii cronice (tuberculoză
pulmonară, lupus eritematos sistemic, sarcoidoză). În mielomul multiplu (plasmocitom)
se produce proliferarea canceroasă a unei clone de plasmocite producătoare de
imunoglobuline al căror nivel crește în sânge. Macroglobulinemia Waldenström este un
limfom malign cu hipergamaglobulinemie. Apare hiperproteinemie și în unele forme de
leucemie.
Hipoproteinemie relativă apare în cadrul diluării sângelui circulant prin
administrare de perfuzii sau prin ingerare excesivă de lichide.
Hipoproteinemie absolută apare în deficitul genetic de anticorpi sau albumină,
afecțiuni hepatice grave (ciroză cu evoluție spre insuficiență hepatică, intoxicații cu
benzen, CCl4) în care este compromisă funcția hepatică de sinteză a proteinelor.
Pacienții cu tumori maligne prezintă hipoproteinemie datorită catabolismului proteic
accentuat. În inaniție și sindrom de malabsorbție apare carență de proteine datorită
aportului insuficient, sau datorită tulburării de absorbției intestinală. Se pot pierde

97
cantități însemnate de proteine în sindromul nefrotic (prin filtrul renal lezat trec
numeroase molecule de proteină și se elimină prin urină), sau poate avea loc pierdere
de proteine pe cale intestinală (enterocolită). Hipoproteinemie mai apare în arsuri
extinse, hemoragii, ascită (lichid bogat în proteine apărut în cavitatea abdominală în
cadrul insuficienței hepatice).

Dozarea proteinelor din lapte

Principiu:
Grupările aminice ale proteinelor (-NH 2) se blochează cu formaldehidă,
rămânând astfel libere grupările carboxilice (-COOH), care se titrează cu o soluţie de
hidroxid de sodiu de normalitate şi factor cunoscute.
Tehnica de lucru folosită permite calcularea directă a conţinutului de substanţe
proteice totale.
Reactivi:
- NaOH soluţie 0,143 N, 1 ml din această substanţă corespunde la un conţinut de
proteină de 1%.
- Aldehidă formică soluţie 40%, neutralizată înainte de folosire faţă de
fenolftaleină.
- Oxalat de potasiu soluţie 28% neutralizată
- Sulfat de cobalt (CoSO4 . 7H2O) soluţie 5%
- Fenolftaleină soluţie alcoolică 2%
Modul de lucru:
- Pregătirea probei de comparaţie. Într-un vas Erlenmeyer de 100 ml se
introduc 25 ml lapte, 1 ml soluţie de oxalat de potasiu şi 0,5 ml soluţie de sulfat de
cobalt, apoi se omogenizează bine întregul conţinut. Se dezvoltă imediat o culoare roz,
stabilă. Aceasta constituie proba de comparaţie.
- Determinarea. Într-un vas Erlenmeyer asemănător cu cel folosit la proba de
comparaţie se introduc 25 ml lapte, 0,25 ml soluţie de fenolftaleină şi 1 ml soluţie de
oxalat de potasiu. Se agită şi după 1 minut se titrează cu soluţie de NaOH, folosind
microbiureta, până la identitate de culoare cu proba de comparaţie.
Laptele cu aciditate liberă peste valorile normale nu este apt pentru determinarea
titrului proteic (la neutralizare volumul maxim de NaOH să fie sub 1,75 ml).

98
 După neutralizare se adaugă 5 ml aldehidă formică, se omogenizează şi după 1
minut de titrează din nou cu soluţie de hidroxid de sodiu până la coloraţie identică cu a
probei de comparaţie.

Calculul rezultatelor:
În condiţiile metodei de lucru descrise, volumul în ml a soluţiei de hidroxid de
sodiu 0,143 N folosit la a doua titrare reprezintă conţinutul de proteine % din proba de
lapte supusă analizei (titru proteic).
Rezultatul se exprimă din media a două determinări efectuate în paralel
(diferenţa între acestea nu trebuie să fie mai mare de 0,05% substanţe proteice).
Interpretarea rezultatelor:
Conţinutul proteic al laptelui este în medie 3,5%.
În urma determinării conţinutului de substanţe proteice totale din lapte, pot
rezulta două categorii de situaţii anormale:
- Conţinut de substanţe proteice sub limita minimă (standardizată) de 3,2% este
dovada adaosului de apă în lapte.
- Conţinut de substanţe proteice totale peste valorile normale poate apare în caz
de lapte falsificat prin adaos de substanţe azotoase de tipul azotaţilor sau ureei, sau
dozarea s-a efectuat din lapte colostral.

Determinarea pH-ului laptelui

Aciditatea laptelui se apreciază prin determinarea pH-ului. În cazul laptelui, pH-

ul se paote determina prin metoda cu hârtie indicator (metodă orientativă) şi prin
metoda potenţiometrică (metodă de referinţă).
Metoda cu hârtie indicator
Principiu:
Se recurge la umectarea hârtiei indicator cu o picătură din laptele al cărui pH
dorim să-l cunoaştem şi compararea nuanţei de culoare cu o scară etalon.
Rezultatele au caracter orientativ, întrucât cea mai sensibilă hârtie indicator are
domeniul de apreciere cuprins între 0,25-0,5 unităţi de pH.
Metoda potenţiometrică

99
 Principiu:
Se măsoară diferenţa de potenţial dintre un electrod de referinţă şi un electrod de
măsurare introduşi în proba de lapte care se cercetează. Rezultatele exprimate în unităţi
pH se citesc direct pe scala aparatului.
Reactivi și materiale:
Se utilizează un pH-metru prevăzut cu un electrod de calomel (electrodul de
referinţă) cu potenţial zero şi un electrod de sticlă (electrod de măsurare).
Modul de lucru:
Pentru etalonarea aparatului se folosesc în general două soluţii tampon cu pH-ul
cel mai apropiat de cel presupus la proba de lapte care se analizează – în general pentru
laptele proaspăt se folosesc la etalonare soluţii tampon cu pH 6 şi 7, aduse la
temperatura de 20oC.
Între cele două etalonări electrozii se spală cu apă distilată şi se usucă prin
tamponare cu hârtie de filtru, la fel şi după etalonare, apoi se introduc electrozii în
paharul conţinând proba de lapte adusă la temperatura de 20oC şi se citeşte pH-ul. După
terminarea acestei operaţii, electrozii se spală bine cu apă distilată, se usucă prin
tamponare cu hârtie de filtru şi se ţin pentru conservare în condiţii corespunzătoare.
Metoda potenţiometrică permite aprecierea exactă a pH-ului cu câteva zecimale.

Interpretarea rezultatelor:
Valorile normale ale pH-ului laptelui proaspăt sunt cuprinse între 6,4-6,7. Dacă
găsim pH peste acest interval, este un indiciu de falsificare prin adaos de substanţe
alcaline. La laptele acidulat valoarea pH-ului este mult sub 6,4.

Caracteristicile şi compoziţia laptelui

Proprietăţile laptelui colostral

Laptele colostral se caracterizează printr-un conţinut mai mare de substanţă
uscată (are densitate mai mare, în jur de 1,04-1,08), cantitate mai mare de albumine,
globuline şi de substanţe minerale, iar conţinutul de cazeină şi lactoză este mai mică faţă
de laptele obişnuit. Compoziţia chimică a grăsimii din colostru se caracterizează printr-

100
un conţinut mai ridicat în steride (colesterol) şi de fosfolipide (lecitină), ceea ce îi
conferă o culoare gălbuie pronunţată şi formează o emulsie mai stabilă. Colostrul are un
pH mai mic decât laptele obişnuit, dar este mai rezistent la acidifiere spontană.
Colostrul nu coagulează spontan prin învechire şi este mai susceptibil la alterare
proteolitică decât laptele.
Însuşirile organoleptice ale laptelui
Laptele constituie o soluţie apoasă în care se găsesc emulsionate globule de
grăsime, suspendate micele proteice şi dizolvate glucide, vitamine şi substanţe minerale.
Însuşirile organoleptice reprezintă ansamblul proprietăţilor laptelui percepute prin
stimuli, cunoaşterea acestora are o semnificaţie deosebită pentru aprecierea calităţii şi
defectelor laptelui.
Culoarea laptelui este albă, însă cu nuanţe diferite. Culoarea albă este
imprimată în primul rând de cazeină şi albumină, care se găsesc în stare coloidală, şi în
al doilea rând de globulele de grăsime afate în stare de emulsie. Laptele se prezintă ca
un lichid omogen, opalescent, fără sedimente. Laptele are un miros specific, aceasta
trebuie să fie uşor butiric şi cetonic datorită prezenţei acizilor graşi cu catenă scurtă
(butiric, caprilic) şi a compoziţiei cetonice (acetonă, acid acetonic). Se disting patru
gusturi fundamentale în funcţie de prospeţimea şi natura lactatelor (dulceag, acidulat,
sărat şi amar). Senzaţia de dulce este dată de lactoză.
Compoziţia laptelui
Componentele azotate reprezintă partea cea mai complexă din lapte. Protidele
alcătuiesc 94-95% din totalul componentelor azotate şi sunt reprezentate de cazeine şi
proteinele din zer (lactalbumina, lactoglobuline şi proteaz-peptone). Conţinutul în
proteine a laptelui de vacă este de 3,4-3,5%, iar în cazul laptelui de femeie 1,0-1,2%,
prezentând valori mai mari în laptele de tranziţie (2%) şi imediat după naştere (5%), în
special la femeile care au născut prematuri (15-20%, paralel cu valori mai ridicate ale
grăsimilor). Laptele conţine şi substanţe azotate neproteice (5-6% din substanţele
azotate), cum ar fi: uree, creatinină, hipoxantină, aminoacizi liberi, amoniac şi vitamine
din grupul B; procentul acestora creşte prin încălzirea la temperaturi peste 50 oC, când
are loc degradarea componentelor protidice. Laptele de vacă conţine aminoacizi
ramificaţi, incomplet metabolizabili. Concentraţia taurinei libere (H 2N-CH2-CH2-SO3H)
este mult mai ridicată în laptele şi colostrul de femeie comparativ cu laptele de vacă.
Taurina e un aminoacid necodificat genetic care facilitează mielinizarea, ajutând astfel
la dezvoltarea corespunzătoare a creierului.

101
 Alimentele de origine animală (din lapte, carne, ouă) au valoare nutritivă mult
mai mare comparativ cu proteinele vegetale, datorită conţinutului de proteine complete,
bogate în aminoacizi esenţiali, care sunt: valina, leucina, izoleucina, fenilalanina,
triptofanul, treonina, metionina şi lizina. Proteinele animale pot fi digerate mult mai
bine, fiindcă pepsina şi tripsina le hidrolizează mai uşor. Aproximativ 30% dintre
alimentele vegetale sunt deficitari în metionină, chiar şi proteinele din soia conţin
cantităţi relativ reduse de metionină şi cistină. Consumul unei jumătăţi de litru de lapte
pe zi satisface necesarul de aminoacizi esenţiali, cu excepţia metioninei şi cistinei
(cistina poate satisface parţial necesarul de aminoacizi cu sulf). Într-o alimentaţie
sănătoase în copilărie 60-70% din proteine trebuie să fie de origine animală.
Cazeinele reprezintă 80% din totalul protidelor în cazul laptelui de vacă, iar
proteinele zerului constituie 20%. În cazul laptelui de femeie, raportul este invers:
proteinele din lactoser constituie 70-80% din totalul protidelor, iar cazeina reprezintă
numai 20-30%. Din punct de vedere chimic, cazeinele sunt fosfoproteine care au ca
grupare prostetică fosforilserina sau fosforiltreonina. Compoziţia cazeinei variază în
funcţie de specie. Astfel, cazeina din laptele de vacă are un conţinut mai scăzut de
cisteină, respectiv de sulf şi de glucide, comparativ cu laptele uman. Cazeina formează
uşor polimeri, alcătuind soluţii coloidale. Laptele conţine micele de cazeină şi mici
agregate de cazeină solubilă. Micelele de cazeină au formă de particule sferice
înglobând calciu, fosfat şi citrat, între micele şi cazeina solubilă se stabileşte un
echilibru dependent de concentraţia ionilor de calciu.
Compoziţia cazeinei se modifică substanţial în cursul lactaţiei. Laptele de mamă
este mai uşor digerabil comparativ cu laptele de vacă datorită dimensiunii mai mici a
micelelor de cazeină, prin urmare precipitatul mai mic este mai uşor accesibil enzimelor
digestive. Digerabilitatea laptelui de vacă poate fi ameliorată prin prelucrare termică.
Proteinele din lactoser reprezintă un amestec complex format din componente
nedializabile care rămân în zer după precipitarea cazeinei. În funcţie de solubilitatea lor,
proteinele din lactoser se clasifică în: globuline (lactoglobulina şi imunoglobuline),
albumine (lactalbumina şi albumina serică) şi proteaz-peptone. Prin încălzire la 100 oC,
globulinele şi albuminele suferă un proces de denaturare şi precipită, spre deosebire de
proteaz-peptone, care nu precipită în aceste condiţii.
Dintre globuline, -lactoglobulina este absentă în laptele de mamă (identificarea
ei denotă falsificarea laptelui de femeie), constituie fracţiunea alergogenă din
compoziţia laptelui de vacă. În schimb laptele de mamă conţine o proteină care leagă

102
vitamina B12, absentă în laptele de vacă, contribuind la efectul protector al laptelui de
mamă datorită competiţiei dintre bacterii şi această proteină de a lega vitamina B 12.
Lactoferina, o glicoproteină cu proprietăţi bacteriostatice, care transportă fierul,
este de zece ori mai bine reprezentată în laptele de mamă (0,1-0,2%), în special în
colostru (0,5%). Lactoferina joacă rol important în rezistenţa împotriva infecţiilor
intestinale, mai ales cele cauzate de bacteria Escherichia coli, datorită legării fierului
necesar multiplicării germenilor patogeni din tractul intestinal. Lactoferina protejează în
primele 6 luni sugarii alimentaţi natural de apariţia anemiei feriprive. După această
vârstă se începe diversificarea, introducând în dieta sugarului printre altele alimente cu
conţinut mare de fier (ficat, gălbenuş de ou) pentru a preveni această boală carenţială.
Imunoglobulinele constituie 10% din totalul proteinelor din laptele de mamă.
Principala fracţiune este cea de IgA, se mai găsesc IgG şi IgM. În laptele de vacă
principala fracţiune este reprezentată de IgG (1,4-4%), iar celelalte imunoglobuline sunt
mai slab reprezentate: IgA constituie 0,2-0,7%, şi IgM 0,1-0,7% din totalul proteinelor
din lapte. Globulinele se găsesc în concentraţii mai ridicate în colostru atât la bovine
(50% din totalul proteinelor), cât şi la om.
S-a demonstrat că la om în primele 24 de ore ale vieţii chiar 10-15% din IgA se
poate absorbi, datorită permeabilitatăţii crescute a peretelui intestinal la nou născuţi.
După prima zi de viaţă, imunoglobulinele alimentare nu mai pot pătrunde în torentul
sanguin al sugarului, dar joacă rol important în protecţia mucoasei intestinale, deoarece
imunoglobulinele din laptele matern, în special IgA nu sunt atacate de către enzimele
digestive, astfel ajung intacte la nivelul intestinului subţire, unde inhibă şi absorbţia
proteinelor străine. Imunoglobulinele laptelui de vacă sunt atacate de către enzimele
digestive ale sugarului, astfel nu pot exercita un efect protector antimicrobian.
Lactalbumina are cea mai mare valoare biologică dintre proteinele laptelui,
reprezintă 10-25% din totalul proteinelor prezente. Cazeina are valoare biologică mai
mică, dar amestecul dintre cele două are o valoare biologică foarte ridicată, care o
depăşeşte chiar şi pe cea a proteinelor din carne, în ciuda faptului că proteinele din carne
conţin cantităţi mai ridicate de lizină. Explicaţia constă în secvenţa de aminoacizi, care
la proteinele din carne realizează o zonă în care lizina este mai greu accesibilă
comparativ cu proteinele din lapte. În ciuda valorii biologice mai mari, preţul
proteinelor din lapte este mult mai mic comparativ cu cele din preparatele de carne.
Proteaz-peptonele sunt mult mai bine reprezentate în laptele matern comparativ
cu laptele de vacă. Proteaz-peptonele din laptele de femeie prezintă patru fracţiuni şi se

103
presupune că ar avea rol în facilitarea multiplicării bacteriei saprofite Bifidobacterium
bifidus.
În afară de proteinele amintite, laptele de mamă mai conţine 2 microglobulină,
ceruloplasmină (glicoproteină cupru-dependentă cu activitate feroxidazică),
galactotermină, o globulină care leagă corticosteroizi, etc.
Laptele conţine peste 60 de enzime care îşi au originea în celulele epiteliale
secretoare ale glandei mamare. Putem exemplifica dintre oxidoreductaze:
- catalaza, legată slab de membrana globulelor de grăsime, care precipită odată
cu cazeina la coagulare,
- xantinoxidaza se găseşte sub formă legată în complexele lipidoproteice din
membrana globulelor de grăsime, favorizează râncezirea laptelui prin efectul său
catalitic în cadrul unor reacţii prin care se produc specii reactive ale oxigenului,
- superoxid dismutaza este metal-enzimă conţinând cupru şi zinc, are efect
inhibitor asupra oxidării lipidelor din membrana globulară,
- lactoperoxidaza se găseşte în concentraţie mare în laptele de vacă şi este
solubilizată în lactoser.
Dintre hidrolaze, laptele conţine:
- lipaze, care produc hidroliza grăsimilor membranare şi sunt absorbite
ireversibil de membrana globulelor grase
- proteazele catalizează scindarea hidrolitică a proteinelor cu formare de proteaz-
peptone, peptide şi în final aminoacizi
- fosfatazele catalizează hidroliza esterilor acidului fosforic
- amilazele catalizează hidroliza polizaharidelor
- ribonucleaza catalizează hidroliza acizilor ribonucleici.
Glucidele din lapte sunt reprezentate în principal de dizaharidul lactoză, dar
există şi alte glucide cum este monozaharidul galactoză cu rol în procesul de
mielinizare. Laptele de vacă conţine mai puţine glucide decât laptele de femeie, aşadar
se va completa cu zahăr (zaharoză) până la 5%. Laptele de vacă conţine mai puţină
galactoză comparativ cu laptele de femeie, de aceea mielinizarea are loc mai lent la
sugarii alimentaţi artificial cu lapte de vacă.
Lactoza se transformă prin fermentare sub acţiunea bacteriilor lactice în acid
lactic. Produşii intermediari şi finali modifică gustul, mirosul şi valoarea nutritivă a
laptelui. Preparatele de lapte acidulate sunt foarte utile în tratamentul dietetic al
sugarilor cu toleranţă digestivă scăzută.

104
 Creşterea glicemiei după consumul de lapte este mai mică decât în cazul altor
glucide, datorită particularităţilor de absorbţie la nivel intestinal ale componenţilor
lactozei: glucoza şi galactoza. Scindarea lor se realizează sub acţiunea lactazei secretată
de pancreas. În lapte apar şi produşi intermediari ai metabolismului glucidic.
Lactoza influenţează absorbţia calciului şi a altor metale probabil prin formarea
unor complecşi uşor solubili. Sub acţiunea temperaturii, tratării cu alcooli sau păstrare
îndelungată, lactoza trece în lactuloză, formată din galactoză şi fructoză.
Laptele conţine acid citric, care favorizează absorbţia calciului şi magneziului,
datorită formării unor geluri uşor solubile cu aceşti ioni.

Tabelul 1. Compoziţia chimică a laptelui

Nr. curent Specificare Unitate de măsură Lapte de vacă Lapte uman

1. Substanţă uscată % 12,6-12,8 12,35
2. Grăsime % 3,7-3,9 4,50
3. Proteine % 3,3-3,4 1,30
4. Lactoză % 4,7-4,8 6,30
5. Săruri minerale % 0,7-0,9 0,25

Lipidele din lapte reprezintă componente importante din punct de vedere nutritiv
şi organoleptic. Laptele conţine cca. 35 g de lipide pe litru sub forma unor mici globule
cu diametrul de 3-5 m. Globulele de grăsime prezintă în exterior o membrană
constituită din mono-şi di- şi trigliceride, acizi graşi, steroli, fosfolipide, glicolipide,
proteine, caroten. Membrana împiedică aglomerarea acestor particule care au aceeaşi
încărcătură electrică şi astfel sunt menţinute în emulsie.

Tabelul 2. Tipurile de acizi graşi din compoziţia laptelui

Tipul de Grupa de acizi graşi (exprimare în procente)

lapte C4 C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 C18:1 C18:2
Lapte 0,1 0,2 0,3 2,1 7,2 10,9 29,6 35,4 7,5 6,7
uman

105
 Lapte de 1,4 2,2 1,8 3,6 4 13,1 30,2 27,1 13,6 3
vacă

Capacitatea mare de absorbţie a lipidelor din lapte le conferă acestora rol

vehiculant pentru substanţele liposolubile (de exemplu vitaminele A, D, E, K şi
provitaminele respective). Oxidarea lipidelor se produce la nivelul dublelor legături din
acizii graşi nesaturaţi ai lipidelor din membranele globulelor de grăsime, proces
favorizat de creşterea acidităţii, de lumină şi de urmele de fier sau cupru. Lipoliza
grăsimilor se produce sub acţiunea lipazelor din lapte sau a lipazelor bacteriene.
Conform tabelului 2. se poate observa că laptele de vacă conţine cantităţi mult
mai mari de acizi graşi cu catenă scurtă (C4-C8) comparativ cu laptele uman, ceea ce
poate provoca iritaţii ale mucoasei digestive.
Vitaminele din lapte sunt hidro- sau liposolubile. Concentraţia în vitamina A,
acid folic, vitamina B12 şi acid ascorbic este suficient de ridicată pentru a acoperi
necesităţile organismului, evitându-se astfel îmbolnăvirile prin carenţă.
- Vitamine liposolubile:
Laptele conţine , ,  caroteni şi vitamine A. Carotenii se găsesc în lapte
legaţi de proteine, culoarea galbenă a grăsimii din lapte fiind datorată acestora. Prin
oxidarea grăsimii, carotenii se degradează uşor, fiindcă conţin multe duble legături.
Cantitatea de caroten din lapte variază mult în funcţie de alimentaţie, respectiv de sezon.
În perioada de lactaţie o cantitate mare de vitamine A sintetizate la nivel hepatic trec în
lapte. Lumina, acidifierea laptelui şi temperatura afectează activitatea vitaminelor A.
Vitaminele D se găsesc în concentraţii diferite în lapte în funcţie de sezon,
cantităţi mari se găsesc mai ales în ser. Pentru prevenirea instalării rahitismului, se
recomandă administrarea a două picături de vitamina D 3 (de ex. Vigantol) începând din
perioada de nou născut până la vârsta de 2 ani (mai ales în anotimpurile reci); după unii
specialişti acest tratament preventiv ar fi bine să continue până la 3-5 ani.
Dintre vitaminele E (tocoferoli) reprezentantul principal este -tocoferolul,
compusul biologic cu cea mai mare activitate vitaminică din această grupă. Concentraţia
de tocoferol din lapte variază foarte mult în funcţie de alimentaţie, sunt degradaţi sub
acţiunea radiaţiilor ultraviolete şi au rol de protejare a lipidelor din lapte.
- Vitamine hidrosolubile:
Vitamina B1 (tiamina) se găseşte în lapte sub formă liberă şi legată de o proteină
sau sub formă fosforilată. Vitamina B2 (riboflavina) se găseşte în stare liberă şi legată la

106
suprafaţa globulelor de grăsime. Intrând în compoziţia coenzimei FAD (flavin-adenin-
dinucleotid), intervine în procese de oxidoreducere. Este o vitamină foarte fotosensibilă
şi în laptele expus la soare câteva ore pierde mai mult de jumătate din activitatea
vitaminică.
Vitamina B6 (piridoxinele) se găsesc în lapte preponderent sub formă liberă ca
piridoxal. Conţinutul în vitaminele B6 este de 5-10 ori mai mare în laptele de vacă
comparativ cu laptele uman. Vitamina B 12 se găseşte în cantitate mică în lapte totuşi
activitatea sa este considerabilă. O treime apare legată de proteinele din lactoser. Este
stabilă la aer, dar sensibilă la lumină. Vitamina PP (nicotinamida) se găseşte în lapte în
stare liberă, în cantităţi reduse, deşi proteinele din lapte conţin cantităţi mari de
triptofan, precursorul vitaminei PP. Această vitamină este stabilă la aer şi lumină.
Vitamina C (acidul ascorbic) se găseşte de asemenea în lapte, este sensibilă la
căldură şi prooxidanţi. Acidul folic se găseşte în cantităţi variabile legat de proteine.
Este sensibil la lumină şi faţă de oxigen, dar este stabil la căldură. Biotina (vitamina H)
se găseşte în stare liberă în lapte dar în cantităţi foarte mici. Este stabilă la lumină, dar
sensibilă la aer.
Hormonii estrogeni şi prolactinele din lapte scad pe măsură ce lactaţia
progresează, conţinutul de progesteron este proporţional cu cel de lipide. Au mai fost
puse în evidenţă: prostaglandine, gonadotropine, tireotropină şi poliamine.
Elementele minerale se găsesc în lapte fie în soluţie (lactoser) fie sub formă
legată în fracţiunea insolubilă sau coloidală. Unele elemente minerale se găsesc exclusiv
sub formă de ioni (Na+, K+, Cl-), fiind foarte accesibile organismului. Alte elemente (Ca,
Mg, P, S) se găsesc în fracţiunea solubilă a laptelui parţial sub formă liberă, ionizată
(Ca2+, Mg2+), parţial sub formă de săruri nedisociate sau sub formă de complexe (esteri
fosforici şi fosfolipide).

Tabelul 3. Compoziţia minerală a laptelui

Minerale Specia
Femeie (g/l) Vacă (g/l)
Potasiu (K2O) 0,5-0,7 1,6-1,8
Sodiu (Na2O) 0,16-0,2 0,5-0,7
Calciu (CaO) 0,2-0,4 1,3-1,8

107
 Magneziu (MgO) 0,05-0,08 0,14-0,20
Fosfor (P2O5) 0,15-0,4 1,0-2,3
Clor (NaCl) 0,5-0,8 1,1-1,8
Sulf 0,15 0,35

Calciul, magneziul, fosforul şi sulful se găsesc în fracţiunea coloidală a laptelui

asociate sau legate de micele de cazeină. Fracţiunea coloidală salină a laptelui include
aproximativ 2/3 din calciu, 1/3 din fosfat şi 1/3 din magneziu. Toate aceste minerale
sunt în general legate de cazeină. Laptele conţine şi o serie de oligoelemente în
concentraţie variabilă.
Elementele minerale sunt componentele din lapte cel mai bine absorbite şi
reţinute. Calciul din lapte se absoarbe mai uşor decât alte elemente. Laptele nu conţine
acid oxalic care poate împiedica absorbţia acestui element. Raportul calciu/fosfor din
laptele uman este superior celui din alte alimente şi face din lapte o sursă excelentă de
calciu.
Concentraţia sodiului din laptele uman este mai scăzută în comparaţie cu laptele
de vacă, de aproximativ 3-4 ori mai mică. Alimentaţia artificială cu lapte de vacă crează
încărcătură osmotică mare care produce hipertrofierea rinichilor În ciuda concentraţiei
mai mari a calciului şi fosforului din laptele de vacă, raportul Ca/P este inadecvat
absorbţiei.
Valoarea nutritivă a laptelui
Valoarea nutritivă reprezintă capacitatea laptelui de a satisface cerinţele
organismului omului în energie şi substanţe, cu rol plastic şi biostimulator. Valoarea
nutritivă a laptelui este dată de valoarea sa energetică şi de valoarea biologică.
- Valoarea energetică este dată de energia degajată de lapte cu ocazia combustiei
lipidelor, glucidelor şi proteinelor (650-720 Kcal/l pentru laptele de vacă).
- Valoarea biologică reprezintă în alimentaţie raţia de azot asimilată şi reţinută
de organism pentru a acoperi cerinţele azotate. Valoarea biologică este numită
coeficient de retenţie a substanţelor azotate (0,75 pentru lapte), este dată şi de raportul
dintre fracţiunile proteice şi compoziţia în aminoacizi, în săruri minerale şi în vitamine.
Valoarea biologică ridicată a laptelui este întregită şi de prezenţa sărurilor minerale şi a
vitaminelor cu rol plastic.

108
 Electroforeza proteinelor serice

Principiu:
Electroforeza se bazează pe proprietatea particulelor încărcate electric de a
migra spre polul pozitiv sau negativ sub acțiunea tensiunii electrice. În funcție de pH
proteinele se comportă ca anioni și vor migra spre anod (+), sau ca și cationi și vor
migra spre catod (-). În cursul electroforezei componenții amestecului de analizat se vor
separa datorită vitezelor de deplasare diferite. În funcție de mediul în care are loc
migrarea există două tipuri de electroforeză: electroforeza în fază liberă și electroforeza
zonală. În cazul electroforezei în fază liberă migrarea are loc în fază lichidă.
Electroforeza zonală folosește o fază solidă sau un gel de amidon, agar, agaroză etc.
pentru migrare. Electroforeza zonală este tipul cel mai folosit în laborator.
Aparate și materiale: - Sursă de curent continuu: redresor (0-500 V, 0-50 mA)
- Cameră de electroforeză confecționată din material
plastic care conține două cuve prevăzute cu electrozi de
platină, și o punte mobilă pe care se vor pune lamele cu
probele de analizat. În camera de electroforeză închisă cu
un capac se realizează echilibrul lichid (tampon)-vapori
de apă.

Schema aparatului de elecroforeză.

a) plăcuță de sticlă acoperită cu gel de agaroză; b) suport; c) benzi de hârtie de filtru;
d) soluție tampon; e) electrozi.
Reactivi:
- Soluție tampon: tampon Tris-barbital [tris-hidroximetil-
aminometan 7,2 g/l; acid dietilbarbituric (veronal) 1,82 g/l;
dietilbarbiturat de sodiu (medinal) 10,2 g/l; etiltiosalicilat de
mercur (conservant) 0,02 g/l], pH = 8,6
- Gel de agaroză: se prepară o soluție de agaroză 1% în soluția
tampon, prin încălzire la fierbere, care se toarnă pe plăcuțe de sticlă

109
 degresate anterior cu alcool. Gelurile se pot păstra în frigider 2-3
zile în cutii umede de plastic.
- Soluție de fixare: se amestecă 90 ml metanol cu 20 ml acid acetic
glacial și cu 90 ml apă bidistilată. Compoziția ei este metanol 45%
și acid acetic 10%.
- Colorant: roșu de Ponceau 0,1% în soluție de acid tricloracetic
10%.

Modul de lucru:

a.) În camera umedă se introduc în cele două cuve laterale volume egale de soluție
tampon, măsurate cu cilindrul gradat. Aceste două compartimente nu comunică între
ele, deoarece numai în felul acesta curentul electric trece numai prin gel.
b.) Se scoate lama de sticlă cu gel din cutia de plastic. Se așează o bandă de hârtie de
filtru pe o zonă a gelului unde urmează să fie depusă proba. După umectare se
îndepărtează imediat hârtia de filtru și se pune în locul ei o matriță pentru probe.
Matrița trebuie să adere la gel. Cu o seringă cu Hamilton se introduce 1 µl de ser în
șanțul creat de matriță și se așteaptă 5 minute pentru absorbția serului în gel. După 5
minute se îndepărtează excesul de ser cu o bandă de hârtie de filtru. Se scoate
matrița și se pune lama pe puntea care se află în mijlocul camerei de electroforeză.
La extremitățile lamelor se aplică două hârtii de filtru Whatman îmbibate cu soluție
tampon. Aceste hârtii de filtru sunt îndoite la capete astfel încât cu un capăt să
acopere aproximativ 1/2 cm din lungimea lamei (gelului), iar celălalt capăt să facă
legătura cu soluția tampon din cuvele cu electrozi.
c.) Se închide etanș aparatul, se conectează cuvele la redresor și se lasă probele la
migrat 1 h la 170 V.
d.) După migrare se scot lamele din camera de electroforeză și se introduc 10 minute în
soluția de fixare, aflată într-o cutie Petri.
e.) Colorarea se face prin îmbibare timp de 5 minute într-o soluție de colorant aflat
într-o cutie Petri. Excesul de colorant de pe plăcuțe se îndepărtează prin spălare cu
apă distilată.
f.) Uscarea se poate face la termostat sau la temperatura camerei. Gelul uscat va avea
consistența unui film.

110
g.) Determinarea cantitativă a fracțiunilor proteice se face cu ajutorul unui densitometru
optic. Acesta trasează automat curba de extincție (reflexie optică), care prezintă
atâtea maxime câte fracțiuni sunt. Aparatul calculează valorile procentuale ale
fracțiunilor proteice. În cazul serului normal, prin electroforeza în gel de agaroză,
rezultă următoarele 6 fracțiuni:

Fracțiunea Valoarea procentuală g/100ml

Albumine 50-59 3,50-4,20
1 - Globuline 3-5 0,25-0,40
2 - Globuline 7-9 0,50-0,65
1 + 2- Globuline 11-14 0,80-1,02
 - Globuline 16-20 1,10-1,40

Interpretarea valorilor fracțiunilor proteice.

1. Hiperalbuminemiile apar în puține stări patologice, mai importante fiind leucozele

limfatice cronice.
2. Hiperglobulinemie globală () se întâlnește în cazul tumorilor maligne, bolilor
infecțioase acute sau cronice, afecțiunilor hepatice cronice, nefropatiilor cronice.
3. Hiperalfaglobulinemia asociată sau nu cu hiperbetaglobulinemia se întâlnește în
inflamații acute (reumatism poliarticular acut, boli infecțioase acute, infarct
miocardic), sindrom nefrotic (cresc îndeosebi 2 – globulinele), tumorile maligne,
poliartrita reumatoidă.
4. Hiperbetaglobulinemia izolată se întâlnește în  - plasmocitom, hepatite acute
virotice sau toxice, diabet zaharat, sindrom nefrotic, icter obstructiv prelungit.
5. Hiperalfa și hipergamaglobulinemia sunt întâlnite în inflamațiile acute și cronice, în
tumori maligne.
6. Hipergamaglobulinemie izolată se întâlnește în afecțiunile cu implicație
imunologică cum sunt:
- boli infecțioase acute sau cronice: hepatită virotică, mononucleoză infecțioasă;
- limfogranulomatoză benignă, tuberculoză, sifilis, stafilococi, streptococi
endocardită bacteriană subacută;

111
 - colagenaze: poliartrită reumatoidă, lupusul eritematos diseminat, sclerodermie;
- afecțiuni hepatice: hepatite cronice, ciroze;
- afecțiuni neoplazice de sistem: boala Hodkin, leucemii.
7. Hipogamaglobulinemia se întâlnește în :
- agamaglobulinemie și hipogamaglobulinemie congenitală;
- afecțiuni digestive: inflamația mucoasei digestive, neoplasm digestiv;
- sindrom nefrotic;
- insuficiență cardiacă;
- arsuri întinse;
- eczeme generalizate.

Elecroforegrame în gel de poliacrilamidă

112
 În figură sunt prezentate proteinogramele obținute prin citirea
electroforegramelor la densitometru optic, în câteva cazuri patologice precum și în
cazul normal. a) Normal (vezi tabelul de mai sus), b) Inflamație acută, c) Inflamație
cronică, d) Sindrom nefrotic, e) Enteropatie exudativă, f) Ciroză hepatică, g) Mielom
multiplu, h) Hipogamaglobulinemie.

Dozarea ureei din ser prin metoda cu urează

Principiu:
Ureea din ser este hidrolizată sub acțiunea unei enzime specifice, ureaza, și se
descompune în amoniac și dioxid de carbon. Amoniacul eliberat este determinat apoi pe
baza reacției pe care o dă cu fenolul și hipocloritul de sodiu în mediu alcalin. (Reacția
Berthelot).

-
ClO + OH + NH 3 O N Cl

parachinoncloroimina formată astfel, reacționează cu o altă moleculă de fenol pentru a

forma indofenol care dezvoltă în mediu alcalin o intensă culoare albastră. Reacția este
catalizată de nitroprusiatul de sodiu.

113
 -
O N O

Reactivi:
- urează tamponată: se dizolvă 1 g EDTA în 80 ml apă bidistilată și se
ajustează, pH-ul la 6,5 cu NaOH diluat. Se adaugă apoi 150 mg urează și se
completează volumul la 100 ml cu apă bidistilată. Se agită bine și se
păsrează într-un vas de plastic.
- soluție etalon de uree: 40 mg uree pură, uscată în prealabil în exicator, se
dizolvă în apă bidistilată aducându-se la 100 ml.
- reactiv fenolic. Se dizolvă 25 g fenol chimic pur în 400 ml apă bidistilată.
Separat se dizolvă 125 mg nitroprusiat de sodiu în 50 ml apă distilată. Se
amestecă cele două soluții și se aduce volumul la 500 m1.
- reactiv hipoclorit. Într-un balon de 500 ml se dizolvă 12,5 g NaOH în 400
ml apa bidistilată. Se adaugă apoi un volum de hipoclorit comercial
conținând 1,10 g hipoclorit de sodiu (de regulă 20 ml soluție). Se aduce
volumul la 500 ml.
Modul de lucru:
Se pipetează 0,2 ml suspensie urează într-o serie de eprubete. Se adaugă apoi cu
o pipetă câte 0,02 ml ser în probele de analizat, 0,02 ml apă distilată pentru proba oarbă
și 0,02 ml soluție de uree 40 mg% pentru proba standard. Se incubează eprubetele la
37°C pe baia de apa timp de 15 minute. Se scot eprubetele de la incubat și se adaugă 1
ml reactiv fenolic, se agită ușor și se adaugă 1 ml reactiv hipoclorit alcalin. Se
incubează din nou la 37°C timp de 15 minute pentru dezvoltarea culorii. Se scot din
baie eprubetele și se diluează prin adăugarea a 10 ml apă distilată. Se amestecă continuu
eprubetele și se citește extincția la 630 nm fată de proba oarbă.
Calcul: uree mg% = (E probei / E standardului )• 40
Valori normale : 21 - 54 mg uree/100 ml ser sau 3,5 – 9,0 mmoli/l
Valori crescute : Patologic creșterea ureei poate fi de origine renală sau
extrarenală.
Cauze de origine renală: insuficiență renală acută sau cronică; (eliminare scăzută),
glomerulonefrită acută sau cronică, nefroangioscleroză
benignă sau malignă, tuberculoză renală, tumori renale,
rinichi polichistic, calculoză.

114
Cauze de origine extrarenlă: stări de exsicoză și șoc provocate de hemoragii, arsuri,
traumatisme;
Valori scăzute : - insuficiență hepatică gravă (ciroză)(sinteză scăzută)

Dozarea acidului uric din ser

Principiu:
Acidul uric (catabolitul final al nucleotidelor purinice) reduce în mediu alcalin
reactivul fosfowolframic până la un produs de culoare albastră. Intensitatea culorii este
proporțională cu concentrația acidului uric în proba de analizat.
Reactivi: - Acid tricloracetic 20%
- Reactiv fosfowolframic: într-un balon de 1000 ml prevăzut cu
refrigerent cu reflux, se introduc 50 g wolframat de sodiu, 40
ml H3PO4 85% (d = 1,71 g/cm3) și 350 ml apă bidistilată. Se
fierbe lent aproximativ 6 ore. Se răcește balonul și conținutul
său se trece cantitativ într-un balon cotat de 500 ml. Se aduce
la semn cu apă bidistilată. Dacă reactivul este verde se adaugă
1-2 picături de brom și se fierbe câteva minute fără refrigerent
pentru îndepărtarea excesului de brom. Reactivul are culoarea
galben-verde deschis, păstrat în sticlă brună, el nu se alterează.
Reacția este următoarea:
12 Na2WO4 + 9 H3PO4 = P(W2O7)6H7 + 8 Na3PO4 + 10 H2O
- Na2CO3 crist 22%
- Soluție stoc de acid uric: se introduc în aproximativ 60 ml apă
bidistilată caldă (60°C) 100 mg acid uric, 200 mg fosfat disodic,
100 mg fosfat monosodic și se agită până la dizolvare completă.
După răcire se completează la 100 ml cu apă bidistilată într-un
balon cotat. Soluția stoc, închisă ermetic prin parafinare (după
adăugare de 3-4 picături de cloroform) se poate păstra 4-5 luni la
temperatura de +4°C.
- Soluția standard de acid uric se prepară prin diluarea soluției
stoc: 1 ml se aduce la 100 cu apă bidistilată.
Modul de lucru:

115
 a) Deproteinizarea serului: Într-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml apă
bidistilată si 2 ml acid tricloracetic 20%. Se agită puternic și după 10 minute se
filtrează.
b) Reducerea reactivului fosfowolframic se realizează efectuând următoarele
amestecuri în eprubete care apoi se agită energic:

Probă Standard Blanc

Filtrat, ml 2,0 - -
Sol. standard, ml - 2,0 -
Apă distilată, ml - - 2,0
Na2CO3 22%, ml 0,9 0,9 0,9
Reactiv fosfowolframic, ml 0,1 0,1 0,1

Se lasă eprubetele în repaus 10 minute la temperatura camerei, apoi se măsoară

extincția probei și a standardului față de blanc la =610 nm în cuva de 1 cm.
Observație: În cazul că proba prezintă opalescență, ea se centrifughează înainte
de măsurarea estincției.
Calcul:
concentrația standardului = 1 mg%
2 ml filtrat corespunde la 0,5 ml ser ( diluția serului= 2/0,5 = 4)
Ep/Es x 1 x 4 = mg acid uric/100 ml ser iar mg % x 60 = moli/l
Valori normale: 2-8 mg acid uric/100 ml ser ( 119 - 476 moli/l )
Valori crescute: fiziologic: după efort fizic accentuat sau după ingestia unor
cantități crescute de alimente bogate în acizi nucleici (ficat,
testicule).
patologic: a) hiperuricemie primară (biosinteză crescută sau
eliminare renală scăzută)
b) hiperuricemie secundară, destrucție celulară
accentuată în tumori maligne, anemie hemolitică,
pneumonie severă etc.; eliminare renală scăzută
(insuficiență renală, acidoză metabolică si
respiratorie)

116
Hiperuricemia de durată determină acumularea acidului uric în organism și apariția
gutei.
Valori scăzute: mai rar întâlnite, apar în urma administrării unor medicamente, defecte
enzimatice (xantinurie ereditară), afecțiuni hepatice grave.

Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin

Principiu:
Creatinina reacționează cu acidul picric (galben) în mediu alcalin dând naștere
unui produs a cărui colorație poate fi de la orange la roșu aprins. Intensitatea colorației
roșii este proporțională cu concentrația creatininei din probă. Colorația se datorează
formării unor tautomeri colorați ai creatininei, unul din ei fiind stabilizat prin
complexare de un mezomer al acidului picric (reacția Jaffé).

Complex roşu

Reactivi: - Wolframat de sodiu 10%.

- H2SO4 2/3N.
- Soluție saturată de acid picric.
- NaOH 10%.
- Soluție picrat alcalin; se prepară înainte de utilizare prin
amestecarea unui volum de soluție de acid picric cu 2 volume
NaOH 10%
- Soluție stoc de creatinină: se dizolvă în HCl 0,1N 100 mg
creatinină pură sau 160,2 mg clorură de zinc creatinină și se
aduce volumul la 100 ml cu HCl 0,1N
- Soluția standard de creatinină se obține diluându-se 1 ml din
soluția standard stoc la 100 ml cu apă bidistilată. Această soluție
conținând 0,01 mg creatinină/ml trebuie reînnoită săptămânal.
Modul de lucru:
Într-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml de ser și 6 ml acid picric saturat și se
agită energic. Se introduce balonul pentru 15-20 secunde într-o baie de apă fierbinte.

117
După răcire se filtrează într-o eprubetă iar din filtrat se măsoară 5 ml. Se adaugă 0,25 ml
soluție de NaOH 10% se agită și peste 15 minute se citește extincția probei (Ep) față de
martor la  = 530 nm. Martorul este soluția de picrat alcalin, căreia în loc de ser i s-au
adăugat 2 ml apă bidistilată. În paralel se efectuează aceleași operații, în locul serului
folosindu-se soluție standard de creatinină. Extincția obținută este Es.
Calcul:
Ep/Es = mg creatinină/100ml ser.
Valori normale: 0,6-1,8 mg/100ml ser sau 53-159 moli/l.
Variații fiziologice: nivelul seric al creatininei suferă doar foarte mici variații în
condiții fiziologice. El poate crește în condițiile unei diete foarte bogate în proteine.
Clearance-ul endogen de creatinină (fără aport exogen de creatinină) este un indicator al
filtrării glomerulare la subiecții normali.
Valori patologice crescute: se întâlnesc în insuficiență renală cronică (este ultima
substanță azotată care crește în sânge în aceste condiții, ca și în condițiile fiziologice),
distrofia musculară progresivă, eclampsie, acromegalie.

Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecția van den Bergh

Principiu:
Bilirubina reacționează cu diazo-reactivul Ehrlich (acid sulfanilic diazotat) și
formează azopigmenți, care au culoare roșie în mediu slab acid sau neutru (reacția van
den Bergh). Azopigmentul A este un fragment de bilirubină cuplată cu sarea de
diazoniu a acidului sulfanilic iar azopigmentul B este un fragment de bilirubină
conjugată cuplată cu aceiași sare de diazoniu. Intensitatea colorației este proporțională
cu concentrația bilirubinei din ser.

R: radical de acid glutaric

CH3 CH=CH2 CH3 CH2 CH2 COOH(R)
+
Bilirubina + 2 N N SO3 2

O N CH N N=N SO3H
Ionul de diazoniu H H
Azopigmnet A (B)
Reactivi:
- Soluție HCl 1N;

118
 - Soluție de cofeină-benzoat-acetat: se cântăresc și se amestecă 20 g
cofeină pură, 30 g benzoat de sodiu, 50 g acetat de sodiu. Se adaugă 400
ml apă bidistilată și se dizolvă încălzind ușor. După răcire se filtrează.
- Reactiv diazo: Sol.A: se măsoară 0,5 g acid sulfanilic într-un balon
cotat de 500 ml, se adaugă 125 ml HCl 1N și se completează până la
semn cu apă bidistilată
Sol.B: NaNO2 0,5%
Înainte de întrebuințare se amestecă 10 ml soluție A cu 0,3 ml soluție B.
- NaCl 0,9%

Bilirubina neconjugată (bilirubina indirectă) în stare liberă nu este hidrosolubilă,

este menținută în soluție apoasă prin legarea sa strânsă pe albumină. Această bilirubină
nu reacționează direct cu reactivul diazo ci doar în prezență de acceleratori (alcooli
inferiori, cofeină, etc.), care o eliberează din legătura cu albumina și o mențin în soluție.
Nu se filtrează la nivel glomerular, deci în mod normal nu apare în urină.
Bilirubina conjugată (bilirubina directă) hidrosolubilă reacționează direct cu
reactivul diazo. Se filtrează la nivel glomerular și apare în urină.
Se dozează paralel bilirubina totală (directă + indirectă) si bilirubina directă.
Modul de lucru: Se lucrează în trei eprubete după tabelul de mai jos:
Bilirubina totală Bilirubina directă Blanc
reactiv Ehrlich ml 0,5 0,5 -
sol. de cofeină ml 3,5 - -
NaCl 0,9% ml - 3,5 4,0
ser ml 1,0 1,0 1,0

După amestecarea reactivilor se agită energic eprubetele iar după 5 minute se

citesc extincțiile la  = 530 nm, în cuva de 1 cm față de blanc.
Calcul:
Rezultatul se calculează cu ajutorul coeficientului de extincție specific
procentual (a) al azopigmentului la = 530 nm:
1g% 1mg%
a = E1cm = 943, de unde E1cm = 0,943

119
 Volumul final (Vf ) = 5,0 ml; volumul probei (V p) = 1,0 ml; diluția probei =
Vf/Vp = 5
Ep = extincția citită
Concentrația bilirubinei (bilirubinemia) se calculează cu formulele:

1mg%
mg bilirubină/100 ml ser = E p /E 1cm ×5 sau E p ×5 , 3
moli bilirubină/l ser = Ep x 91 știind că Mbilirubină = 584

Se calculează separat valoarea bilirubinemiei totale și a celei directe iar diferența

între aceste două valori reprezintă bilirubinemia indirectă.
Valori normale: Circa 1 mg% (cca.17 moli/l) bilirubină totală, din care
bilirubina directă cca. 0,25 mg% (4,3 µmoli/l).
Valori crescute: Bilirubina se va infiltra determinând apariția unei colorații
gălbui a scleroticelor și a tegumentelor (icter) la valori de peste 3 mg% (51moli/l).
Hiperbilirubinemiile pot fi cauzate de:
- creșterea vitezei de formare a bilirubinei în urma degradării excesive
a hemoglobinei (hemoliză) în icterul hemolitic;
- scăderea capacității de conjugare a ficatului cauzează
hiperbilirubinemia indirectă (10-40mg%) la homozigoți (sindromul
Crigler-Najjar de tip I);
- scăderea capacității de eliminare a bilirubinei de către ficat (boala
Gilbert);
- perturbarea eliminării prin bilă a bilirubinei în urma blocării căilor
biliare (calculi, tumori cum ar fi neoplasmul de cap de pancreas) în
icterul mecanic;
- deficitul intrahepatic de eliminare activă a bilirubinei conjugate de la
nivelul microsomilor hepatici în canaliculele biliare (sindrom Dubin-
Johnson) determină hiperbilirubinemie directă (2-10 mg%);
- icterul neonatal, datorat imaturității sistemelor de epurare a
bilirubinei la nou născut când bilirubinemia este crescută (4-5 mg%)
temporar (1-2 zile) după care revine la normal.

120
 Dozarea glucozei prin metoda enzimatică (glucozoxidază)
Principiu:
Glucoza, sub acțiunea glucozoxidazei, se transformă în acid gluconic. H 2O2
rezultată va fi descompusă de peroxidază, în urma reacției la care participă și indicatorul
Trinder (fenol și 4-aminoantipirină), rezultând un produs de condensare colorat în roșu
cu absorbție maximă la  = 505 nm. Extincția este direct proporțională cu concentrația
glucozei. Reacțiile care stau la baza metodei sunt următoarele:
glucozoxidază

Glucoză + O2 + H2O acid gluconic + H2O2

peroxidază

2 H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina Chinonimină + 4 H2O

(roșu)

Reactivi: 1). Reactiv 1 conține: tampon TRIS-Cl sau Sörensen 90 mmoli/l și

fenol 0,3 mmoli/l (pH = 7,5 ).
2). Reactiv 2 conține: glucozoxidază 10000 U/l, peroxidază 1000 U/l
și 4-aminoantipirină 2,6 mmoli/l
3). Reactiv 3 conține: standard de glucoză 5,56 mmoli/l (1g/l sau 100
mg %)
Probe: ser nehemolizat, plasmă heparinată, sânge deproteinizat, LCR
(lichid cefalorahidian).

Modul de lucru:
Se amestecă conținutul unei sticluțe de reactiv 2 cu conținutul unei sticluțe de
reactiv 1, obținând astfel reactivul de lucru. Stabilitatea soluției la 20 - 25 oC este 2
săptămâni, iar la 2 - 8oC este de o lună.
Se prepară următoarele soluții:

Blanc Standard Probă

H2O distilată 10 l - -
Standard - 10 l -
Probă - - 10 l

121
 Reactiv de lucru 1 ml 1 ml 1 ml

Se agită conținutul eprubetelor și se incubează timp de 10 minute la 37 oC sau 30

minute la temperatura camerei (20 - 25 oC). Se măsoară extincția probei față de blanc la
505 nm (490 - 550 nm). Culoarea formată este stabilă 30 minute.
Calcul:
E probă
Cprobă =  Cstandard
E standard

Cstandard este 5,56 mmoli/l, sau 100 mg %, în funcție de unitățile de măsură

folosite la exprimarea concentrației glucozei din soluția standard.
Linearitate: Extincția este direct proporțională cu concentrația glucozei până la
22,22 mmoli/l (sau 400 mg %). Dacă concentrația glucozei depășește această valoare, se
diluează proba cu ser fiziologic și se repetă determinarea. La calcularea rezultatului se ia
în considerare diluția.
Valori normale: ser, plasmă: 3,9 - 5,8 mmoli/l (70,2 – 104,45 mg %)
LCR: 2,8 - 3,9 mmoli/l (50,4 – 70,2 mg %)

Teste rapide pentru determinarea glicemiei

În practica medicală curentă se folosesc tot mai des glucometrele (aparate mici,
asemănătoare cu un calculator de buzunar), care determină glicemia prin metodă
enzimatică specifică pentru glucoză. Determinarea se face cu ajutorul unor stripsuri
(kituri, benzi de hârtie impregnate cu reactivi).
Mod de utilizare:
Efectuăm pregătirile pentru prelevarea sângelui din pulpa degetului, apoi pornim
aparatul, care începe numărătoarea inversă. Înțepăm un deget și punem o picătură de
sânge pe strips. Peste un minut, la semnalul sonor al aparatului, înlăturăm prin
tamponare cu hârtie excesul de sânge de pe banda cu reactivi. Introducem kitul în aparat
și, la unele tipuri, apăsăm butonul de măsurare. Peste câteva momente apare pe ecran
valoarea glicemiei în unitatea de măsură folosită de aparatul respectiv.
Avantajele metodei: - Este o metodă rapidă, precisă și specifică pentru glucoză

122
 - Se poate folosi în dispensare medicale și la domiciliu,
fiind foarte utilă în monitorizarea glicemiei la bolnavii diabetici
- Unele aparate au și memorie în care sunt păstrate
ultimele valori ale glicemiei
- Necesită o cantitate foarte mică de sânge (o picătură).
Valori normale: 70 - 110 mg % (3,89 - 6,11 mmoli/l)
Valorile obținute la determinarea glicemiei depind de metoda folosită.
În sânge, alături de glucoză, sunt și alte substanțe reducătoare (glutation, acid
ascorbic, acid uric, cisteină). Din acest motiv valorile glicemiei obținute prin metode
chimice, care se bazează pe proprietatea reducătoare a glucozei (metoda Hagedorn-
Jensen, colorimetrie cu reactiv arseno-molibdenic) sunt mai ridicate decât cele obținute
prin metoda enzimatică specifică cu glucozoxidază. Metoda colorimetrică cu o-toluidină
dă rezultate mai apropiate de valorile obținute prin metoda enzimatică.

Interpretarea medicală a valorilor glicemiei

Valori crescute: Hiperglicemia trecătoare poate fi de origine alimentară sau în
legătură cu stări emoționale. Postprandial glicemia crește ușor, în cazul consumului
excesiv de glucide chiar până la instalarea unei glicozurii.
Hiperglicemia de durată este caracteristică în primul rând pentru diabetul zaharat
(diabetes mellitus). În formele de diabet asimptomatic (diabet chimic) glicemia este
adesea normală și tulburările metabolice (insuficienta de insulină) pot fi stabilite numai
prin proba de încărcare cu glucoză (proba hiperglicemiei provocate).
Proba numită test oral de toleranță pentru glucoză (TOTG) constă din
administrarea orală la pacient a unei cantități de aproximativ 70 g glucoză (1 g/kg corp).
Se urmărește din jumătate în jumătate de oră variația glicemiei față de valoarea inițială
măsurată pe nemâncate (vezi schema). În cazuri fiziologice, creșterea maximă a
glicemiei după încărcare nu depășește valoarea de 8,8 mmoli/l (160 mg %) în prima oră,
iar după 2 ore revine sub 6,6 mmoli/l (120 mg %), și atinge nivelul inițial la cca. 3 ore .

123
 În cazurile ușoare de diabet, când glicemia nu depășește valoarea de 180 mg %
(10 mmoli/l), glicozuria este absentă. În cazuri de gravitate medie valoarea glicemiei
este de 200-300 mg %, iar în cazuri grave poate crește până la 39 mmoli/l (702 mg %)
sau mai mult, fiind însoțită de glicozurie masivă. Evidențierea accidentală a glicozuriei
este uneori semnul care atrage atenția asupra unui diabet asimptomatic.
Sarcina este o stare care scade toleranța la glucoză și produce diabet gestațional
la aproximativ 3 % din gravide, uneori cu repercusiuni grave asupra fătului.
Monitorizarea glicemiei și glicozuriei este foarte importantă în aceste cazuri pentru
stabilirea dozelor de insulină.
Informații suplimentare asupra valorilor retroactive ale glicemiei ne furnizează
nivelul hemoglobinei glicozilate. Valorile crescute ale acesteia se corelează bine cu
nivele mari de glicemie pe perioade lungi.
Creșteri ale glicemiei apar în diferite disfuncții endocrine cum ar fi hipersecreția
de adrenalină, glucagon, ACTH (hormon adrenocorticotrop), STH (hormon
somatotrop), cortizol - hormonii enumerați având acțiune antagonistă cu cea a insulinei.
Ei stimulează adenilat ciclaza cu formare de AMP ciclic, care intensifică glicogenoliza
și gluconeogeneza. Persoanele care sunt tratate timp îndelungat cu corticosteroizi (astm
bronșic, poliartrită reumatoidă) pot dezvolta așa numitul diabet steroid. Hormonii
tiroidieni (T3, T4) au acțiune hiperglicemiantă prin creșterea absorbției glucidelor la
nivel intestinal, stimularea gluconeogenezei și a secreției de adrenalină.
Valori scăzute ale glicemiei survin în primul rând după administrarea de doze
excesive de insulină. La valori sub 40 mg % apar simptome hipoglicemice manifestate
prin stări convulsive în urma deficienței de aport glucidic la nivelul celulelor cerebrale.
Hipoglicemie apare și în cazul insulinomului (adenomul insulelor Langerhans), tumoră

124
care secretă cantități mari de insulină. Disfuncții endocrine cum ar fi insuficiența
hipofizară, tiroidiană, corticosuprarenală precum și afecțiunile hepatice grave și
tulburări de absorbție pot induce stări hipoglicemice. O ușoară și trecătoare
hipoglicemie poate să fie de origine alimentară.

Dozarea beta-lipoproteinelor după Burstein

Principiu:
Beta-lipoproteinele din ser sunt precipitate selectiv de heparinatul de calciu în
soluție de clorură de calciu cu forță ionică joasă. Se măsoară turbiditatea soluției și se
exprimă în unități arbitrare.
Reactivi: - Clorură de calciu 0,025 M
- Sol. heparină 0,2%
Modul de lucru:
Se pipetează în două erubete, proba (P) și blanc (B), următoarele soluții:
P B
Clorură de calciu ml 5,0 5,0
H2O bidistilată ml - 0,1
Sol. de heparină ml 0,1 -
Ser ml 0,1 0,1

Se agită și se lasă în repaus 5 minute la temperatura camerei. Apoi se măsoară

extincția probei (EP) și a blancului (EB), față de H2O bidistilată la 6 45 nm în cuva de
1 cm. Turbiditatea serului depinde de numărul de chilomicroni și de conținutul în
grăsimi neutre. Din această cauză serul trebuie să provină din sânge recoltat pe
nemâncate. Determinarea trebuie să se facă în ziua recoltării sângelui.
Calcul:
Rezultatele sunt exprimate direct în unități de extincție:
1) Turbiditatea serului: E = EB  Vfinal/Vser = EB  52
2) Conținutul în beta lipoproteine:
E = (EP - EB)  52
Valori normale: 1) Turbiditatea serului: 0-0,1 U. extincție
2) Beta-lipoproteine: 4,0-10,0 U. extincție
Fracționarea electroforetică a lipoproteinelor în gel de agaroză produce
următoarele fracțiuni care sunt în următoarea corespondență aproximativă cu fracțiunile
separabile în câmp centrifugal: chilomicronii corespunzători alfa 2 – lipoproteinelor și

125
care rămân pe linia de start, beta-lipoproteinele care corespund LDL, pre-beta
lipoproteinele care corespund VLDL și alfa1-lipoproteinele care corespund HDL.
Tipurile de dislipidemie: Pe baza modificărilor cantitative ale fracțiunilor
lipoproteice și ale conținutului acestora în colesterol, fosfolipide și trigliceride,
Fredrickson a stabilit 5 fenotipuri de dislipidemie:
Tipul I.: chilomicronemie și hiper-VLDL, cu creșterea trigliceridelor și
cu ser lactescent datorate deficitului de lipoproteinlipază sau de apoCII. Se mai numește
hipertrigliceridemie familială.
Tipul II.a: creșterea colesterolului și a LDL, cu ser clar datorată
deficitului în receptori apoB100. Se mai numește hipercolesterolemie familială.
Tipul II.b: creșterea concomitentă a colesterolului și a trigliceridelor, ser
clar, sau opalescent. Cresc concomitent LDL și VLDL. Se mai numește hiperlipidemie
combinată familială.
Tipul III.: anomalie ereditară rar întâlnită (boala "betei late") cu creștera
concomitentă a colesterolului și a trigliceridelor, ser lactescent. Se datorează deficitului
de clarificare hepatică a IDL și chilomicronilor remanenți. Este cauzat de lipsa de apoE
și de lipoproteinlipază hepatică.
Tipul IV.: creșterea trigliceridelor endogene (VLDL), ser clar sau
opalescent.
Tipul V.: creșterea chilomicronilor endogeni și exogeni, a colesterolului,
cu LDL și VLDL crescute, HDL scăzute, ser opalescent sau uneori lactescent.

Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatică

Principiu:
Kit-ul enzimatic conține următoarele enzime care catalizează reacțiile indicate
mai jos:
Colesterol esteraza catalizează reacția de hidroliză a esterilor de colesterol
rezultând colesterol liber și acizi grași:
colesterol-estează

esteri de colesterol + H2O ----------------- colesterol + acizi grași

În prezența colesterol oxidazei colesterolul suferă o reacție de oxidare cu
formarea a 4- colestenonei și a apei oxigenate:
colesterol-oxidază

126
 colesterol + O2 -------------- 4- colestenona + H2O2

Sub acțiunea peroxidazei apa oxigenată reacționează cu fenolul și 4-amino

antipirina formând un compus chinonic de culoarea roșie, fotometrabilă:
peroxidază

2 H2O2 + fenol + 4-amino-antipirină ---------------- compus chinonic + 4H2O

Reactivi: Reactivul pentru colesterol conține în soluție tampon: colesterol
esteraza, colesterol oxidaza, peroxidaza, fenol, 4-amino-antipirină.
Mod de lucru:
Se pregătesc 3 eprubete în care se pipetează:

P S B
Reactiv pt. Colesterol 2 ml 2 ml 2 ml
H2O bidistilată - - 20 l
Sol. standard de colesterol (200 mg%) - 20 l -
Ser 20 l - -

Se agită și se incubează 5 minute la 37C. Apoi se citește extincția probei (P) și

a standardului (S) față de blanc (B) la  = 500 nm în cuva de 1 cm.
Calcul: mg colesterol/100 ml ser = Ep/Es  200
Valori normale: 150-200 mg%
Variații fiziologice: Colesterolemia este strâns corelată cu lipidemia și prezintă,
în mare, aceleași variații fiziologice. Valoarea nivelului colesterolului seric la naștere
este scăzută, începe să crească în câteva ore sau zile și variază în funcție de vârstă, sex,
rasă, alimentație, echilibru neuro-endocrin, profesie.
Există diferențe ale colesterolemiei în funcție de sex și de vârstă. De exemplu: la
bărbați valoarea medie este de 250mg/100ml la vârsta de 50 de ani, după care scade
ușor; la femei valorile cresc odată cu vârsta atingând valoarea maximă de 280
mg/100ml în jurul vârstei de 50 ani, după care scad ușor.
Cea mai mare parte a colesterolului seric este de origine endogenă, aportul de
colesterol exogen influențând în mică măsură colesterolemia.
Variații patologice: Acest raport este scăzut în afecțiuni hepatice grave (comă
hepatică).

127
 Raportul dintre colesterolul esterificat/colesterolul total permite diferențierea și
diagnosticul icterelor și este:
- normal în icterele obstructive
- moderat scăzut în icterele catarale
- scăzut în icterele parenchimatoase grave.
Valori crescute (hipercolesterolemii) se întâlnesc în: hipercolesterolemie
esențială, hiperlipemie esențială, hipotiroidism, diabet zaharat, obezitate, sindrom
nefrotic (nefroze lipoidice), ateroscleroză, intoxicații cu fosfor, CCl 4, alcool, morfină,
icter obstructiv (calea de excreție a colesterolului fiind cea biliară), pancreatite,
alcoolism.
Valori scăzute (hipocolesterolemii) se întâlnesc în: afecțiuni genetice ca:
analfalipo proteinemia (boala Tangier), abetalipoproteinemia; hepatite acute, hepatite
cronice și ciroze decompensate (numai colesterolul esterificat), hipertiroidism; infecții
bacteriene: pneumonie, tuberculoză, difterie, lepră; hemopatii severe: leucemii.

Dozarea hemoglobinei sub formă de oxihemoglobină

Principiu:
În prezență de amoniac globulele roșii se hemolizează și hemoglobina se
transformă în oxihemoglobină care prezintă un maxim de absorbție la  = 540 nm.
Reactivi și materiale: - soluție de amoniac 0,1%
- pipetă de hemoglobină de 0,02 ml
Modul de lucru:
Într-o eprubetă se măsoară 5 ml de soluție de amoniac. În acesta se introduc cu
pipeta de hemoglobină 0,02 ml de sânge în prealabil agitat. După agitare se citește
extincția probei față de apă distilată la = 540 nm în cuva de 1 cm.Rezultatul se
raportează la o curbă de calibrare obținută cu diluții dintr-o probă de concentrat de
eritrocite cu concentrația hemoglobinei cunoscută.
Valori normale: femei: 14-17 g/100 ml sânge
bărbați: 15-20 g/100 ml sânge
Dozarea hemoglobinei din sângele total prezintă importanță pentru diagnosticul unor
forme de anemii.

128
 Observație: Ca metodă de referință (pentru obținerea unei curbe de calibrare în
absența unui standard de hemoglobină) se poate folosi metoda bazată pe dozarea ferului
eritrocitar.

Determinarea hemoglobinei glicozilate

În condiţii de hiperglicemie, proteinele suferă o glicozilare neenzimatică

proporţională cu creşterea glicemiei. Glucoza se leagă de o grupare NH 2 a proteinelor,
inclusiv a hemoglobinei (la restul de valină terminală a lanţurilor beta). Legarea
glucidului la această grupare duce la scăderea sarcinilor pozitive de suprafaţă, astfel
hemoglobinele glicozilate migrează mai lent pe electroforeză şi mai rapid pe coloana
cromatografică.
Glicozilarea are loc lent, dar continuu pe parcursul vieţii eritrocitelor. În
momentul în care apare o hiperglicemie, câteva molecule de glucoza se ataşează, prin
gruparea lor aldehidică, pe amina N-terminală, formând o legătură de tip aldimină sau
bază Schiff. În prima etapă procesul este reversibil, aldimina instabilă putând trece din
nou în glucoză. Etapa următoare, de trecere în cetimină este mai lentă şi ireversibilă:
Glucoză  Aldimină (instabilă)  Cetimină (stabilă).
Noţiunea de hemoglobină glicozilată (HbA1) a apărut în 1958 când Allen
Schoeder şi Bolog au identificat prin în urma trecerii prin coloana de răşină
schimbătoare de ioni a unui hemolizat de hematii umane, trei componente eluate
înaintea hemoglobinei A. Ei le-au notat cu simbolurile HbA1a, HbA1c şi Hba1b.
HbA1 diferă de Hb A prin faptul că la capătul N terminal al valinei este legată o
componentă glucidică.
Hemoglobina glicozilată cuprinde mai multe subfracţiuni, denumite HbA1a1
(conţine fructozo 1,6 difosfat ataşat), HbA1a2 (conţine glucozo-6-fosfat), HbA1c (are o
moleculă de glucoză ataşată la fiecare lanţ beta), HbA1b (conţine alte glucide),
corespunzând ritmului lor de migrare cromatografică.
Glucoza fixată pe hemoglobina este stabilă 3-4 luni până când eritrocitul moare.
Prin dozarea analitică a HbA1 este posibilă evaluarea metabolismului glucidic,
inclusiv eficacitatea tratamentului la un pacient diabetic, pe durata ultimelor 6-8
săptămâni.
Spre deosebire de o determinare a glicemiei, care arată numai o stare
momentană a pacientului şi astfel poate să ne inducă în eroare, hemoglobina glicozilată

129
arată în ansamblu trecutul pacientului, de aceea HbA1c este cunoscută şi sub denumirea
de „memoria glicemiei”
Determinarea HbA1c se poate face prin metoda cromatografică (folosind răşini
schimbătoare de ioni sau cromatografie de afinitate, ori HPLC – metoda de referinţă de
cea mai mare precizie), metoda colorimetrică (folosind acidul tiobarbituric),
electroforeza şi, mai recent, prin metoda radioimunologică. Se apreciază procentul
fracţiunii glicozilate în raport cu hemoglobina totală. Determinarea HbA1c se
recomandă pentru urmărirea pacienţilor diabetici cunoscuţi, dar o valoare ridicată a
acestei analize la persoane cu toleranţă alterată la glucoză este un argument important
pentru evoluţia către diabet.
Principiu:
Determinarea hemoglobinei glicozilate (HbA1c) se va efectua printr-o metodă
cromatografică, utilizând un set de reactivi ai firmei BIOMIDI, iar rezultatele se citesc
spectrofotometric.
Reactivi și materiale:
Reactiv 1: Detergent şi biftalat de potasiu pentru hemoliză, cu pH=5
Reactiv 2: Tampon fosfat cu pH=6,5
Reactiv 3: Tampon fosfat cu pH=6,4
Probe biologice
Analiza se efectuează din sânge recoltat pe anticoagulant (EDTA-2Na sau
heparină), care apoi va fi hemolizat. Analiza se efectuează la temperatura camerei (21-
26 oC). Probele se pot stoca 10 zile la temperatura de 2-8 oC.
Modul de lucru:
I. Hemoglobina glicozilată
1. Microcoloanele cromatografice se pregătesc prin inversarea poziţiei timp de
10 minute
2. Aducere la poziţia obişnuită, înlăturarea capacului şi desprinderea porţiunii
inferioare a coloanei cromatografice
3. Filtrul superior se împinge până la contactul cu coloana cromatografică.
4. Prepararea hemolizatului: la 50 l sânge se adaugă 200 l reactiv 1 (detergent
şi biftalat de potasiu pentru hemoliză). Se agită şi se lasă în repaus la temperatura
camerei 10-15 minute.
5. După ce se scurge complet tamponul fosfat de pe răşină, se pipetează 50 l de
hemolizat pe filtrul superior.

130
 6. După ce hemolizatul s-a scurs prin filtru, se pipetează 2,2 ml reactiv 2
(tampon fosfat cu pH=6,5), care eluează, în afară de HbA1c, celelalte fracţiuni de
hemoglobină de pe coloană.
7. Se pipetează 4 ml reactiv 3 (tampon fosfat cu pH=6,4) peste coloană, care
eluează de pe răşină fracţiunea HbA1c într-o eprubetă curată.
II. Hemoglobina totală
Într-o eprubetă separată se prepară soluţia pentru hemoglobina totală: 2,4 ml
reactiv 3 (tampon fosfat cu pH=6,4) şi 10 l hemolizat.
Se agită lichidele din eprubete înainte de citirea extincţiilor la 405-425 nm faţă
de apă distilată. Formula folosită pentru calcularea rezultatelor este:
(EHbA1c/3xEHbtotală) x 100 = HbA1c %
Valori normale:
Valorile normale se încadrează în intervalul 4,2-6,2 %. La pacienţii diabetici valori sub
7% arată un echilibru metabolic bun, între 7-9% echilibrul este moderat, între 9-12%
echilibrul metabolic este precar, se recomandă reevaluarea schemei terapeutice, iar peste
12% este nevoie de internare de urgenţă, complicaţiile acute sunt iminente.

Protocol de lucru pentru dozarea hemoglobinei glicozilate cu

Micromat II

Sistemul Micromat II. pt. determinarea HbA1c utilizează tehnica cromatografiei

de afinitate şi este destinat determinărilor cantitative de HbA1c din sânge capilar
recoltat din deget sau sânge integral recoltat pe heparină sau EDTA.
Testul este indicat pentru monitorizarea nivelului mediu al glicemiei pe o
perioadă de 3-4 luni retroactiv.
Principiu:
Testul Micromat foloseşte cromatografia de afinitate la boronat pentru separarea
fracţiilor de hemoglobină glicată de cea neglicată.
Principiul testului constă în capturarea hemoglobinei glicate de către sferele de
agaroză boronată. Hemoglobina neglicată va trece prin cartuş fără să fie reţinută. Prin
spălare cu tamponul se elimină hemoglobina neglicată. Eluţia hemoglobinei glicate se
realizează cu tamponul de eluţie. Procentul de hemoglobină A1c se calculează astfel:

131
 Hb glicozilată x 100%
Hb glicată + Hb neglicată

Privire de ansamblu asupra sistemului:

Analizorul are o memorie pentru 400 de teste. Rezultatele sunt validate pentru
un nivel al hemoglobinei cuprins între 4-15%. Nu apar interferenţe cu alte forme de
hemoglobină, baze Schiff sau hemoglobină carbamilată. Acurateţea rezultatelor rezultă
din utilizarea cromatografiei de afinitate. CV <5% (pt. sistem), CV <5% (pt. analiza
spectrofotometrică). Corelarea cu sistemul Variant II (care utilizează HPLC şi este
sistem de referinţă) este de 0,97. LED-uri albastre plasate pe marginea cartuşului
semnalizează poziţia la care trebuie să ajungă cartuşul prin rotire. Sistemul operează la
lungimea de undă între 430-450 nm. Rezultatele se obţin în 5 minute, fără preparare
prealabilă a probei, % de HbA1c poate fi vizualizat pe ecran.
Testul se prezintă sub formă de cartuş care conţine trei denivelări sugestive.
Meniscul care ghidează lichidul către camera optică şi reţine partea aglutinată. Partea de
deasupra care păstrează tuburile de reactivi şi permite rotirea acestuia către operator.
Camera optică care aşează cartuşul în poziţia optimă pentru analiza spectrofotometrică.
De asemenea cartuşul conţine trei tuburi diferite cu soluţii tampon.
1. Tamponul pentru probă
2. Soluţia de spălare

132
 3. Tamponul de eluţie
Pe ecranul aparatului apar o serie de icoane care ghidează operatorul în timpul
lucrului. De asemenea semnale luminoase şi auditive sugerează operatorului trecerea la
pasul următor.
Sunt trei paşi de bază în lucrul cu sistemul micromat:
1. Adăugarea probei în tamponul pt. probă şi punerea acestuia în cartuşul de
testare
2. Adăugarea tamponului (soluţiei de spălare)
3. Adăugarea tampnului de eluţie
Nu este necesară un volum exact de probă. Pipete furnizate în trusă sunt
calibrate pt. colectarea de aprox. 10 ml de sânge. Se poate utiliza sânge capilar sau venos
recoltat pe heparină sau pe EDTA. Probele de sânge venos se pot păstra la 2-8 oC timp
de 4 zile.
Procedura de testare:
A. Pentru început se introduce în sistem cartuşul de control. Acest cartuş se
livrează separat şi este necesară utilizarea lui la începului fiecărei zile de lucru. Rularea
cartuşului este necesară pentru a vă asigura că parametrii de lucru ai instrumentului se
încadrează în specificaţii. Cartuşul de control conţine un elastomer silicat care mimează
un nivel al HbA1c de aprox. 10%. Dacă valorile citite sunt în afara domeniului declarat
se curăţă suprafeţele acrilice ale cartuşului şi se repetă testarea. Durata de viaţă a unui
cartuş este de aprox. un an şi jumătate. Cartuşul control este diferit de cartuşul de testare
şi este recunoscut de senzorii aparatului.
B. Realizarea testului:
- I. Se introduce cartuşul de testare în instrument şi se împinge în locaş până se
aude un clic. Instrumentul va verifica dacă cartuşul introdus este valid. În această
perioadă veţi observa pe afişaj icoana sub formă de clepsidră. La terminarea verificării,
în câteva secunde, la poziţia 1 se aude un beep şi se aprinde o lumină roşie. Afişajul va
arăta acum icoana cu numărul de identificare al testului. Acest număr unic de
identificare va fi memorat de aparat şi asociat cu rezultatul testării. Operatorul poate
accesa această informaţie mai târziu la nevoie. Se pot atribui până la 9999 de nr. de
identificare
- II. Ţineţi de buza albă a cartuşului şi rotiţi-l în sensul acelor de ceas cu 90 grd.
la poziţia 1. Cartuşul de testare se va fixa în noua poziţie printr-un clic iar eprubeta de

133
probe se va ridica din cartuş. Se aprinde icoana care indică colectarea probei. Timerul
va începe să cronometreze cele 5 minute în care trebuie începută incubarea probei.
- III. Cu ajutorul micropipetei livrată în trusă se colectează 10 ml sânge capilar
sau venos. Observaţi linia neagră a pipetei ca ghid pentru bula de aer. Nu stoarceţi
pipeta în timpul umplerii capilarului.
- IV. Puneţi proba în tubul 1 (care conţine tamponul pentru probă) şi amestecaţi
conţinutul prin răsturnarea eprubetei de 5 ori. Puneţi eprubeta înapoi în cartuş.
- V. Porniţi perioada de incubare prin apăsarea butonului Enter. Pe afişaj va
apărea un cronometru care va indica cele 60 de secunde de incubare. Terminarea
incubării va fi indicată de un sunet intermitent şi apariţia pe afişaj a icoanelor Insert/Mix
(introduceţi/amestecaţi) şi Pour reagent (turnaţi reactivul).
- VI. Remestecaţi conţinutul eprubetei prin răsturnare de trei ori, scoateţi capacul
şi răsturnaţi conţinutul eprubetei în adâncitura conică centrală a cartuşului de testare.
Remontaţi capacul şi puneţi eprubeta înapoi în cartuş.
- VII. Aveţi 5 minute în care trebuie pus tubul cu probă la incubat. În cazul
depăşirii celor 5 minute aparatul va afişa un mesaj de eroare.
- VIII. Instrumentul detectează automat adăugarea probei nefiind necesară
apăsarea vreunui buton. După turnarea conţinutului eprubetei 1 în conul central, pe
afişaj va apărea un cronometru de 50 secunde. La sfârşitul perioadei cronometrate
icoana sub formă de clepsidră apare în timp ce instrumentul efectuează măsurătoarea.
După aceasta veţi auzi un beep intermitent, se aprinde poziţia 2, iar pe ecran apare
mesajul “rotiţi cartuşul”.
- IX. Rotiţi cartuşul 90 grd. în poziţia 2. Cartuşul se va fixa iar cea de-a doua
eprubetă va ieşi din cartuş.
- X. Scoateţi eprubeta din cartuş şi turnaţi conţinutul în dispozitivul conic
central. Puneţi eprubeta goală la loc, şi apăsaţi Enter pentru a începe cronometrarea a 40
secunde, timp în care cartuşul va dispărea treptat în cartuşul de testare.
- XI. Sfârşitul perioadei cronometrate este indicat printr-un sunet intermitent şi
lumina aprinsă la poziţia 3.
- XII. Rotiţi cartuşul în poziţia 3. Eprubeta 3 va ieşi din cartuş.
- XIII. Turnaţi conţinutul eprubetei 3 în meniscul central al cartuşului şi puneţi
eprubeta înapoi în cartuş. Instrumentul va detecta automat lichidul iar sunetul
intermitent va continua cu max. 20 sec. Perioada în care aparatul va efectua măsurarea.
Pe afişaj va apărea ultima numărătoare inversă de 80 sec. La terminarea perioadei

134
cronometrate pe afişaj va apărea icoana tip clepsidră. Nu rotiţi cartuşul înainte de a auzi
semnalul intermitent şi a apărea pe ecran icoana “rotiţi cartuşul”.
- XIV. Rotiţi cartuşul 90 grd. până la poziţia start după care scoateţi-l din
instrument.
- XV. După îndepărtarea cartuşului de testare instrumentul calculează şi afişează
valoarea procentuală a HbA1c a probei testate. Puteţi apoi apăsa enter pt. a trece la
execuţia unei noi testări.

Analiza urinei
Urina este un produs de filtrare, reabsorbție și excreție, reprezentând exercitarea
funcției renale. Este un lichid biologic ușor accesibil, care dă multe informații utile în
diagnostic.
Urina "de dimineață" servește la determinări calitative (albumină, glucoză, pH,
acetonă și sediment urinar). Se golește vezica de urina acumulată în timpul nopții și se
colectează urina proaspătă de dimineață, care este mai concentrată.
Urina de 24 ore se folosește la determinările cantitative. Este necesar să se
măsoare volumul diurn de urină fiindcă rezultatele dozărilor se raportează la acest
volum. Se golește vezica de urina "de dimineață" și se începe la oră fixă recoltarea urinii
în intervalul de 24 de ore.
Pentru prevenirea contaminării probelor de urină cu microorganisme se
recomandă efectuarea analizelor în cel mult 2-3 ore de la recoltare. Păstrarea nealterată
se poate realiza la rece (+4oC) sau prin tratare cu substanțe conservante, de preferat cu
timol (0,1 g la 100 ml de urină). Nu se recomandă folosirea de cloroform, fenol, formol
fiindcă acestea falsifică rezultatele obținute.

135
 Examenul fizic al urinei

Volumul. Cantitatea de urină emisă în 24 ore depinde de ingestia de lichide, de

pierderile de apă (piele, intestin, plămâni) și de cantitatea de substanțe excretate prin
urină. Volumul se măsoară cu cilindrul gradat.
Valori normale: 1500 - 2000 ml/24 ore (bărbați); 1000 - 1500 ml/24 ore (femei).
Valori patologice: - sub 200 ml/24 ore (anurie)
- între 200-800 ml/24 ore (oligurie)
- peste 2000 ml/24 ore (poliurie)
Oligo-anuria este semnul cel mai important al insuficienței renale acute. Cauzele
acesteia se pot clasifica în trei grupe:
- Cauze prerenale: hipovolemie (diaree severă, stare de șoc cu prăbușirea
presiunii arteriale), insuficiență cardiacă stângă - în aceste cazuri nu se
realizează presiunea hidrostatică necesară funcției de filtrare a rinichiului.
- Cauze renale: boli inflamatorii ale rinichiului (glomerulonefrită acută),
necroză tubulară acută (ischemică, toxică), boli autoimune cu afectare renală.
- Cauze postrenale: obstrucția mecanică a căilor urinare (calculi, malformații).
Se formează urină, dar nu se poate elimina.
Poliuria se întâlnește în: diabet zaharat, diabet insipid (se constată o poliurie
extremă de 5-20 l/24 ore, cauza fiind lipsa secreției de hormon antidiuretic-ADH;
poliuria este însoțită de polidipsie, adică consumul excesiv de lichide), alcoolism cronic
(inhibarea secreției de ADH), hiperparatiroidism (se elimină cantități mari de calciu prin
urină care antrenează eliminarea unui volum mare de lichid), insuficiență renală cronică
(capacitatea de concentrare a rinichilor este alterată).
Alte noțiuni patologice legate de distribuția volumului urinar sunt:
- Polakiurie: micțiuni dese cu eliminarea unor cantități mici de urină (apare în
cistită, hipertrofie de prostată, tumori ale vezicii urinare). Deseori este
însoțită de disurie (durere sau senzație de arsură la emisia de urină).
- Nicturie: urinare nocturnă (diabet insipid, insuficiență cardiacă dreaptă -
semnalează evoluția spre decompensare).

136
Aspectul. În condiții fiziologice urina proaspătă este limpede și transparentă. Urina
tulbure în momentul emisiei poate fi datorată conținutului excesiv de săruri
(urați, fosfați, carbonați), mucusului, puroiului, celulelor epiteliale, grăsimilor
sau microbilor. Dacă într-o urină clară în momentul eliminării după un timp se
formează un depozit în formă de nor, el se datorează unui proces de
descuamare epitelială a căilor urinare. Acest depozit nu are nici o valoare
diagnostică.
Situațiile patologice se diferențiază în felul următor:
a). Dispariția tulburării prin încălzire indică prezența uraților, oxalaților și a
acidului uric.
b). Dispariția tulburării care a devenit mai abundentă în urma încălzirii, prin
adăugare de acid acetic 10 % indică prezența fosfaților și carbonaților (dacă se produce
efervescență).
c). Dacă tulburarea apare la cald și se intensifică prin adăugare de acid acetic,
urina conține albumină.
d). Dispariția tulburării numai la adaus de HCl 12,5 % după încălzire prealabilă,
indică prezența oxalatului de calciu.
e). Din urina tulbure, chiar în momentul emisiei, puroiul, hematiile sau celulele
epiteliale se pot îndepărta prin centrifugare.
f). Dispariția tulburării după adăugarea unui amestec de etanol-eter (1:1; v:v)
indică prezența grăsimilor.

137
Culoarea. Urina normală are culoare galben-deschisă până la galben-aurie. Urina din
timpul nopții fiind mai concentrată, are o culoare mai închisă. Culoarea urinii
poate fi modificată de diferite substanțe pe care le conține.
Substanțe endogene: sângele imprimă urinii culoare roșie, brună sau maronie;
porfirinele dau o culoare roșie sau brun-roșcată; pigmenții biliari conferă
culoare galben verzuie; alcaptonul (compus apărut în urină datorită dereglării
catabolizării Phe și Tyr) dă în contact cu aerul o culoare brună-neagră.
Substanțe exogene: albastrul de metilen colorează urina în verde-albăstrui; piramidonul
în roșu-cărămiziu; fenolul îi dă o colorație brună.
Mirosul. Mirosul urinii proaspete se datorează acizilor volatili din compoziția sa. În
urinile concentrate mirosul este mai accentuat. În cazurile de acidoză apare un
miros de fructe sau cloroform. Urinile infectate au un miros amoniacal datorită
descompunerii ureei de către ureaza bacteriană. Mirosul fecaloid al urinii poate
atrage atenția asupra existenței unei fistule (comunicare patologică între tubul
digestiv și urinar). Miros fecaloid apare și în infecțiile cu Escherichia coli (E.
coli este o componentă a florei intestinale saprofite, dar poate cauza frecvent
infecții urinare).
Densitatea. Greutatea specifică sau densitatea urinii se măsoară cu un densimetru
special numit urodensimetru, format dintr-un tub de sticlă care se termină la
partea inferioară printr-un rezervor cu mercur. În partea superioară se află o tijă
pe care este înscrisă scara gradată pentru intervalul 1,000 - 1,040 g/cm 3 la 15
o
C, fiind anexată și o scală termometrică, pentru că densitatea urinii variază în
funcție de temperatură. Densitatea depinde de substanțele dizolvate: sărurile în
general și ureea la indivizi sănătoși; glucoza și albumina în cazurile patologice.
Densitatea este de obicei invers proporțională cu diluția urinii și direct
proporțională cu intensitatea culorii. Excepție face diabetul zaharat, când, cu
toate că volumul urinar este mare, ceea ce ar determina o diluție mare,
densitatea este mare datorită prezenței glucozei.
Modul de lucru:
Urina de 24 ore se amestecă pentru omogenizare, apoi se toarnă într-un cilindru
gradat, evitându-se formarea spumei. Se introduce urodensimetrul care trebuie să
plutească fără a atinge pereții cilindrului. Se citește diviziunea care este tangentă la
meniscul inferior al suprafeței urinii. Valoarea citită trebuie corectată prin mărire cu
0,001 pentru fiecare depășire cu 3 oC respectiv prin micșorare cu 0,001 pentru fiecare

138
scădere cu 3oC sub 15oC. Când urina conține cantități mari de proteine, peste 7 g%, se
vor scădea câte 0,03 pentru fiecare gram de proteină în plus.
Valori: 1,015 - 1,025 g/cm3, putându-se modifica fiziologic la valori extreme de
1,001 - 1,035 g/cm3 în funcție de aportul sporit sau de eliminarea abundentă de lichide.
Scăderea densității urinare se întâlnește în diabet insipid (se elimină o cantitate mare de
urină foarte diluată), insuficiență renală cronică (datorită incapacității de concentrare a
rinichiului). Creșterea densității urinare apare în diabetul zaharat, nefroză (boală renală
în care se elimină o cantitate mare de proteine prin urină).

Examenul chimic al urinei

pH-ul urinei. Valoarea pH-ului urinei normale depinde de dietă. O alimentație

bogată în proteine produce aciditate urinară, pe când un regim vegetarian determină
alcalinizarea urinei. Aciditatea urinei provine din acizi organici (uric, hipuric, citric,
acetic, oxalic) și din sărurile acide (fosfați primari de Na +, K+, NH4+). Regimul carnat
determină o creștere a acidității urinei datorită eliminării crescute de acid uric, urați și
fosfați acizi. Un regim alimentar vegetarian determină o alcalinizare a urinei prin
excesul de săruri minerale și organice.
Măsurarea pH-ului se face prin folosirea benzilor de hârtie indicator universal
sau cu pH-metrul.
Modul de lucru:
Se introduce în urina proaspătă, pentru câteva secunde, o bucată de hârtie
indicator. Se stabilește valoarea pH-ului după 30 de secunde comparând culoarea hârtiei
cu cea a scalei de culori care însoțește fiecare pachet de hârtie indicator.
Prin metoda potențiometrică (cu pH-metrul), după calibrarea aparatului cu
soluții standard de pH, se introduc cei doi electrozi (de pH și de referință) într-un volum
adecvat de urină a cărei temperatură se cunoaște și se citește valoarea pH-ului.
Valorile: pH-ul urinei este slab acid, cu variații în jurul valorii de 6 (4,8 - 7,4) la
un individ cu alimentație mixtă. Urini puternic acide se produc în cursul proceselor
maligne datorită distrugerii crescute de proteine, în febră, diaree abundentă și acidoză
metabolică. pH puternic alcalin se constată în infecții urinare (prin fermentare
microbiană) și în alcaloză metabolică. pH-ul se măsoară din urina proaspăt emisă,
deoarece în timp se produce contaminarea produsului cu bacterii, care determină
schimbarea reacției în sensul alcalinizării urinei.

139
 Analiza compușilor patologici din urină

Identificarea proteinelor urinare

Urina normală conține doar urme de proteine (albumine și globuline provenite
din plasmă), în cantitate de 20-40 mg%o, care nu se pot decela prin tehnici uzuale.
Proteinurii apar în stări patologice cum ar fi:
- afecțiuni renale: filtrul renal lezat nu mai poate reține moleculele proteice și
acestea ajung în urină în cantitate mare. Proteinuria poate fi selectivă (numai
albuminurie) de exemplu în glomerulonefrite, sau neselectivă în cazuri mai grave
(albuminurie și globulinurie) cum ar fi glomerulonefrozele. În afară de bolile
inflamatorii renale enumerate, leziuni ale nefronului pot apare și în intoxicații sau în
rinichiul de șoc. Proteinuria este pusă în evidență și în leziuni mai grave ale filtrului
glomerular, caz în care se pune în evidență chiar hematuria.
- afecțiuni postrenale: leziuni ale mucoasei căilor urinare (litiază, inflamație,
tumori, etc). În aceste cazuri proteinuria se asociază obligatoriu cu hematurie (apariția
sângelui în urină).
- afecțiuni prerenale: stări febrile, boli cardiace, ictere, leucemie, apariția în
urină a proteinelor Bence-Jones (provenite din imunoglobuline patologice) în mielomul
multiplu (plasmocitom). Datorită hiperproteinemiei (creșterea cantității proteinelor în
sânge), se saturează capacitatea maximă de transport a celulelor mucoasei tubulare
renale, și proteinele care nu s-au reabsorbit se elimină prin urină.
În mod fiziologic, în cursul efortului fizic are loc o creștere a proteinuriei care
poate atinge de 5 ori valoarea normală. Cantitatea de proteine eliminată variază în
timpul zilei, de aceea trebuie să se facă analiza pe urina de 24 ore (valori normale: 30-
40 mg/1500 ml).
Procedeul cu acid acetic la cald
Principiu:
Proteinele precipită prin încălzirea și acidularea urinei îmbogățite cu săruri de
sodiu.
Reactivi: - Acid acetic 10%
- NaCl cristale
Mod de lucru:
În 10 ml de urină filtrată se adaugă câteva cristale de NaCl și se încălzește
eprubeta în flacără pentru aducerea la fierbere doar a părții superioare a coloanei de

140
lichid. Se adaugă câteva picături din soluția de acid acetic. Apariția unui precipitat
persistent indică prezența albuminei.
Aprecieri semicantitative asupra cantității de albumină:
- opalescență, urmată de sedimentare la câteva minute . . . . cca 10 mg%
- precipitare și sedimentare imediată . . . . . . . . . . . . . . . . . . cca 50 mg%
Înălțimea coloanei de precipitat raportată la înălțimea coloanei de urină după
staționarea amestecului timp de 30 secunde:
- 1 : 4 . . . . . . . . . . . . cca 250 mg%
- 1 : 3 . . . . . . . . . . . . cca 500 mg%
- 1 : 2 . . . . . . . . . . . . cca 1000 mg%
Proba cu acid sulfosalicilic la rece
Principiu:
Proteinele sunt precipitate în mediu de acid sulfosalicilic.
Reactiv: Sol. acid sulfosalicilic 20%
Mod de lucru:
La 5 ml urină filtrată se adaugă 10-15 picături din soluția de acid sulfosalicilic.
Se agită și se apreciază reacția ținând eprubeta pe un fond negru. Rezultatele posibile
sunt:
- urina rămâne limpede . . . . . . . albumină absentă
- ușoară opalescență . . . . . . . . cca 15 mg% albumină
- opalescență apreciabilă . . . . . cca 20 mg% albumină
- floculare abundentă . . . . . . . . > 20 mg% albumină
Reacții fals pozitive se observă în terapia diabetului cu antidiabetice orale
(tolbutamid), după administrare de antibiotice din familia cefalosporinelor, etc.
Reacția cu acid azotic (proba Heller)
Reactiv: Acid azotic concentrat
Mod de lucru:
În cca. 1-2 ml acid azotic concentrat se lasă să se prelingă pe peretele eprubetei
1-2 ml urină. Apariția unui precipitat sub formă de inel la zona de contact dintre cel
două soluții indică prezența proteinelor.
Reacții fals pozitive pot fi date de urina conservată cu timol sau care conține
uree și urați în cantitate mare. Mucoproteinele secretate de mucoasa căilor urinare pot
da numai o tulbureală care nu este delimitată sub formă de inel.

141
 Proba cu acid tricloracetic
Reactiv: Acid tricloracetic 15%
Mod de lucru:
La 5 ml urină se adaugă 1 ml acid tricloracetic. Formarea unui precipitat alb
floconos arată prezența proteinelor.
Evidențierea proteinelor Bence-Jones (termosolubile)
Principiu:
În urina slab acidă proteinele Bence-Jones precipită între 45-55 oC și se
redizolvă în apropiere de 100 oC.
Reactiv: Tampon acetat 2 N (pH=4,9)
Mod de lucru:
Se lucrează din urinele la care am obținut rezultat pozitiv la reacțiile de
precipitare a proteinelor. Într-o eprubetă se pun 4 ml de urină, se adaugă 1 ml tampon
acetat și se incubează în baie de apă la 56 oC până la apariția unui precipitat. Apoi se
introduce eprubeta în apă la fierbere timp de 3 minute. Descreșterea cantității de
precipitat, clarificarea tulburării, confirmă prezența proteinelor Bence-Jones. Prin răcire
la 56 oC reapare precipitatul inițial.
Proteinele Bence-Jones sunt lanțurile ușoare ale imunoglobulinelor. Ele apar în
60% din cazurile cu mielom multiplu (multiplicarea canceroasă a unei clone de
plasmocite care produce imunoglobuline) și ocazional în alte boli care afectează
măduva osoasă: leucemii, osteosarcoame (tumori canceroase ale țesutului osos),
metastaze osoase, unele disproteinemii.
Test rapid pentru detectarea proteinelor urinare
Principiu:
Hârtia reactivă impregnată cu albastru de tetra-bromfenol este colorată în galben
deschis în mediu acid (pH ≈ 3). În prezența proteinelor urinare, culoarea virează spre
verde, verde-albăstrui, albastru sau violet, nuanța depinzând de tipul de proteină și de
concentrația acesteia în urină.
Mod de lucru:
Se înmoaie capătul benzii în urina de analizat. După 2 minute se apreciază
prezența proteinelor urinare prin compararea culorii obținute cu o scală de etalonare.
Cantitativ urmele de proteine corespund la aproximativ 5-20 mg% de albumină. Testul
are valoare orientativă.

142
 Evidențierea puroiului
Proba Donné
Principiu:
Cu ajutorul NaOH se lezează membrana leucocitară din care astfel se eliberează
mucină, care mărește vâscozitatea urinei și împiedică ridicarea imediată a bulelor de aer.
Reactiv: Sol. NaOH 20%
Mod de lucru:
Se iau într-o eprubetă 5 ml urină, se adaugă câteva picături de NaOH 20%, se
astupă eprubeta și se răstoarnă brusc, apoi se readuce în poziția inițială. Apariția unor
bule de aer în lichid, care rămân mai mult timp în suspensie și se ridică încet la
suprafață denotă prezența puroiului.
În cazul în care bulele de aer se ridică rapid, testul este negativ. Dacă toate
bulele de are se ridică încet la suprafață rezultatul se notează cu +. În cazul în care
bulele mici rămân pe fundul eprubetei, rezultatul este ++. Dacă nici bulele mai mari nu
se ridică datorită prezenței unei cantități mari de mucină, proba se notează cu +++.
Interpretare: Puroiul este constituit din leucocite degenerate care apar în urină în
urma proceselor inflamatorii ale tractului urinar (pielonefrită, cistită, uretrită). Probe fals
pozitive pot apare în albuminurie masivă, datorită prezenței polizaharidelor, a mucinei,
etc. Testele pozitive trebuie întotdeauna verificate prin examenul microscopic al
sedimentului urinar.

Identificarea glucidelor urinare

În mod normal, urina nu conține decât cantități mici de glucide. În mod
patologic însă, glucoza poate apărea în cantități apreciabile, prezența ei în urină fiind
denumită glicozurie și este caracteristică diabetului zaharat. În anumite stări patologice
particulare, urina mai poate conține în afară de glucoză și alte glucide: fructoză,
galactoză, lactoză, maltoză și pentoze.
Fiziologic poate apare glicozurie după ingerarea unor cantități mari de glucide.
De asemenea, lăuzele și 40% din gravidele în a doua jumătate a sarcinii prezintă
lactozurie.
Evidențierea glucidelor urinare se face pe baza proprietății reducătoare a
acestora față de sărurile unor metale (Cu, Bi). Pe lângă glucide, în urină pot exista și alte
substanțe reducătoare care pot da rezultate fals pozitive (cantități mari de creatinină,
acid ascorbic, acid uric, fenoli, etc.). Unele medicamente eliminate prin urină cum ar fi

143
penicilina, streptomicina, dextranul pot reduce sărurile metalice. Din acest considerent,
înaintea cercetării calitative a diferitelor tipuri de glucide urinare, se efectuează operația
de defecare - adică înlăturarea substanțelor reducătoare neglucidice din urină.
Defecarea urinii
Defecarea urinii se efectuează cu reactivul Courtonne, care se prepară în felul
următor: se dizolvă 100 g acetat de plumb în apă distilată, se neutralizează cu acid acetic
glacial (control cu hârtie indicator), se filtrează într-un balon cotat de 1000 ml și se
completează cu apă distilată până la semn.
Mod de lucru:
Se iau într-un cilindru 45 ml urină și 5 ml reactiv Courtonne, se amestecă cu o
baghetă, se lasă să se depună precipitatul și se filtrează.
Majoritatea reacțiilor de reducere nu sunt considerate suficient de specifice
pentru a fi utilizate pentru depistarea glicozuriei. Mai specifice sunt reacțiile Nylander și
Benedict, ultima având avantajul de a da indicații orientative asupra cantității de
substanță reducătoare din urină. O metodă specifică de evidențiere a glucozei este
metoda cu glucozoxidază.

Reacția Nylander
Principiu:
Glucidele reducătoare reduc în mediu bazic ionii de Bi3+ la Bi metalic.
Reactivi: 20 g azotat de bismut, 40 g sare Seignette (tartrat dublu de sodiu și
potasiu) și 100 g NaOH se dizolvă în apă până la 1000 ml soluție.
Mod de lucru:
Într-o eprubetă, la 5 ml urină se adaugă 1 ml reactiv Nylander și se încălzește la
flacără timp de 4 minute.
În prezența glucozei apare un precipitat brun până la negru. Reacții fals pozitive
pot exista în proteinurie masivă, când apare un precipitat brun de sulfură de bismut
datorită reacțiilor de reducere date de unele grupări funcționale ale radicalilor
aminoacizilor.

144
 Reacția Benedict (semicantitativă)
Principiu: Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce la cald Cu 2+ din
reactivul Benedict la Cu+ (menținerea în soluție a Cu2+ se face prin complexare cu citrat
de sodiu). În urma reacției se formează Cu 2O de culoare roșie-cărămizie. Reacția este
pozitivă pentru toate glucidele reducătoare.
Mod de lucru:
Se pun într-o eprubetă 0,5 ml urină și 5 ml reactiv Benedict. Se amestecă și se
pune într-o baie de apă la fierbere timp de 5 minute. Se răcește la temperatura camerei și
se interpretează rezultatul astfel:
Culoare Rezultat Substanțe reducătoare g‰
albastru - absente
albastru-verzui Urme urme
verde + cca 0,5
brun-verzui ++ cca 1,0
galben +++ cca 1,5
roșu-cărămiziu ++++ cca 2,0

Reacția Barfoed

Principiu:
Reacția de reducere a Cu2+ la Cu+ din Cu2O în mediu slab acid este pozitivă
numai în prezența monozaharidelor și ea servește la identificarea acestora în prezența
dizaharidelor reducătoare (lactoză, maltoză), pentru care această reacție este negativă în
condițiile de lucru. În mediu slab acid viteza reducerii Cu 2+→ Cu+ este mult mai mică
decât în mediu alcalin (se formează un precipitat roșu-cărămiziu), totuși mecanismul
reacției Barfoed încă nu este pe deplin cunoscut.
Reactiv: Reactiv Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolvă în 200 ml apă
distilată, se filtrează și se adaugă 1,8 ml acid acetic glacial.
Mod de lucru:
Se pun într-o eprubetă 2 ml urină și 2 ml reactiv Barfoed. Se amestecă și se
încălzește eprubeta la fierbere timp de 5 minute. Pozitivitatea acestei reacții, adică
apariția pulberii roșii de Cu2O la suprafața și la fundul eprubetei, indică existența
monozaharidelor reducătoare.

145
 Reacția Wöhlk

Se folosește tot în scopul diferențierii glucozei de lactoză.

Principiu:
Urina care conține lactoză, încălzită la 60 oC în prezența NH3 și KOH, se
colorează în roșu.
Reactivi: - Sol. NH3 25%
- Sol. KOH 20%
Mod de lucru:
Într-o eprubetă, la 5 ml urină, se adaugă 3 ml soluție NH 3 și 5 pic. soluție KOH.
Eprubeta se agită și se introduce în baie de apă la 60 oC, 30 minute. Prezența lactozei
determină apariția colorației roșii. Galactoza produce culoare galben deschisă, iar
glucoza în concentrații ridicate dă o colorație brună.
Interpretare: Lactozuria este un fenomen inofensiv care poate apare în ultimele
luni de sarcină sau la începutul alăptării.

Reacția Seliwanoff

Se folosește pentru identificarea fructozei urinare.

Principiu:
Monozaharidele în prezența acidului clorhidric concentrat reacționează cu
rezorcina (sau alți polifenoli) formând produși de condensare colorați. Reacția este mai
rapidă și intensă în prezența cetozelor, când se obțin produși colorați în roșu. În prezența
aldozelor, în aceleași condiții, colorația este slab roză. Această reacție servește la
diferențierea aldozelor de cetoze.

Reactivi: - Reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcină și 100 ml acid clorhidric

concentrat se dizolvă în apă distilată până la 200 ml.
- Soluție fructoză 1%

Mod de lucru:
Se pun într-o eprubetă 0,5 ml urină și 5 ml reactiv Selivanoff. În paralel se
execută doi martori, unul cu 0,5 ml urină normală și celălalt cu 0,5 ml urină normală
care conține fructoză 1%. Se aduc la fierbere cele trei eprubete.

146
 Prezența fructozei este indicată de apariția unei colorații roșu intens. Prin răcire
se poate depune un precipitat roșu care se dizolvă în alcool.
Interpretare: Fructozuria esențială este o boală ereditară rară datorată blocării
conversiei normale a fructozei în glucoză în ficat (deficit de fructokinază). Se poate
produce o fructozurie alimentară în diabet și în unele boli hepatice.

Reacția Bial
Se folosește pentru identificarea pentozelor urinare.
Principiu:
În mediu puternic acid pentozele dau reacție de culoare cu orcina
(metilrezorcina).
Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcină se dizolvă în 200 ml alcool etilic 96%
și se adaugă 40 picături sol. FeCl3 10%
- HCl conc.
- soluție 1% de fructoză, arabinoză, glucoză

Mod de lucru:
Se iau într-o eprubetă 5 ml reactiv Bial și 0,5 ml urină. Se execută în paralel doi
martori, unul cu urină normală și altul cu o urină normală la care se adaugă 1 ml soluție
de pentoze 0,1% (arabinoză sau xiloză). Se aduc la fierbere cele trei eprubete, apoi se
lasă în repaus 15-20 minute. Pentozele dau culoare verde, sau dacă sunt prezente în
cantități mari, un precipitat de culoare verzuie. Culoarea poate fi extrasă prin agitare în
alcool amilic.
Interpretare:
Pentozuria alimentară apare după un consum substanțial de fructe bogate în
pentoze. Pentozele sunt adesea excretate în urina diabeticilor. Pentozuria esențială (în
care se elimină xiluloza) este o boală ereditară rară în care apar cantități considerabile
de L-xiluloză în urină datorită deficitului de reductază care convertește pentoza în
xilitol.

Reacția cu fenilhidrazina
În laboratorul clinic formarea glucosazonei și a lactosazonei este utilizată ca test
pentru diferențierea glucozei de lactoză în urina femeilor gravide.

147
 Reactivi: - Soluție fenilhidrazină în acid acetic glacial 10%;
- Soluție acetat de sodiu 25%;
- Acid acetic glacial;
- Reactiv Patein: se dizolvă 200 g acetat de mercur în 600 ml apă
distilată, se alcalinizează (indicator hârtie de turnesol) cu soluție
de hidroxid de sodiu 10%. Se trece într-un balon cotat de 1000 ml
și se completează cu apă distilată la semn. Reactivul nu se
alterează.
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se pipetează 1 ml soluție fenilhidrazină, 1 ml acid acetic glacial
și 1 ml soluție acetat de sodiu 25%, apoi se adaugă 10 ml urină defecată cu reactiv
Patein. Prin defecare se elimină celelalte substanțe reducătoare pe care le-ar putea
conține urina trecând în filtrat numai glucidele. Se filtrează și eprubeta cu filtrat se ține
o oră în baia de apă la fierbere, apoi se filtrează imediat la cald într-o altă eprubetă care
se lasă să se răcească.
În prezența glucozei (în cantitate mai mare de 4 g% o) se obține glucosazonă
insolubilă la cald care rămâne pe al doilea filtru și care examinată la microscop, se
prezintă sub formă de ace galbene aurii dispuse în snopi (vezi pag. 49). Fructosazona
are aspect asemănător. Dacă urina conține și lactoză sau maltoză, osazonele acestora se
vor cristaliza în ultima eprubetă, la rece. Cristalele de lactosazonă apar la microscop
sub formă de rozete, iar cele de maltosazonă au formă de lame aproape rectangulare
unite prin una din extremități.

Identificarea corpilor cetonici urinari

Corpii cetonici (acetona, acidul acetoacetic și acidul -hidroxibutiric) sunt
implicați în metabolismul lipidic. În condiții patologice de dereglare a catabolismului
acizilor grași se excretă prin urină în special acidul -hidroxibutiric și acidul
acetoacetic, ultimul fiind convertit în acetonă prin decarboxilare dacă urina este păstrată
la temperatura camerei.

148
 Reacția Legal
Servește la identificarea acetonei. În scop diagnostic este suficientă identificarea
acesteia, fiindcă acetona, acidul acetoacetic și -hidroxibutiratul sunt întotdeauna
prezenți împreună.
Reactivi: - Sol. nitroprusiat de Na 10% (proaspătă)
- Acid acetic glacial
- NaOH 10%
Mod de lucru:
Se iau într-o eprubetă 3 ml urină, se adaugă 5 picături de soluție de nitroprusiat
de Na 10% și 2-3 pic. de NaOH 10% până la reacție alcalină. Apariția unei culori roșii
sau portocalii se datorează acetonei sau creatininei urinare. Se adaugă apoi 1-2 ml acid
acetic glacial. Dispariția culorii indică absența acetonei, iar intensificarea culorii cu
virare spre roșu-violet indică prezența acetonei. Intensitatea culorii variază în raport
direct cu concentrația corpilor cetonici din urină.
Reacția poate fi dată și de unele medicamente (salicilați - de ex. aspirina).
Diferențierea se face fierbând în prealabil câteva minute urina, operație prin care
acetona se îndepărtează. O reacție pozitivă inițială, care nu mai apare după fierberea
unei alte probe din urina respectivă, indică prezența acetonei.

Reacția Lieben
Principiu:
În reacția dintre acetonă și iod în mediu alcalin, ia naștere iodoformul care poate
fi recunoscut prin miros.

H3C - CO - CH3 + 3I2 + 3NaOH CH3 - CO - CI3 + 3NaI + 3H2O

CH3 - CO - CI3 + NaOH CH3 - COONa + CHI3

tri-iod-acetona iodoform
Reactivi: - Sol. de iod - iodură de potasiu 0,1 N
- Sol. NaOH 10%
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se iau 5 ml urină, se adaugă 1-2 ml NaOH 10% și 1-2 ml iod 0,1
N. Apariția unui precipitat galben și a mirosului de iodoform indică prezența acetonei.

149
 Interpretare: Corpii cetonici apar în urină în diabetul zaharat netratat (datorită
lipsei de insulină, celulele nu pot internaliza glucoza din sânge. Acizii grași vor fi
principala sursă de energie, ceea ce intensifică exagerat cetogeneza hepatică. Ficatul
exportă mari cantități de corpii cetonici care sunt folosiți în scop energetic de țesuturile
extrahepatice). Acetonurie apare în toate cazurile în care aportul de glucide sau
utilizarea lor este deficitară: înfometare, regim alimentar dezechilibrat (bogat în lipide și
proteine, sărac în glucide), diaree, vărsături (accentuate de sarcină), malabsorbție
intestinală, boli metabolice.

Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici

Corpii cetonici se pot evidenția cu pulbere reactivă sau cu tablete "Acetotest"
sau baghete "Ketostix" care conțin nitroprusiat de sodiu și substanțe alcalinizante, care
se colorează în roșu în cazul reacției pozitive. Aceste teste rapide se bazează pe reacția
Legal clasică. Cu ajutorul lor putem detecta corpii cetonici chiar în concentrații de 0,5-1
mmol/l, prin apariția culorii roșii la 15 secunde de la contactul urinei cu bagheta cu
reactivi.
Identificarea acizilor biliari
Eliminarea acizilor biliari în urină se mai numește colalurie. Apare în special în
caz de icter mecanic (din cauze obstrucției tubului coledoc, sărurile acizilor biliari nu
mai sunt excretate în bilă. Datorită presiunii ele trec în curentul sanguin și se elimină în
urină). Colaluria mai apare în ictere date de hepatită, când celula hepatică bolnavă nu
mai poate excreta acizii biliari.
Proba Hay
Principiu:
Sărurile acizilor biliari scad tensiunea superficială a urinei permițând
sedimentarea florii de sulf.
Reactiv: Sulf sublimat (floare de sulf).
Mod de lucru:
Se presară floarea de sulf pe suprafața urinei pusă într-o eprubetă. Dacă urina
conține acizi biliari, sulful sedimentează în 5 minute. În absența acizilor biliari sulful
plutește câteva ore.

150
 Reacția Pettenkoffer
Principiu:
Acidul sulfuric transformă glucidele în derivați furfurolici care se condensează
cu acizii biliari dând produși colorați.
Reactivi: - Acid sulfuric concentrat
- Zaharoză 10%
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se iau 1 ml apă distilată, 1-2 ml urină, 5-6 picături zaharoză 10%
și se agită. Se adaugă cu grijă, prelingându-se pe peretele eprubetei ținută într-o poziție
înclinată, 1-2 ml acid sulfuric. Apariția unui inel roșu-violet la limita de separație a
reactivului cu proba indică prezența acizilor biliari. În paralel se execută o probă martor
în aceleași condiții, înlocuind urina cu apă. Inelul obținut are o nuanță brună cărămizie.

Identificarea pigmenților biliari urinari

Pigmenții biliari sunt derivați pirolici care provin din catabolismul hemului.
Principalii reprezentanți sunt biliverdina, bilirubina, urobilinogenul, urobilina,
stercobilinogenul, stercobilina. Urobilinogenul și stercobilinogenul, rezultați prin
reducerea bilirubinei, sunt compuși incolori, care în contact cu aerul se oxidează parțial,
trecând în urobilină, respectiv stercobilină, care sunt compuși colorați.

Identificarea bilirubinei

După cantitatea de bilirubină eliminată, culoarea urinei variază între galben și

brun-închis, cu nuanță verzuie. Bilirubina eliminată în urină, fiind instabilă, reacțiile de
identificare trebuiesc făcute în timp cât mai scurt de la emisie. Bilirubina fiind
fotosensibilă, urina trebuie conservată la întuneric.
Urina normală conține doar urme de bilirubină, care nu dă reacția de identificare
pozitivă. Creșterea eliminării urinare a bilirubinei apare, ca și în cazul acizilor biliari, în
icterele prin obstrucția căilor biliare și în icterele prin hepatită.

Proba Popper
Principiu:
Oxidarea bilirubinei în biliverdină (de culoare verde) cu ajutorul iodului.

151
 Reactivi: - Reactiv Popper: Se amestecă 525 ml apă distilată, 125 ml alcool 95 o,
3,5 ml tinctură de iod 10% și se adaugă 12 g KI și 27 g NaCl.
Mod de lucru:
Se pun 5 ml urină într-o eprubetă. Se adaugă cu precauție, cu o pipetă, 2 ml
reactiv, astfel ca cele două lichide să nu se amestece. Reactivul fiind mai dens, se
introduce la fundul eprubetei. În prezența bilirubinei apare un inel verde la suprafața de
contact dintre coloanele celor două lichide.
Reacții fals pozitive: după consum de antipirină (analgetic) și piramidon.
Testele rapide de determinare a bilirubinei din urină au la bază reacția de
condensare a bilirubinei cu un alt compus în mediu puternic acid, cu apariția unei
colorații maronii de intensitate diferită. Reacția completă necesită 20 de minute.

Identificarea urobilinogenului și stercobilinogenului

Urobilinoizii sunt derivații hidrogenați ai bilirubinei: urobilinogenul,
stercobilinogenul, urobilina și stercobilina. Reducerea bilirubinei se produce în intestin
sub influența bacteriilor. O parte din urobilinoizi este reabsorbită și ajunge din nou la
ficat prin vena portă (circuitul hepatoenterohepatic al pigmenților biliari). Cea mai mare
parte este metabolizată, în timp ce 35-140 mg sunt excretate în urina de 24 de ore.

Identificarea urobilinoizilor urinari

Reacția Ehrlich
Principiu:
În prezența p-dimetilaminobenzaldehidei în mediu puternic acid, urobilinogenul
și stercobilinogenul dau o colorație roșie intensă prin formarea unui compus chinoid.
Reactivi: - Reactiv Ehrlich: se dizolvă 2 g p-dimetilaminobenzaldehidă în 100
ml HCl 20%.
- Cloroform
Mod de lucru:
La 3 ml de urină se adaugă 2-3 picături reactiv Ehrlich. Se lasă în repaus un
minut. Apariția unei colorații roșii intense la temperatura ambiantă denotă o eliminare
crescută de urobilinogen. Colorantul se poate extrage în cloroform. Porfobilinogenul
intermediar al sintezei hemului, care apare în urină în porfiria intermitentă acută, dă o
colorație asemănătoare. El nu este însă solubil în cloroform. Dacă după agitare cu

152
cloroform acesta rămâne incolor, reacția pozitivă se datorește prezenței
porfobilinogenului.
Observație: Urina de analizat trebuie să fie rece. În urina caldă indolul eliberat în
condițiile de reacție poate da și el culoare roșie cu reactivul Ehrlich. Sulfamidele dau o
colorație galbenă care poate masca reacția bilinogenilor.
Interpretare: Eliminarea crescută a urobilinoizilor apare în următoarele situații:
1). Hemoliză exagerată: funcția hepatică este în general intactă, dar posibilitățile
de glucuronoconjugare ale ficatului sunt depășite.
2). Tulburarea funcției hepatice: ictere hepatocelulare, hepatite, ciroză sau
intoxicații chimice cu cloroform și în special cu tetraclorură de carbon.
3). Icter prin obstrucție, în stadiile precoce, de obstrucție incompletă.

Identificarea sângelui
În urină apare fie hemoglobina liberă (hemoglobinurie), fie hematii (hematurie).
Diferențierea se poate face numai prin examenul microscopic al sedimentului urinar, și
anume în primul caz în sediment nu se observă hematii.
Se folosește urina proaspătă fiindcă majoritatea testelor se bazează pe acțiunea
pseudoperoxidazică a hemoglobinei: leucoderivatul unui colorant (benzidina,
fenolftaleină redusă în mediu alcalin, etc.) este oxidat cu apă oxigenată, în prezența
hemoglobinei, în colorantul respectiv. Întrucât leucocitele dau o reacție peroxidazică
adevărată (enzimatică) este necesar să se fiarbă urina câteva minute, după acidularea
prealabilă cu acid acetic.
Reacția cu benzidină
Reactivi: - Sol. benzidină: 5 g benzidină se dizolvă în 50 ml acid acetic
glacial și se completează cu apă distilată la 1000 ml.
- Apă oxigenată 3%

Mod de lucru:
Se iau 3 ml urină, 2-3 pic. sol. benzidină și 2 ml apă oxigenată 3%. Se agită,
reacția pozitivă prezintă o culoare albastră. Ordinea de adăugare a reactivilor este
esențială.
Interpretare:
Hematuria macroscopică (vizibilă cu ochiul liber) apare în caz de: calculi renali,
tumori renale sau ale căilor urinare (cancerul renal deseori are ca primă manifestare

153
hematuria), tuberculoză urogenitală, traumatisme, chisturi renale, diateză hemoragică
(sângerări multiple, în diferite țesuturi), cistită hemoragică. Hematuria microscopică,
deseori renală apare în caz de: calculi ureterali care produc leziuni ale mucoasei,
pielonefrită, nefrită interstițială, în colagenoze (boli autoimune cu frecventă afectare
renală), de însoțire în boli infecțioase, efort fizic, glomerulonefrită (lezarea gravă a
filtrului glomerular face posibilă traversarea lui de către hematii) .

Teste rapide de diagnostic din urină

Stripsurile pentru analiza urinei sunt plăci de celuloid care conțin mai multe
benzi de hârtie impregnate cu reactivi. Parametri cei mai importanți care se analizează
sunt: densitatea, pH-ul, bilirubina, urobilinogenul, proteinele, glucoza, corpii cetonici,
leucocitele, nitriții și sângele. Stripsul se introduce în proba de urină pentru câteva
secunde, timp în care au loc reacțiile corespunzătoare. Culoarea se compară cu o scală
de culori care arată aproximativ cantitatea de substanțe conținute, pH-ul, etc, sau se
introduce stripsul într-un aparat special care citește rezultatele.

Test rapid de sarcină

Se bazează pe determinarea hormonului coriogonadotrop uman (hCG). Dacă

acesta se găsește în urină în cantitate mare (peste 800 U/l), testul este pozitiv, iar la
valori sub 500 U/l testul este negativ. Principiul de determinare se bazează pe latex-
aglutinare, hemaglutinare, sau o metodă imunoenzimatică, în funcție de testul folosit.
La metoda de latexaglutinare elementele de latex ale plăcii de reacție a kitului
sunt acoperite cu hCG. Antiserul folosit conține anticorpi monoclonali specifici pentru
beta-hCG. În caz pozitiv (dacă este sarcină) hCG din urină în concentrație de peste 800
U/l se leagă de anticorpii monoclonali ai antiserului, împiedicând astfel aglutinarea
elementelor de latex acoperite cu anticorpi. În caz negativ, dacă nivelul hCG în urină
este sub 500 U/l, atunci hCG de pe suprafața elementelor de latex se poate lega de
anticorpii monoclonali cu locusurile de legare libere, astfel se produce aglutinarea.
În cadrul metodei imunoenzimatice în prima etapă se adaugă într-o eprubetă
proba de urină la anticorpul anti-hCG legat de o enzimă, apoi acest amestec este pus pe
o placă de reacție. Dacă proba conține hCG, acesta se leagă de anticorpul monoclonal și
complexul se leagă de un alt anticorp (anti-hCG) legat de placa de reacție. În a doua

154
etapă se adaugă un substrat care este transformat de către enzima din complex într-un
compus colorat. Această reacție este foarte sensibilă, fiind pozitivă peste valoarea de 25
U/l hCG.

Analiza de laborator a urinei

Analiza de rutina evidențiază: Aspect: clar. Cilindri: absenți, eventual prezența

cilindrilor hialini. Culoare: galben pai. Cristale: prezente. Celule epiteliale: absente.
Miros: ușor aromatic. pH: 4,5-8,0. Densitate: 1,025-1,030g/cm 3. Glucide: absente.
Hematii: 2-3/câmp vizual. Leucocite: 0-4/câmp vizual.
Proba de concentrare pune în evidență: Densitatea: 1,025-1,032g/cm3.
Osmolaritatea: > 800 mOsm/kg apă
Proba de diluție pune în evidență: Densitatea: < 1,003. Osmolaritatea: < 100
mOsm/kg apă.

Dozarea acidului uric din urină

Recoltarea urinii de 24 ore se face într-un recipient de sticlă cu 10 ml NaOH 5%
pentru a preveni precipitarea uraților.
Modul de lucru:
În loc de 2 ml filtrat se lucrează cu 2 ml urină diluată 1:100.
Calcul:
Ep/Es x 100 x 15 = mg acid uric/1500 ml urină (pe 24 de ore)
Valori normale:
0,25 - 1,00 g acid uric eliminat/24 h
Valori crescute: În gută (după puseuri), tumori maligne
Valori scăzute: în gută (înainte si în cursul puseurilor), boli renale

Dozarea creatininei din urină

Principiu și reactivii: același ca pentru ser
Modul de lucru:
Se diluează urina de 50 ori. Din această soluție se pipetează 1,5 ml, se adaugă
4,5 ml acid picric saturat și se introduce vasul pentru 15-20 secunde în baie de apă
fierbinte. Dacă soluția rămâne limpede, după răcire se scot 5 ml de probă la care se
adaugă 0,25 ml NaOH 10%. După 15 minute se citește extincția probei față de martor la

155
530 nm. Martorul va conține 2 ml de apă bidistilată, 6 ml acid picric saturat și 0,25 ml
NaOH 10%. În paralel se execută aceleași operații folosind în locul urinei diluate o
soluție standard de creatinină de concentrație c S = 10 g/ml pentru care se obține
extincția Es.
E urină 1
mg creatinină = ⋅c S⋅50⋅
Calcul: ES 1000

Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal

Pornind de la faptul că constituenții urinii provin din sânge, cunoscând cantitatea

lor în sânge și în urină, putem calcula volumul de sânge epurat de aceste substanțe.
Pentru orice substanță din sânge, care se elimină în urină, putem scrie formula: m p = mu
unde: mp = cantitatea absolută a substanței dintr-un volum de plasmă care va fi epurată
de aceea substanță. mu = cantitatea absolută a substanței ajunse prin epurare în urină.
mp = Vp  cp/100. mu = Vu  cu/100. Vp  cp = Vu  cu
cp, cu = concentrațiile plasmatică și urinară a substanței. V u = volumul de urină eliminat
în ml/min. Vp = C (clearance = coeficient de epurare) = acel volum virtual de plasmă
care este epurat într-un minut de această substanță (ml/min) pe cale renală. Deci
coeficientul de epurare este exprimat prin raportul dintre debitul urinar al unei substanțe
pe minut și concentrația sa în plasmă:
cu
C = ----  Vu
cp
La nivelul nefronului au loc 3 procese importante: filtrarea glomerulară,
reabsorbția tubulară și secreția tubulară. Clearance-ul este egal cu volumul filtrării
glomerulare pe minut în cazul substanțelor care se filtrează liber, adică nu sunt
reabsorbite și secretate la nivel tubular, nu se transformă, nu se depozitează, nu
influențează funcția renală, nu sunt toxice. Astfel de substanțe pot fi endogene
(creatinină) și exogene (inulină, manitol-polizaharide cu masă moleculară mare etc.).
Astfel determinarea clearance-ului de creatinină endogenă permite explorarea filtrării
glomerulare. Clearance-ul de creatinină endogenă este egal cu 120 ml/min pentru o
suprafață corporală medie de 1,7 m2 și o greutate medie de 70 kg.

156
 Fiecare substanță din plasmă are un coeficient de epurare indiferent de
concentrația sa în urină. Majoritatea constituenților obișnuiți ai urinei au un coeficient
de epurare mai mic de 120 ml/min, datorită reabsorbției tubulare parțiale sau totale (de
ex. Cglucoză = 0). O altă categorie de substanțe au un clearance superior filtratului
glomerular, deoarece ele ajung în urina finală și printr-un proces de secreție tubulară.
Determinarea clearance-ului de creatinină permite deci explorarea capacității de filtrare
glomerulară.
Calcul:
Calculul clearence-lui de creatinină (C) se poate face cu următoarea formulă
C = Eurină/Eser  50  1500/24  60
unde: Eurină și Eser sunt extincțiile optice citite pentru probele de urină, respectiv ser
în metodele de dozare descrise la pag. 121.
Valori normale: 80-120 ml/min

Analiza calculilor urinari

Calculii urinari se formează prin precipitarea unor substanțe organice și

anorganice des întâlnite în sedimentul urinar: oxalat de calciu, acid uric, urați, fosfați de
calciu și magneziu, xantina, colesterolul. Acestea se depun sub formă de straturi
alternante în jurul unui nucleu sau sunt amestecate intim. Calculi omogeni se întâlnesc
rar.

Identificarea unor componenți prin reacții specifice:

1) CO32-: Pulberea de calcul urinar se dizolvă cu efervescență în soluție de HCl 2N la
cald.
2) PO43-: Într-o eprubetă se introduce un vârf de cuțit de pulbere de calcul, se adaugă
câteva picături de HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml) și 1-2 ml soluție de molibdat de
amoniu 5%. Se încălzește și se lasă în repaus. Apariția unei colorații sau precipitat
galben de fosfomolibdat de amoniu indică prezența fosfatului.
3) (COO)22-: Într-o eprubetă se introduc un vârf de cuțit de pulbere de calcul, 1 ml
H2SO4 5% și 2 picături KMnO4 1%o. Se încălzește eprubeta. Dacă oxalatul este
prezent, va reduce KMnO4 producând decolorarea soluției.

157
4) Cistină: Într-o eprubetă se introduc un vârf de cuțit de pulbere, 1 ml soluție de
NaOH 10% și 2-3 picături soluție de Pb(CH 3COO)2 saturată. Eprubeta se încălzește
la fierbere 1-2 minute. Prezența cistinei duce la formarea PbS (precipitat negru).
5) Urat (reacția murexidului): Într-o capsulă de porțelan se introduce un vârf de cuțit
de pulbere care apoi se umectează cu 2-3 picături HNO 3 concentrat (d = 1,42 g/ml)
și se evaporă pe flacără la sec. Apariția unei culori roșii indică formarea acidului
purpuric prin oxidarea acidului uric de către HNO 3. Adăugând o picătură de soluție
NH3 25% și o picătură soluție NaOH 10% apare o culoare violetă datorită
murexidului (purpurat de amoniu).
6) Xantina: Se face reacția cu HNO3 concentrat ca și în cazul evidențierii uratului.
Prezența xantinei determină un reziduu galben care nu-și schimbă culoarea la
adăugarea soluției de NaOH. Adăugând soluție de NH3 culoarea virează spre roșu.
7) Colesterolul: (reacția Liebermann-Burchardt): Într-o eprubetă se introduc 1 vârf de
cuțit de pulbere, 1 ml cloroform, 4 picături H2SO4 concentrat (d = 1,92 g/ml) și 2
picături anhidridă acetică.
Prezența colesterolului determină formarea dicolestendienei de culoare ce variază de la
roz la verde, extractibilă în cloroform.
Calculii urinari apar în litiaza urinară cu următoarea frecvență relativă: Oxalat
de Ca 34,2%. Oxalat de Ca + fosfat de Ca 26,2%. Acid uric 18,8%. Fosfat de Ca 9,7%.
Oxalat de Ca + acid uric 4,5%. Fosfat amoniaco-magnezian 2,2%. Carbonat de Ca
2,2%. Cistină 1,7%.

Analiza sucului gastric

Determinarea acidității gastrice

Sucul gastric provine din secreția unui mare și variat număr de celule ale
mucoasei gastrice. Zona glandelor fundice elaborează secreția primară acidă (secreție
parietală) care este de fapt o soluție apoasă de acid clorhidric. Zona antropilorică
elaborează secreția primară alcalină (secreția neparietală), care este un amestec de
proteine, mucus, ioni de sodiu, potasiu, calciu, clorură și bicarbonat. Secreția alcalină
are rolul de a reduce aciditatea gastrică prin neutralizare și diluție.
Sucul gastric rezultă deci din amestecul celor două secreții parietale și
neparietale din care rezultă lichidul intens acidulat (pH = 1-2).

158
 Principiu:
În laborator se determină aciditatea totală, liberă și legată. Aciditatea liberă
reprezintă concentrația ionilor de hidroniu proveniți din acidul clorhidric liber.
Aciditatea legată reprezintă concentrația ionilor de hidroniu legați de proteine, fosfați
acizi, acizi carboxilici și alte substanțe. Aciditatea totală este dată de însumarea celor
două acidități (liberă și legată) și se poate defini ca fiind suma ionilor de hidroniu
titrabili cu NaOH 0,1 N.

Sucul gastric filtrat se titrează cu NaOH 0,1 N în prezență de indicator Tőpfer.

Figura redă curba de titrare (variația pH-ului în funcție de NaOH 0,1N adăugat)
în cazul unui suc gastric normal.
Indicatorul Tőpfer este un indicator universal preparat din p-
dietilaminoazobenzen și fenolftaleină. În tabel este prezentat virajul indicatorului Tőpfer
în funcție de pH (vezi curba de titrare de mai sus).

Indicator Tőpfer pH Culoarea

0 - 2,9 roșu
p-dimetilaminoazobenzen 2,9 - 4,1 portocaliu
4,1 - 14 galben
0-8 incolor
Fenolftaleină 8 - 10 roz
10 - 14 roșu

Reactivi: - Indicatorul Tőpfer : p-dimetilaminoazobenzen 0,25 g

fenolftaleină 2g
alcool etilic 96%. 100 ml
- Sol. NaOH 0,1 N cu factorul FNaOH
Modul de lucru:

159
 În trei flacoane Erlenmeyer de 100 ml se măsoară câte 10 ml suc gastric și se
adaugă 1-2 picături de indicator Tőpfer. Soluția se titrează cu NaOH 0,1 N până la
portocaliu și se notează cantitatea de NaOH 0,1 N folosită. Această cantitate reprezintă
volumul folosit pentru dozarea acidității libere și se notează cu v. Se continuă titrarea
trecând prin culoarea galbenă până la apariția culorii roșii. Totalul mililitrilor de NaOH
0,1 N consumați de la începutul titrării se notează cu v' și vor fi luați în considerare
pentru calculul acidității totale.
Calcul: Rezultatul se exprimă în unități clinice (UC, numărul de ml de NaOH
0,1 N folosiți la titrarea a 100 ml suc gastric).
aciditatea liberă = v FNaOH 10 UC
aciditatea totală = v' FNaOH 10 UC
Valoarea acidității legată se obține făcând diferența dintre aciditatea totală și cea
liberă.
Valori normale: aciditatea liberă = 30 UC; aciditatea totală = 50 UC.
Valori patologice:
Valori crescute: Hiperaciditate se întâlnește în stări de stres (stimulul simpatic
induce creșterea secreției de HCl în mucoasa gastrică), în gastrite hiperacide, ulcer
gastric și duodenal. În tumori pancreatice secretoare de gastrină (gastrinoame), se
produc ulcerații multiple datorită hiperstimulării secreției de HCl de către gastrină
(sindromul Zollinger-Ellison).
Valori scăzute: Hipoaciditatea apare în unele tipuri de gastrită. Aclorhidria, lipsa
totală de HCl se datorează atrofiei mucoasei gastrice sau proliferării ei tumorale
(celulele canceroase își pierd funcțiile fiziologice). O stare și mai gravă este aclorhidria
histamino-refractară, când nici la stimulare cu histamină nu se secretă HCl. În afară de
HCl, celulele parietale ale mucoasei gastrice mai secretă și o glicoproteină numită factor
extrinsec care leagă vitamina B 12 și o transportă la celulele intestinale pentru a se
absorbi. În cazul atrofiei mucoasei sau proliferării ei canceroase, nu se secretă acest
factor intrinsec și apare anemia pernicioasă (prin deficitul de absorbție a vitaminei B 12).

160
 Metode fizice de analiză folosite în laborator

Fotometria

Principiu:
Fotometria se bazează pe excitarea luminoasă a electronilor moleculelor
substanței.
După lungimea de undă, exprimată în nanometri (nm) sau în Ångströmi (Å),
spectrul undelor electromagnetice folosite în fotometrie se împarte în 3 regiuni:
- ultraviolet 200 - 450 nm,
- vizibil 400 - 800 nm,
- infraroșu 800 - 20000 nm,
Metoda spectrofotometrică de analiză se bazează pe determinarea extincției unui
strat de soluție colorată cu grosimea de 1 cm, la diferite lungimi de undă
Pentru obținerea radiațiilor de diferite lungimi de undă spectrofotometrele conțin
trei tipuri de monocromaoare: prisme, rețele de difracție sau filtre.
Lungimile de undă corespunzătoare diferitelor culori sunt redate în tabelul de
mai jos:

Culoarea Domeniul lungimilor de undă

Violet 400 - 450 nm
Albastru 450 - 500 nm
Verde 500 - 570 nm
Galben 570 - 590 nm
Portocaliu 590 - 620 nm
Roșu 620 - 760 nm

Efectuarea analizelor prin metoda colorimetrică prezintă avantajul că necesită

cantități mici de substanță și un timp relativ redus în comparație cu analizele chimice.
Legea Bouguer-Lambert-Beer, lege fundamentală a colorimetriei
În condiții similare, straturile de substanță colorată de aceeași grosime absorb
aceeași cantitate de lumină incidentă, absorbție ce se exprimă matematic prin ecuația:
I =I 0⋅e−K⋅l

161
în care I este intensitatea fluxului luminos după trecerea prin soluție; I 0 - intensitatea
fluxului luminos incident; e - baza logaritmilor naturali; l - grosimea stratului; K -
coeficient de absorbție optică.
Dacă se ia ca bază zecimală de logaritmare, rezultă ecuația:
I = I0 • 10 –k•l
Din această ecuație, în care coeficientul k reprezintă coeficientul de extincție, rezultă că:
a. Raportul între intensitatea luminii care a trecut prin stratul de soluție și
intensitatea luminii incidente nu depinde de intensitatea absolută a luminii incidente.
b. Când grosimea stratului de soluție se mărește în progresie aritmetică,
intensitatea luminii care trece prin aceasta descrește în progresie geometrică.
c. Coeficientul de extincție k, depinde numai de natura substanței dizolvate și
lungimea de undă a luminii incidente și este valabilă numai pentru lumină
monocromatică. Această lege a fost stabilită de către P.Bouguer și I.Lambert.
Beer a stabilit că, coeficientul de extincție k este liniar proporțional cu concentrația
substanței absorbante, adică :
k=•C
în care C este concentrația substanței colorate iar  este un coeficient care nu depinde de
concentrație.
Legea lui Beer stabilește dependența absorbției luminii de către stratul cu
grosime constantă de concentrația substanței colorante.
Din ultimele două ecuații rezultă ecuația legii fundamentale a colorimetriei -
legea Bouguer-Lambert-Beer:
I = I0 • 10 –•C•l
Raportul dintre intensitatea luminii, I, care a trecut printr-o soluție și intensitatea
luminii incidente, I0, poartă denumirea de transparență sau transmisie și se notează cu
litera T:
T = I/I0 = 10 –•C•l
Valoarea T pentru un strat de 1 cm grosime se numește coeficient de transmisie.
Logaritmul mărimii inverse transmisiei se numește extincție, E, sau densitate
optică, D.O.:
E = D.O. = lg 1/T = lg I0/I = • C • l

162
 Din această ecuație rezultă că extincția E este liniar proporțională cu
concentrația substanței colorate din soluție.

Schema de principiu al unui fotocolorimetru

Spectrofotometru PG T60

Spectrofotometrul de absorbție atomică

Principiu:
O parte din atomii speciei ce urmează a fi analizați sunt excitați în fllacără la un
nivel energetic superior emițând apoi prin revenirea la nivelul inițial o radiație
corespunzătoare liniei de rezonanță. Dar majoritatea atomilor rămân în starea
fundamentală. În spectroscopia de absorbție atomică se trece prin flacără o radiație

163
având frecvența liniei de rezonanță. Atomii rămași în starea fundamentală absorb
această radiație (pe care ar emite-o dacă ar fi excitați) și absorbția este proporțională cu
concentrația atomilor în flacără și grosimea stratului străbătut de radiația
monocromatică.

Spectrofotometrul de absorbție atomică

Spectrofotometrul de absorbție atomică se compune din:
1. Sursa de radiație care emite linia de rezonanță a elementului de determinat. Emisia
lămpii este modulată pentru ca detectorul să înregistreze doar lumina emisă de lampă nu
și cea emisă din flacără (de către atomii excitați). Se folosesc în general lămpi de,
descărcare cu catod tubular. Catodul trebuie să fie făcut din elementul pe care vrem să-l
determinăm. Sunt și lămpi care au catozi făcuți din aliaje astfel că pot fi folosite pentru
determinarea tuturor elementelor din care este făcut aliajul.
2. Atomizorul are rolul de a trece elementul de analizat sub formă de atomi. Se folosesc
atomizoare de flacără sau cu cuptor de grafit.
a) Atomizoarele de flacără sunt alimentate cu amestecuri de gaze cum ar fi:
aer-acetilenă; aer-hidrogen; aer-propan; N2O-acetilenă etc. Proba de analizat este
introdusă în atomizor prin aspirare și pulverizare.
b) Atomizorul cu cuptor de grafit este încălzit cu curent electric după un
program reglabil. Pentru a feri cuptorul (tubul de grafit), de ardere se folosesc gaze de
protecție. În general, ca gaz de protecție se folosește argonul sau azotul. La aparatele
dotate cu atomizor cu cuptor de grafit se pot analiza probe lichide sau solide. Probele
lichide se introduc cu ajutorul unor seringi iar probele solide cu ajutorul unor pensete.
3. Monocromatorul izolează linia de rezonanță și o focalizează asupra detectorului.
4. Fotomultiplicatorul detectează și amplifică intensitatea luminii care cade asupra sa.
Practic, aparatul este ajustat la extincția zero când o soluție martor este
vaporizată în probă și lumina lămpii ajunge la fotomultiplicator. Când se introduc soluții
conținând specii absorbante o parte din lumină este absorbită și rezultă o diminuare a
intensității luminii ce ajunge la fotomultiplicator. Se determină extincțiile obținute cu
soluții standard ale elementului de analizat cu care se construiește o curbă de etalonare a
aparatului. Se introduc apoi probele de analizat prelucrate în mod corespunzător iar din
compararea extincțiilor probelor cu curba de etalonare se calculează concentrația
elementului de analizat.

164
 Flamfotometria

Fotometrul cu flacără (flamfotometrul)

Principiu:
Soluția de analizat este pulverizată automat într-un dispozitiv, numit
pulverizator și se introduce sub formă de aerosoli in flacăra unui arzător special
(Brenner). Soluția, sub formă de aerosoli, ajunsă în flacără suferă diferite transformări:
apa în care este dizolvată sarea se evaporă, componentele dizolvate sunt excitate de
temperatura ridicată a flăcării, reîntoarcerea electronilor din starea excitată pe un nivel
energetic inferior eliberează energia absorbită sub formă de lumină cu lungime de undă
caracteristică elementelor chimice ai cărui atomi sunt excitați.
Prin excitarea în flacără a acestui amestec complex iau naștere diferite spectre de
emisie. Radiația emisă este focalizată pe o celulă fotoelectrică, după ce au trecut prin
filtre optice de selecție. Ia naștere astfel un fotocurent care se măsoară cu ajutorul unui
galvanometru. În cazul determinării unui anumit element (sodiu, potasiu, calciu etc.),
intensitatea fotocurentului este proporțională cu concentrația elementului respectiv din
soluție.
Pulverizatorul pulverizează automat în picături foarte fine soluția de analizat. El
este confecționat din sticlă, cuarț sau material plastic. Pulverizarea se realizează în felul
următor: gazul purtător comprimat, care iese cu viteză mare în apropierea tubului cu
soluție, antrenează soluția de analizat și o pulverizează în particule foarte fine. Soluția
pulverizată ajunge in flacăra arzătorului, unde se vaporizează iar ionii absorbiți se
excită. Pentru ca analiza să se desfășoare în condiții optime este necesară menținerea
unei presiuni constante atât pentru aer cât și pentru gazul de ardere. Reglarea presiunii
se realizează cu ajutorul unor reductoare de presiune și se măsoară cu manometrul.
Gazul purtător poate fi aerul sau oxigenul.

165
 În figura de mai sus apar principalele componente ale unui flamfotometru.
Arzătorul este dispozitivul cu flacără în care substanța de analizat se vaporizează
și se excită, emanând radialii luminoase. Pentru întreținerea flăcării, care se aprinde
automat, se utilizează diferite amestecuri de gaze în funcție de temperatura necesară
pentru excitarea substanței de analizat.

Amestec de gaze Temperatura flăcării măsurată în ºC

Gaz de iluminat – aer 1700 –1840
Propan – aer 1925
Hidrogen – aer 2000 – 2045
Acetilenă – aer 2125 – 2397
Hidrogen – oxigen 2550 – 2660
Propan – oxigen 2850 (calculată)
Acetilenă – oxigen 3100 – 3137

În tabelul de mai sus sunt redate câteva amestecuri de gaze folosite în

flamfotometrie precum și temperaura flăcării acestora. În funcție de potențialul de
ionizare al elementului care urmează a fi determinat se alege și temperatura dorită și
deci gazul combustibil capabil să o realizeze. Pentru a fi activați, sodiul și potasiul
necesită o temperatură relativ joasă cum ar fi cea a amestecului: propan-aer (1925°C),
iar calciul și magneziul o temperatură mult mai ridicată (flacără de acetilenă-oxigen).
Determinarea cantitativă a elementelor din soluția de analizat se face după mai
multe metode: metoda curbei de calibrare, metoda soluțiilor limitative, metoda
adaosurilor, etc.

166
 Soluțiile de analizat și standardele respective (soluțiile etalon) trebuie să posede,
pe cât posibil, aceleași proprietăți fizice, în așa fel încât condițiile de pulverizare sa fie
identice.

Potențiometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi

Măsurarea pH-ului cu electrodul de sticlă

Metoda necesită un pH-metru și doi electrozi: unul selectiv pentru ionii de
hidroniu - electrodul de sticlă și unul de referință. Acesta din urmă este un electrod
metalic de speța a II-a în contact cu o soluție saturată a anionului sării metalice,
Ag/AgCl/KClsat. sau, în cazul celui de calomel, Hg/Hg 2Cl2/KClsat. Electrodul de sticlă
este confecționat din sticlă specială care se comportă ca o membrană permeabilă pentru
ionii de hidroniu. Acest electrod în formă de balonaș sferic este umplut cu o soluție
tampon cu pH dat care nu-și schimbă compoziția (pH-ul) în timpul măsurătorilor. El se
cufundă în soluția probă cu pH necunoscut. Diferența de potențial dintre aceste soluții
este dată de relația lui Nernst. Rescrisă în termeni de pH această relație devine:
RT
E = ——— ( pHelectrod – pHprobă )
2,303 F

Această diferență de potențial este, cum se vede, într-o relație lineară cu pH-ul soluției
probei, deoarece pHelectrod = constant. Ea se poate măsura cu pH-metrul. Acesta este un
milivoltmetru cu impedanță de intrare mare, datorită rezistenței electrice mari a
electrodului de sticlă, cu scală de pH, numit pH-metru. Pentru măsurarea pH-ului unei
soluții necunoscute este necesară în prealabil calibrarea pH-metrului cu ajutorul a două
soluții tampon cu pH cunoscut.
Avantajele pe care le prezintă metoda potențiometrică față de cea colorimetrică
sunt:
- exactitate mare,  0,01 în cazul pH-metrelor obișnuite ca de exemplu
cel de tip MV-84, sau chiar  0,001 în cazul pH-metrelor
performante ca de exemplu cel de tip Radiometer-Copenhagen.
- pot fi analizate soluții colorate, vâscoase, cu proprietăți redox
- timp de măsurare foarte scurt (1-2 minute)

167
 Schema de principiu al unui pH – metru

Valori patologice de laborator care amenință viața

Na seric sub 120 mmol/l peste 160 mmol/l
K seric sub 3 mmol/l peste 8 mmol/l
Ca seric sub 1 mmol/l peste 4 mmol/l
Cl seric sub 80 mmol/l peste 120 mmol/l
HCO3- seric sub 10 mmol/l peste 40 mmol/l
pH sub 7,00 peste 7,7
PCO2 sub 20 mmHg peste 80 mmHg
PO2 sub 40 mmHg peste 400 mmHg
Glicemie sub 2,5 mmol/l peste 56 mmol/l
Hematocrit sub 20% (pierdere acută)
Indice de protrombină sub 20%

168
 Limitele valorilor normale

St – sânge total U - urină

Pl – plasmă SG – suc gastric
Se – ser FBG - fibrinogen
L – LCR GC – greutate corporală

Acid uric Se Bărbați 4,3 – 8 mg/100 ml (256 – 476 mol/ l)

Femei 2,3 – 6 mg/100 ml (137 – 357 mol/ l)
2 - 8 mg/100 ml (119 –476 mol/ l)
U 400 – 1000 mg/ 24 ore (2,4 – 6 mmol/24 h)
L 0,5 – 2,6 mg/100 m (29 – 155 mol/ l )
Aminoacizi Se 35 – 55 mg N /l (3,5 – 5,5 mg N/100 ml)
U 0,5 g/24 ore
Amoniac Se 50 – 80 g/100 ml (29 – 47 mol/l)
U 0,3 – 1,2 g/24 ore (17,6 – 71 mmol/24 ore)
Bilirubina Se totală cca. 1mg/100ml (17mol/l);
directă cca. 0,25 mg/100ml (4,3mol/l)
Calciu (total) Se Copii 7 – 14 mg/100ml (1,8 - 3,5 mmol/l; 3,5–7 mEq/l)
Adulți 9– 11 mg/100ml (2,2 - 2,8 mmol/l; 4,5-5,5 mEq/l)
U Sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore (0,25 - 3,5 mmol/24 ore)
Copii 0,10 - 0,14 g/24 ore (2,5 - 3,5 mmol/24 ore)
Adulți 0,10 - 0,40 g/24 ore (2,5 - 10,0 mmol/24 ore)
L 4 – 6 mg/100ml (1 - 1,5 mmol/l)
Clor St 280 – 320 mg/100ml (79 – 90 mmol/l)
Se 340 – 390 mg/100ml (96 – 110mmol/l)
L 410 – 460 mg/100ml (115 – 130mmol/l)
U 600 – 900 mg/100ml (169 – 254mmol/l)
SG 300 – 530 mg/100ml (85 – 149mmol/l)
Colesterol Se total 150 – 250 mg/100ml (3,9 - 6,5 mmol/l)
esterificat 60 – 80% din colesterolul total sau
colesterol esterificat / colesterol total = 0,6 - 0,8
Creatinină Se Bărbați 0,8 - 1,8 mg/100ml (71 –159 mol/l)
Femei 0,6 - 0,9 mg/100ml (53 –80 mol/l)

169
 0,6 – 1,8 mg/100 ml (53 - 159 mol/l)
U Bărbați 26 mg/kg GC (230 mol/kg GC)
Femei 22 mg/kg GC (190 mol/kg GC)
Fer Se Bărbați 90 – 160 g/ 100ml (16,1 – 28,6 mol/l)
Femei 80 – 130 g/ 100ml (14,3 – 23,3 mol/l)
Fosfatază alcalină Se Sugari 3 – 10 UB/100 ml (25 – 83 UI/l)
Copii 2 – 8 UB/100 ml (16,6 – 66,4 UI/l)
Adulți 2 – 4 UB/100 ml (16,6 – 33,2 UI/l)
Fosfatază acidă Se
totală 4,5 – 13,5 UI/l
prostatică 0,05 – 3,6 UI/l
Glucoză St Iodo- 80 –120 mg/100ml (4,4- 6,6 mmol/l)
metric
o-tolu- 70 –100 mg/100ml (3,9- 5,5 mmol/l)
idină
Se Glocoz- 70 –104 mg/100ml (3,9 - 5,8 mmol/l)
Pl oxidază
L 50 - 70 mg/100ml (2,8 – 3,9 mmol/l)
U <30 mg/100ml (<1,7 mmol/l)
GOT Se adulți 2 - 20 UI/l
copii sub → 40 UI/l
3 luni

GPT Se Adulți 2 – 16,5 UI/l

Copii sun 10,2 – 13 UI/ l
5 ani

Hemoglobină St Bărbați 15 – 20 g/100ml (9,3 - 12,4 (Hb/4) mmol/l)

Femei 14,0 – 17,0 g/100ml (8,7 - 10,5 (Hb/4) mmol/l
Potasiu Se 13– 21mg/100ml (3,3 -5,4 mmol/l)
L 8 – 11 mg/100ml (2,0 -2,8 mmol/l)
U 1,9 – 3,9 mg/100ml (0,5 –1,0 mmol/l)
Lipide Se totale 400 – 700 mg/100ml
fosfolipide 150 – 250 mg/100ml
trigliceride 80 – 200 mg/100ml

170
Magneziu St 3,7- 4,7 mg/100ml(1,5-1,9 mmol/l; 3,0-3,9 mEq/l)
Se Nou
născuți 1,6-2,3mg/100ml(0,66-0,95mmol/l; 1,3-1,9mEq/l)
Adulți 1,9-2,9 mg/100ml (0,8-1,2 mmol/l; 1,6-2,4 mEq/l)
L 2,5 mg/100ml (1,0 mmol/l; 2,0 mEq/l)
Azot neproteic Se 20 – 40 mg/100ml (14,3 - 28,6 mmol/l)
L 15 – 18 mg/100ml (11 - 13 mmol/l)
Sodiu Se 315-350mg/100ml(137-152mmol/l)
L 300-340mg/100ml(130-148mmol/l)
U 4 – 6 g/24 ore (174 – 261 mmol/24 ore)

Fosfor anorganic St 30 –50 mg/100ml (9,7 – 16,1 mmol/l)

Se Copii 4 –6 mg/100ml (1,3 – 1,9 mmol/l)
Adulți 2,5 –4,5 mg/100ml (0,8 – 1,15 mmol/l)
L 1 –1,8 mg/100ml (0,3 – 0,6 mmol/l)
Proteine totale Se 6,5 - 8,2 g/100ml
Pl Copii 5 – 7,5 g/100ml
Adulți 6,5 - 8,5 g/100ml
L 10 – 30 mg/100ml
Fracțiuni proteice Se Alb. 3,50-4,20 g/100ml
1 0,25-0,40 g/100ml
 0,50-0,65 g/100ml
1+ 0,80-1,02 g/100ml
 1,10-1,40 g/100ml
FBG 0,2 – 0,4 100 g/100 ml
Uree Se 21 – 54 mg/100ml (3,5 – 9 mmol/l)
U 20 – 30 g/24 ore (0,33 - 0,50 mol/24 ore)
L 20 – 60 mg/l (0,33 - 1,00 mmol/l)

171
 Sistemul internațional de unități

Cantitatea fizică Unitatea de măsură Simbol

lungime metru m
masă kilogram kg
timp secundă s
intensitatea c. electric amper A
intensitate luminoasă candelă cd
cantitate de subst. mol mol
temp. termodinamică Kelvin K

172