Analizele Probelor Biologice - Curs 2

Prelevarea probelor

Prelevarea este actiunea care consta in luarea unei probe reprezentative in scopul examinarii caracteristicilor acesteia.

Pentru prelevarea probelor se au in vedere trei aspecte: Planificarea prelevarii probelor; Desfasurarea prelevarii probelor; Controlul calitatii la prelevare.

SAMPLING
prelevarea conservarea prepararea (prelucrarea)

SURSE OMOGENE SURSE HETEROGENE Tipuri de probe: 1. probe aleatoare 2. probe sistematice 3. probe reprezentative 4. probe mari 5. probe compozite 6. probe de laborator 7. probe test

Probe lichide Probe solide Probe gazoase

Locul de prelevare Masa minima Conservarea Separarea Probe unice Tipul analizei Reprezentativitatea
pozitia in spatiu compozitia fizico-chimice

ECHIPAMENTE de PRELEVARE AUTOMATIZARE

Contaminare redusa Curatire facila Inertie chimica si biologica Absenta adsorbtiei/absortiei

Probleme practice
Din cauza deosebirilor dintre modalitatile, echipamentele de prelevare si manipulare, se recomanda utilizarea de probe distincte pentru analiza fizica, chimica, microbiologica, biologica si radioactivitatii; Problemele cele mai frecvent puse la prelevarea probelor sunt: - adsorbtia in peretii recipientilor; - contaminarea semnificativa a probelor datorita curatarii neadecvate a prelevatorului sau a recipientului prelevator; - contaminarea probelor din cauza materialului echipamentului de prelevare sau a recipientului prelevator.

Materiale solide
1. Reprezentativ 2. Sa nu fie mai mare decat este necesar precizia ceruta neomogenitatea materialului marimea granulelor Cantitatea necesara efectuarii analizelor este de cateva grame sau de cateva zeci de grame ?

Gaze si lichide
1. De obicei sunt suficient de omogene 2. Sunt suficiente probe mici pentru efectuarea masuratorilor 3. Adsorbtia poate fi un factor de risc pentru raporturi mari suprafata/volum al flacoanelor in care se tin probele 4. Se vor folosi recipienti din sticla speciala ( tip duran )

Transportul si depozitarea
Se vor evita transformarile induse probelor datorate reactiilor chimice induse de agitarii puternice Timpul intre prelevare si efectuarea analizei propriuzise este important Adsorbtia compusilor in urme pe peretii recipientului trebuie evitata.

Prepararea probelor
Important: tehnica analitica trebuie adaptata la starea in care se gaseste proba Trebuie luata in considerare domeniul de concentratie in care se gaseste elemental de analizat in proba, daca este necesara dilutia sau concentrarea Trebuie eliminata contributia compusilor nedoriti prin proceduri de mascare

Proba gaz

Prepararea probei

Aparatura

lichid

solid
1. Introducerea probei direct in instrument 2. gl : transfer din gaz in lichid: condensare sau faza de extractie a gazului 3. gs : condensare 4. lg : evaporare 5. ll : introducere direct in instrument, extractie solvent-solvent 6. ls : precipitare, evaporarea solventului, inghetare uscata 7. sg : evaporare 8. sl: dizolvare, solubilizare 9. ss: introducere directa

Recipientele care se folosesc la prelevarea si pastrarea probelor trebuiesc selectate dupa urmatoarele criterii:
rezistenta mecanica si termica; usurinta de inchidere etansa si de deschidere; posibilitate de curatare si de utilizare; sa nu reactioneze cu diversi constituenti ai probei. marime, forma, greutate, durata de functionare; cost ; posibilitati de curatire; reutilizare.

Fiecare recipient trebuie marcat clar si durabil cu numarul probei ce trebuie sa corespunda cu acelas inscris pe fisa de prelevare. Pentru prelevarea de probe destinate bioanalizei se folosesc in general recipiente din sticla sau din material plastic (polietilena). Recipientele din polietilena de inalta densitate sunt recomandate pentru pastrarea probelor care urmeza sa li se determine: ionii, enzime, glucide, proteine etc.

Recipientul prelevator trebuie sa mentina continutul probei, pentru a impiedica pierderile datorate absorbtiei si volatilizarii sau a contaminarii cu substante straine.

Surse de erori in prelevarea probelor

Contaminarea probelor (materiale necorespunzatoare a echipamentului de prelevare); Instabilitatea probelor (tipul recipientelor ce pot afecta stabilitatea probelor); Conservarea incorecta a probelor (alegerea gresita a vaselor si recipientelor de prelevare); Prelevarea incorecta (devieri de la procedura de prelevare).

Adaugarea agentilor de conservare

Se adauga direct agenti de conservare in proba imediat dupa prelevare sau in prealabil in recipientul gol (anticoagulanti). Adaugarea agentilor de conservare se face sub forma de solutii relativ concentrate, astfel incat sa se foloseasca volume reduse, ceea ce permite sa se neglijeze dilutia produsa. Alegerea agentului sau modul de conservare se face in corelare cu metoda bioanalitica de identificare sau dozare a caracteristicii urmarite. In cazul in care apar incompabilitatii (intre analizele care se efectueaza, agentii de conservare sau recipientele de prelevare) este necesar sa se preleveze mai multe probe si sa se trateze fiecare proba in functie de analiza ce urmeaza sa se efectueze.

Controlul calitatii la prelevare se asigura prin:

Monitorizarea eficientei metodologiei de prelevare; Demonstrarea ca diferitele etape ale procesului de prelevare a probelor sunt controlate in mod adecvat si potrivite pentru scopul intentionat; Cuantificarea si controlarea surselor erorilor care ar putea sa apara in procesul de prelevare; Furnizarea informatiilor privind oportunitatea aproximarii procedurilor de asigurare a calitatii.

Pregatirea Probelor
Dizolvarea Dizolvarea in apa Dizolvarea in acizi sau baze Dizolvarea prin dezagregare pe cale uscata a. Constanta de extratie b. Raportul de distributie c. Gradul de extractie procentual d. Factorul de selectivitate e. Coeficientul sinergic Evaporarea

Extractia Solid-lichid Lichid-lichid Gaz-lichid

STOCAREA PROBELOR
Situaie ideal = analizarea probelor in situ Probele trebuie s fie depozitate i transportate la laborator n aceeai stare n care au fost prelevate La stocarea probelor pot aprea pierderi, datorate adsorbiei pe pereii recipienilor de stocare sau exist pericolul ca potenialii contaminani s ajung n prob de la desorbia sau scurgerea din recipientele de stocare

Conservarea probelor
Conservarea probelor este indicata de fiecare data cand analiza probei nu poate fi facuta la locul de prelevare si trebuie sa fie transportata in laborator. Datorita reactiilor fizice, chimice sau biologice ce pot avea loc, intre momentul prelevarii si momentul efectuarii analizelor, este posibil sa apara diferente in continuturile determinate - sa fie diferite de cele existente in momentul prelevarii. In scopul reducerii la minimim a acestor reactii, se iau o serie de precautii posibile, cunoscute in general sub numele de conservare. Precautiile care se impun la conservarea fiecarei probe sunt specificate in fiecare metoda de analiza.

METODE DE CONSERVARE
O conservare complet i neechivoc a probelor este imposibil Utilizarea metodelor de conservare ar trebui s fie capabil de a ntrzia orice schimbare chimic sau biochimic care ar aprea inevitabil dup ce a avut loc prelevarea Stocarea probelor ntre prelevare i analiz ntr-un interval de timp ct mai scurt posibil n unele cazuri cnd analiii sunt cunoscui a fi instabili sau volatili poate fi necesar efectuarea analizei imediat

Metodele de conservare urmresc atingerea urmtoarelor criterii: S ntrzie aciunea biologic; S ntrzie hidroliza compuilor chimici i a complecilor; S reduc volatilitatea componenilor; S reduc efectele de adsorbie. Metodele de conservare disponibile necesit urmtoarele demersuri: Controlul pH-ului; Adugarea de reactivi; Refrigerare; nghe.

Dac analitul este fotosensibil proba stocat ntr-un recipient din sticl brun pentru a preveni degradarea fotochimic Pentru speciile volatile proba stocat ntr-un recipient nchis etan Utilizarea recipienilor din sticl este recomandat deoarece posibilitatea contaminrii de la vas este mai mic; pentru probele solide se mai pot utiliza recipiente din polietilen sau politetrafluoroetilen (PTFE) Este de dorit s se efectueze experimente pentru a se stabili c analitul de interes nu sufer degradare chimic sau microbian i c, contaminarea este meninut la minim

Compus
Metale Totale Dizolvate n suspensie Crom Nemetale Fluorur Clorur Bromur Azotat i azotit Sulfat Substane organice Pesticide (organoclorurate) Pesticide (organofosforice) Compui fenolici Consum biochimic de oxigen Consum chmic de oxigen Sticl Sticl Sticl

Recipient
Polietilen, cu un capac de polipropilen, sau sticl Polietilen, cu un capac de polipropilen, sau sticl Polietilen, cu un capac de polipropilen, sau sticl Polietilen, cu un capac de polipropilen, sau sticl Plastic sau sticl Plastic sau sticl Plastic sau sticl Plastic sau sticl Plastic sau sticl

Conservare
100 mL ap acidifiat (HNO3) pn la pH<2 200 mL ap filtrat n amplasament, apoi acidifiat pn la pH<2 200 mL de ap filtrat n amplasament Rcire la 4C (200 mL ap)

Timp maxim stocare

6 luni 6 luni 6 luni 24 h

Nu necesit (300 mL ap) Nu necesit (200 mL ap) Nu necesit (100 mL ap) Rcire la 4C, adugare de H2SO4 pn la pH<2 (100 mL ap) Rcire pn la 4C (50 mL ap) 1 mL de HgCl2 10 mg mL-1 sau adugare de solvent de extracie (500 mL ap) 1 mL de HgCl2 10 mg mL-1 sau adugare de solvent de extracie (500 mL ap) Rcire pn la 4C, etanare, adugare H2SO4 pn la pH<2 (500 mL ap) Rcire pn la 4C(1000 mL ap) Rcire pn la 4C, etanare, adugare H2SO4 pn la pH<2 (50 mL ap)

28 zile 28 zile 28 zile 28 zile 28 zile 7 zile, 40 zile dup extracie 14 zile, 28 zile dup extracie 28 zile 48 h 28 zile

Plastic sau sticl Plastic sau sticl

PREGTIREA RECIPIENTILOR
Recipientul pentru probe din sticl borosilicatic sau din plastic (polietilen, polipropilen sau teflon (PTFE)) ar trebui tratat n urmtoarele etape: 1) splare cu detergent pentru ndeprtarea oricror reziduuri solide (nu e neaprat necesar); 2) nmuierea recipienilor pentru cel puin 24 de ore ntr-o baie de acid (10% acid azotic; 10 mL de acid azotic concentrat n 100 mL de ap); 3) cltire cu ap distilat deionizat; 4) repetarea etapei de cltire cel puin de nc dou ori cu ap distilat deionizat.

Stocarea probei trebuie fcut pentru un timp ct mai scurt Dac proba trebuie s fie stocat deoarece urmtoarea etap a procedurii nu se poate desfura imediat din cauza lipsei de echipament, disponibilitii personalului sau deoarece proba trebuie transportat la o distan mare, se aplic procedurile de stocare

Lucrul efectiv in laborator

de: - un mediu de lucru curat - echipament curat - spalarea si stocarea echipamentului dupa utilizare, pentru ca acesta sa poata fi folosit la viitoarea experienta Cerinte efective in laborator sunt legate

Este important sa consideram urmatoarele:

- imediat dupa utilizare se aseaza substantele la locul lor de stocare - dulapurile si/sau sertarele unde este stocat echipamentul/aparatura se eticheteaza - sticlaria nu trebuie lasata niciodata in partea stanga a mesei sau in dulapuri cu vapori -echipamentul/aparatele se stocheaza in apropiere; paharele se stocheaza cu gura in jos pe o suprafata curata

- asigurati-va ca substantele sunt stocate corect; unele substante sunt usor sensibile acestea trebuie stocate in sticle de culoare inchisa, acizii trebuie sa fie tinuti in dulapuri de siguranta -intotdeauna asezati corect substantele apropriate; solventii organici necesita o aranjare speciala - ganditi-va la alti oameni/colegi care pot lucra in apropiere

Schema unui protocol complet

(proba martor foloseste un process statistic)

Colectarea probelor

(utilizarea

containerelor inerte; stabilizarea probelor daca este necesar)

Stocarea si conservarea probelor

Tratamentul preliminar al probelor : proba in forma apropiata pentru un pre-tratament efficient al probei
(curatare, filtrare, centrifugare, sitare etc.)

Dilutia volumetrica sau cantitativa (precautie ceruta pentru reactivi,probe instabile sau biologice) Extractia probelor Analize: Cromatografie/Spectroscopie; ELISA etc. Prelucrarea rezultatelor pentru : -probe necunoscute -probe martor -reproductibilitate

GRAFICE DE CONTROL
Au fost introduse de Shewhart in 1931; Instrument utilizat in procesele industriale de fabricatie; Graficele pot indica daca procesul este sub control in acest caz pot fi folosite pentru a estima performantele procesului sau poate indica o abatere de la normalitate in acest caz procesul poate fi readus la normalitate ; Interventie imediata pentru a reduce riscul de producere a rebuturilor si reclamatiile clientilor.

PROCEDURA PROCEDURA ANALITIC ANALITIC

PROCEDURA constnd din diferite PROCEDURA constnd din diferite MODULE MODULE

Abordarea adecvrii pentru scop MU = f(c)

Abordarea validrii modulare Lotul de probe

SAMPLING

Incertitudine (modul 1)

Proba de laborator METODA ANALITIC METODA ANALITIC

PREGTIREA

PROBEI

Incertitudine (modul 2)

Proba de ncercare

Abordare criterial - precizie - justee - selectivitate/specificitate - liniaritate i domeniu - LD i LQ - regsire - robustee/rezisten

EXTRACIA

ANALITULUI

Incertitudine (modul 3)

Proba analitic

DETERMINAREA

ANALITULUI

Incertitudine (modul 4)

Rezultatul analitic

 Graficul de control este unul din cele 7 instrumente de baza pentru controlul calitatii (alaturi de histograme, grafice Pareto, diagrame de control, diagrama cauzaefect, organigrama si diagrama de distributie); Graficul de control cuprinde :
- Punctul masurarea calitatii caracteristice in probele luate din proces, la diferite intervale de timp ; - Linia trasa in centru media valorii calitatii caracteristice corespunzatoare domeniului controlat; - Limitele de control superioare si inferioare limitele naturale ale procesului; - Limitele de avertizare superioare si inferioare pragul pana unde procesul este considerat statistic sub control fara a fi nevoie de interventie;

GRAFICE PENTRU CONTROLUL CALITATII

Funcia trompet a lui Horwitz

Abatere standard relativ
60

40

Reziduuri de pesticide Substane chimice n suplimente alimentare Produse medicamentoase Alfatoxine

20

-20

Impuriti medicamentoase

Elemente la nivel de urme

log10 c

-40

-60 100% 0,1% 1 ppm 1 ppb 1 ppt

Concentraie

Valori acceptate ale metodei recuperrii n funcie de nivelul de concentraie a analitului.

Analit (%) 100 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 0,000001 0,0000001 Raport analit 1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 Unitate 100% 10% 1% 0,1% 100 ppm 10 ppm 1 ppm 100 ppb 10 ppb 1 ppb Media recuperrii (%) 98-102 98-102 97-103 95-105 90-107 90-110 80-110 80-110 60-115 40-120

GRAFICE PENTRU CONTROLUL CALITATII

DISTRIBUTIA NORMALA PROPRIETATI IMPORTANTE

Aprox. 68% din valorile caracteristice normale sunt pt. deviatia standard >0 iar datelele se afla in intervalul 1; 99,5% din date sunt distribuite in intervalul 2; 99,7% din date sunt distribuite in intervalul 3; = masura a dispersiei valorilor unei variabile aleatoare fata de media

GRAFICE DE CONTROL IN BIOANALIZA

Situatia 1-in afara limitei de control

Situatia 2-in afara limitei de control

Situatia 3-in afara limitei de control

Situatia 4-in afara limitei de control

Situatia 5-in afara limitei de control

TIPURI DE GRAFICE DE CONTROL

GRAFICE X - provin din graf. Shewhart; - sunt satisfacatoare pentru determinarea parametrilor de calibrare (panta, diferenta de nivel); - fidele probelor martor; - in special pentru a valida precizia. GRAFICE CU VALOARE BLANK (OARBA) - analizeaza probele despre care se spune ca nu contin analit; - ofera informatii despre: reactivi, starea sistemului analitic, contaminarea din mediu; - opereaza cu masuratori inregistrate direct, nu cu valori calculate.

TIPURI DE GRAFICE DE CONTROL

GRAFICE CU GRAD DE RECUPERARE I - reflecta influenta probelor matrice; - analizeaza proba reala; - tinteste probe cu cantitate cunoscuta de analit; - Gradul de recuperare

x tinta x netinta RR 100 x asteptata

GRAFICE CU GRAD DE RECUPERARE II -detecteaza numai erorile sistematice proportionale cu concentratia; -limita pe care o poate atinge analitul este legata de proba matrice; -grad de recuperare foarte mare (valoare atinsa 100%).

TIPURI DE GRAFICE DE CONTROL

GRAFICE DE DOMENIU - diferente absolute intre valoare maxima si minima a analizei multiple; - graficul de control are numai limita superioara; - verifica precizia.

TIPURI DE GRAFICE DE CONTROL

GRAFICE CU SUMA CUMULATA Suma cumulata =suma tuturor erorilor pentru o valoare tinta. Valoare tinta este scazuta din fiecare analiza de control si diferenta este adunata sumei tuturor diferentelor anterioare. Avantaje ale Graficelor cu suma cumulata: - Se indica ce punct din proces este in afara controlului; - Media lungimii intervalului de lucru este scurtata; - Din media pantei se poate estima dimensiunea schimbarii ce are loc in proces.

GRAFICE CU SUMA CUMULATA

T = 80 Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 s = 2.5 x x-T Cusum 82 79 80 78 82 79 80 79 78 80 76 77 76 76 75 +2 -1 0 -2 +2 -1 0 -1 -2 0 -4 -3 -4 -4 -5 +2 +1 +1 -1 +1 0 0 -1 -3 -3 -7 -10 -14 -18 -23
90

85

80

75

70 0 30 20 10 0 0 -10 -20 -30 2 4 6 8 10 12 14 16 2 4 6 8 10 12 14 16

PROBE DE CONTROL
PROBE MARTOR - Nu se realizeaza grafic de control fara probe martor. Cerinte : - trebuie sa fie potrivite pentru monitorizare de-a lungul unei perioade mari de timp; - trebuie sa fie reprezentative pentru matrice si conc. analitului; - conc. trebuie sa fie in regiunea limitelor valorilor analitice; - trebuie sa fie stabile in timp; - nu trebuie existe schimbari datorate recipientului; SOLUTII STANDARD - Pentru a verifica calibrarea; - trebuie sa fie complet independente de solutia de calibrare; - control limitat al preciziei; - control foarte limitat pentru exactitate;

 PROBE REALE - sunt utilizate pentru diverse analize, pentru obtinerea graficelor; - control precis si rapid. PROBE REALE CU ANALIT - pentru a realiza alura graficului de control; - detectarea influentei matricei; - este necesar sa se separe graficele de matrice; - daca este posibil pentru verificarea preciziei si exactitatii. PROBE OARBE - probe care probabil nu contin analit; Pentru a detectata erorile : - schimbam reactivul; - sa utilizam un nou amestec de reactivi; - modificam parametrii de lucru ai aparatului. PROBE SINTETICE MATERIALE DE REFERINTA

TIPURI DE PROBE DE CONTROL SI APLICABILITATEA ACESTORA PENTRU CONTROLUL DE CALITATE INTERN

Aplicabil pentru supravegherea Tipul probei Standard Proba oarba Proba reala Proba reala cu analit Proba sintetica Mat. de referinta cerificat Preciziei Da Da Da Nu Da Da Exactitatii Nu Da(controlul reactivilor) Nu Da(grad de recuperare) Da(numai daca e Da
reprezentativ pt matrice)

Exactitatea Nu Nu Nu Nu Da (numai daca e

reprezentativ pt matrice)

Da

CAND SE UTILIZEAZA GRAFICELE DE CONTROL ?

Cand se urmareste controlul procesului, prin identificarea si corectarea probemelor care apar; Cand se analizeaza variatiile procesului din cauze speciale (evenimente care nu se petrec in mod obisnuit) sau din cauze comune (aparute in mod obisnuit in timpul procesului); Cand se urmareste calitatea procesului, cu scopul de a preveni problemele specifice sau pentru a realiza schimbari fundamentale in proces.