PROTEINE CU FUNCIE

CATALITIC
ENZIME
Mecanisme de reglare a funciei proteice
1 celul bacterian 250000 proteine diferite, aflate la
distane f. mici i doar cteva molecule de ap
necesar o reglare foarte strict a funciei proteice
Unele proteine nu au specificitate mare pot ndeplinii
mai multe funcii depinde de condiiile de mediu
Reglarea funciei proteice poate fi controlat prin:
Localizarea produilor genelor i/sau a speciilor cu care
interacioneaz
Legarea covalent sau necovalent a moleculelor de efector
(vezi i cooperativitatea)
Cantitatea i durata de via a proteinei active
Legarea covalent a efectorilor:
Fosforilare
Atari covalente de lipide i glucide
Metilri la catenele laterale
Acetilri amino-terminale
Scindri proteolitice la nuvelul lanului
polipeptidic
Controlul cantitii i duratei de via
Cantitatea la nivel transcripional
Durata de via viteza de degradare
ENZIME

sunt produse chiar de organism - proteine
cu aciune catalitic (en zyme = n drojdie)
s-au identificat i acizi ribonucleici cu
funcie catalitic, substane numite
ribozime
Aciunea enzimelor const n accelerarea
reaciei, grbind instalarea strii de
echilibru
Particulariti
Domeniu moderat de temperatur, pH i
presiune (37C / 7,4 / 1 atm)
Mare specificitate, neformnd produi secundari
Efect net superior al aciunii catalitice, scznd
energia de activare a reactanilor
n reacii reversibile, catalizeaz desfurarea
reaciei n ambele sensuri, n funcie de
concentraia reactanilor i a produilor de
reacie
Aciunea :
formarea unor complexe
tranzitorii de activare, cu
energie foarte mic i n
care se realizeaz
orientarea stereospecific
a reactanilor i
desfurarea reaciei.
n majoritatea cazurilor,
fixarea reactanilor de
centrul activ al enzimei
este nsoit de
labilizarea sau ruperea
unor legturi din structura
reactanilor, favorizndu-
se astfel reacia.
G
o
' = R T ln K
ech
G
o
' = n F E
Eficacitate
Viteza de descompunere a apei oxigenate
n prezena a diveri catalizatori
Catalizator
Viteza de
reacie
relativ
Energie de
activare
(kcal / mol)
Necatalizat 1 18
Ioduri 8 x 10
2
14
Platina 2 x 10
4
12
Catalaza 3 x 10
11
5
Concentraia constant a constituenilor
chimici celulari
Marea majoritate a reaciilor chimice sunt
reversibile, catalizate de enzime i sunt
ncadrate n iruri de reacii consecutive,
numite ci metabolice, care cuprind att reacii
exergonice, ct i reacii endergonice, cuplate
ntre ele prin transfer de energie. Cile
metabolice sunt interconectate ntre ele prin
intermediari comuni sau transfer de energie,
ceea ce d sistemului biologic o mare mobilitate
n relaia sa cu mediul ambiant.
Sistemul viu este deci un sistem
termodinamic deschis
o stare veritabil de echilibru (n sens
termodinamic), n reaciile ce au loc, nu se
realizeaz
se constituie, pentru irul de reacii
biochimice considerat, o stare de echilibru
dinamic
"stare de constan a concentraiilor de
metabolii"
Nomenclatura i clasificarea enzimelor
numele vechi: pepsina, tripsina,
numele enzimei s fie determinat de
substratul aciunii, urmat de sufixul "-az"
(amilaz, maltaz etc.).
necesar includerea, n denumire, a unor
indicaii privind aciunea enzimei (succinat
dehidrogenaz
Din 1961, Uniunea Internaional de
Biochimie: clasificare raional:
Numele are dou pri:
prima parte este format din numele substratului,
a doua se termin n "az", denumind reacia
catalizat de exemplu
numele mai poate conine informaii
suplimentare, n cazul n care enzima
funcioneaz cu o anumit coenzim; de
exemplu: L-lactat-NAD
+
-oxidoreductaz
Fiecare enzim se definete printr-un
numr de cod, EC (enzyme classification) format din patru cifre:
prima indic clasa din care fac parte;
a doua indic subclasa, n funcie de gruparea asupra creia
intervine;
a treia indic subclasa de apartenen, de exemplu n funcie de
coenzima coninut;
a patra indic numrul de ordine al enzimei considerate.
De exemplu: L-lactat-NAD
+
-oxidoreductaza are numrul de cod EC
1.1.1.27.



Clase de enzime
Oxidoreductaze: catalizeaz transferul de hidrogen
sau de electroni de pe substraturi sau fixare de
oxigen;
Transferaze: catalizeaz transferul unor atomi sau
grupe de atomi, altele dect cele din clasa 1;
Hidrolaze: catalizeaz procesele hidrolitice de liz a
moleculelor cu ajutorul apei;
Liaze: sunt enzime care desfac sau refac molecule,
dar n alt mod dect hidroliza;
Izomeraze: catalizeaz transformri cu meninerea
formulei moleculare;
Ligaze (sau sintetaze): catalizeaz formarea unor
legturi ntre carbon i un alt nemetal.
I. Oxidoreductaze
transportoare de hidrogen sau de electroni
dehidrogenaze, reductaze sau oxidaze, avnd
drept cofactori enzimatici nucleotide piridinice
(NAD
+
, NADP
+
), respectiv flavinice (FMN, FAD)
sau derivai porfirinici ce leag ioni de fier
(citocromii, catalaza, etc)
Subclase:
-CH
2
-OH, CH
2
CH
2
,
CH
2
NH
2
, fenoli, compui cu sulf
SuccinatFADdehidrogenaza



acid succinic FAD acid fumaric FADH
2

Catalaza


CoenzimaQH
2
-Cit.C reductaza

+
+
CH
2
CH
2
COOH
COOH
N
N
CH
CH
COOH
HOOC
HN
NH
catalaza
O
2
+ 2H
2
O H
2
O
2
+ H
2
O
2
coenzima QH
2
-citocrom C reductaza
coenzima QH
2
+ 2citC
oxidat
coenzima Q + 2H
+
+ 2citC
redus
II. Transferaze
transfer anumite grupri de atomi
(CH
3
, NH
2
, PO
3
H
2
, etc.) de la un donor pe un
acceptor.
Submprirea n cadrul clasei se face n funcie de
natura radicalului transferat: metiltransferaze, amino-
transferaze (transaminaze), etc
a) Metiltransferaze: transfer grupa CH
3
de la
donor la acceptor.
- Donorii de metil: metionina i colina
- Acceptorii: colamina, homocisteina,
noradrenalina, acidul guanin-acetic
metionin S-adenozil-metionin
Pi PPi
ATP
+
+
CH
2
CH
2
CHNH
2
COOH
S CH
3
H
H H
H
N
N
N
NH
2
OH OH
O
C C C C CH
2
CH
3
CH
2
)
2
CHNH
2
COOH
(
S
N
b) Transaminazele catalizeaz transferul gruprii amino
de la un aminoacid pe un cetoacid.
Ex. glutamicoxalacetic transaminaza (GOT - ASAT) i
glutamicpiruvic transaminaza (GPT . ALAT).
Gruparea prostetic a transaminazelor este piridoxal
fosfatul.
alanina +
- cetoglutarat piruvat + glutamat
alanin - aminotransferaza

c) Aciltransferazele catalizeaz transferul

radicalilor acil. Transportorul este Coenzima A,
activat de ATP, care formeaz ca intermediar
acilcoenzima A, unde radicalul acil este legat de
atomul de sulf al CoA.



Aciltransferazele sunt active n special n
metabolismul lipidic; un rol important l joac
acetil-coenzima A (CH
3
CO ~ SCoA).
acil-CoA + glicerol-3-P acilglicerol-3-P + CoA
glicerol-3-fosfat-aciltransferaza
d) Fosfotransferazele, numite i kinaze, transfer un rest
PO
3
H
2
de pe un nucleotid trifosfat (ATP, UTP, GTP) pe
un acceptor, care poate fi monozaharid, un acid sau un
alcool.
n procesele catalizate de kinaze nu apare H
3
PO
4
liber.
glucoza + ATP glucoz - 6 - P + ADP
hexokinaza
III. Hidrolaze
catalizeaz acele reacii n care, cu intervenia apei se
desfac legturi de tip ester, eter, amid, anhidrid, etc.

Subgrupa - funcie de tipul legturii pe care o desfac,

Denumirea deriv fie de la numele legturii (esteraze,
anhidraze), fie de la cel al substratului asupra cruia
acioneaz (glicozidaze, lipaze, proteaze).
a) Esterazele catalizeaz hidroliza esterilor
acizilor carboxilici sau anorganici.



b) Glicozidazele sunt eteraze care catalizeaz
hidroliza legturilor glicozidice din di-, tri- i
polizaharide. Joac rol n digestia glucidelor,
de exemplu amilaza care hidrolizeaz
amidonul.


glucozo - 6 - P + H
2
O
glucoza + P
i
glucozo - 6 - fosfataza
c) Peptidazele (proteazele) catalizeaz hidroliza
legturilor peptidice -CONH- elibernd gruprile COOH
i NH
2
din componena sa.
- enzimele proteolitice ale tubului digestiv i catepsinele.
- ele se grupeaz n endo- i exopeptidaze.

d) Hidrolaze de nucleotide, nucleozide i acizi nucleici
(nucleaze, nucleotidaze, nucleozidaze) hidrolizeaz
legturi N-glicozidice, fosfodiesterice, n urma crora:
Acizii nucleici nucleotide
Nucleotide nucleozide + ATP
Nucleozide riboz + baz azotat
IV. Liaze

scindeaz molecula la nivelul unor legturi: CC, CO,
CN, CS, CX, dar prin alt mecanism dect hidrolazele.
a) Decarboxilazele (liaze C-C) catalizeaz reaciile n care
se elimin CO
2
. Ex. aminoacid-decarboxilazele
b) Liaze CO" cuprind hidroliazele sau hidratazele, care
catalizeaz legarea moleculei de ap la dubla legtur
CC sau CO, ct i procesul invers (deshidratarea).
Exemplu fumaraza:
Fumaraza
+
H
H
C
C
COOH
HOOC
H
2
O
HO CH
CH
2
COOH
COOH
+ +
Anhidraza
carbonic
CO
2
H
2
O
H
2
CO
3
H
+
HCO
3

V. Izomeraze
Catalizeaz transformrile reciproce ale tuturor tipurilor de
izomeri i se grupeaz n patru subclase. Exemplu:
Modificri funcionale, de exemplu cetoz aldoz:


fosfoglucomutaza, care transform esterul glucozo6
P n ester glucozo1P i invers:


epimeraze, ex. transforma glucoza n galactoz i
invers:

gliceraldehida - 3 - P dihidroxiacetonfosfat
triozofosfatizomeraza
glucozo - 6 - P
glucozo - 1 - P
fosfoglucomutaza
UDP - galactoza UDP - glucoza
UDP - galactoepimeraza
VI. Ligaze - sintetaze

Catalizeaz reaciile de formare ale unor legturi CC,
CO, CN, folosind energia eliberat din ATP. Exemple:
a) ligaze CC, ca de ex. piruvatcarboxilaza (sau piruvat-
CO
2
-ligaza) avnd ca grupare prostetic biotina:


b) ligaze CN (ligaze aminoacid-amoniac) ca de ex.
glutamin-sintetaza, Enzima este foarte activ n creier,
unde asigur detoxifierea; se mai gsete n rinichi i
muchi.
piruvat + CO
2
+ ATP
2
+ H
2
O
oxalacetat + ADP + P
i
piruvatcarboxilaza
glutamat + NH
3
+ ATP glutamina + ADP + P
i
glutaminsintetaza
Specificitatea enzimelor
De aciune sau reacie, de exemplu fosfatazele
hidrolizeaz esteri fosfai
De substrat
Larg fosfataze esteri ai acidului fosforic cu
diveri alcooli
De grup esteraze (hidrolizeaz esterii aceluiai
alcool cu acizi diferii)
Absolut - Ureaza hidrolizeaz exclusiv ureea la
CO
2
i NH
3
Stereospecific -amilaza hidrolizeaz doar
legturile (1 4) din amidon i/sau glicogen.
Structura enzimelor
Este subordonat aciunii catalitice pe care trebuie s o
realizeze.
Aceast aciune poate fi realizat cu sau fr ajutorul unor
componente neproteice numite cofactori enzimatici.
Astfel, enzimele se pot clasifica n dou mari grupe:
Enzime simple constituite numai dintr-o parte
proteic. Aceste enzime catalizeaz n special reacii de
liz.
Enzime complexe constituite din 2 componente:
Componenta proteic, numit apoenzim, responsabil de
specificitatea de substrat a enzimei
Componenta neproteic, numit cofactor enzimatic,
responsabil de specificitatea de aciune a enzimei.

Cofactorii enzimatici

COENZIME
substane organice cu masa molecular mic;
n principal derivai ai vitaminelor: NAD
+
i NADP
+
din vitamina PP
(niacina), FAD i FMN din vitamina B2, sau nucleozid-trifosfai ca
ATP, UTP, CTP, etc.
Sunt ataate labil de enzim, putnd fi detaate de aceasta i
ataate altor enzime.
Coenzimele sunt numite i cosubstrate - particip la reacii ca un
al doilea substrat (de ex. preiau componente ale substratului i
apoi, ntr-o nou reacie, de asemenea enzimatic, revin la starea
lor iniial).

GRUP PROSTETIC
derivai ai vitaminelor B1 tiamin-pirofosfat, B6 piridoxal-fosfat,
biotin, dar i componente diferite ca hemul i ionii metalici.
sunt legate covalent la nivelul centrului catalitic i nu pot fi
detaate de enzim.
Ionii metalici sunt cofactori la peste 2/3 din totalul enzimelor i
intervin n funcia catalitic a acestora astfel:
particip la legarea substraturilor sau/i a cofactorilor
enzimatici. De exemplu, pentru aciunea creatinkinazei,
adevratul substrat de reacie este Mg
2+
ATP
stabilizeaz conformaia activ a enzimei
acioneaz n procesul catalitic ca acizi Lewis sau
faciliteaz cataliza electrofil
particip nemijlocit ca i substrat n reacii de oxido -
reducere, unde ionul metalic furnizeaz electroni
pot fi legai strns de enzim, formnd metalo enzime
particip la reaciile enzimatice legai labil (chelatai) de
enzim sau de substratul acesteia.
Aciunea unui anumit ion metalic nu este general, fiind
determinat de partea proteic a enzimei (apoenzima) de
care acesta se leag.
Astfel, enzime ce catalizeaz acelai tip de reacii, pot avea,
n funcie de esutul unde i desfoar aciunea, cofactori
metalici diferii.
Izoenzimele

enzime cu funcie catalitic identic, dar care se
deosebesc prin proprieti fizico - chimice difereniate,
determinate de diferenele genetice ntre moleculele
proteice.
Ele se deosebesc n privina termostabilitii, a pH-ului
optim de aciune, constantei Michaelis, a migrrii n
cmpul electroforetic.
Se pot distinge trei categorii:
Izoenzime ale cror gene sunt total diferite. Exemplu:
malat-dehidrogenaza din citoplasm i din mitocondrie
sunt enzime cu structur primar total diferit.
Izoenzime de tip heteropolimer formate prin asocieri
diferite a dou sau mai multe catene polipeptidice.
Exemplu. LDH (M = 132000) este format din patru
catene de 2 tipuri , , existnd 5 izoenzime: LDH14,
LDH23, LDH322, LDH43, LDH54.
Aleloenzime ce cuprind proteine ce difer printr-o
unitate punctual (nlocuirea unui aminoacid cu un altul).
Izoenzime cu aplicaii n clinic

Creatinkinaza (CPK) - dimeric format din dou tipuri de
subuniti M (tip muscular) i B (tip creier).
Se disting astfel 3 izoenzime cu structura:
MM (muchi scheletic) CPK3
MB (numai n miocard) CPK2
BB (n creier) CPK1
Lactatdehidrogenaza tetrameric format din dou tipuri de
subuniti H (miocard) i M (muchi). Cele 2 subuniti se pot
combina n 5 variante:
LDH1 HHHH miocard i hematii
LDH2 HHHM miocard i hematii
LDH3 HHMM creier i rinichi
LDH4 HMMM -
LDH5 MMMM ficat i muchi
Dup un infarct miocardic, CPK2 seric crete la 6 -18 ore dup
infarct i, de asemenea, LDH1 i LDH2, Aceste efecte reprezint
diagnosticul infarctului miocardic n 100% din cazuri.
Creterea activitii LDH5 este asociat cu o congestie a ficatului.
Centrul activ al enzimei
cinetica enzimatic
demonstreaz
formarea intermediar,
n cursul aciunii unei
enzime, a unui complex
ES
existenei unei zone
bine circumscrise din E
care stabilete
contactul funcional
dintre E i S, adic
legarea S de E i
asigur desvrirea
actului catalitic
Centru activ
Situsuri de legare
- realizarea orientrii sterice optime care asigur
obinerea uoar a strii de tranziie,
- cu reducerea marcat a energiei de activare,
caracteristic aciunii enzimatice
- exist resturi de aminoacizi cu caracter nepolar, ca
Ala, Val, Leu, Ileu, Phe, care acioneaz prin stabilirea
unor legturi nepolare cu substratul (S).
Situs catalitic - realizarea actului catalitic
desfacerea legturilor caracteristice substratului i
formarea noilor legturi,
La acest proces particip: grupri OH, SH, COO

,
NH
4
+
, imidazolil, etc. i de aceea situsurile catalitice
sunt constituite cu participarea resturilor unor anumii
aminoacizi (Ser, Cis, Glu, Asp, Lis, His).
Modul de aciune a enzimelor
Conformaia enzimei creeaz regiuni
complementare (mrime, topologie, sarcin
electric) cu substratul asupra cruia
acioneaz.
a) modelul cheii i lactului
Datorit legrii E de S, realizat la nivelul situsului de
legare, se induc n enzim modificri conformaionale
care cuprind i situsul catalitic, asigurnd o orientare
corespunztoare ("armonizare") a acestuia fa de
substrat. n acest fel se exercit asupra substratului fore
de constrngere, ceea ce contribuie la labilizarea
legturilor coninute.
b) Modelul armonizrii induse
Mecanisme de aciune
Cataliza acido-bazic
gruprile acidice sau bazice din catena lateral a aminoacizilor din situsul
activ pot servi ca ageni de transfer de proton. La pH fiziologic, forma
protonat a His este cel mai puternic acid, ca form de baz conjugat
cea mai puternic baz.
Ali acizi: SH Cis, OH Tyr, -amino-Lis, iar baze bazele conjugate ale
formelor acide
OPO
3
-2
O
HO
OPO
3
-2
O
OH
dihidroxiaceton fosfat gliceraldehid - 3 - fosfat
N
N
His - 95
O O
Glu -165
OH
OPO
3
-2
H
O H
-
Cataliza covalent
are loc prin atacul nucleofil sau electrofil al unor
resturi de aminoacizi din centrul activ al enzimei asupra
substratului, rezultnd o legtur covalent a enzimei
cu substratul
Cataliza electrofil: catenele laterale pot stabiliza
intermediarii de sarcin opus, de exemplu anionul
carboxilat din resturile de Glu, Asp din situsul activ,
poate stabiliza un carbocation. Un ion pozitiv metalic,
din centrul catalitic activ, poate stabiliza un oxianion
Superoxid dismutaza
E Cu
++
+ O
2

-
E Cu
+
+ O
2
E Cu
+
+ O
2

-
+ 2H
+
E Cu
++
+ H
2
O
2
Cataliza nucleofil

un agent nucleofil din enzim (de exemplu gruparea HO din
Ser) atac nucleofil o grupare din substrat, formnd un
intermediar care este mai reactiv dect substratul iniial.
Serin-proteazele - catalizeaz hidroliza legturilor esterice i
peptidice. Ele ocup un rol important n procesele de digestie
ale proteinelor alimentare, coagularea sngelui i n cteva
din cile de semnalizare i difereniere. Proteazele active n
procesul de digestie sunt: tripsina, chimotripsina i
elastaza. Dei aceste enzime prezint un mecanism comun
de aciune asupra substratului, ele au specificitate diferit.
Mecanismul de aciune implic formarea unui intermediar
stabil, acil-enzim. Aminoacizi din situsul activ sunt: Ser 195,
His 57 i Asp 102. Structura cristalin a serin-proteazelor
arat c aceste resturi de aminoacizi sunt apropiate n
spaiu i nalt conservate (se gsesc n toate serin-
proteazele) formnd aa-numita triad catalitic.
Asp
102
His
57
Ser
195
N
O
CH
2
H
O
CH
2
N
H
O
H
2
C
C
1
3
H
N C
R R'
O
1
3
Asp
102
His
57
Ser
195
N
O
CH
2
H
O
CH
2
N
H
O
H
2
C
C
Polipeptida
substrat
Atac nucleofil
1
3
Asp
102
His
57
Ser
195
N
O
CH
2
H
O
CH
2
N
H
O
H
2
C
C
H
N C
R R'
O
+
+
Intermediar
1
3
Asp
102
His
57
Ser
195
N
O
CH
2
H
O
CH
2
N
H
O
H
2
C
C
H
N C
R R'
O
1
3
Asp
102
His
57
Ser
195
N
O
CH
2
H
O
CH
2
N
H
O
H
2
C
C
H
N C
R R'
O
Noul capt N-terminal
al
fragmentului A
Fragmentul B
Ser
195
O
CH
2
C
R
O
Asp
102
H
O
O
C
1
3
His
57
N
CH
2
H
H
O
N
H
2
C
Ser
195
O
CH
2
C
R
O
3
His
57
N
CH
2
H
H
O
+
N
H
2
C
1
Asp
102
H
O
O
C
N
H
2
C
1
Asp
102
H
O
O
C
C
R
O H
O
Noul capt C - terminal
al
fragmentului B
Ser
195
O
CH
2
3
His
57
N
CH
2
H
+
Cataliza prin stabilizarea strii de
tranziie a reactanilor
Stabilizarea strii de tranziie se poate
realiza prin:
Potrivirea steric dintre centrul activ al
enzimei i intermediarul de tranziie; aceasta
este superioar celei dintre enzim i substrat
Resturile polare din situsul activ se pot lega
strns de starea de tranziie care prezint
sarcini pariale; de asemenea,
Rezidiile lipofile pot stabiliza compusul
intermediar
Riboz
H
2
N
N
N
N
N
H
OH
N
N
N
N
NH
2
Riboz
N
N
N
N
Riboz
OH
H
2
O
Adenozin Intermediar Inozin
NH
3
adenil-deaminaza
Mecanismul enzimatic cu dou substrate
n funcie de ordinea fixrii substratelor i desprinderii
produilor de reacie sunt descrise 3 mecanisme de
baz:
Secvenial ordonat
Secvenial aleatoriu
Ping-pong
Mecanism secvenial ordonat
S
2
S
1 P
1
P
2
E
(ES
1
S
2
EP
1
P
2
) EP
2
E
ES
1
Mecanism secvenial aleator
E ES
1
E ES
2
ES
1
S
2
S
2
S
1
S
1
S
2
EP
1
P
2
EP
2
EP
1
P
1
P
2
P
2
P
1
S
2
S
1
P
1
P
2
E
E ES
1
E'P
1
E'
E'S
2
EP
2
Mecanism ping-pong
transaminazele - piridoxal-fosfat
E
CHO
CH
2
NH
2
- cetoglutarat
E
CH
2
NH
2
E
Glu
E
CHO
- cetoglutarat
Glu
CH
2
NH
2
E
E
CHO
Piruvat
Alanina
+ Alanin
CH
2
NH
2
E
Piruvat
E
CHO
Cinetica enzimatic
Viteza unei reacii catalizate enzimatic se msoar n moli de substrat
transformai n produs / minut la 25C i 1 atm i pH optim al enzimei.

Activitatea enzimatic reprezint numrul de moli de substrat
transformai n produs / minut la 25C i 1 atm i pH optim al enzimei de
ctre unitatea de volum de preparat enzimatic (Litru) sau cantitatea de
enzim.

O unitate standard (internaional) = 1 mol substrat/minut de activitate
enzimatic; este cantitatea de enzim ce transform 1 mol substrat /
minut.

Activitatea specific a unui preparat enzimatic este n funcie de numrul
de uniti enzimatice / mg de protein: mol min
-1
/ mg protein.

Constanta catalitic (katal): conform noilor recomandri ale Comisiei de
Nomenclatur Enzimatic a IUBMBiol se recomand o nou msur pentru
activitatea enzimatic: katalul.
1 katal = 1 mol substrat / mol enzim / secund

Viteza maxim (Vmax) este viteza reaciei enzimatice obinut n condiii
de saturare a enzimei cu substrat i n condiii optime de pH, temperatur,
trie ionic. Vmax este o constant specific fiecrei enzime.
Caracteristicile generale ale reaciilor catalizate
viteza reaciei crete proporional cu concentraia substratului pn
la o anumit valoare (cnd toate situsurile catalitice ale enzimei sunt
ocupate) dup care viteza rmne constant.
n cazul unei reacii enzimatice deosebim trei etape:
Fixarea substratului [S] pe enzim [E] i formarea complexului [ES]
Transformarea substratului legat [ES] n produs legat [EP]
Disocierea complexului [EP] n [E] i [P]
E + S ES
EP E + P
k
+1
k
+2
k
+3
k
-1
k
-2
k
-3
La nceputul reaciei nu exist P i se poate spune c complexul
[EP] se disociaz mai repede dect se formeaz din EP, deci K3 >
K2. Ca urmare, reacia ce limiteaz viteza de formare a lui P este
reacia a doua caracterizat prin k+2



Leonor Michaelis i Maud Menten au elaborat o ecuaie ce descrie
viteza de formare a produsului n funcie de concentraia substratului




E + S ES E + P
k
+1
k
+2
k
-1
] [
dt
[P] d
v
2 0
ES k

Conform teoriei strii staionare, steady state, n orice moment al
reaciei enzimatice vitezele de formare i de disociere ale lui ES sunt
egale i [ES] = constant.
[S] K
[S] V

[S] K
[S] [Et] k
v
M
max
M
2
0

V
max
2
V
[S]
K
M
V
max
Dependena vitezei de reacie enzimatic
de concentraia substratului
Verificarea ecuaiei n cazuri speciale:
[S] >> K
M
v
0
= Vmax viteza devine independent de [S]
[S] = K
M
v
0
= Vmax / 2 enzim semisaturat
[S] << K
M
v
0
= Vmax[S] / Km
= k [S] viteza depinde liniar de [S]


[S] K
[S] V

[S] K
[S] [Et] k
v
M
max
M
2
0

Semnificaia K
M




- constanta aparent de disociere i concentraia de
substrat la care enzima este saturat pe jumtate iar
viteza reaciei este jumtate din viteza maxim de
reacie.
- Valoarea K
M
este un indicator n aprecierea afinitii
enzimei pentru substratul su, valoarea K
M
fiind invers
proporional cu intensitatea afinitii. n general,
afinitatea enzimelor pentru substrat are valori:
10
-5
M < K
M
< 10
-2
M.


1
2 1 -
M
k
k k
K

E + S ES E + P
k
+1
k
+2
k
-1
Transformarea Lineweaver-Burke
Reprezentarea hiperbolic v/[S] face dificil calcularea K
M
i V
max
. Din acest
motiv, se utilizeaz transformarea matematic a hiperbolei n dreapt, n
care se reprezint grafic
1/v
0
= f(1/[S]
max
M
max 0
V
K

[S]
1

V
1

v
1

1
[S]
V
max
1
K
M
1

1
v
0
panta = K
M
/ v
max
Factori implicai n cinetica enzimatic
Influena conc. de enzim
Viteza de reacie crete direct
proporional cu concentraia enzimei
n condiiile n care toat cantitatea de
enzim se gsete sub forma (ES),
viteza reaciei rmne constant
Influena temperaturii
Creterea vitezei este limitat de
temperatura la care ncepe ruperea
legturilor slabe, hidrofobe i de
hidrogen, ce menin conformaia
enzimei i care produce denaturarea
enzimei i pierderea proprietilor
catalitice
Influena pH-ului
Sarcina electric a moleculei
de enzim este dependent de
concentraia ionilor de
hidrogen din ambian.
Pe de alt parte, sarcina
electric a proteinei - enzim
influeneaz activitatea ei;
cele mai multe enzime au un
pH - optim de activitate
caracteristic (la care efectul
catalitic este maxim).
pH-ul optim sufer influene:
- felul substratului,
- concentraia substratului,
- concentraia unor sruri
- temperatur.
Activatori enzimatici
determin stimularea activitii enzimatice, aciune numit activare.
poate fi direct - stimulare nemijlocit a enzimei sau
indirect - prin suspendarea unui efect inhibitor.

Activarea direct are loc prin aciunea nemijlocit asupra structurii enzimei
sau a legturii enzim substrat.

Activarea prin ioni: Mg
2+
, Mn
2+
, Zn
2+
, Co
2+
, Cl
-
(amilazei salivare)
Activare prin alosterie

Activarea prin "demascare".
- deblocheaz grupuri reactive din molecula enzimei;
- Tripsinogen tripsin : enzim proteolitic inactiv ca atare, se
transform n enzim activ sub aciunea unei kinaze (enterochinaza,
secretat de mucoasa intestinului subire), care ndeprteaz din
tripsinogen un fragment de lan polipeptidic ce "mascheaz" centrul activ al
enzimei.
- Pepsinogen pepsin: activat de Cl
-
sau nsi pepsina.

Este un tip de reglare ireversibil a enzimei.
Activarea indirect
aciune de anti-inhibiie i se realizeaz prin
ndeprtarea sau neutralizarea unor inhibitori.
cianura de potasiu (de altfel un inhibitor puternic al
enzimelor cu coninut de Fe
3+
) este un anti-inhibitor
pentru ureaz: ionii de cupru care inhib ureaza
formeaz cu cianura un complex, lipsit de efect inhibitor.
gruprile SH din centrul activ al unor enzime sunt foarte
sensibile la aciunea unor ageni chimici (de ex.
oxidani); vitamina C, puternic reductoare, protejeaz
grupele SH, anihilnd aciunea oxidant;
substane bogate n funcii SH pot aciona protector
asupra funciilor SH din enzime, prin competiia lor cu
enzima ce conine funcia SH, fa de agentul inhibitor
(glutationul, cisteina, proteine).
Inhibitorii enzimatici
Sunt factori ce reduc sau anuleaz
activitatea catalitic a enzimei.
Inhibitorii pot fi clasificai n:
Competitivi
Non-competitivi
Incompetitivi
Ireversibili
Antienzime
Inhibitori competitivi
- se leag reversibil la nivelul situsului activ,
catalitic, al enzimei,
- blocheaz accesul substratului (concuren cu
substratul).
- au o structur asemntoare cu substratul,
pclind enzima.
n cazul n care o enzim acioneaz asupra mai
multor substane, acestea acioneaz unul fa
de altul ca inhibitori competitivi.
Cei mai eficieni inhibitori sunt analogii strii de
tranziie a reaciei, tiindu-se c enzima are o
eficacitate mrit pentru intermediari de reacie.
E + S
ES
E + I
EI
[ S ] > [ I ]
[ I ] > [ S ]
EI + S ES + I
[I] > [S], echilibru deplasat n favoarea EI
[S] > [I], echilibru deplasat n favoarea ES
1
[S]
1
V
V
max
1
K
M
1
K'
M
1
reacie inhibat
reacie neinhibat
-aciunea acidului malonic asupra succinat dehidrogenazei

HOOC-CH
2
-COOH HOOC-CH
2
-CH
2
-COOH
Aplicaii terapeutice:
efectul bacteriostatic al sulfamidelor se bazeaz pe competiia
PABA i medicamentul sulfamid n sinteza catalizat
enzimatic de acid folic.
Sulfanilamida Acid para - aminobenzoic
H
2
N
COOH SO
2
NH
2
H
2
N
Inhibitori necompetitivi
se leag reversibil de enzim,
dar n alt parte dect centrul activ,
deci inhibitorul nu este concurent cu substratul.
Legarea inhibitorului induce efecte alosterice, modificnd
conformaia enzimei i, implicit, reduce activitatea catalitic.
n acest tip de inhibiie, K
M
rmne nemodificat, dar modificarea
structurii enzimei o mpiedic s aib activitate maxim, deci viteza
maxim scade.
E + I EI
1
[S]
1
V
K
M
1
V
max
1
V'
max
1
reacie inhibat
reacie neinhibat
Inhibitori incompetitiv
- se leag de complexul [ES].
- raportul K
M
/Vmax va rmne neschimbat,
- o dreapt paralel cu cea a reaciei neinhibate.
- K
M
crete iar Vmax scade
E + S
ES
k
+1
k
-1
k
IS
ESI
E + P
k
IS
k
+2
1
[S]
1
V
K
M
1
V
max
1
V'
max
1
K'
M
1
reacie inhibat
reacie neinhibat
Inhibitori ireversibili
substane ce se fixeaz de enzim prin legturi covalente
ireversibile.
duce la blocarea activitii enzimei.
Inhibitorii se pot lega fie la nivelul centrului activ, fie n alt loc.
Exemple
- Compuii cu mercur sau iodoacetaii reacioneaz cu gruprile
SH ale resturilor de cistein libere din centrul catalitic activ;
- dietilpirocarbonatul reacioneaz cu histidina din centrul activ.
Un caz particular este al metaloenzimelor, la care blocarea ionului
metalic duce la inhibiia enzimei: Mg
2+
este blocat de EDTA.

Inhibiia prin antienzime
substane de natur proteic ce inhib specific anumite enzime.
Exemple
- n snge
1
-antitripsina sau
1
-antitrombina neutralizeaz
enzimele respective.
- Alfa
1
-antitripsina se leag la nivel pulmonar de elastaz,
mpiedicnd hidroliza elastinei din structura alveolelor pulmonare,
mpiedicnd colapsarea acestora.
- Paraziii intestinali, de exemplu Ascaris lumbricoides, secret
inhibitori ai tripsinei i chimotripsinei, fapt ce le permite existena n
intestin.
Inhibitori enzimatici cu efecte toxice sau terapeutice
Inhibitorul Enzima int Aciune
Acid acetil salicilic Ciclooxigenaza Antiinflamator
Penicilina Transpeptidaza bacterian Antimicrobian
-aminopropionitril Lisinoxidaza n boli colagenice
Captopril (Lopril)
Enzima de conversie a
angiotensinei
n HTA
Atorvastatine (Tahor) HMG-CoA reductaza n ateroscleroz
Allopurinol (Zycloric) Xantin oxidaza n gut
Sildenafil (Viagra) GMP-fosfodiesteraza tip 5 n tulburri de erecie
Selegilin Monoamin oxidaza tip B n Parkinson
Finasterine Testosteron 5 -reductaza
Hiperplazie prostatic
benign
Omeprazol (Mopral) H
+
, K
+
ATP-aza Ulcer gastroduodenal
Ibuprofen Prostaglandin sintetaz Procese inflamatorii
Metotrexat Dihidrofolat reductaza Cancer
Orlistat (Xenical) Lipaza gastrointestinal Obezitate
Reglarea activitii enzimatice
Condiiile schimbtoare ale mediului impun un rspuns
permanent de adaptare al organismului, rspuns
materializat prin modificarea metabolismului.
Deoarece cile metabolice sunt succesiuni de reacii
catalizate enzimatic, reglarea activitii enzimatice
constituie principalul element n modificrile metabolice.

Reglarea aciunii enzimelor se realizeaz prin 2
mecanisme principale:
Modificarea cantitii de enzim
Modificarea activitii enzimelor prin modificri alosterice
(inhibitori, activatori) sau modificare covalent.
Reglarea cantitii de enzim

Este un mecanism primitiv, lent, consumator de
energie i materie.
Mecanismul presupune reglarea procesului de
sintez a enzimelor (transcripie, traslaie),
respectiv de catabolizare a lor i poate fi:
Inducie a sintezei enzimatice: ca inductor la
bacterii funcioneaz substratul, iar la mamifere
semnalele hormonale.
Represie a sintezei enzimatice: ca represor la
bacterii funcioneaz produsul reaciei, iar la
mamifere semnalele hormonale.
Degradarea enzimelor
Reglarea activitii enzimatice
modularea activitii, alosteric sau covalent a unei
cantiti fixe de enzim.

Reglarea alosteric
substane numite efectori.
au n general o mas mic,
nu seamn cu substratul sau produsul de reacie
se ataeaz de enzim n alt zon dect centrul
catalitic activ.
Ataarea efectorului de enzim induce modificri ale
conformaiei acesteia, ce cuprind i centrul catalitic activ,
modificnd astfel afinitatea enzimei pentru substrat.
n funcie de efectul asupra activitii catalitice, efectorii
sunt pozitivi sau negativi.
Enzimele reglate n acest fel se numesc enzime
alosterice.
S
1
S
2
S
3
S
n
P ......
E
Feed-back negativ (retroreglare)
Din punct de vedere cinetic, exist 2 clase de enzime reglate
alosteric:
Enzime din clasa K, la care efectorul alosteric afecteaz
resturile de aminoacizi din situsurile de legtur, n urma
cruia se modific K
M
, Vmax rmnnd la aceeai valoare.
Enzime din clasa V la care modificrile din situsurile
catalitice afecteaz valoarea lui Vmax, n timp ce K
M
rmne
nemodificat.

Efectul alosteric la enzima oligomer ce are un singur tip de
monomer este de dou tipuri:
Homotropic legarea efectorului la o unitate protomeric
influeneaz legarea aceluiai ligand la ceilali monomeri
Heterotropic cnd legarea unui efector influeneaz
legarea altui efector
Influena legrii efectorului la un protomer asupra celorlali
protomeri = cooperativitate i ea produce o curb sigmoid
a dependenei vitezei de concentraia substratului.
Pentru enzime oligomere cu dou tipuri de monomeri, s-a
constatat c acetia sunt:
Subuniti reglatoare ce au situsuri alosterice pentru
efectori +, efectori - i legare subuniti catalitice
Subuniti catalitice
De exemplu, proteinkinaza A este un tetramer format din
dou tipuri de protomeri 2R i 2C. Legarea efectorului
pozitiv, AMPc, la subunitile reglatoare (R) elibereaz
subunitile catalitice (C) din tetramerul inactiv, enzima
devenind activ.
R
2
C
2
+ 4AMP
C

2C + R
2
(4AMP
C
)
Reglarea covalent
Se realizeaz prin ataarea sau detaarea covalent a unei grupri
din molecula enzimei.
Cea mai frecvent modalitate este reglarea prin fosforilare
defosforilare la gruparea OH de la resturi de Ser, Tre, Tyr
Donatorul de fosfat este ATP,
enzimele ce realizeaz procesul sunt:
Kinaze pentru ataarea gruprii fosfat
Fosfataze pentru hidroliza gruprii fosfat
Enzimele reglate prin fosforilare defosforilare pot fi active
sub form defosforilat (glicogen-sintetaza, piruvat-
dehidrogenaza) sau fosforilat (fosforilaza, triglicerid-lipaza).
Alte modificri covalente reversibile pot consta n ataarea
detaarea unui rest de AMP (adenilare) sau ADP (ADP-
ribozilare).
Exist i modificri covalente, ireversibile, atunci cnd
molecula enzimei sufer o hidroliz parial n urma creia
rezult o modificare a proprietilor enzimei respective n
procese ca:
Activarea proteazelor din precursori inactivi (zimogene)
Activarea proteazelor implicate n coagularea sngelui
Activarea proteazelor implicate n apoptoz (moartea
celular programat)
Aplicaii ale enzimelor n medicin
Determinri de enzime cu rol diagnostic
esuturile din organism sufer o rennoire permanent,
fapt ce implic o distrugere celular necontenit. Acest
proces de citoliz elibereaz coninutul celulelor n
circulaia sangvin.
De exemplu, hepatocitele triesc un an, deci zilnic 0,3% din
ficat este distrus i coninutul celular deversat n plasm.
Din cauz c enzimele hepatice din plasm se distrug cu
viteze diferite, este greu de fcut un paralelism ntre
coninutul plasmatic de enzime hepatice i concentraia
lor n hepatocite.
Creterea citolizei patologice poate fi efectul unor:
Leziuni virale sau toxice (hepatite)
Leziuni anoxice datorit absenei vascularizaiei (infarctul
miocardic este asociat cu necroza parial a muchiului
cardiac)
n acest mod, msurarea activitii unor enzime marker
poate fi utilizat n diagnostic.
Exemple:
LDH (lactat dehidrogenaza), cu cele 5 izoenzime pot fi
separate prin electroforez i cuantificate LDH1 (4) i
LDH2 sunt caracteristice esutului miocardic i, astfel,
coninutul ridicat de LDH1 din ser poate confirma
diagnosticul clinic i EKG de infarct miocardic.
CK (creatin kinaza) se gsete sub forma a trei
izoenzime dimerice (CK musculare, CK miocardic,
util n infarctul miocardic la 6-8 ore dup acesta, CK
cerebrale).
Fosfataza acid crete n cancer de prostat.
Amilaza i tripsina cresc n pancreatite acute.
Transaminazele i izocitrat dehidrogenaza cresc n
boli hepatice.
Fosfataza alcalin crete n icter mecanic i boli
osoase.
Enzime ca reactivi n analize biochimice
majoritatea determinrilor de metabolii organici se face prin
metode enzimatice ce utilizeaz ca reactivi enzime.
Aceste metode sunt mult mai exacte dect metodele chimice
datorit specificitii deosebite pentru substratul de
determinat.
Enzimele imobilizate pe suport sunt utilizate n teste
screening
De exemplu, n determinarea glicemiei se folosesc
glucozoxidaza i peroxidaza, conform reaciilor:
glucoza + O
2
H
2
O
2
+ o - tolidina
gluconolactona + H
2
O
2
complex albastru + H
2
O
glucozoxidaza
peroxidaza
Tehnica ELISA
Este o analiz cu enzime legate de imunoabsorbani i
se utilizeaz pentru determinarea unor cantiti foarte
mici de antigen - 10
-8
10
-10
mol/l (hormoni, receptori,
proteine virale, etc.). Reacia este:

Ag + Ac-E Ag AcE

AC-E enzim legat de anticorp
Ag antigen de determinat
Complexul format, Ag-AcE, se separ de restul de Ac-E
i se incubeaz cu un substrat cromogen al enzimei.
Intensitatea coloraiei este proporional cu cantitatea de
antigen.
Enzimele ca ageni terapeutici
Utilizarea este ngreunat datorit distrugerii lor rapide n
plasm.
cercetrile actuale urmresc creterea stabilitii
preparatelor enzimatice i legarea de materiale suport
care s permit atingerea prioritar a esuturilor int:
Modificare chimic (succinilarea asparaginazei crete
existena acesteia n organism de la o or la 17 ore)
ncorporarea n vezicule artificiale numite lipozomi
ncorporarea n hematii
Cuplarea cu polietilenglicol
Pentru aparatul digestiv:
pepsina n hipo- i anaclorhidrii, dispepsii iatrogene
proteaze, lipaze, -amilaze n colite, enterocolite, colecistopatii,
meteorisme, dispepsii de fermentaie, de putrefacie
Medicaie dermatologic i antiinflamatoare:
endopeptidaze + hialuronidaza degradeaz esuturile alterate,
existente la suprafaa leziunii; este facilitat penetraia
medicamentelor n profunzimea esutului lezat; se asociaz cu
antibiotice, corticosteroizi.
hialuronidaza + heparina accelereaz resorbia soluiilor
injectate subcutanat, intramuscular; resorbia exudatelor,
hematoamelor. NU se injectez n esuturi infectate sau
modificate neoplazic.
tripsina favorizeaz vindecarea proceselor supurativ-necrotice,
stimuleaz fagocitoza, inhib hialuronidaza i penicinilaza,
prelungete efectul antibioticelor, neutralizeaz toxine bacteriene.
Este activat de Ca
2+
i inhibat de heparin i tetracicline. Este
indicat n: procese inflamatorii ale tegumentelor, leziuni necrotice
sau purulente arsuri, plgi, fracturi deschise, ulcer varicos,
fistule, ulceraii bucale.
chimotripsina (i.m.) are aciune antiinflamatoare puternic. Se
recomand n hematoame superficiale i profunde, entorse,
edeme dup fracturi, intervenii chirurgicale
colagenaza ndeprteaz colagenul din esuturile necrozate.
Medicae sanguin:
streptokinaza este utilizat ca agent anticoagulant n cazul
infarctului, ea avnd rolul de activator al plasminei, enzim ce va
ataca fibrina, mpiedicnd formarea coagulului de snge. Este
indicat n infarct acut de miocard, tromboz venoas profund,
embolie pulmonar masiv acut, trombozarea protezelor
valvulare cardiace, ocluzii arteriale.
asparaginaza este folosit n terapia leucemiei, deoarece esuturile
tumorale au asparagina ca necesitate nutriional. Utilizarea
asparaginazei scade nivelul asparaginei din snge, reducndu-se
astfel i viabilitatea tumorii

n industria farmaceutic, enzimele, imobilizate pe suport n reactoare
de sintez, funcioneaz ca i catalizatori stereospecifici n
realizarea unor compui organici cu activitate biologic. De
exemplu, prin trecerea laptelui printr-un reactor cu
galactozidaz, se hidrolizeaz lactoza din lapte, obinndu-se lapte
fr lactoz, aliment necesar persoanelor cu intoleran la lactoz.
De asemenea n reactoare cu 11hidroxilaz i 1,2
dehidrogenaz, are loc conversia rapid a unui precursor ieftin n
prednisolon, agent medicamentos eficace n restabilirea funciilor
organismului.

Enzime sintetice

Enzime semisintetice obinute prin modificarea chimic a
enzimelor cunoscute, modificri n urma crora enzimele dobndesc
noi proprieti catalitice. Se utilizeaz n acest scop enzime cu
structura primar i spaial cunoscut i uor de obinut n stare
cristalin pur.
Exemplu: papaina este o enzim proteolitic; fixarea chimic a unei
flavine n cisteina din poziia 2 anihileaz activitatea proteolitic i
dezvolt o activitate oxidoreductazic nentlnit anterior. O alt
metod este mutageneza controlat prin care se modific selectiv
un aminoacid.
Enzime sintetice sunt structuri ciclice a cror structur spaial
este analog unui situs enzimatic. Cele mai utilizate sunt polimerii
ciclici ai glucozei: ciclodextrinele (, , , dup numrul de resturi
glicozilate 6, 7, 8).
Abzime sunt anticorpi cu funcie catalitic. Sunt utilizai ca
haptene a unei structuri de tranziie a substratului. Exemplu:
fosfaratul este starea de tranziie caracteristic legturii esterice din
lipide. Anticorpii obinui se comport ca nite lipaze, crescnd
viteza reaciei de hidroliz de 10
3
-10
5
ori. Se obine, de asemenea,
o stereospecificitate de tip anomeric (metil-benzil-ester).